CN116449023A - 一种血清淀粉样蛋白a检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种血清淀粉样蛋白A检测试剂盒及其制备方法。该检测试剂盒包括第一试剂、第二试剂和第三试剂,第一试剂包括解离剂,第二试剂包括第一偶联血清淀粉样蛋白A单克隆抗体的胶乳颗粒,第三试剂包括第二偶联血清淀粉样蛋白A单克隆抗体的胶乳颗粒。该检测试剂盒的制备方法包括本发明胶乳颗粒的制备步骤。本发明通过在第一试剂中增加聚丙二醇和有机酸作为新组分,促进SAA游离出来;在第二试剂的胶乳颗粒上偶联一定数量的柔性臂,再偶联SAA抗体,增加设置含有表面一端偶联少量SAA单克隆抗体的胶乳颗粒的第三试剂,可使胶乳颗粒与SAA形成的复合颗粒的粒度更加均匀,其粒度分布更窄。从而提高SAA测定的灵敏度和准确性。
Description
技术领域
本发明涉及临床医学参数检测技术领域,具体涉及一种血清淀粉样蛋白A检测试剂盒及其制备方法。
背景技术
血清淀粉样蛋白A(SAA)是一种急性时相反应蛋白,属于载脂蛋白家族中的异质类蛋白质,相对分子量约12000。在急性时相反应中,经IL-1、IL-6和TNF刺激,SAA在肝脏中由被激活的巨噬细胞和纤维母细胞合成,但半衰期极短,只有50分钟左右。
血清淀粉样蛋白A与高密度脂蛋白(HDL)有关,它能在炎症期间调节高密度脂蛋白的代谢。正常人体中,SAA的含量在10mg/L以下,在发生轻微感染时,人体内SAA的含量上升并处于10-200mg/L范围内。但是对于部分疾病患者而言,其体内SAA含量将显著上升,例如重症的手足口患儿体内SAA含量高达600mg/L,患者体内超高的SAA含量能够有效的反应疾病的严重性,同时更加有利于医生进行疾病的判别。因此,其临床检测的灵敏度、准确性、及时性及其重要。
目前,用于血清SAA检测的方法包括酶联免疫吸附法、放射性免疫检测法、免疫层析法、免疫散射比浊法、胶乳增强免疫比浊法等等。酶联免疫吸附法操作繁琐,耗时,自动化水平低;放射性免疫分析法虽然具有特异性强灵敏度高的特点,但也存在潜在放射性污染,因此也逐渐不被接受;乳胶增强免疫比浊法较之免疫层析法具有更高的灵敏度和准确度。但其灵敏度仍不能满足临床检测需要,且部分SAA与HDL结合,影响其检测灵敏度和准确性。
因此,需要开发一种灵敏度、准确性更高的血清淀粉样蛋白A的检测试剂盒及其制备方法。
发明内容
有鉴于此,本发明提供一种血清淀粉样蛋白A的检测试剂盒及其制备方法,一方面,通过在第一试剂中增加解离剂聚丙二醇和有机酸作为新组分,与第一试剂的其他组分协同作用,促进SAA游离出来;另一方面,在第二试剂的胶乳颗粒上偶联一定数量的柔性臂,再偶联SAA抗体,增加设置含有表面一端偶联少量SAA单克隆抗体的胶乳颗粒的第三试剂,可使胶乳颗粒与SAA形成的复合颗粒的粒度更加均匀,其粒度分布更窄。从而提高SAA测定的灵敏度和准确性。
为达到此发明目的,本发明采用以下技术方案:
第一方面,本发明提供一种血清淀粉样蛋白A检测试剂盒,所述检测试剂盒包括第一试剂、第二试剂和第三试剂;
所述第一试剂包括解离剂、第一缓冲剂、促凝剂、第一稳定剂、抑制剂、第一防腐剂;
所述解离剂为聚丙二醇和有机酸,聚丙二醇质量浓度为0.8%-1.4%,有机酸的质量浓度为0.3%-0.9%;所述第一缓冲剂为磷酸盐缓冲液,浓度为30-60mmol/L;所述促凝剂为聚乙二醇4000,质量浓度为1.5%-2.2%;所述第一稳定剂为甘露醇,质量浓度为1.2%-2.9%;所述抑制剂为氯化钙和甘油,氯化钙的浓度为3-7mmol/L,甘油的质量浓度为0.5%-1.6%;所述第一防腐剂为Proclin300,质量浓度为0.2%-0.4%;所述第一试剂的pH在6.2-6.8之间;
所述第二试剂包括第一偶联血清淀粉样蛋白A单克隆抗体的胶乳颗粒、第二缓冲剂、第二稳定剂、第二防腐剂;
所述第一偶联血清淀粉样蛋白A单克隆抗体的胶乳颗粒具有一定数量柔性臂,柔性臂两端分别连接血清淀粉样蛋白A单克隆抗体和胶乳颗粒,质量浓度为0.07wt%-1.3wt%;所述第二缓冲剂为3-N-吗啉-丙磺酸缓冲液,浓度为5-34mmol/L;所述第二稳定剂为氯化钠和牛血清白蛋白,氯化钠的质量浓度为0.75%-0.98%,牛血清白蛋白的质量浓度为2%-3.1%;所述第二防腐剂为叠氮钠,质量浓度为0.07%-0.13%;所述第二试剂的pH在6.9-7.5之间;
所述第三试剂包括第二偶联血清淀粉样蛋白A单克隆抗体的胶乳颗粒、第三缓冲剂、第三稳定剂、第三防腐剂;
所述第二偶联血清淀粉样蛋白A单克隆抗体的胶乳颗粒表面一端偶联少量血清淀粉样蛋白A单克隆抗体,质量浓度为0.14wt%-2.6wt%;所述第三缓冲剂为N,N二羟乙基甘氨酸,浓度为80-110mmol/L;所述第三稳定剂为海藻糖和甘氨酸,海藻糖的质量浓度为1.9%-3.3%,甘氨酸的浓度为0.6%-1.2%;所述第三防腐剂为叠氮钠,质量浓度为0.09%-0.17%;所述第三试剂的pH在7.1-7.7之间。
优选地,所述聚丙二醇的分子量为400以下。
优选地,所述有机酸包括丁酸和戊酸中的一种或者两种。
优选地,所述柔性臂包括含有4-6个碳原子的羟基酸,所述羟基酸的羧基和羟基分别位于所述羟基酸的两端。
优选地,所述柔性臂在所述第一偶联血清淀粉样蛋白A单克隆抗体的胶乳颗粒的数量为12-22条/胶乳微球,所述柔性臂在所述第一偶联血清淀粉样蛋白A单克隆抗体的胶乳颗粒上的分布为均匀分布或者接近均匀分布。
优选地,所述柔性臂在所述第二偶联血清淀粉样蛋白A单克隆抗体的胶乳颗粒的数量为1-2条/胶乳微球,所述柔性臂位于所述第二偶联血清淀粉样蛋白A单克隆抗体的胶乳颗粒的同一侧或者一端。
第二方面,本发明提供一种如上所述血清淀粉样蛋白A检测试剂盒的制备方法,其特征在于,所述制备方法包括以下步骤:
根据需要配制第一试剂的体积,按照如下配比计算并称取配料:聚丙二醇0.8wt%-1.4wt%,有机酸0.3wt%-0.9wt%,磷酸盐缓冲液30-60mmol/L,聚乙二醇4000为1.5wt%-2.2wt%,甘露醇1.2wt%-2.9wt%,氯化钙3-7mmol/L,甘油0.5wt%-1.6wt%,Proclin300为0.2wt%-0.4wt%,溶解于相应体积的去离子水中,并用一定浓度的磷酸和氢氧化钠溶液将pH值调节到6.2-6.8之间,得到第一试剂;
根据需要配制第二试剂的体积,按照如下配比计算并称取配料:第一偶联血清淀粉样蛋白A单克隆抗体的胶乳颗粒0.07wt%-1.3wt%,3-N-吗啉-丙磺酸缓冲液5-34mmol/L,氯化钠0.75wt%-0.98wt%,牛血清白蛋白2wt%-3.1wt%,叠氮钠0.07wt%-0.13wt%,并用一定浓度的丙酸和氢氧化钾溶液将pH值调节到6.9-7.5之间,得到第二试剂;
根据需要配制第三试剂的体积,按照如下配比计算并称取配料:第二偶联血清淀粉样蛋白A单克隆抗体的胶乳颗粒0.14wt%-2.6wt%,N,N二羟乙基甘氨酸80-110mmol/L,海藻糖1.9wt%-3.3wt%,甘氨酸0.6wt%-1.2wt%,叠氮钠0.09wt%-0.17wt%,并用一定浓度的柠檬酸和氢氧化钠溶液将pH值调节到7.1-7.7之间,得到第三试剂;
所述第一偶联血清淀粉样蛋白A单克隆抗体的胶乳颗粒的制备方法为:将羧化改性的聚苯乙烯胶乳微球与羟基酸溶液混合,使所述羟基酸的羟基与所述聚苯乙烯胶乳微球上的羧基反应形成酯键,反应完成后过滤,洗涤,得到第一偶联柔性臂的胶乳微球;将所述第一偶联柔性臂的胶乳微球悬浮于磷酸缓冲液中,并加入活化剂NHS-EDC,搅拌均匀,加入一定量的水杨酸和吗啉,加入血清淀粉样蛋白A单克隆抗体,搅拌均匀后孵育一定时间,得到所述第一偶联血清淀粉样蛋白A单克隆抗体的胶乳颗粒;
所述第二偶联血清淀粉样蛋白A单克隆抗体的胶乳颗粒的制备方法为:将聚苯乙烯胶乳微球放入熔融的长链二元酸中,使所述聚苯乙烯胶乳微球漂浮于熔融液表面,降低温度使熔融液凝固,除去暴露在外的所述聚苯乙烯胶乳微球部分表面的残留凝固长链二元酸,将暴露在外的局部羧化,偶联柔性臂和血清淀粉样蛋白A单克隆抗体,得到所述第二偶联血清淀粉样蛋白A单克隆抗体的胶乳颗粒。
优选地,所述羧化改性的聚苯乙烯胶乳微球和所述聚苯乙烯胶乳微球的粒径为180-240nm。
优选地,所述聚苯乙烯胶乳微球暴露于所述凝固长链二元酸外的高度为所述聚苯乙烯胶乳微球直径的0.08-0.13倍。
相对于现有技术,本发明具有以下有益技术效果:①通过在第一试剂中增加解离剂聚丙二醇和有机酸作为新组分,与第一试剂的其他组分协同作用,促进SAA游离出来;②在第二试剂的胶乳颗粒上偶联一定数量的柔性臂,再偶联SAA抗体,增加设置含有表面一端偶联少量SAA单克隆抗体的胶乳颗粒的第三试剂,可使胶乳颗粒与SAA形成的复合颗粒的粒度更加均匀,其粒度分布更窄。从而提高SAA测定的灵敏度和准确性。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案进行详细描述。
需说明的是,在不冲突的情况下,以下实施例及实施例中的特征可以相互组合;并且,基于本公开中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本公开保护的范围。
需要说明的是,下文描述在所附权利要求书的范围内的实施例的各种方面。应显而易见,本文中所描述的方面可体现于广泛多种形式中,且本文中所描述的任何特定结构及/或功能仅为说明性的。基于本公开,所属领域的技术人员应了解,本文中所描述的一个方面可与任何其它方面独立地实施,且可以各种方式组合这些方面中的两者或两者以上。举例来说,可使用本文中所阐述的任何数目各方面来实施设备及/或实践方法。
需要说明的是,本申请文件中所编序号本身,例如“第一”、“第二”、“第三”等,仅区分所描述的对象,不具有任何顺序或技术含义。
本发明所提供的一种血清淀粉样蛋白A的检测试剂盒及其制备方法,一方面,通过在第一试剂中增加解离剂聚丙二醇和有机酸作为新组分,与第一试剂的其他组分协同作用,促进SAA游离出来;另一方面,在第二试剂的胶乳颗粒上偶联一定数量的柔性臂,再偶联SAA抗体,增加设置含有表面一端偶联少量SAA单克隆抗体的胶乳颗粒的第三试剂,可使胶乳颗粒与SAA形成的复合颗粒的粒度更加均匀,其粒度分布更窄。从而提高SAA测定的灵敏度和准确性。
本发明提供一种血清淀粉样蛋白A的检测试剂盒,该检测试剂盒包括第一试剂、第二试剂和第三试剂;
第一试剂包括解离剂、第一缓冲剂、促凝剂、第一稳定剂、抑制剂、第一防腐剂;
解离剂为聚丙二醇和有机酸,聚丙二醇质量浓度为0.8%-1.4%,有机酸的质量浓度为0.3%-0.9%;第一缓冲剂为磷酸盐缓冲液,浓度为30-60mmol/L;促凝剂为聚乙二醇4000,质量浓度为1.5%-2.2%;第一稳定剂为甘露醇,质量浓度为1.2%-2.9%;抑制剂为氯化钙和甘油,氯化钙的浓度为3-7mmol/L,甘油的质量浓度为0.5%-1.6%;第一防腐剂为Proclin300,质量浓度为0.2%-0.4%;第一试剂的pH在6.2-6.8之间;
第二试剂包括第一偶联血清淀粉样蛋白A单克隆抗体的胶乳颗粒、第二缓冲剂、第二稳定剂、第二防腐剂;
第一偶联血清淀粉样蛋白A单克隆抗体的胶乳颗粒具有一定数量柔性臂,柔性臂两端分别连接血清淀粉样蛋白A单克隆抗体和胶乳颗粒,质量浓度为0.07wt%-1.3wt%;第二缓冲剂为3-N-吗啉-丙磺酸缓冲液,浓度为5-34mmol/L;第二稳定剂为氯化钠和牛血清白蛋白,氯化钠的质量浓度为0.75%-0.98%,牛血清白蛋白的质量浓度为2%-3.1%;第二防腐剂为叠氮钠,质量浓度为0.07%-0.13%;第二试剂的pH在6.9-7.5之间;
所述第三试剂包括第二偶联血清淀粉样蛋白A单克隆抗体的胶乳颗粒、第三缓冲剂、第三稳定剂、第三防腐剂;
第二偶联血清淀粉样蛋白A单克隆抗体的胶乳颗粒表面一端偶联少量血清淀粉样蛋白A单克隆抗体,质量浓度为0.14wt%-2.6wt%;第三缓冲剂为N,N二羟乙基甘氨酸,浓度为80-110mmol/L;第三稳定剂为海藻糖和甘氨酸,海藻糖的质量浓度为1.9%-3.3%,甘氨酸的浓度为0.6%-1.2%;第三防腐剂为叠氮钠,质量浓度为0.09%-0.17%;第三试剂的pH在7.1-7.7之间。
优选地,聚丙二醇的分子量为400以下。
优选地,有机酸包括丁酸和戊酸中的一种或者两种。
进一步优选地,丁酸和戊酸的质量比1:(1-3)。
需要说明的是,解离剂的作用是促进血清中SAA从SAA与HDL复合体中解离出来。聚丙二醇与有机酸在第一缓冲剂的作用下,相互配合的结果。
优选地,柔性臂包括含有4-6个碳原子的羟基酸,羟基酸的羧基和羟基分别位于羟基酸的两端。
具体来说,含有4-6个碳原子的、羧基和羟基分别位于两端的羟基酸包括γ-羟基丁酸、4-羟基戊酸、5-羟基己酸。
优选地,柔性臂在第一偶联血清淀粉样蛋白A单克隆抗体的胶乳颗粒的数量为12-22条/胶乳微球,柔性臂在第一偶联血清淀粉样蛋白A单克隆抗体的胶乳颗粒上的分布为均匀分布或者接近均匀分布。
需要说明的是,第一偶联血清淀粉样蛋白A单克隆抗体的胶乳颗粒上的12-22条柔性臂,且在其表面均匀分布或者接近均匀分布的主要目的和作用是血清中的SAA与第一偶联血清淀粉样蛋白A单克隆抗体的胶乳颗粒在反应体系中形成更大粒径的颗粒,使反应体系的浑浊度发生变化,从而能够测定血清中的SAA;在胶乳颗粒上设置12-22条柔性臂且均匀或者接近均匀分布,可以使形成的颗粒更加均一,防止具有SAA抗体的胶乳颗粒与血清中的SAA形成无序颗粒,使SAA测定的灵敏度降低。
优选地,柔性臂在第二偶联血清淀粉样蛋白A单克隆抗体的胶乳颗粒的数量为1-2条/胶乳微球,柔性臂位于第二偶联血清淀粉样蛋白A单克隆抗体的胶乳颗粒的同一侧或者一端。
需要说明的是,第二偶联血清淀粉样蛋白A单克隆抗体的胶乳颗粒上的1-2条柔性臂,且位于胶乳颗粒的同一侧或者一端的主要目的和作用是在血清中的SAA与第一偶联血清淀粉样蛋白A单克隆抗体的胶乳颗粒反应到一定程度时,加入第二偶联血清淀粉样蛋白A单克隆抗体的胶乳颗粒,在已经形成的较大颗粒外表面形成无SAA单克隆抗体的胶乳颗粒层,阻断颗粒的进一步增大,防止形成的颗粒不均一性增大,降低测定灵敏度和准确性。
需要说明的是,本发明的血清淀粉样蛋白A检测试剂盒与现有技术的试剂盒相比,还设置了第三试剂,使用过程有所不同:需要在第二试剂加入后的30-70s加入第三试剂,并且同一批次待检样品、质控品的第二试剂与第三试剂加入间隔时间需相同。
本发明还提供一种上述血清淀粉样蛋白A检测试剂盒的制备方法,该制备方法包括以下步骤:
根据需要配制第一试剂的体积,按照如下配比计算并称取配料:聚丙二醇0.8wt%-1.4wt%,有机酸0.3wt%-0.9wt%,磷酸盐缓冲液30-60mmol/L,聚乙二醇4000为1.5wt%-2.2wt%,甘露醇1.2wt%-2.9wt%,氯化钙3-7mmol/L,甘油0.5wt%-1.6wt%,Proclin300为0.2wt%-0.4wt%,溶解于相应体积的去离子水中,并用一定浓度的磷酸和氢氧化钠溶液将pH值调节到6.2-6.8之间,得到第一试剂;
根据需要配制第二试剂的体积,按照如下配比计算并称取配料:第一偶联血清淀粉样蛋白A单克隆抗体的胶乳颗粒0.07wt%-1.3wt%,3-N-吗啉-丙磺酸缓冲液5-34mmol/L,氯化钠0.75wt%-0.98wt%,牛血清白蛋白2wt%-3.1wt%,叠氮钠0.07wt%-0.13wt%,并用一定浓度的丙酸和氢氧化钾溶液将pH值调节到6.9-7.5之间,得到第二试剂;
根据需要配制第三试剂的体积,按照如下配比计算并称取配料:第二偶联血清淀粉样蛋白A单克隆抗体的胶乳颗粒0.14wt%-2.6wt%,N,N二羟乙基甘氨酸80-110mmol/L,海藻糖1.9wt%-3.3wt%,甘氨酸0.6wt%-1.2wt%,叠氮钠0.09wt%-0.17wt%,并用一定浓度的柠檬酸和氢氧化钠溶液将pH值调节到7.1-7.7之间,得到第三试剂;
第一偶联血清淀粉样蛋白A单克隆抗体的胶乳颗粒的制备方法为:将羧化改性的聚苯乙烯胶乳微球与羟基酸溶液混合,使羟基酸的羟基与聚苯乙烯胶乳微球上的羧基反应形成酯键,反应完成后过滤,洗涤,得到第一偶联柔性臂的胶乳微球;将第一偶联柔性臂的胶乳微球悬浮于磷酸缓冲液中,并加入活化剂NHS-EDC,搅拌均匀,加入一定量的水杨酸和吗啉,加入血清淀粉样蛋白A单克隆抗体,搅拌均匀后孵育一定时间,得到第一偶联血清淀粉样蛋白A单克隆抗体的胶乳颗粒;
第二偶联血清淀粉样蛋白A单克隆抗体的胶乳颗粒的制备方法为:将聚苯乙烯胶乳微球放入熔融的长链二元酸中,使聚苯乙烯胶乳微球漂浮于熔融液表面,降低温度使熔融液凝固,除去暴露在外的聚苯乙烯胶乳微球部分表面的残留凝固长链二元酸,将暴露在外的局部羧化,偶联柔性臂和血清淀粉样蛋白A单克隆抗体,得到第二偶联血清淀粉样蛋白A单克隆抗体的胶乳颗粒。
进一步优选地,用于调节pH值的磷酸溶液的浓度为0.3-1.6mol/L,氢氧化钠溶液的浓度为0.8-2.4mol/L,丙酸溶液的浓度为0.9-2.6mol/L,氢氧化钾溶液的浓度为1.1-2.8mol/L,柠檬酸溶液的浓度为0.2-1.4mol/L。
进一步优选地,用于制备第一偶联血清淀粉样蛋白A单克隆抗体的胶乳颗粒的聚苯乙烯胶乳微球的羧化程度为12%-23%。
进一步优选地,聚苯乙烯胶乳微球的在羟基酸溶液中的质量浓度为19%-27%。
进一步优选地,羟基酸溶液的浓度为3.2-4.4mol/L。
进一步优选地,磷酸缓冲液的浓度为0.1-0.21mol/L。
进一步优选地,柔性臂连接的具体反应条件为76-91℃,反应80-120min,反应过程中的搅拌转速为120-160转/min。
进一步优选地,水杨酸的浓度为0.7%-1.3%,吗啉的浓度为0.2%-0.6%。
进一步优选地,NHS与EDC以及胶乳微球的质量比为---1:(0.4-1.6):(900-1200),SAA单克隆抗体与胶乳微球的质量比为---1:(550-700)。
优选地,羧化改性的聚苯乙烯胶乳微球和聚苯乙烯胶乳微球的粒径为180-240nm。
优选地,聚苯乙烯胶乳微球暴露于凝固长链二元酸外的高度为聚苯乙烯胶乳微球直径的0.08-0.13倍。
进一步优选地,长链二元酸碳原子数为15-19,可依据胶乳微球的密度进行调整。
进一步优选地,除去暴露在外的聚苯乙烯胶乳微球部分表面的残留凝固长链二元酸的具体方法是:采用比长链二元酸的熔点高1-3℃的惰性气体气流吹扫4-9秒,并在相对湿度为87%-92%的氮气环境中冷却至室温。惰性气体包括氩气、二氧化碳等气体。
为了进一步了解本发明,下面结合实施例对本发明的技术方案进行描述,但是应当理解,这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点,而不是对本发明权利要求的限定。
实施例1
按照如下步骤和条件制备本发明的血清淀粉样蛋白A的检测试剂盒:
根据需要配制第一试剂的体积,按照如下配比计算并称取配料:聚丙二醇0.8wt%,丁酸0.5wt%,磷酸盐缓冲液52mmol/L,聚乙二醇4000为2.2wt%,甘露醇1.2wt%,氯化钙4mmol/L,甘油1.3wt%,Proclin300为0.4wt%,溶解于相应体积的去离子水中,并用浓度为0.3mol/L的磷酸和浓度为1.2mol/L的氢氧化钠溶液将pH值调节到6.4,得到第一试剂;
根据需要配制第二试剂的体积,按照如下配比计算并称取配料:第一偶联血清淀粉样蛋白A单克隆抗体的胶乳颗粒0.1wt%,3-N-吗啉-丙磺酸缓冲液26mmol/L,氯化钠0.98wt%,牛血清白蛋白2wt%,叠氮钠0.09wt%,并用浓度为2.1mol/L的丙酸和浓度为2.8mol/L的氢氧化钾溶液将pH值调节到6.9之间,得到第二试剂;
根据需要配制第三试剂的体积,按照如下配比计算并称取配料:第二偶联血清淀粉样蛋白A单克隆抗体的胶乳颗粒2.3wt%,N,N二羟乙基甘氨酸110mmol/L,海藻糖1.9wt%,甘氨酸0.8wt%,叠氮钠0.14wt%,并用浓度为1.4mol/L的柠檬酸和浓度为0.8-mol/L的氢氧化钠溶液将pH值调节到7.3之间,得到第三试剂;
第一偶联血清淀粉样蛋白A单克隆抗体的胶乳颗粒的制备方法为:将羧化程度为23%的聚苯乙烯胶乳微球与羟基酸溶液混合,聚苯乙烯胶乳微球的在羟基酸溶液中的质量浓度为19%,羟基酸溶液的浓度为3.5mol/L,使羟基酸的羟基与聚苯乙烯胶乳微球上的羧基反应形成酯键,反应完成后过滤,洗涤,得到第一偶联柔性臂的胶乳微球;将第一偶联柔性臂的胶乳微球悬浮于浓度为0.18mol/L的磷酸缓冲液中,并加入活化剂NHS-EDC,搅拌均匀,NHS与EDC以及胶乳微球的质量比为1:1.6:900,SAA单克隆抗体与胶乳微球的质量比为1:590,加入一定量的水杨酸和吗啉,水杨酸的质量浓度为1.1%,吗啉的质量浓度为0.6%,加入血清淀粉样蛋白A单克隆抗体,搅拌均匀后,在反应条件为76℃,反应90min,反应过程中的搅拌转速为150转/min,得到第一偶联血清淀粉样蛋白A单克隆抗体的胶乳颗粒;
第二偶联血清淀粉样蛋白A单克隆抗体的胶乳颗粒的制备方法为:将聚苯乙烯胶乳微球放入熔融的长链二元酸中,长链二元酸碳原子数为19,使聚苯乙烯胶乳微球漂浮于熔融液表面,聚苯乙烯胶乳微球暴露于凝固长链二元酸外的高度为聚苯乙烯胶乳微球直径的0.08倍,降低温度使熔融液凝固,采用比长链二元酸的熔点高2℃的惰性气体气流吹扫7秒,并在相对湿度为92%的氮气环境中冷却至室温。惰性气体包括氩气,除去暴露在外的聚苯乙烯胶乳微球部分表面的残留凝固长链二元酸,将暴露在外的局部羧化,偶联柔性臂和血清淀粉样蛋白A单克隆抗体,得到第二偶联血清淀粉样蛋白A单克隆抗体的胶乳颗粒。
羧化改性的聚苯乙烯胶乳微球和聚苯乙烯胶乳微球的粒径为240nm。
采用常规方法对上述制备的血清淀粉样蛋白A检测试剂盒的灵敏性进行测试,结果表明,其灵敏性,即检测限低至0.055mg/L。
实施例2
根据需要配制第一试剂的体积,按照如下配比计算并称取配料:聚丙二醇0.95wt%,丁酸和戊酸0.7wt%,丁酸与戊酸的质量比为1:3,磷酸盐缓冲液60mmol/L,聚乙二醇4000为1.5wt%,甘露醇1.6wt%,氯化钙6mmol/L,甘油1.6wt%,Proclin300为0.2wt%,溶解于相应体积的去离子水中,并用浓度为0.7mol/L的磷酸和浓度为1.6mol/L的氢氧化钠溶液将pH值调节到6.8之间,得到第一试剂;
根据需要配制第二试剂的体积,按照如下配比计算并称取配料:第一偶联血清淀粉样蛋白A单克隆抗体的胶乳颗粒1.1wt%,3-N-吗啉-丙磺酸缓冲液34mmol/L,氯化钠0.75wt%,牛血清白蛋白2.3wt%,叠氮钠0.11wt%,并用浓度为2.6mol/L的丙酸和浓度为1.1mol/L的氢氧化钾溶液将pH值调节到7.2之间,得到第二试剂;
根据需要配制第三试剂的体积,按照如下配比计算并称取配料:第二偶联血清淀粉样蛋白A单克隆抗体的胶乳颗粒2.6wt%,N,N二羟乙基甘氨酸80mmol/L,海藻糖2.2wt%,甘氨酸1.0wt%,叠氮钠0.17wt%,并用浓度为0.2mol/L的柠檬酸和浓度为1.1mol/L的氢氧化钠溶液将pH值调节到7.4之间,得到第三试剂;
第一偶联血清淀粉样蛋白A单克隆抗体的胶乳颗粒的制备方法为:将羧化程度为12%的聚苯乙烯胶乳微球与羟基酸溶液混合,聚苯乙烯胶乳微球的在羟基酸溶液中的质量浓度为21%,羟基酸溶液的浓度为4.0mol/L,使羟基酸的羟基与聚苯乙烯胶乳微球上的羧基反应形成酯键,反应完成后过滤,洗涤,得到第一偶联柔性臂的胶乳微球;将第一偶联柔性臂的胶乳微球悬浮于浓度为0.21mol/L的磷酸缓冲液中,并加入活化剂NHS-EDC,搅拌均匀,NHS与EDC以及胶乳微球的质量比为1:0.4:1000,SAA单克隆抗体与胶乳微球的质量比为1:630,加入一定量的水杨酸和吗啉,水杨酸的质量浓度为1.3%,吗啉的质量浓度为0.2%,加入血清淀粉样蛋白A单克隆抗体,搅拌均匀后,在反应条件为80℃,反应100min,反应过程中的搅拌转速为160转/min,得到第一偶联血清淀粉样蛋白A单克隆抗体的胶乳颗粒;
第二偶联血清淀粉样蛋白A单克隆抗体的胶乳颗粒的制备方法为:将聚苯乙烯胶乳微球放入熔融的长链二元酸中,长链二元酸碳原子数为15,使聚苯乙烯胶乳微球漂浮于熔融液表面,聚苯乙烯胶乳微球暴露于凝固长链二元酸外的高度为聚苯乙烯胶乳微球直径的0.1倍,降低温度使熔融液凝固,采用比长链二元酸的熔点高2.5℃的惰性气体气流吹扫9秒,并在相对湿度为87%的氮气环境中冷却至室温。惰性气体包括二氧化碳,除去暴露在外的聚苯乙烯胶乳微球部分表面的残留凝固长链二元酸,将暴露在外的局部羧化,偶联柔性臂和血清淀粉样蛋白A单克隆抗体,得到第二偶联血清淀粉样蛋白A单克隆抗体的胶乳颗粒。
羧化改性的聚苯乙烯胶乳微球和聚苯乙烯胶乳微球的粒径为200nm。
采用常规方法对上述制备的血清淀粉样蛋白A检测试剂盒的灵敏性进行测试,结果表明,其灵敏性,即检测限低至0.045mg/L。
实施例3
根据需要配制第一试剂的体积,按照如下配比计算并称取配料:聚丙二醇1.2wt%,丁酸和戊酸0.9wt%,丁酸与戊酸的质量比为1:1,磷酸盐缓冲液30mmol/L,聚乙二醇4000为1.7wt%,甘露醇2.5wt%,氯化钙7mmol/L,甘油0.5wt%,Proclin300为0.3wt%,溶解于相应体积的去离子水中,并用浓度为1.2mol/L的磷酸和浓度为2.4mol/L的氢氧化钠溶液将pH值调节到6.2之间,得到第一试剂;
根据需要配制第二试剂的体积,按照如下配比计算并称取配料:第一偶联血清淀粉样蛋白A单克隆抗体的胶乳颗粒1.3wt%,3-N-吗啉-丙磺酸缓冲液5mmol/L,氯化钠0.86wt%,牛血清白蛋白3.1wt%,叠氮钠0.07wt%,并用浓度为1.4mol/L的丙酸和浓度为2.3mol/L的氢氧化钾溶液将pH值调节到7.5之间,得到第二试剂;
根据需要配制第三试剂的体积,按照如下配比计算并称取配料:第二偶联血清淀粉样蛋白A单克隆抗体的胶乳颗粒0.14wt%,N,N二羟乙基甘氨酸90mmol/L,海藻糖2.7wt%,甘氨酸1.2wt%,叠氮钠0.09wt%,并用浓度为0.5mol/L的柠檬酸和浓度为1.8mol/L的氢氧化钠溶液将pH值调节到7.7之间,得到第三试剂;
第一偶联血清淀粉样蛋白A单克隆抗体的胶乳颗粒的制备方法为:将羧化程度为15%的聚苯乙烯胶乳微球与羟基酸溶液混合,聚苯乙烯胶乳微球的在羟基酸溶液中的质量浓度为23%,羟基酸溶液的浓度为4.4mol/L,使羟基酸的羟基与聚苯乙烯胶乳微球上的羧基反应形成酯键,反应完成后过滤,洗涤,得到第一偶联柔性臂的胶乳微球;将第一偶联柔性臂的胶乳微球悬浮于浓度为0.1mol/L的磷酸缓冲液中,并加入活化剂NHS-EDC,搅拌均匀,NHS与EDC以及胶乳微球的质量比为1:0.7:1100,SAA单克隆抗体与胶乳微球的质量比为1:700,加入一定量的水杨酸和吗啉,水杨酸的质量浓度为0.7%,吗啉的质量浓度为0.4%,加入血清淀粉样蛋白A单克隆抗体,搅拌均匀后,在反应条件为82℃,反应120min,反应过程中的搅拌转速为1200转/min,得到第一偶联血清淀粉样蛋白A单克隆抗体的胶乳颗粒;
第二偶联血清淀粉样蛋白A单克隆抗体的胶乳颗粒的制备方法为:将聚苯乙烯胶乳微球放入熔融的长链二元酸中,长链二元酸碳原子数为16,使聚苯乙烯胶乳微球漂浮于熔融液表面,聚苯乙烯胶乳微球暴露于凝固长链二元酸外的高度为聚苯乙烯胶乳微球直径的0.11倍,降低温度使熔融液凝固,采用比长链二元酸的熔点高3℃的惰性气体气流吹扫4秒,并在相对湿度为90%的氮气环境中冷却至室温。惰性气体包括氩气,除去暴露在外的聚苯乙烯胶乳微球部分表面的残留凝固长链二元酸,将暴露在外的局部羧化,偶联柔性臂和血清淀粉样蛋白A单克隆抗体,得到第二偶联血清淀粉样蛋白A单克隆抗体的胶乳颗粒。
羧化改性的聚苯乙烯胶乳微球和聚苯乙烯胶乳微球的粒径为180nm。
采用常规方法对上述制备的血清淀粉样蛋白A检测试剂盒的灵敏性进行测试,结果表明,其灵敏性,即检测限低至0.04mg/L。
实施例4
根据需要配制第一试剂的体积,按照如下配比计算并称取配料:聚丙二醇1.4wt%,戊酸0.3wt%,磷酸盐缓冲液40mmol/L,聚乙二醇4000为1.9wt%,甘露醇2.9wt%,氯化钙3mmol/L,甘油0.8wt%,Proclin300为0.34wt%,溶解于相应体积的去离子水中,并用浓度为1.6mol/L的磷酸和浓度为0.8mol/L的氢氧化钠溶液将pH值调节到6.6之间,得到第一试剂;
根据需要配制第二试剂的体积,按照如下配比计算并称取配料:第一偶联血清淀粉样蛋白A单克隆抗体的胶乳颗粒0.07wt%,3-N-吗啉-丙磺酸缓冲液15mmol/L,氯化钠0.83wt%,牛血清白蛋白2.7wt%,叠氮钠0.13wt%,并用浓度为0.9mol/L的丙酸和浓度为1.5mol/L的氢氧化钾溶液将pH值调节到7.3之间,得到第二试剂;
根据需要配制第三试剂的体积,按照如下配比计算并称取配料:第二偶联血清淀粉样蛋白A单克隆抗体的胶乳颗粒0.98wt%,N,N二羟乙基甘氨酸93mmol/L,海藻糖3.3wt%,甘氨酸0.6wt%,叠氮钠0.12wt%,并用浓度为1.08mol/L的柠檬酸和浓度为2.4mol/L的氢氧化钠溶液将pH值调节到7.1之间,得到第三试剂;
第一偶联血清淀粉样蛋白A单克隆抗体的胶乳颗粒的制备方法为:将羧化程度为20%的聚苯乙烯胶乳微球与羟基酸溶液混合,聚苯乙烯胶乳微球的在羟基酸溶液中的质量浓度为25%,羟基酸溶液的浓度为3.2mol/L,使羟基酸的羟基与聚苯乙烯胶乳微球上的羧基反应形成酯键,反应完成后过滤,洗涤,得到第一偶联柔性臂的胶乳微球;将第一偶联柔性臂的胶乳微球悬浮于浓度为0.14mol/L的磷酸缓冲液中,并加入活化剂NHS-EDC,搅拌均匀,NHS与EDC以及胶乳微球的质量比为1:1.2:1200,SAA单克隆抗体与胶乳微球的质量比为1:550,加入一定量的水杨酸和吗啉,水杨酸的浓度为1.0%,吗啉的浓度为0.5%,加入血清淀粉样蛋白A单克隆抗体,搅拌均匀后,在反应条件为91℃,反应80min,反应过程中的搅拌转速为130转/min,得到第一偶联血清淀粉样蛋白A单克隆抗体的胶乳颗粒;
第二偶联血清淀粉样蛋白A单克隆抗体的胶乳颗粒的制备方法为:将聚苯乙烯胶乳微球放入熔融的长链二元酸中,长链二元酸碳原子数为17,使聚苯乙烯胶乳微球漂浮于熔融液表面,聚苯乙烯胶乳微球暴露于凝固长链二元酸外的高度为聚苯乙烯胶乳微球直径的0.13倍,降低温度使熔融液凝固,采用比长链二元酸的熔点高1-3℃的惰性气体气流吹扫6秒,并在相对湿度为88%的氮气环境中冷却至室温。惰性气体包括二氧化碳,除去暴露在外的聚苯乙烯胶乳微球部分表面的残留凝固长链二元酸,将暴露在外的局部羧化,偶联柔性臂和血清淀粉样蛋白A单克隆抗体,得到第二偶联血清淀粉样蛋白A单克隆抗体的胶乳颗粒。
羧化改性的聚苯乙烯胶乳微球和聚苯乙烯胶乳微球的粒径为220nm。
采用常规方法对上述制备的血清淀粉样蛋白A检测试剂盒的灵敏性进行测试,结果表明,其灵敏性,即检测限低至0.05mg/L。
对比例1
按照实施例2中制备检测试剂盒的各种组分及配比,但第一试剂中不加入聚丙二醇、丁酸和戊酸,其他相同。
采用常规方法对本对比例制备的血清淀粉样蛋白A检测试剂盒的灵敏性进行测试,结果表明,其灵敏性,即检测限为0.5mg/L。
对比例2
按照实施例2中制备检测试剂盒的各种组分及配比,但第二试剂中偶联血清淀粉样蛋白A单克隆抗体的胶乳颗粒为常规技术制备得到,不连接柔性臂,且对羧化度没有限定,没有第三试剂的设置,其他相同。
采用常规方法对本对比例制备的血清淀粉样蛋白A检测试剂盒的灵敏性进行测试,结果表明,其灵敏性,即检测限为0.38mg/L。
对比例3
按照实施例2中制备检测试剂盒的各种组分及配比,但但第一试剂中不加入聚丙二醇、丁酸和戊酸,第二试剂中偶联血清淀粉样蛋白A单克隆抗体的胶乳颗粒为常规技术制备得到,不连接柔性臂,且对羧化度没有限定,没有第三试剂的设置,其他相同。
采用常规方法对本对比例制备的血清淀粉样蛋白A检测试剂盒的灵敏性进行测试,结果表明,其灵敏性,即检测限为0.82mg/L。
综上所述,采用本发明的血清淀粉样蛋白A检测试剂盒可大幅提高检测试剂盒的检测灵敏度。
Claims (9)
1.一种血清淀粉样蛋白A检测试剂盒,其特征在于,所述检测试剂盒包括第一试剂、第二试剂和第三试剂;
所述第一试剂包括解离剂、第一缓冲剂、促凝剂、第一稳定剂、抑制剂、第一防腐剂;
所述解离剂为聚丙二醇和有机酸,聚丙二醇质量浓度为0.8%-1.4%,有机酸的质量浓度为0.3%-0.9%;所述第一缓冲剂为磷酸盐缓冲液,浓度为30-60mmol/L;所述促凝剂为聚乙二醇4000,质量浓度为1.5%-2.2%;所述第一稳定剂为甘露醇,质量浓度为1.2%-2.9%;所述抑制剂为氯化钙和甘油,氯化钙的浓度为3-7mmol/L,甘油的质量浓度为0.5%-1.6%;所述第一防腐剂为Proclin300,质量浓度为0.2%-0.4%;所述第一试剂的pH在6.2-6.8之间;
所述第二试剂包括第一偶联血清淀粉样蛋白A单克隆抗体的胶乳颗粒、第二缓冲剂、第二稳定剂、第二防腐剂;
所述第一偶联血清淀粉样蛋白A单克隆抗体的胶乳颗粒具有一定数量柔性臂,柔性臂两端分别连接血清淀粉样蛋白A单克隆抗体和胶乳颗粒,质量浓度为0.07wt%-1.3wt%;所述第二缓冲剂为3-N-吗啉-丙磺酸缓冲液,浓度为5-34mmol/L;所述第二稳定剂为氯化钠和牛血清白蛋白,氯化钠的质量浓度为0.75%-0.98%,牛血清白蛋白的质量浓度为2%-3.1%;所述第二防腐剂为叠氮钠,质量浓度为0.07%-0.13%;所述第二试剂的pH在6.9-7.5之间;
所述第三试剂包括第二偶联血清淀粉样蛋白A单克隆抗体的胶乳颗粒、第三缓冲剂、第三稳定剂、第三防腐剂;
所述第二偶联血清淀粉样蛋白A单克隆抗体的胶乳颗粒表面一端偶联少量血清淀粉样蛋白A单克隆抗体,质量浓度为0.14wt%-2.6wt%;所述第三缓冲剂为N,N二羟乙基甘氨酸,浓度为80-110mmol/L;所述第三稳定剂为海藻糖和甘氨酸,海藻糖的质量浓度为1.9%-3.3%,甘氨酸的浓度为0.6%-1.2%;所述第三防腐剂为叠氮钠,质量浓度为0.09%-0.17%;所述第三试剂的pH在7.1-7.7之间。
2.根据权利要求1所述血清淀粉样蛋白A检测试剂盒,其特征在于,所述聚丙二醇的分子量为400以下。
3.根据权利要求1所述血清淀粉样蛋白A检测试剂盒,其特征在于,所述有机酸包括丁酸和戊酸中的一种或者两种。
4.根据权利要求1所述血清淀粉样蛋白A检测试剂盒,其特征在于,所述柔性臂包括含有4-6个碳原子的羟基酸,所述羟基酸的羧基和羟基分别位于所述羟基酸的两端。
5.根据权利要求1所述血清淀粉样蛋白A检测试剂盒,其特征在于,所述柔性臂在所述第一偶联血清淀粉样蛋白A单克隆抗体的胶乳颗粒的数量为12-22条/胶乳微球,所述柔性臂在所述第一偶联血清淀粉样蛋白A单克隆抗体的胶乳颗粒上的分布为均匀分布或者接近均匀分布。
6.根据权利要求1所述血清淀粉样蛋白A检测试剂盒,其特征在于,所述柔性臂在所述第二偶联血清淀粉样蛋白A单克隆抗体的胶乳颗粒的数量为1-2条/胶乳微球,所述柔性臂位于所述第二偶联血清淀粉样蛋白A单克隆抗体的胶乳颗粒的同一侧或者一端。
7.一种如权利要求1-6任一项所述血清淀粉样蛋白A检测试剂盒的制备方法,其特征在于,所述制备方法包括以下步骤:
根据需要配制第一试剂的体积,按照如下配比计算并称取配料:聚丙二醇0.8wt%-1.4wt%,有机酸0.3wt%-0.9wt%,磷酸盐缓冲液30-60mmol/L,聚乙二醇4000为1.5wt%-2.2wt%,甘露醇1.2wt%-2.9wt%,氯化钙3-7mmol/L,甘油0.5wt%-1.6wt%,Proclin300为0.2wt%-0.4wt%,溶解于相应体积的去离子水中,并用一定浓度的磷酸和氢氧化钠溶液将pH值调节到6.2-6.8之间,得到第一试剂;
根据需要配制第二试剂的体积,按照如下配比计算并称取配料:第一偶联血清淀粉样蛋白A单克隆抗体的胶乳颗粒0.07wt%-1.3wt%,3-N-吗啉-丙磺酸缓冲液5-34mmol/L,氯化钠0.75wt%-0.98wt%,牛血清白蛋白2wt%-3.1wt%,叠氮钠0.07wt%-0.13wt%,并用一定浓度的丙酸和氢氧化钾溶液将pH值调节到6.9-7.5之间,得到第二试剂;
根据需要配制第三试剂的体积,按照如下配比计算并称取配料:第二偶联血清淀粉样蛋白A单克隆抗体的胶乳颗粒0.14wt%-2.6wt%,N,N二羟乙基甘氨酸80-110mmol/L,海藻糖1.9wt%-3.3wt%,甘氨酸0.6wt%-1.2wt%,叠氮钠0.09wt%-0.17wt%,并用一定浓度的柠檬酸和氢氧化钠溶液将pH值调节到7.1-7.7之间,得到第三试剂;
所述第一偶联血清淀粉样蛋白A单克隆抗体的胶乳颗粒的制备方法为:将羧化改性的聚苯乙烯胶乳微球与羟基酸溶液混合,使所述羟基酸的羟基与所述聚苯乙烯胶乳微球上的羧基反应形成酯键,反应完成后过滤,洗涤,得到第一偶联柔性臂的胶乳微球;将所述第一偶联柔性臂的胶乳微球悬浮于磷酸缓冲液中,并加入活化剂NHS-EDC,搅拌均匀,加入一定量的水杨酸和吗啉,加入血清淀粉样蛋白A单克隆抗体,搅拌均匀后孵育一定时间,得到所述第一偶联血清淀粉样蛋白A单克隆抗体的胶乳颗粒;
所述第二偶联血清淀粉样蛋白A单克隆抗体的胶乳颗粒的制备方法为:将聚苯乙烯胶乳微球放入熔融的长链二元酸中,使所述聚苯乙烯胶乳微球漂浮于熔融液表面,降低温度使熔融液凝固,除去暴露在外的所述聚苯乙烯胶乳微球部分表面的残留凝固长链二元酸,将暴露在外的局部羧化,偶联柔性臂和血清淀粉样蛋白A单克隆抗体,得到所述第二偶联血清淀粉样蛋白A单克隆抗体的胶乳颗粒。
8.根据权利要求7所述血清淀粉样蛋白A检测试剂盒的制备方法,其特征在于,所述羧化改性的聚苯乙烯胶乳微球和所述聚苯乙烯胶乳微球的粒径为180-240nm。
9.根据权利要求7所述血清淀粉样蛋白A检测试剂盒的制备方法,其特征在于,所述聚苯乙烯胶乳微球暴露于所述凝固长链二元酸外的高度为所述聚苯乙烯胶乳微球直径的0.08-0.13倍。
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