WO2011136332A1 - 軽度に酸化された酸化低密度リポタンパク質に対するモノクローナル抗体およびこれを産生するハイブリドーマ - Google Patents

軽度に酸化された酸化低密度リポタンパク質に対するモノクローナル抗体およびこれを産生するハイブリドーマ Download PDF

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WO2011136332A1
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monoclonal antibody
antibody
oxidized
solution
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仁志 千葉
小林　清一
古川　博之
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国立大学法人北海道大学
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    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity

Definitions

  • the present invention includes a monoclonal antibody against lightly oxidized oxidized low density lipoprotein, a hybridoma producing the monoclonal antibody, a kit for detecting lightly oxidized oxidized low density lipoprotein and a biological sample collected from a subject. Relates to a method for detecting lightly oxidized oxidized low density lipoproteins.
  • LDL Low Density Lipoprotein
  • Oxidation of low-density lipoprotein occurs when the active oxygen becomes excessive, that is, an oxidative stress state is caused by disruption of the balance between generation and elimination of active oxygen in the living body.
  • LDL is a huge molecule in which apolipoprotein B is bound to lipids such as cholesterol, phospholipids, and neutral fats.
  • unsaturated fatty acids in the constituent lipids are oxidized by active oxygen. .
  • chain oxidation reactions occur one after another, and lipid peroxides and aldehydes are produced via conjugated dienes.
  • Apolipoprotein B is also oxidized and cleaved by this chain oxidation reaction or direct oxidation reaction with active oxygen.
  • LDL loses a spherical structure, the negative charge increases, and the affinity for the receptor also changes, resulting in oxidized LDL having properties different from those of normal LDL (native-LDL).
  • Oxidative stress is involved because oxidized LDL is present in arteriosclerotic lesions and is detected at higher concentrations in the serum of patients with hyperlipidemia, diabetes, liver disease, etc. than healthy individuals. It is considered to be an important substance related to various diseases. Thus, antibodies that specifically recognize oxidized LDL have been developed for the purpose of elucidating, treating, diagnosing, and evaluating these diseases.
  • an oxidized phospholipid antibody that recognizes as an antigen a phospholipid having a fatty acid cleaved by oxidation obtained from oxidized LDL purified from an arteriosclerotic lesion, or native- Anti-MDA-LDL antibody (Non-patent document 2 and Non-patent document 3) obtained by using malondialdehyde-modified LDL (MDA-LDL) prepared from LDL as an immunogen, acetylated LDL, MDA- from native-LDL in serum
  • An antibody obtained by preparing LDL and metal oxide LDL and using solutions containing equal amounts of these as immunogens can be mentioned.
  • LDL is a huge particle having many sites that can be oxidized, the degree of oxidation varies.
  • antioxidants such as vitamin C in the blood
  • highly oxidized oxidized LDL highly oxidized LDL
  • lightly oxidized LDL lightly oxidized LDL
  • highly oxidized LDL present as oxidized LDL present in blood vessel walls and atherosclerotic lesions. It is considered.
  • the antibody described in Non-Patent Document 1 is an antibody against highly oxidized LDL and not an antibody against lightly oxidized LDL.
  • Non-Patent Document 2 since a site recognized as an antigen exists inside LDL, it is necessary to pre-process the sample to expose the antigen site.
  • Non-Patent Document 1 since the antibodies described in Non-Patent Document 1, Non-Patent Document 2, Non-Patent Document 3 and Patent Document 1 are not antibodies obtained using oxidized LDL present in serum as an immunogen, serum samples When it is used on plasma samples, it produces a false positive reaction, has low sensitivity, and it is difficult to detect the effects of drug administration or lifestyle improvement.
  • the present invention provides a monoclonal antibody against lightly oxidized oxidized LDL, which can serve as an important tool in research and development related to oxidized LDL, and also provides oxidized LDL lightly oxidized using the monoclonal antibody. It is an object of the present invention to provide a kit for simply detecting oxidase and a method for easily detecting lightly oxidized oxidized LDL contained in a biological sample collected from a subject.
  • the present inventors prepared and selected a hybridoma using an immunogen as a triglyceride-rich low-density lipoprotein (TG-rich LDL), which is a mildly oxidized LDL that appears in the serum of patients with liver disease.
  • TG-rich LDL triglyceride-rich low-density lipoprotein
  • the inventors have found that the monoclonal antibody produced by the hybridoma has the property that the degree of reaction with respect to lightly oxidized LDL is large and the degree of reaction with respect to highly oxidized LDL is small, and the following inventions have been completed.
  • NASH non-alcoholic steatohepatitis
  • a kit for detecting oxidized low density lipoprotein comprising the monoclonal antibody according to any one of (1) to (11).
  • a method for detecting oxidized low density lipoprotein contained in a biological sample collected from a subject, wherein the monoclonal antibody according to any one of (1) to (11) is collected from a subject comprising: a step of specifically reacting with oxidized low density lipoprotein contained in a biological sample to form a complex; and a step of detecting the complex.
  • a monoclonal antibody a hybridoma producing a monoclonal antibody
  • a kit for detecting lightly oxidized oxidized LDL a kit for detecting lightly oxidized oxidized LDL
  • a method for detecting lightly oxidized oxidized LDL contained in a biological sample collected from a subject To elucidate, treat, diagnose and evaluate various diseases related to oxidized LDL such as TG-rich LDL, and to develop pharmaceutical compositions with excellent medicinal properties. Can contribute and provide.
  • the diagrams on the upper and lower right sides are diagrams showing the results of measuring the concentration of each lipid in each eluate obtained by performing the gel filtration chromatography.
  • TC represents total cholesterol
  • PL represents phospholipid
  • FC represents free cholesterol
  • TG neutral fat.
  • the horizontal axis indicates the fraction, that is, the size, and the size is smaller as the position is in the positive direction (right direction) of the horizontal axis.
  • the results of a homology search with the known amino acid sequence of the amino acid sequences of CDR1 and CDR2 It is a figure which shows the highest thing with high homology. It is a figure which shows the highest thing with high homology as a result of homology search with respect to the known amino acid sequence about the amino acid sequence of CDR3 of G11-6-VH and CDR1 of G11-6-VL. It is a figure which shows the highest thing with high homology as a result of homology search with the known amino acid sequence about the amino acid sequence of CDR2 and CDR3 of G11-6-VL.
  • FIG. 4B is a diagram (B) showing the result of dividing the absorbance measurement value of each sample by the serum LDL-C concentration value of each sample.
  • FIG. 3B is a diagram (B) showing the results of ELISA performed with an MDA-LDL antibody adhered thereto.
  • FIG. 6 is a view showing the results of performing ELISA with G11-6 antibody immobilized on metal oxide LDL of ⁇ a->, ⁇ b->, ⁇ c->, and ⁇ d->.
  • the vertical axis represents the absorbance of the ELISA, and the horizontal axis represents the oxidation time of the metal oxide LDL used as the ELISA sample.
  • 5A is a graph showing the results of lipid peroxide concentration measurement by the TBARS method and the results of ELISA with G11-6 antibody immobilized (A; vertical axis indicates the absorbance of the ELISA and the excess of the metal oxide LDL of ⁇ a->). Lipid oxide concentration, the horizontal axis indicates the oxidation time of metal oxide LDL as a sample of ELISA and TBARS method), and the result of measurement of lipid peroxide concentration by TBARS method for ⁇ c-> metal oxide LDL (B; vertical axis shows ELISA absorbance and lipid peroxide concentration, horizontal axis shows ELISA and TBARS method sample oxidation time of metal-oxidized LDL) Respectively).
  • FIG. 1 shows the result of having performed ELISA which fixed G11-6 antibody about the metal oxide LDL of ⁇ a->, ⁇ a-1>, and ⁇ a + 1>
  • A the vertical axis
  • a horizontal axis is the horizontal axis
  • the oxidation time of the metal oxide LDL used as the ELISA sample is shown), and the results of the lipid peroxide concentration measurement by the TBARS method for the metal oxide LDL of ⁇ a->, ⁇ a-1>, and ⁇ a + 1> are shown.
  • FIG. 2 is a diagram (B; the vertical axis represents the lipid peroxide concentration, and the horizontal axis represents the oxidation time of the metal oxide LDL as a sample of the TBARS method).
  • FIG. 6 is a view showing the results of ELISA with G11-6 antibody immobilized on metal oxide LDL of ⁇ a->, ⁇ a-1>, ⁇ a + 1>, ⁇ a-1w> and ⁇ a + 1w>.
  • the vertical axis represents the absorbance of the ELISA
  • the horizontal axis represents the oxidation time of the metal oxide LDL used as the ELISA sample.
  • ELISA with G11-6 antibody immobilized For metal oxidized LDL, ELISA with G11-6 antibody immobilized, ELISA with antioxidant phospholipid antibody immobilized, ELISA with anti-MDA-LDL antibody immobilized, ELISA with anti-apolipoprotein B antibody immobilized, TBARS method It is a figure which shows the result of having performed the lipid peroxide density
  • the vertical axis represents the absorbance and lipid peroxide concentration measured by ELISA and conjugated diene, and the horizontal axis represents the oxidation time of the metal oxide LDL as a sample.
  • the monoclonal antibody against lightly oxidized oxidized LDL according to the present invention has a property that the degree of reaction to lightly oxidized oxidized LDL is large and the degree of reaction to highly oxidized oxidized LDL is small. It is a monoclonal antibody.
  • lightly oxidized LDL means a relatively small amount of oxides such as lipid peroxides and aldehydes generated by oxidation reaction, and cleaved apolipoprotein B, and is negative in comparison with native-LDL.
  • Highly charged oxidized LDL that is, lightly oxidized LDL
  • highly oxidized LDL refers to relatively high oxides such as lipid peroxides, aldehydes, and cleaved apolipoprotein B produced by oxidation reaction. It refers to oxidized LDL having a large number and having a negative charge significantly larger than that of native-LDL, that is, highly oxidized oxidized LDL.
  • both lightly oxidized LDL and highly oxidized LDL can be prepared according to a conventional method, for example, by oxidizing native-LDL in serum using a metal.
  • the degree of oxidation of the obtained oxidized LDL increases in proportion to the concentration of the metal that acts on native-LDL or the time that it acts. For example, by reacting native-LDL having a final concentration of about 0.493 g / L with copper sulfate having a final concentration of about 3.29 ⁇ mol / L at 37 ° C.
  • the final concentration is about
  • the final concentration is about
  • the final concentration is about 0.476 g / L.
  • the native-LDL is reacted with copper sulfate having a final concentration of about 23.81 ⁇ mol / L at 37 ° C. for H3 hours (0 ⁇ H3 ⁇ 8), or the final concentration is about 0.476 g / L of native-LDL.
  • Lightly oxidized LDL can be obtained by reacting copper sulfate having a concentration of about 47.62 ⁇ mol / L at 37 ° C. for H4 hours (0 ⁇ H4 ⁇ 8), with a final concentration of 0.493 g.
  • the native concentration of about 0.493 g / L of native-LDL is about 6.579 ⁇ mol / L.
  • the final concentration of native-LDL was about 0.476 g / L, and the final concentration of about 23.81 ⁇ mol / L copper sulfate was added at 37 ° C.
  • H6 hours H6 ⁇ 8
  • native sulfate LLD native sulfate LLD having a final concentration of about 0.476 g / L to copper sulfate having a final concentration of about 47.62 ⁇ mol / L at 37 ° C. for H7 hours (H7 ⁇ 8).
  • highly oxidized LDL can be obtained.
  • a monoclonal antibody has the property that the degree of reaction to lightly oxidized LDL is large and the degree of reaction to highly oxidized LDL is small is, for example, using a monoclonal antibody as a solid-phased antibody, And it can confirm by ELISA which uses an anti- apolipoprotein B antibody for a detection antibody. That is, in this ELISA, if the degree of reaction when using highly oxidized LDL as a sample is small compared to the degree of reaction when using lightly oxidized LDL as a sample, the monoclonal antibody used for the immobilized antibody Will have the property that the degree of reaction to lightly oxidized LDL is large and the degree of reaction to highly oxidized LDL is small.
  • the lightly oxidized LDL can include lightly oxidized LDL of mammals and birds such as humans, mice, rats, monkeys (primates excluding humans), goats, dogs, pigs, guinea pigs, rabbits, sheep, chickens and the like. Is preferably human lightly oxidized LDL. Further, it is preferable that the lightly oxidized LDL is TG-rich ⁇ LDL.
  • TG-rich LDL is LDL that appears at least in the serum of patients with liver disease.
  • TG-rich LDL is characterized by a high content of triacylglycerol (triglyceride, tri-O-acylglycerol; TG, TAG), which is a neutral fat.
  • triacylglycerol triglyceride, tri-O-acylglycerol
  • TG TAG
  • normal LDL with a high cholesterol content It is a lipoprotein different from (native-LDL).
  • VLDL very low density lipoprotein
  • HDL high density lipoprotein
  • TG-rich LDL foams cultured macrophages are directly proportional (Nagasaka H. et al., J. Pediatr, Vol. 146). Pp. 329-335, 2005), while TG peroxidation is hardly detected in the plasma of healthy volunteers, whereas a significant increase in TG peroxidation is observed in the plasma of patients with liver disease (Hui SP. Et al., Lipids, 38, pp.
  • TG-rich LDL is considered to be a kind of oxidized LDL. Furthermore, highly oxidized LDL cannot be present in a large amount in serum, but TG-rich® LDL is present in a large amount in the serum of patients with liver disease. Therefore, TG-rich® LDL is considered to be a kind of mildly oxidized LDL. ing.
  • TG-rich LDL is an LDL with a large weight ratio of TG compared to native-LDL.
  • TG-rich LDL is LDL that foams macrophages.
  • Such TG-rich LDL has an oxidized form of intermediate density lipoprotein ⁇ Intermediate en Density Lipoprotein; IDL (also referred to as mid-band, which includes a remnant lipoprotein corresponding to IDL as a fraction) ⁇ (ie, oxidized form)
  • IDL also referred to as mid-band, which includes a remnant lipoprotein corresponding to IDL as a fraction
  • remnant lipoproteins which is referred to as small dense LDL (sd-LDL, modified LDL), which has a particle size of 25.5 nm or less and a fraction of 1.040 to 1.063 when fractionated by specific gravity.
  • An oxidized form of lipoprotein corresponding to LDL is included.
  • FIG. 1 and Table 1 show typical examples of the measurement results of the weight ratio of TG in TG-rich LDL.
  • the upper and lower left figures in FIG. 1 show gel filtration chromatography while measuring the absorbance at 280 nm for the total lipoprotein fraction separated from the serum of healthy subjects (upper figure) and liver disease patients (lower figure).
  • FIG. 1 is a diagram showing the results of the graph, and the upper and lower right diagrams in FIG. 1 show the total lipoprotein fraction separated from the serum of healthy subjects (upper figure) and liver disease patients (lower figure) by ultracentrifugation, respectively. It is a figure which shows the result of having performed the gel filtration chromatography and measuring the density
  • Table 1 shows the results of measuring the concentration of each lipid by the above method for 4 patients with liver disease and 7 healthy subjects, and calculating the average value and standard deviation.
  • VLDL and HDL disappear in patients with liver disease, and TG-rich LDL having a particle size similar to that of native-LDL is present at a high concentration.
  • the weight ratio of TG in TG-rich LDL present at a high concentration is clearly larger than the weight ratio of TG in native-LDL.
  • Table 1 since the standard deviation value of each lipid weight ratio in TG-rich LDL is large, it can be understood that the TG weight ratio in TG-rich LDL has some variation.
  • TG-rich LDL can be measured by polyacrylamide gel electrophoresis, high performance liquid chromatography (HPLC), or the like to obtain results that are close to native-LDL. May vary to some extent due to differences or severity of disease.
  • a result approximated to native-LDL or a result showing that it is slightly negative compared to native-LDL can be obtained by measuring by agarose gel electrophoresis or the like. It may vary to some extent depending on the individual difference of the examiner and the severity of the disease.
  • TG-rich LDL is collected from the serum of patients with liver disease, but is considered to be present not only in liver diseases but also in the sera of patients with various diseases, particularly those with oxidative stress-related diseases and those suspected of suffering from such diseases. It has been.
  • diseases include acute hepatitis, chronic hepatitis, cirrhosis, liver fibrosis, benign recurrent intrahepatic cholestasis, biliary atresia, steatohepatitis, non-alcoholic steatohepatitis (Non-alcoholic steatohepatitis;
  • hyperlipidemia such as hypercholesterolemia, high LDL cholesterolemia, low HDL cholesterolemia, hypertriglyceridemia, cerebral infarction, ischemic heart disease, aortic aneurysm, nephrosclerosis And arteriosclerotic diseases such as obstructive arteriosclerosis, diabetes, hypertension and the like.
  • an antibody has a Y chain in which two polypeptides each of a light chain (L chain; molecular weight of about 25,000) and a heavy chain (H chain; molecular weight of about 50,000 to 77,000) are bound to each other by a disulfide bond.
  • the basic structure is a letter-shaped heterotetramer.
  • the Y-shaped tip portion is called a variable region, and the other portion is called a stationary region.
  • the variable region of the light chain is referred to as the VL region
  • the variable region of the heavy chain is referred to as the VH region.
  • the variable region is an antigen recognition site, and its amino acid sequence varies depending on the type of antibody. On the other hand, the amino acid sequence of the constant region is relatively little changed between antibodies.
  • variable regions a region that directly contacts the antigen and plays a central role in binding to the antigen has a particularly large change in amino acid sequence between antibodies, and this region is a complementarity determining region (CDR) or hypervariable. It is called an area.
  • An area other than the CDR in the variable area is referred to as a framework area (FR).
  • FR framework area
  • variable regions (VH region and VL region) in the present invention are healthy as long as the monoclonal antibody according to the present invention has the property that the degree of reaction to lightly oxidized LDL is large and the degree of reaction to highly oxidized LDL is small. As long as it has the property of specifically reacting with oxidized small dense LDL in the elderly, it has the property of specifically reacting with oxidized LDL having the same particle size as native-LDL in NASH patients, or in patients with dyslipidemia Any amino acid sequence may be used as long as it has a property of specifically reacting with oxidized remnant lipoprotein. Examples of the amino acid sequence of the variable region (VH region and VL region) in the present invention include the following (i) to (v).
  • the amino acid sequence of the variable region can be confirmed according to a conventional method.
  • a conventional method for example, first, RNA is extracted from a hybridoma that produces the monoclonal antibody according to the present invention described later, and a reverse transcription reaction is performed to obtain cDNA.
  • the variable region cDNA sequence is amplified by PCR using primers of a known sequence suitable for variable region amplification, and if necessary, the sequence is cloned using a sequencer. The DNA sequence is determined by doing. Finally, it can be confirmed by converting the determined DNA sequence of the variable region into an amino acid sequence according to a triplet codon.
  • “react” is used interchangeably with “interact”, “couple”, and “recognize”. Further, in the present invention, it is sufficient if it is clear that an antibody “reacts specifically” with a specific antigen (immunogen) is reactive with the specific antigen.
  • the phrase “specifically reacts” with respect to the specific antigen includes not only reacting with other antigens at all, but also includes reacting with other antigens and significantly reacting with the specific antigen.
  • the hybridoma according to the present invention produces the monoclonal antibody according to the present invention.
  • the hybridoma according to the present invention can be prepared using any method that can be appropriately selected by those skilled in the art. Such methods include, for example, the hybridoma method (Nature, 256, 495-497, 1975), the trioma method, the human B cell hybridoma method (ImmunologyoToday, Vol. 4, page 72, 1983). And EBV-hybridoma method (MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, pp. 77-96, Alan R. Liss, Inc., 1985), etc., and methods having the following steps (i) to (iv): Can be mentioned.
  • an immunogen is prepared.
  • the immunogen may be prepared by any method.
  • the TG-rich LDL fraction is separated from the serum, concentrated by ultrafiltration, and then dialyzed. Can do.
  • a method for confirming that TG-rich LDL is contained in the serum a method that can be appropriately selected by those skilled in the art can be mentioned, and as such a method, there is an agarose gel electrophoresis method. it can.
  • the ⁇ -position band was not detected in the subject serum, and moved to the anode side compared to the healthy subject serum. When a ⁇ -position band is detected at the position, it can be determined that the subject serum contains TG-rich LDL.
  • a method for separating the TG-rich LDL fraction from serum a method that can be appropriately selected by those skilled in the art can be mentioned, and as such a method, for example, a previously reported method (Ciba H. et al., J. Biol. Lipid Res., 38, 1204-1216, 1997 / Hirano T. et al., J. Aeroclerosis and h Thrombosis, 12, 67-72, 2005) using density gradient centrifugation.
  • a method for separating the TG-rich LDL fraction by subjecting the total lipoprotein fraction separated from the serum to gel filtration chromatography can be mentioned.
  • the animal is immunized using the isolated TG-rich LDL fraction as an immunogen. Immunization can be performed using a conventional method as appropriate.
  • the animal to be immunized is not particularly limited, and examples thereof include mice, rats, monkeys (primates excluding humans), goats, dogs, pigs, guinea pigs, rabbits, sheep, chickens and the like.
  • antibody-producing cells are collected from the immunized animal.
  • antibody-producing cells include spleen cells, lymph node cells, and peripheral blood cells.
  • the collected antibody-producing cells are fused with other cells. Examples of methods for collecting antibody-producing cells and cell fusion methods include methods that can be appropriately selected by those skilled in the art.
  • a cell to be fused with the antibody-producing cell a cell having a strong proliferation ability is preferably used. For example, a generally available myeloma cell line can be used.
  • the cell line used has drug selectivity and cannot survive in a HAT selection medium (including hypoxanthine, aminopterin, and thymidine) in an unfused state, but can survive only in a state fused with antibody-producing cells. Those having properties are preferred.
  • a HAT selection medium including hypoxanthine, aminopterin, and thymidine
  • the hybridoma produced is screened for a hybridoma producing a monoclonal antibody having a low degree of reaction with respect to native-LDL and a high degree of reaction with respect to metal-oxidized LDL.
  • the screening can be performed by a method that can be appropriately selected by those skilled in the art using a conventional method such as an ELISA method or an immunoblot method.
  • ELISA with a native-LDL immobilized is performed on the culture supernatant of the hybridoma, the ELISA reaction is detected with an anti- (immunized animal) antibody labeled appropriately, and native- A hybridoma can be identified by identifying a culture supernatant that has a low degree of reaction for LDL and a high degree of reaction for metal-oxidized LDL.
  • the hybridoma obtained by the method having the above steps (i) to (iv) can be used as the hybridoma according to the present invention.
  • the cell is purified by further cloning or screening, and the hybridoma according to the present invention can do.
  • cloning or screening methods include methods such as a limiting dilution method, a trypsin filter paper method, and a penicillin cap method.
  • the monoclonal antibody produced by the hybridoma thus obtained can be used as the monoclonal antibody according to the present invention, and the monoclonal antibody produced by the antibody-producing cells collected in step (iii) of the method can be used as the monoclonal antibody. It can be a monoclonal antibody according to the invention.
  • Examples of a method for extracting a monoclonal antibody from a hybridoma or antibody-producing cell include conventional methods such as a cell culture method and ascites formation method.
  • the extracted monoclonal antibody can be purified by, for example, appropriately selecting a known method such as ammonium sulfate salting-out method, HPLC, ion exchange chromatography, gel filtration chromatography, affinity chromatography, or a combination thereof.
  • a known method such as ammonium sulfate salting-out method, HPLC, ion exchange chromatography, gel filtration chromatography, affinity chromatography, or a combination thereof.
  • the determination of the class of the obtained monoclonal antibody can be performed according to a conventional method as appropriate.
  • the immunized animal is a mouse
  • it can be performed using an IsoStripe mouse monoclonal antibody isotyping kit (Roche) or the like.
  • the class of the monoclonal antibody according to the present invention any of IgG, IgA, IgM, IgD and IgE can be used.
  • the monoclonal antibody according to the present invention can be used after being labeled with biotin, a radioisotope, a fluorescent substance, an enzyme or the like, if necessary. Further, if necessary, it can be used by being fixed to a carrier such as a polystyrene plate, a polypropylene plate, a silicon plate, a polystyrene microbead, a magnetic bead or a latex particle.
  • a carrier such as a polystyrene plate, a polypropylene plate, a silicon plate, a polystyrene microbead, a magnetic bead or a latex particle.
  • the monoclonal antibody according to the present invention can be obtained as a human antibody by immunizing an animal having human immunoglobulin producing ability, if necessary, and can be derived from an immunized animal using genetic engineering techniques. It can also be obtained as a chimeric antibody composed of a variable region and a human-derived constant region, and has a hypervariable region derived from an immunized animal, and the other antibody regions can also be obtained as humanized antibodies derived from humans.
  • a monoclonal antibody according to the present invention a monoclonal antibody produced by a hybridoma with a deposit number of NITE BP-916, which was commissioned on March 17, 2010, to the Patent Microorganism Depositary, National Institute of Technology and Evaluation of the National Institute of Technology and Evaluation. Although an antibody can be mentioned, it is not limited to this.
  • the hybridoma according to the present invention can include, but is not limited to, a hybridoma in which the accession number is NITE-BP-916.
  • a monoclonal antibody that reacts specifically with oxidized small ⁇ dense LDL in healthy subjects and specifically reacts with oxidized LDL having the same particle size as native-LDL in NASH patients.
  • Monoclonal antibodies and monoclonal antibodies that specifically react with oxidized remnant lipoproteins in patients with dyslipidemia are also encompassed by the monoclonal antibodies according to the present invention.
  • “healthy person” means a person who is healthy without injury (Iwanami Shoten, Kojien, 6th edition) and who is not suffering from a disease involving at least oxidized LDL.
  • the present invention provides a kit for detecting lightly oxidized oxidized LDL according to the present invention.
  • the kit according to the present invention comprises the monoclonal antibody according to the present invention, but does not impair the characteristics of secondary antibodies, labeling substances and other substances useful for the implementation of immunological detection means, buffers, instruments, etc. As long as it is included as a component.
  • the present invention provides a method for detecting lightly oxidized oxidized LDL contained in a biological sample collected from a subject. It should be noted that the method for detecting lightly oxidized oxidized LDL according to the present invention may include an incubation step, a washing step, etc. as long as the method for detecting lightly oxidized oxidized LDL according to the present invention is not impaired. Good.
  • a method for detecting lightly oxidized oxidized LDL according to the present invention is a method for detecting oxidized LDL contained in a biological sample collected from a subject, (I) A step of forming a complex by specifically reacting the monoclonal antibody according to the present invention with oxidized LDL contained in a biological sample collected from a subject (complex formation step) (Ii) Step of detecting the complex (detection step) The above steps (i) and (ii) are included.
  • any method that can be appropriately selected by those skilled in the art can be exemplified.
  • a solution containing the monoclonal antibody according to the present invention and a biological sample are mixed to form a complex, and the biological sample is fixed to a carrier to form the monoclonal antibody according to the present invention.
  • Examples thereof include a method of reacting with a solution containing the same, a method of allowing the monoclonal antibody according to the present invention to adhere to a carrier and reacting with a biological sample.
  • a different aspect of the method for detecting lightly oxidized oxidized LDL according to the present invention is a method for detecting oxidized LDL contained in a biological sample collected from a subject, (I) Step of fixing the monoclonal antibody according to the present invention to a carrier (fixing step) (Ii) a step of specifically reacting the monoclonal antibody fixed to a carrier with oxidized LDL contained in a biological sample collected from a subject to form a complex (fixed complex forming step) (Iii) Step of detecting the complex (fixed complex detection step)
  • the above steps (i) to (iii) are included.
  • any carrier can be used for fixing the monoclonal antibody according to the present invention.
  • a carrier include the same carriers as those described above.
  • the method for fixing is not particularly limited, and can be appropriately set depending on the carrier used.
  • the kit for detecting lightly oxidized oxidized LDL and the method for detecting lightly oxidized oxidized LDL according to the present invention include elucidation, diagnosis and evaluation of severity of various diseases involving not only liver disease but also oxidized LDL. In addition to evaluation of therapeutic effects, it can be used for evaluation of the degree of oxidation of lipoproteins.
  • a monoclonal antibody against lightly oxidized oxidized LDL according to the present invention a hybridoma producing the monoclonal antibody, a lightly oxidized oxidized LDL detection kit, and a lightly oxidized material contained in a biological sample collected from a subject
  • a method for detecting the oxidized LDL will be described based on examples. Note that the technical scope of the present invention is not limited to the features shown by these examples.
  • Example 1 Production of monoclonal antibody using TG-rich LDL as an immunogen (1) Confirmation of TG-rich LDL by agarose gel electrophoresis Blood collected from one end-stage patient and one healthy subject was collected at room temperature. After standing for 1 hour, centrifugation was performed at 3500 rpm and 4 ° C. for 10 minutes to obtain the serum of end-stage patients with liver disease and the serum of healthy subjects. 1.5 ⁇ L of the obtained serum was applied to an agarose gel (Universal Gel / 8; Helena Laboratories) and electrophoresed at 100 V and 150 W for 45 minutes in a barbital buffer solution with a pH of 8.6 and an ionic strength of 0.06. Then, the gel was dried using a dryer.
  • agarose gel Universal Gel / 8; Helena Laboratories
  • Triton X-100 2 drops are added to 20 mL of methanol containing 0.03% (w / v) Fat Red 7B (Helena Laboratories), and 4 mL of 0.1 mol / L sodium hydroxide aqueous solution is further added. After dyeing the dried gel for 10 minutes in the staining solution prepared by the above, decolorization was performed by immersing in a 75% (v / v) aqueous methanol solution for 10 seconds.
  • potassium bromide Kanto Chemical Co., Inc.
  • a sample solution (12 mL) was placed in a centrifuge tube (40PA; Hitachi Koki Co., Ltd.) and filled with a specific gravity solution.
  • Centrifugation was performed for 18 hours under conditions of 40000 rpm and 15 ° C., and the upper layer (d ⁇ 1.225 kg / L) was recovered as a total lipoprotein fraction.
  • About 8 mL of the collected total lipoprotein fraction was added in an amount of 2 to 3 mL under a nitrogen gas atmosphere using an Amicon stirring cell Model 8050 (Millipore) and an ultrafiltration membrane Amicon XM50 (Millipore) according to the attached instruction manual.
  • the eluate was collected 9 mL (3 mL ⁇ 3 fractions) before and after the absorbance peak to obtain 18 mL (3 mL ⁇ 6 fraction) of the TG-rich LDL fraction.
  • aqueous solution containing sodium dodecyl sulfate (SDS) was prepared, and a solution prepared by mixing this aqueous solution with a 4% (w / v) aqueous copper sulfate solution at a volume ratio of 100: 1 was prepared as a reaction solution. Further, an equal amount of a phenol reagent (foreign thiocult reagent; Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was mixed with deionized water to prepare a foreign thiocult reagent solution.
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • bovine serum albumin (BSA) aqueous solution was prepared as a standard solution. 3 mL of the prepared reaction solution was added to 1 mL each of the TG-rich LDL solution and standard solution of Example (2) [2-3] and allowed to react at room temperature for 30 minutes. Subsequently, 300 ⁇ L of the prepared foreign thiocult reagent solution was added with vigorous stirring, followed by reaction at room temperature for 45 minutes. Thereafter, the absorbance at 660 nm was measured. From the comparison with the measured value of the standard solution, the protein concentration of the TG-rich LDL solution of Example (2) [2-3] was calculated.
  • BSA bovine serum albumin
  • the hybridoma was cultured for about 10 days using a RPMI1640 medium containing penicillin / streptomycin, 10% (w / v) fetal calf serum (FCS) and a HAT solution according to a conventional method until colonies were confirmed.
  • a RPMI1640 medium containing penicillin / streptomycin, 10% (w / v) fetal calf serum (FCS) and a HAT solution according to a conventional method until colonies were confirmed.
  • Example (4) [4-3] ELISA in which native-LDL and metal oxide LDL are fixed After diluting the native-LDL solution of Example (4) [4-1] and the metal-oxidized LDL solution of Example (4) [4-2] to 20 ⁇ g / mL with PBS, respectively, A plate (Nunc MaxiSorp; Nalge Nunc International) was placed at 50 ⁇ L / well and reacted at 4 ° C. overnight to fix native-LDL and metal oxide LDL on the plate. After removing the liquid and blocking by adding 150 ⁇ L / well of PBS containing 1% (w / v) BSA and incubating at 37 ° C.
  • Tween 20 is contained Washed 4 times with PBS (0.05% Tween-PBS). Subsequently, 50 ⁇ L / well of the culture supernatant of each colony of this Example (3) was put into a well to which native-LDL was fixed and a well to which metal oxide LDL was fixed, and reacted at room temperature for 1 hour. Washed 4 times with 0.05% Tween-PBS.
  • Disodium p-nitrophenyl phosphate hydrate (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) adjusted to 1 mg / mL using 10 mmol / L Diethanolamine solution containing 0.5 mmol / L MgCl 2 was added at room temperature to 30 ⁇ L / well. Reacted for 1 minute. Subsequently, the absorbance was measured at a main wavelength of 405 nm and a sub wavelength of 600 nm using a microplate reader (Bio-Rad Laboratories). Colonies were selected by identifying a culture supernatant having a low absorbance for the well to which native-LDL was fixed, and a culture supernatant having a high absorbance for the well to which the metal-oxidized LDL was fixed.
  • G11-6 of Example (4) was intraperitoneally injected into a mouse injected with 2,6,10,14-tetramethyl-2-pentadecenoic acid (pristen). Ascites containing a monoclonal antibody (G11-6 antibody) produced by G11-6 was obtained.
  • the obtained ascites was subjected to a saturated ammonium sulfate (saturated ammonium sulfate) precipitation method according to a conventional method to obtain a crude monoclonal antibody solution. Specifically, while the obtained ascites was cooled with ice, an equal amount of saturated ammonium sulfate was slowly added dropwise and then centrifuged to remove the supernatant. Subsequently, a 50% saturated ammonium sulfate solution was added to the precipitate and centrifuged again to remove the supernatant, followed by washing. The precipitate was dissolved in PBS to obtain a crude G11-6 antibody solution.
  • saturated ammonium sulfate saturated ammonium sulfate
  • Example 2 Class determination of G11-6 antibody Class of G11-6 antibody of Example 1 (5) by immunochromatography using IsoStrip mouse monoclonal antibody isotyping kit (Roche) according to the attached instructions. Judgment was made. As a result, it was revealed that the class of the G11-6 antibody is IgM.
  • RNA extraction Hybridoma G11-6 of Example 1 (4) was placed in a 25 cm 3 flask containing 10 mL of 10% FCS-containing RPMI1640 medium. Inoculated and cultured for 72 hours under 5% CO 2 atmosphere and 37 ° C. Subsequently, centrifugation was performed for 5 minutes at room temperature and 8500 rpm, the supernatant was removed, and the cell pellet was recovered. Using an absolute RNA Miniprep kit (STRATAGENE), RNA was extracted from the collected cell pellets according to the attached instructions.
  • STRATAGENE absolute RNA Miniprep kit
  • ⁇ -mercaptoethanol was added to 600 ⁇ L of Lysis buffer, and this was added to the cell pellet. After pipetting with a syringe of 18G (outer diameter 1.2 mm, inner diameter 0.94 mm), the entire amount is stored in Prefilter Spin Cup (Cup1), and centrifuged at room temperature and 14000 rpm for 5 minutes, About 600 ⁇ L of filtrate was collected. 600 ⁇ L of 70% (v / v) ethanol was added thereto and mixed by inversion to obtain about 1200 mL of ethanol mixed solution.
  • RNA Binding Binding Spin (Cup2), centrifuged at room temperature and 14000 rpm for 1 minute, the filtrate was removed, and the remaining ethanol mixture was added at about 500 ⁇ L to normal temperature and 14000 rpm. Centrifugation was performed again for 1 minute under the conditions described above. Thereafter, the filtrate was removed, 600 ⁇ L of Low Salt Wash Buffer was added, and the filtrate was further removed by centrifugation at room temperature and 14000 rpm for 1 minute. Subsequently, the mixture was further centrifuged for 2 minutes at room temperature and 14000 rpm, and the filtrate was removed.
  • Cup2 RNA Binding Binding Spin
  • DNase Digestion Buffer 50 ⁇ L and reconstituted RNase-Free DNaseI 5 ⁇ L were mixed and added to Cup2, and incubated at 37 ° C. for 15 minutes. Thereafter, 600 ⁇ L of High-Salt Wash Buffer was added to Cup 2 and centrifuged at room temperature and 14000 rpm for 1 minute, and then the filtrate was removed. After adding 600 ⁇ L of Low Salt Wash Buffer to Cup2, the mixture was centrifuged at room temperature and 14000 rpm for 1 minute, and then the filtrate was removed. Further, 300 ⁇ L of Low Salt Wash Buffer was added to Cup2, and centrifuged at room temperature and 14000 rpm for 2 minutes, and then Cup2 was transferred to a new 1.5 mL Eppendorf tube.
  • RNA concentration of the RNA solution was measured using NanoDrop1000 (Thermo Scientific), it was 128 ng / ⁇ L. Therefore, the RNA concentration was adjusted to about 100 ng / ⁇ L by adding an appropriate amount of DEPC water to the RNA solution.
  • Reaction solution A about 100 ng / ⁇ L RNA solution 8 ⁇ L, 10 mmol / L dNTP mix 1 ⁇ L, 50 ng / ⁇ L Random Hexamers 1 ⁇ L
  • Reaction solution B 10 ⁇ RT Buffer 2 ⁇ L, 25 mmol / L MgCl 2 4 ⁇ L, 0.1 mol / L DTT 2 ⁇ L, 40 U / mL RNaseOUT TM 1 ⁇ L
  • reaction solution A was mixed and incubated at 65 ° C. for 5 minutes, and then left on ice for 1 minute.
  • reaction solution B is added to reaction solution A and incubated at room temperature for 2 minutes, and then 1 ⁇ L of Superscript TM II RT is added, and then at room temperature for 10 minutes, at 42 ° C. for 50 minutes, and at 70 ° C. for 15 minutes.
  • the reverse transcription reaction was performed by incubating in the order of, and cDNA was prepared.
  • the obtained cDNA solution was stored at 4 ° C.
  • the solution containing the amplified G11-6-VH DNA sequence (VH-PCR product solution) and the solution containing the amplified G11-6-VL DNA sequence (VL-PCR product solution) were stored at 4 ° C.
  • VH ligation reaction solution consisting of 4 ⁇ L of G11-6-VH-DNA solution, 1 ⁇ L of Salt Solution and 1 ⁇ L of TOPO vector, and 4 ⁇ L of G11-6- A VL ligation reaction solution comprising a VL-DNA solution, 1 ⁇ L of Salt Solution and 1 ⁇ L of TOPO vector was prepared, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 5 minutes to insert the DNA fragment into the vector.
  • a solution containing E. coli transformed with the VH ligation reaction solution was used as a VH E. coli solution, and a solution containing E. coli transformed with the VL ligation reaction solution was used as a VL E. coli solution.
  • VH E. coli solution was applied to each plate of the VH plate group
  • VL E. coli solution was applied to each plate of the VL plate group by adding 10 ⁇ L, 50 ⁇ L, and 100 ⁇ L, respectively, and then all the plates were incubated at 37 ° C. for 15 hours. . Subsequently, a total of 8 colonies appearing on the plate were picked up using a sterilized toothpick from a total of 8 from the VH plate group and 7 from the VL plate group.
  • VL E. coli pellet was used as the VL plasmid solution
  • VL plasmid solution was used as the VL plasmid solution.
  • VH plasmid solution and VL plasmid solution were stored at 4 ° C.
  • Sequence reaction solution composition Ready Reaction Mix 2 ⁇ L, Sequencing Buffer 1 ⁇ L, T3 primer 1 ⁇ L, DEPC water 5 ⁇ L, template DNA 1 ⁇ L
  • Sequence reaction conditions After a reaction at 96 ° C. for 10 seconds, each reaction was carried out for 25 cycles of 96 ° C. for 10 seconds, 50 ° C. for 5 seconds, and 60 ° C. for 3 minutes, and then allowed to stand at 4 ° C.
  • SAM TM Solution (Applied Biosystems) 45 ⁇ L was added to a sequencing reaction solution (VH sequencing reaction solution) using the VH plasmid solution as a template DNA and a sequencing reaction solution (VL sequencing reaction solution) using the VL plasmid solution as a template DNA.
  • VH sequencing reaction solution a sequencing reaction solution
  • VL sequencing reaction solution a sequencing reaction solution using the VL plasmid solution as a template DNA.
  • TATEC MicroMixer E-36
  • the mixture was centrifuged at room temperature and 14000 rpm for 10 seconds to collect the supernatant, and set on a sequencer (3730xl DNA Analyzer; Applied Biosystems) to analyze the DNA sequence. Subsequently, the amino acid sequence and the CDR1, CDR2 and CDR3 of the complementarity determining region (CDR) were estimated from the obtained DNA sequence using software (MacVector; MacVector). The results are shown below.
  • VQLQQSGTVLARPGASVKMSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGAIYPGNSSDSYNQKFKGKAKLTAVTSTSTAYMELSSLTNEDSAVAYCTRVYGRAMDYWGQGTSVTVSS (Sequence No. 7) CDR1 of VH region; SYWMH (SEQ ID NO: 8) CDR2 of VH region; AIYPGNSDTSNYQKFKG (SEQ ID NO: 9) CDR3 of VH region; VYGRAMDY (SEQ ID NO: 10)
  • Example 3 Reactivity of ELISA in which G11-6 antibody was fixed to serum of liver disease patients (1) Preparation of serum samples Serum was collected from 1 liver disease patient and 1 healthy subject, respectively.
  • anti-apolipoprotein B antibody bound to the column was eluted by flowing 0.1 mol / L Glycine-HCl (pH 2.7) at a flow rate of about 0.2 mL / min.
  • the eluate was fractionated 0.5 mL each.
  • Example 2 [2-1] 27 ⁇ L of the prepared biotin-labeled solution was added to 1 mL of the anti-apolipoprotein B antibody solution of ⁇ 2-1-1>, and reacted at room temperature for 4 hours with shaking.
  • the ELISA reaction was measured using an oxidized LDL ELISA kit (oxidized LDL measuring reagent “MX”; Kyowa Medex) according to the attached instruction manual. Specifically, 100 ⁇ L / well of a reaction buffer solution is placed on a plate to which a mouse antioxidant phospholipid monoclonal antibody is fixed, and the serum sample of this example (1) is diluted 250 times using the attached specimen diluent. Then, each 20 ⁇ L / well was added and incubated at 37 ° C. for 2 hours, followed by washing 4 times using the attached washing solution.
  • MX oxidized LDL measuring reagent
  • peroxidase-labeled goat anti-human apolipoprotein B polyclonal antibody was added at 100 ⁇ L / well, incubated at 37 ° C. for 1 hour, and then washed 4 times with the washing solution.
  • the 3,3 ′, 5,5 ′,-tetramethylbenzidine solution was added at 100 ⁇ L / well, incubated at 37 ° C. for 30 minutes, and 0.5 mol / L sulfuric acid was added at 50 ⁇ L / well to stop the reaction. Thereafter, the absorbance was measured at a main wavelength of 450 nm and a sub-wavelength of 620 nm using a microplate reader (Multiskan FC; Thermo Scientific Fisher).
  • the ELISA reaction was measured using an oxidized LDL ELISA kit (Oxidized LDL Eliser “Daiichi”; Sekisui Medical) according to the attached instruction manual. Specifically, the plate to which the mouse anti-MDA-LDL monoclonal antibody was fixed was washed three times using the attached washing solution. Subsequently, the serum sample of this Example (1) was diluted 2000 times using a sample diluent (HEPES buffer), each was added at 100 ⁇ L / well, reacted at room temperature for 2 hours, and then the attached washing solution was used. And washed 3 times.
  • HEPES buffer sample diluent
  • ⁇ -galactosidase-labeled mouse anti-apolipoprotein B monoclonal antibody was added at 100 ⁇ L / well, reacted at room temperature for 1 hour, and then washed 3 times with the attached washing solution.
  • 100 ⁇ L / well of the substrate o-nitrophenyl- ⁇ -D-galactopyranoside solution was added and allowed to react at room temperature for 2 hours, and then the reaction was stopped by adding 100 ⁇ L / well of sodium carbonate solution.
  • Absorbance was measured at a dominant wavelength of 415 nm and a minor wavelength of 655 nm using a microplate reader (NOVAPATH; Bio-Rad Laboratories).
  • FIG. 8 shows the results of Examples (2), (3), and (4).
  • the G11-6 antibody in the ELISA to which the G11-6 antibody was fixed, an absorbance of 0.212 was confirmed in patients with liver disease, but almost no absorbance was confirmed in healthy subjects.
  • the absorbance of 0.602 was confirmed in the liver disease patients, and the absorbance of 0.094 was confirmed in the healthy subjects.
  • the ELISA to which the anti-MDA-LDL antibody was fixed an absorbance of 0.146 was confirmed in patients with liver disease, and an absorbance of 0.179 was confirmed in healthy subjects.
  • the antioxidant phospholipid antibody and the anti-MDA-LDL antibody react not only to the liver disease patient serum but also to the healthy subject serum, whereas the G11-6 antibody However, it has been shown to be highly specific.
  • Example 4 Correlation between severity of liver disease and reactivity in ELISA with G11-6 antibody fixed (1) Determination of severity of liver disease by agarose gel electrophoresis From 9 patients with liver disease and 14 healthy subjects Each serum was collected and subjected to agarose gel electrophoresis according to the method described in Example 1 (1).
  • FIG. 9 shows typical migration results of healthy subject serum and liver disease patient serum.
  • liver disease patients in which the ⁇ -position band (corresponding to HDL) is completely deleted as compared with the migration pattern of healthy subjects are determined as a severe group, and the ⁇ -position band (corresponding to HDL).
  • the liver disease patients who did not have a deficiency were determined to be in the mild moderate group, 6 of the 9 liver disease patients were in the mild moderate group and 3 were in the severe group.
  • Example 3 (2) ELISA to which G11-6 antibody is fixed
  • ELISA with G11-6 antibody immobilized was performed.
  • a total of 23 samples of 14 healthy subjects, 6 mild to moderate groups, and 3 to severe groups were used in this Example (1).
  • the measured values of absorbance were tabulated for each group of healthy subjects, mild to moderate groups, and severe groups, and average values were calculated. The result is shown in FIG. Comparison between each group was statistically significant when P ⁇ 0.05 by performing one-way analysis of variance and multiple comparison test by Scheffe's method.
  • the absorbance of the healthy group was 0.052 ⁇ 0.024
  • the absorbance of the mild group was 0.105 ⁇ 0.074
  • the absorbance of the severe group was 0.699. It was ⁇ 0.942.
  • a significant difference was recognized between the severe group and the healthy group at P ⁇ 0.05.
  • a significant difference was recognized between P and 0.05 between the severe group and the mild group.
  • Total cholesterol (TC); Cholestest CHO (Sekisui Medical) Neutral fat (TG); Excellator TG (Sekisui Medical) Phospholipid (PL); Pure Auto S PL (Sekisui Medical) Cholesterol in high density lipoprotein (HDL-C); Cores test N HDL (Sekisui Medical) Cholesterol in low density lipoprotein (LDL-C); Cholestest LDL (Sekisui Medical)
  • Example 3 (2) ELISA to which G11-6 antibody is fixed ELISA with G11-6 antibody fixed was performed by the method described in Example 3 (2) [2-2]. However, instead of the serum sample of Example 3 (1), a total of 20 samples of 1 healthy subject, 7 patients with dyslipidemia, and 12 patients with liver disease were used in this example (1). The result is shown in FIG. Further, the absorbance value of each sample was divided by the serum concentration of LDL-C of each sample measured in this Example (1) using the following formula. The result is shown in FIG.
  • the measured value of the absorbance of the healthy person is almost zero, while the measured value of the absorbance of the dyslipidemic patient 1 to the dyslipidemic patient 7 is approximately the measured value of the absorbance of the healthy person. Big in comparison.
  • the measured value of the absorbance of dyslipidemic patient 1 is larger than the measured value of the absorbance of other dyslipidemic patients, and the measured value of the absorbance of liver disease patients 1 to 10 and liver disease patients 12 is large. It can be seen that the same or larger than that.
  • the absorbances of liver disease patients 1 to 12 are larger than those of healthy subjects and are generally greater than those of dyslipidemic patients. . From these results, it was confirmed that the ELISA to which the G11-6 antibody was fixed had a small response in healthy subjects, but a relatively large response in dyslipidemic patients and liver disease patients.
  • Example 6 Reactivity of ELISA to which G11-6 antibody is fixed to gel filtration eluate of serum from patients with various diseases (1) Reactivity of various ELISA to gel filtration eluate of total lipoprotein fraction Serum from healthy subjects Were collected and subjected to density gradient centrifugation according to a previous report (Hirano T. et al., J. Atheroclerosis and Thrombosis, Vol. 12, pp. 67-72, 2005) to separate lipoproteins.
  • each elution solution of elution numbers 5, 7, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 18, 20, 22, 25, and 28 was used as a sample in Example 3 (2) [2-2. ],
  • G11-6 antibody is immobilized by the method described in the above, and elution numbers 5, 7, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 18, 20 using the attached sample diluent , 22, 25 and 28 were diluted 10-fold, and these samples were used as samples, and an ELISA to which an antioxidant phospholipid antibody was fixed by the method described in Example 3 (3) was further added to the attached sample dilution.
  • the eluates of elution numbers 5, 7, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 18, 20, 22, 25, and 28 were diluted 500 times using the solutions, and these were used as samples.
  • FIG. 12A shows the results of TC concentration measurement and various ELISAs for the liver disease patient serum
  • FIG. 12B shows the results for the healthy subject serum.
  • the TC concentration reached the maximum at elution number 13 in patients with liver disease.
  • the ELISA to which the G11-6 antibody was fixed the ELISA to which the antioxidant phospholipid antibody was fixed, and the ELISA to which the anti-MDA-LDL antibody was fixed had the highest absorbance.
  • the TC concentration was highest in elution number 13 in young healthy individuals, whereas ELISA and antioxidant phospholipid antibody in which G11-6 antibody was fixed in elution number 14 The absorbance was maximized in both the ELISA to which the antibody was fixed and the ELISA to which the anti-MDA-LDL antibody was fixed.
  • Example 3 (2) [2 -2] is used to fix the G11-6 antibody to the elution number 1, 3, 5, 8, 10, 11, 12, 13, 14, 15,
  • Each eluate of 16, 18, and 24 was diluted 500 times, and these were used as samples, respectively, and ELISA with an anti-MDA-LDL antibody fixed thereto was performed by the method described in Example 3 (4).
  • dyslipidemia patient (n 2).
  • the elution number 13 shows the TC concentration, TG concentration, PL concentration, the absorbance of the ELISA to which the G11-6 antibody is immobilized, and the absorbance of the ELISA to which the anti-MDA-LDL antibody is immobilized. Both became the maximum.
  • the TC concentration, the TG concentration, and the PL concentration in the elution number 13, and the absorbance of the ELISA to which the G11-6 antibody was fixed in the elution number 11, were the elution number 14 or In the elution number 15, the absorbance of the ELISA to which the anti-MDA-LDL antibody was fixed was maximized.
  • the G11-6 antibody has a small response to the oxidized small dense LDL.
  • the oxidized small dense LDL is highly oxidized in patients with dyslipidemia. The present inventors believe that this is the case.
  • the TC concentration and PL concentration at elution number 13, the TG concentration at elution number 13 or elution number 5, and the ELISA with G11-6 antibody immobilized at elution number 16 were fixed.
  • the absorbance of the ELISA to which the anti-MDA-LDL antibody was fixed at the elution number 15 was maximized.
  • the G11-6 antibody was also applied to the eluate obtained by subjecting the serum directly to gel filtration chromatography without separating the total lipoprotein fraction by density gradient centrifugation.
  • the immobilized ELISA was confirmed to have sufficient sensitivity to specifically detect oxidized LDL.
  • Example 7 Reactivity of ELISA to which G11-6 antibody is immobilized against metal-oxidized LDL (1) Preparation of native-LDL fraction [1-1] Separation of lipoproteins by density gradient centrifugation It was collected and subjected to density gradient centrifugation according to a previous report (Hirano T. et al., J. Atherocleosis and Thrombosis, Vol. 12, pp. 67-72, 2005) to separate lipoproteins.
  • the B fraction is different from the A and C fractions and does not contain HDL and contains LDL. Therefore, the B fraction was used as a native-LDL solution.
  • Example (1) [1-1] The B fraction of Example (1) [1-1], ie, the native-LDL solution, was dialyzed overnight at 4 ° C. using PBS as a dialysis solution. Thereafter, the protein concentration was measured by the method described in Example 1 (2) [2-4] and diluted to 0.5 mg / mL with PBS.
  • ⁇ A->, ⁇ b->, ⁇ c-> and ⁇ d-> were used immediately after incubation for each set time.
  • ⁇ A-1> was used after 24 hours of storage at 4 ° C. following incubation for each set time.
  • ⁇ A-1w> was used after incubation at each set time for 1 week at 4 ° C.
  • ⁇ A + 1> was used after dialysis overnight at 4 ° C. using PBS as a dialysis solution following incubation for each set time.
  • ⁇ A + 1w> was used after incubation at each set time, followed by dialysis overnight at 4 ° C. using PBS as a dialysis solution, and then storing at 4 ° C. for 6 days.
  • the absorbance reaches a maximum at an oxidation time of 0.5 hours, the absorbance decreases at an oxidation time of 1 hour or longer, and reaches an absorbance similar to that of native-LDL at an oxidation time of 8 hours or longer. It was.
  • the ELISA to which the G11-6 antibody is immobilized has a large reaction with respect to the lightly oxidized oxidized LDL (lightly oxidized LDL), and the unoxidized native-LDL and the highly oxidized oxidized It was confirmed that the reaction was small for LDL (highly oxidized LDL).
  • lipid peroxide concentration of metal oxide LDL by TBARS method The metal oxide LDL of ⁇ a-> and ⁇ c-> in Example (2) was attached using TBARS Assay Kit (Cayman Chemical Co.). The lipid peroxide concentration was measured according to the instructions for use. Specifically, a color-developing reagent was prepared by mixing equal amounts of acetic acid and sodium hydroxide, and adding and dissolving Thiobarbituric acid to 36.8 mmol / L. After adding 1 mL of the coloring reagent and 25 ⁇ L of the SDS solution to 25 ⁇ L each of the metal oxide LDL solutions of ⁇ a-> and ⁇ c-> in Example (2) and incubating at 100 ° C.
  • the lipid peroxide concentration showed similar changes between ⁇ a-> and ⁇ c->. That is, in any case, the lipid peroxide concentration increased until the oxidation time passed 2 hours, and the lipid peroxide concentration gradually decreased after the oxidation time passed 4 hours.
  • the ELISA in which the G11-6 antibody was fixed a change in absorbance different between ⁇ a-> and ⁇ c-> was detected. That is, in the case of ⁇ a->, the absorbance increases until the oxidation time passes 2 hours, the absorbance decreases rapidly after the oxidation time passes 4 hours, and the oxidation time is 24 hours, the same as native-LDL.
  • the absorbance reached a maximum at an oxidation time of 0.5 hours, and the absorbance decreased sharply after an oxidation time of 1 hour, and the oxidation time was 8 hours.
  • the absorbance was about the same as that of native-LDL.
  • the absorbance increases until the oxidation time passes 1 hour, and the oxidation time reaches 2 hours. As time passed, the absorbance decreased, and the absorbance was about the same as that of native-LDL after an oxidation time of about 16 hours. In the case of ⁇ a + 1>, the absorbance increases until the oxidation time passes 2 hours, the absorbance decreases after the oxidation time passes 4 hours, and the oxidation time is about 16 hours, which is about the same as native-LDL. The absorbance was.
  • the same change in absorbance was detected between ⁇ a-1w> and ⁇ a + 1w>.
  • the absorbance reached a maximum at an oxidation time of 0.5 hours, and the oxidation time was 1 hour.
  • the absorbance decreased.
  • the absorbance of ⁇ a-1w> and ⁇ a + 1w> decreased after 1 hour of oxidation time.
  • Example 8 Reactivity of ELISA in which G11-6 antibody is immobilized against metal oxide LDL (comparison with reactivity of ELISA in which various antibodies are immobilized) (1)
  • Preparation of metal oxide LDL Copper sulfate was added to 120 ⁇ L of native-LDL solution (0.5 mg / mL) of Example 7 (1) [1-3] so that the concentration was 3.33 ⁇ mol / L, and the temperature was 37 ° C.
  • Metal-oxidized LDL solutions of various degrees of oxidation were prepared by incubating for 0.5 hour, 1 hour, 2 hours, 3 hours, 4 hours, 6 hours, 8 hours and 24 hours. The prepared metal oxide LDL solution was immediately used as an ELISA sample.
  • sandwich ELISA was carried out using anti-apolipoprotein B antibody as a solid phase antibody and anti-apolipoprotein B antibody as a detection antibody. Specifically, ELISA was performed by the method described in Example 3 (2) [2-2]. However, in place of 5 ⁇ g / mL of the G11-6 antibody of Example 1 (5), 10 ⁇ g / mL of the goat anti-apolipoprotein B polyclonal antibody of Example 3 (2) ⁇ 2-1-2> was used.
  • Example 3 replaced with the serum sample of Example 3 (1) diluted 20 times, and the metal oxidation LDL solution prepared in this Example (1) diluted to 0.1 microgram / mL was used.
  • ALP-SA Zymed Laboratories
  • ALP-SA Zymed Laboratories
  • 250 times was used instead of ALP-SA (Zymed Laboratories) diluted 250 times.
  • FIG. 23 shows the results of Examples (2), (3), and (4).
  • the absorbance increased until the oxidation time passed 3 hours, the absorbance decreased after the oxidation time passed 4 hours, and the oxidation time 8 Absorbance was comparable to that of native-LDL over time, and the absorbance was lower than before oxidation when the oxidation time was 24 hours.
  • the absorbance increased until the oxidation time passed 8 hours, and the absorbance slightly decreased after the oxidation time of 24 hours.
  • the absorbance increases until the oxidation time passes 3 hours, the absorbance decreases after the oxidation time passes 4 hours, and the native-LDL is reached after an oxidation time of 24 hours. Absorbance was comparable. In an ELISA using an anti-apolipoprotein B antibody as a solid phase antibody and a detection antibody, the absorbance was high until the oxidation time passed 8 hours, and the absorbance slightly decreased after 24 hours. In the TBARS method, the lipid peroxide concentration increased until the oxidation time passed 4 hours, and decreased slightly when the oxidation time passed 8 hours. In the measurement of the conjugated diene, the absorbance rapidly increased until the oxidation time passed 3 hours, and after 4 hours, the absorbance gradually increased even during the oxidation time.
  • the ELISA to which the G11-6 antibody was immobilized had a large reaction with lightly oxidized LDL and a small reaction with unoxidized native-LDL and highly oxidized LDL.
  • the change in absorbance of the ELISA to which the G11-6 antibody is immobilized is different from any change in absorbance of the ELISA to which the anti-MDA-LDL antibody is immobilized and the ELISA to which the antioxidant phospholipid antibody is immobilized.
  • the G11-6 antibody recognizes a site different from the anti-MDA-LDL antibody and the antioxidant phospholipid antibody as an antigen in oxidized LDL.
  • the site of the G11-6 antibody as an antigen does not correlate with the lipid peroxide concentration responsible for reactivity to thiobarbituric acid and conjugated dienes and apolipoprotein B.

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Abstract

【課題】　酸化ＬＤＬに係る研究開発において、重要なツールとしての機能を果たし得る、軽度に酸化された酸化ＬＤＬに対するモノクローナル抗体を提供するとともに、そのモノクローナル抗体を用いて軽度に酸化された酸化ＬＤＬを簡便に検出するキットおよび被検者から採取した生体試料に含まれる軽度に酸化された酸化ＬＤＬを簡便に検出する方法を提供する。 【解決手段】　本発明に係るモノクローナル抗体は、モノクローナル抗体を固相化抗体とし、かつ抗アポリポタンパク質Ｂ抗体を検出用抗体とするＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）において、軽度に酸化された酸化低密度リポタンパク質と前記モノクローナル抗体との反応の度合いと比較して、高度に酸化された酸化低密度リポタンパク質と前記モノクローナル抗体との反応の度合いが小となり、かつ酸化低密度リポタンパク質に対し特異的に反応する。

Description

軽度に酸化された酸化低密度リポタンパク質に対するモノクローナル抗体およびこれを産生するハイブリドーマ
　本発明は、軽度に酸化された酸化低密度リポタンパク質に対するモノクローナル抗体、そのモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ、軽度に酸化された酸化低密度リポタンパク質検出用キットおよび被検者から採取した生体試料に含まれる軽度に酸化された酸化低密度リポタンパク質を検出する方法に関する。
　低密度リポタンパク質（Ｌｏｗ Ｄｅｎｓｉｔｙ Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ；ＬＤＬ）の酸化は、生体内における活性酸素の生成と消去とのバランスの崩壊による、活性酸素の過剰すなわち酸化ストレス状態となった場合に生じる。ＬＤＬはアポリポタンパク質Ｂと、コレステロール、リン脂質、中性脂肪などの脂質とが結合した巨大な分子であるが、ＬＤＬの酸化では、まず、構成脂質中の不飽和脂肪酸が活性酸素により酸化される。続いて、次々に連鎖的な酸化反応が起こり、共役ジエンを経て、過酸化脂質やアルデヒドが生成する。この連鎖的な酸化反応あるいは活性酸素による直接的な酸化反応によってアポリポタンパク質Ｂも酸化されて断裂する。これらの酸化反応の結果、ＬＤＬは球形の構造を失い、陰性荷電が増加し、受容体に対する親和性も変化して、正常なＬＤＬ（ｎａｔｉｖｅ－ＬＤＬ）とは異なる性質を有する酸化ＬＤＬとなる。
　酸化ＬＤＬは、動脈硬化病巣に存在することや、健常人と比較して、高脂血症や糖尿病、肝疾患などの患者血清中に高濃度で検出されることなどから、酸化ストレスが関与する種々の疾患に係る重要な物質であると考えられている。そこで、これらの疾患の解明、治療、診断、評価などに利用することを目的として、酸化ＬＤＬを特異的に認識する抗体が開発されている。
　例えば、動脈硬化病巣から精製した酸化ＬＤＬを免疫原として得た、酸化により切断された脂肪酸を有するリン脂質を抗原として認識する抗酸化リン脂質抗体（非特許文献１）や、血清中のｎａｔｉｖｅ－ＬＤＬから調製したマロンジアルデヒド修飾ＬＤＬ（ＭＤＡ－ＬＤＬ）を免疫原として得た抗ＭＤＡ－ＬＤＬ抗体（非特許文献２および非特許文献３）、血清中のｎａｔｉｖｅ－ＬＤＬからアセチル化ＬＤＬ、ＭＤＡ－ＬＤＬおよび金属酸化ＬＤＬを調製し、これらをそれぞれ等量含む溶液を免疫原として得た抗体（特許文献１）などを挙げることができる。
　ＬＤＬは酸化され得る部位を多数有する巨大な粒子であるため、その酸化の程度はさまざまである。一般に、生体において、血液中にはビタミンＣなど多くの抗酸化物質が存在していること、高度に酸化された酸化ＬＤＬ（高度酸化ＬＤＬ）は異物と認識されるために貪食細胞により速やかに除去されることなどから、特に血液中に存在する酸化ＬＤＬとしては軽度に酸化されたＬＤＬ（軽度酸化ＬＤＬ）が多く、血管壁や動脈硬化病巣などに存在する酸化ＬＤＬとしては高度酸化ＬＤＬが多いと考えられている。非特許文献１に記載された抗体が高度酸化ＬＤＬに対する抗体であり、軽度酸化ＬＤＬに対する抗体ではないということは前述の理由によると考えられる。
　一方、非特許文献２および非特許文献３に記載された抗体は、抗原として認識する部位がＬＤＬ内部に存在するため、サンプルの前処理を行って抗原部位を露出させる必要がある。
　さらに、非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３および特許文献１に記載された抗体は、いずれも血清中に存在する酸化ＬＤＬを免疫原として得られた抗体ではないため、血清サンプルや血漿サンプルに対して用いた場合には、擬陽性反応を生じ、感度が低く、薬剤投与や生活習慣の改善などによる効果を検出することは困難である。
特開平９－５３２３
Ｉｔａｂｅ Ｈ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、第２６９巻、第１５２７４～１５２７９頁、１９９４年 Ｋｏｔａｎｉ Ｋ．ら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．、第１２１５巻、第１２１～１２５頁、１９９４年 Ｋｏｔａｎｉ Ｋ．ら、臨床病理、第４５巻、第４７～５４頁、１９９７年
　本発明は、酸化ＬＤＬに係る研究開発において、重要なツールとしての機能を果たし得る、軽度に酸化された酸化ＬＤＬに対するモノクローナル抗体を提供するとともに、そのモノクローナル抗体を用いて軽度に酸化された酸化ＬＤＬを簡便に検出するキットおよび被検者から採取した生体試料に含まれる軽度に酸化された酸化ＬＤＬを簡便に検出する方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは、鋭意研究の結果、肝疾患患者の血清中に出現する軽度酸化ＬＤＬであるトリグリセリド高含有低密度リポタンパク質（ＴＧ－ｒｉｃｈ ＬＤＬ）を免疫原としてハイブリドーマを作製し、選択されたハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体が、軽度酸化ＬＤＬに対して反応の度合いが大きく、かつ高度酸化ＬＤＬに対して反応の度合いが小さいという性質を有することを見出し、下記の各発明を完成した。
（１）モノクローナル抗体を固相化抗体とし、かつ抗アポリポタンパク質Ｂ抗体を検出用抗体とするＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）において、下記（ａ）で示される抗原と前記モノクローナル抗体との反応の度合いと比較して、下記（ｂ）で示される抗原と前記モノクローナル抗体との反応の度合いが小となる、酸化低密度リポタンパク質に対し特異的に反応するモノクローナル抗体；（ａ）最終濃度０．４９３ｇ／Ｌの正常な低密度リポタンパク質（ｎａｔｉｖｅ－ＬＤＬ）に最終濃度３．２９μｍｏｌ／Ｌの硫酸銅を３７℃で０．５時間反応させて得られる金属酸化低密度リポタンパク質、（ｂ）最終濃度０．４９３ｇ／Ｌの正常な低密度リポタンパク質（ｎａｔｉｖｅ－ＬＤＬ）に最終濃度３．２９μｍｏｌ／Ｌの硫酸銅を３７℃で２４時間反応させて得られる金属酸化低密度リポタンパク質。
（２）酸化低密度リポタンパク質がトリグリセリド高含有低密度リポタンパク質（ＴＧ－ｒｉｃｈ ＬＤＬ）である、（１）に記載のモノクローナル抗体。
（３）酸化低密度リポタンパク質がヒトの酸化低密度リポタンパク質である、（１）または（２）に記載のモノクローナル抗体。
（４）健常者において酸化型のｓｍａｌｌ ｄｅｎｓｅ ＬＤＬと特異的に反応するモノクローナル抗体。
（５）非アルコール性脂肪性肝炎（Ｎｏｎ－ａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ；ＮＡＳＨ）患者においてｎａｔｉｖｅ－ＬＤＬと同様の粒子サイズの酸化ＬＤＬと特異的に反応するモノクローナル抗体。
（６）脂質異常症患者において酸化型のレムナントリポタンパク質と特異的に反応するモノクローナル抗体。
（７）配列番号１０のアミノ酸配列を含む可変領域を含んでなる、（１）から（６）のいずれかに記載のモノクローナル抗体。
（８）下記（ａ）の可変領域および／または（ｂ）の可変領域を含んでなる、（１）から（７）のいずれかに記載のモノクローナル抗体；（ａ）Ｎ末端から順に、配列番号８のアミノ酸配列、配列番号９のアミノ酸配列および配列番号１０のアミノ酸配列を含む可変領域、（ｂ）Ｎ末端から順に、配列番号１３のアミノ酸配列、配列番号１４のアミノ酸配列および配列番号１５のアミノ酸配列を含む可変領域。
（９）配列番号７のアミノ酸配列からなる可変領域を含んでなる、（１）から（８）のいずれかに記載のモノクローナル抗体。
（１０）配列番号１２のアミノ酸配列からなる可変領域を含んでなる、（１）から（９）のいずれかに記載のモノクローナル抗体。
（１１）受託番号がＮＩＴＥ ＢＰ－９１６であるハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体。
（１２）（１）から（１１）のいずれかに記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
（１３）受託番号がＮＩＴＥ ＢＰ－９１６である、（１２）に記載のハイブリドーマ。
（１４）（１）から（１１）のいずれかに記載のモノクローナル抗体を含んでなる、酸化低密度リポタンパク質検出用キット。
（１５）被検者から採取した生体試料に含まれる酸化低密度リポタンパク質を検出する方法であって、（１）から（１１）のいずれかに記載のモノクローナル抗体を、被検者から採取した生体試料に含まれる酸化低密度リポタンパク質に特異的に反応させて複合体を形成させる工程と、前記複合体を検出する工程とを有する、前記方法。
（１６）被検者から採取した生体試料に含まれる酸化低密度リポタンパク質を検出する方法であって、（１）から（１１）のいずれかに記載のモノクローナル抗体を担体に固着する工程と、担体に固着した前記モノクローナル抗体を、被検者から採取した生体試料に含まれる酸化低密度リポタンパク質に特異的に反応させて複合体を形成させる工程と、前記複合体を検出する工程とを有する、前記方法。
　本発明に係るモノクローナル抗体、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ、軽度に酸化された酸化ＬＤＬ検出用キットおよび被検者から採取した生体試料に含まれる軽度に酸化された酸化ＬＤＬを検出する方法によれば、ＴＧ－ｒｉｃｈ ＬＤＬをはじめとする酸化ＬＤＬが関与する様々な疾患の解明、治療、診断、評価などを、より効果的かつ簡便に行うことができるとともに、薬効に優れた医薬組成物の開発に寄与し、提供することができる。
上下左側の図は、いずれも、健常者（ｎ＝１）または肝疾患患者（ｎ＝１）の血清から超遠心により分離した総リポタンパク質画分について、ゲル濾過クロマトグラフィーを行った図である。一方、上下右側の図は、いずれも、そのゲル濾過クロマトグラフィーを行って得られた各溶出液における各脂質の濃度を測定した結果を示す図である。図中、ＴＣは総コレステロール、ＰＬはリン脂質、ＦＣは遊離コレステロール、ＴＧは中性脂肪を示す。また、いずれの図も、横軸はフラクションすなわちサイズを示し、横軸のプラス方向（右方向）に位置するほどサイズが小さいことを示す。 健常者（Ｎ）および肝疾患末期患者（Ｐ）の血清について、アガロースゲル電気泳動を行った結果を示す図である。 Ｇ１１－６抗体の重鎖可変領域（Ｇ１１－６－ＶＨ）のＤＮＡ配列についてＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ産物を含む溶液にＬｏａｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒを添加してＶＨ泳動用溶液とし、電気泳動を行った結果を示す図（左図）、およびＧ１１－６抗体の軽鎖可変領域（Ｇ１１－６－ＶＬ）のｃＤＮＡ配列についてＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ産物を含む溶液にＬｏａｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒを添加してＶＬ泳動用溶液とし、電気泳動を行った結果を示す図（右図）である。 Ｇ１１－６－ＶＨおよびＧ１１－６－ＶＬのアミノ酸配列について、既知のアミノ酸配列との相同性検索を行った結果、相同性が高かった最上位のものを示す図である。 Ｇ１１－６－ＶＨの相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ；ＣＤＲ）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列うち、ＣＤＲ１およびＣＤＲ２のアミノ酸配列について、既知のアミノ酸配列との相同性検索を行った結果、相同性が高かった最上位のものを示す図である。 Ｇ１１－６－ＶＨのＣＤＲ３およびＧ１１－６－ＶＬのＣＤＲ１のアミノ酸配列について、既知のアミノ酸配列との相同性検索を行った結果、相同性が高かった最上位のものを示す図である。 Ｇ１１－６－ＶＬのＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列について、既知のアミノ酸配列との相同性検索を行った結果、相同性が高かった最上位のものを示す図である。 肝疾患患者（ｎ＝１）血清および健常者（ｎ＝１）血清について、Ｇ１１－６抗体を固着させたＥＬＩＳＡ、抗酸化リン脂質抗体を固着させたＥＬＩＳＡおよび抗ＭＤＡ－ＬＤＬ抗体を固着させたＥＬＩＳＡを行った結果を示す図である。 健常者、軽中度肝疾患患者および重度肝疾患患者の血清について、アガロースゲル電気泳動を行った結果を示す図である。 健常者（ｎ＝１４）、軽中度群（ｎ＝６）および重度群（ｎ＝３）の血清について、Ｇ１１－６抗体を固着させたＥＬＩＳＡを行い測定した吸光度の値を、健常者群、軽中度群および重度群の群別に集計した結果を示す図である。 健常者（ｎ＝１）、脂質異常症患者（ｎ＝７）および肝疾患患者（ｎ＝１２）の血清について、Ｇ１１－６抗体を固着させたＥＬＩＳＡを行った結果を示す図（Ａ）、ならびに各サンプルの吸光度の測定値を、各サンプルの血清中ＬＤＬ－Ｃ濃度の値で除した結果を示す図（Ｂ）である。 肝疾患患者総リポタンパク質のゲル濾過溶出液について、ＴＣ濃度の測定、Ｇ１１－６抗体を固着させたＥＬＩＳＡ、抗酸化リン脂質抗体を固着させたＥＬＩＳＡおよび抗ＭＤＡ－ＬＤＬ抗体を固着させたＥＬＩＳＡを行った結果を示す図（Ａ）、ならびに健常者総リポタンパク質のゲル濾過溶出液について、ＴＣ濃度の測定、Ｇ１１－６抗体を固着させたＥＬＩＳＡ、抗酸化リン脂質抗体を固着させたＥＬＩＳＡおよび抗ＭＤＡ－ＬＤＬ抗体を固着させたＥＬＩＳＡを行った結果を示す図（Ｂ）である。 肝疾患患者（ｎ＝１）血清のゲル濾過溶出液について、ＴＣ濃度の測定、ＴＧ濃度の測定、ＰＬ濃度の測定、Ｇ１１－６抗体を固着させたＥＬＩＳＡおよび抗ＭＤＡ－ＬＤＬ抗体を固着させたＥＬＩＳＡを行った結果を示す図である。 ＮＡＳＨ患者（ｎ＝１）血清のゲル濾過溶出液について、ＴＣ濃度の測定、ＴＧ濃度の測定、ＰＬ濃度の測定、Ｇ１１－６抗体を固着させたＥＬＩＳＡおよび抗ＭＤＡ－ＬＤＬ抗体を固着させたＥＬＩＳＡを行った結果を示す図である。 脂質異常症患者（ｎ＝２）血清のゲル濾過溶出液について、ＴＣ濃度の測定、ＴＧ濃度の測定、ＰＬ濃度の測定、Ｇ１１－６抗体を固着させたＥＬＩＳＡおよび抗ＭＤＡ－ＬＤＬ抗体を固着させたＥＬＩＳＡを行った結果を示す図である。 健常者（ｎ＝２）血清のゲル濾過溶出液について、ＴＣ濃度の測定、ＴＧ濃度の測定、ＰＬ濃度の測定、Ｇ１１－６抗体を固着させたＥＬＩＳＡおよび抗ＭＤＡ－ＬＤＬ抗体を固着させたＥＬＩＳＡを行った結果を示す図である。 健常者血清から密度勾配遠心法により得られたＡ画分、Ｂ画分およびＣ画分について、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法を行った結果を示す図である。 ｎａｔｉｖｅ－ＬＤＬを酸化して得られる金属酸化ＬＤＬについて、その酸化時間を変化させて金属酸化ＬＤＬを調製し、その金属酸化ＬＤＬの溶液について、アガロースゲル電気泳動を行った結果を示す図である。 〈ａ－〉、〈ｂ－〉、〈ｃ－〉および〈ｄ－〉の金属酸化ＬＤＬについて、Ｇ１１－６抗体を固着させたＥＬＩＳＡを行った結果を示す図である。縦軸はＥＬＩＳＡの吸光度を、横軸はＥＬＩＳＡのサンプルとした金属酸化ＬＤＬの酸化時間をそれぞれ示す。 〈ａ－〉の金属酸化ＬＤＬについて、ＴＢＡＲＳ法により過酸化脂質濃度測定を行った結果およびＧ１１－６抗体を固着させたＥＬＩＳＡを行った結果を示す図（Ａ；縦軸はＥＬＩＳＡの吸光度および過酸化脂質濃度を、横軸はＥＬＩＳＡおよびＴＢＡＲＳ法のサンプルとした金属酸化ＬＤＬの酸化時間をそれぞれ示す）、ならびに〈ｃ－〉の金属酸化ＬＤＬについて、ＴＢＡＲＳ法により過酸化脂質濃度測定を行った結果およびＧ１１－６抗体を固着させたＥＬＩＳＡを行った結果を示す図（Ｂ；縦軸はＥＬＩＳＡの吸光度および過酸化脂質濃度を、横軸はＥＬＩＳＡおよびＴＢＡＲＳ法のサンプルとした金属酸化ＬＤＬの酸化時間をそれぞれ示す）である。 〈ａ－〉、〈ａ－１〉および〈ａ＋１〉の金属酸化ＬＤＬについて、Ｇ１１－６抗体を固着させたＥＬＩＳＡを行った結果を示す図（Ａ；縦軸はＥＬＩＳＡの吸光度を、横軸はＥＬＩＳＡのサンプルとした金属酸化ＬＤＬの酸化時間をそれぞれ示す）、ならびに〈ａ－〉、〈ａ－１〉および〈ａ＋１〉の金属酸化ＬＤＬについて、ＴＢＡＲＳ法により過酸化脂質濃度測定を行った結果を示す図（Ｂ；縦軸は過酸化脂質濃度を、横軸はＴＢＡＲＳ法のサンプルとした金属酸化ＬＤＬの酸化時間をそれぞれ示す）である。 〈ａ－〉、〈ａ－１〉、〈ａ＋１〉、〈ａ－１ｗ〉および〈ａ＋１ｗ〉の金属酸化ＬＤＬについて、Ｇ１１－６抗体を固着させたＥＬＩＳＡを行った結果を示す図である。縦軸はＥＬＩＳＡの吸光度を、横軸はＥＬＩＳＡのサンプルとした金属酸化ＬＤＬの酸化時間をそれぞれ示す。 金属酸化ＬＤＬについて、Ｇ１１－６抗体を固着させたＥＬＩＳＡ、抗酸化リン脂質抗体を固着させたＥＬＩＳＡ、抗ＭＤＡ－ＬＤＬ抗体を固着させたＥＬＩＳＡ、抗アポリポタンパク質Ｂ抗体を固着させたＥＬＩＳＡ、ＴＢＡＲＳ法による過酸化脂質濃度測定および共役ジエンの測定を行った結果を示す図である。縦軸はＥＬＩＳＡおよび共役ジエン測定の吸光度と過酸化脂質濃度とを、横軸はサンプルとした金属酸化ＬＤＬの酸化時間をそれぞれ示す。
　以下、本発明に係る軽度に酸化された酸化ＬＤＬに対するモノクローナル抗体、そのモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ、軽度に酸化された酸化ＬＤＬ検出用キットおよび被検者から採取した生体試料に含まれる軽度に酸化された酸化ＬＤＬを検出する方法について詳細に説明する。本発明に係る軽度に酸化された酸化ＬＤＬに対するモノクローナル抗体は、軽度に酸化された酸化ＬＤＬに対する反応の度合いが大であるとともに高度に酸化された酸化ＬＤＬに対する反応の度合いが小である性質を有するモノクローナル抗体である。
　以下、本明細書において、「軽度酸化ＬＤＬ」とは、酸化反応により生じた過酸化脂質やアルデヒド、断裂したアポリポタンパク質Ｂなどの酸化物を比較的少数有し、ｎａｔｉｖｅ－ＬＤＬと比較して陰性荷電が大きい酸化ＬＤＬ、すなわち軽度に酸化された酸化ＬＤＬのことをいい、「高度酸化ＬＤＬ」とは、酸化反応により生じた過酸化脂質やアルデヒド、断裂したアポリポタンパク質Ｂなどの酸化物を比較的多数有し、ｎａｔｉｖｅ－ＬＤＬと比較して陰性荷電が顕著に大きい酸化ＬＤＬ、すなわち高度に酸化された酸化ＬＤＬのことをいう。
　本発明において軽度酸化ＬＤＬおよび高度酸化ＬＤＬは、いずれも定法に従い調製することができ、例えば、金属を用いて血清中のｎａｔｉｖｅ－ＬＤＬを酸化することにより調製することができる。この場合、ｎａｔｉｖｅ－ＬＤＬに作用させる金属の濃度または作用させる時間に比例して、得られる酸化ＬＤＬの酸化度は高くなる。例えば、最終濃度が約０．４９３ｇ／Ｌのｎａｔｉｖｅ－ＬＤＬに最終濃度が約３．２９μｍｏｌ／Ｌの硫酸銅を３７℃でＨ１時間（０＜Ｈ１＜２４）反応させることにより、最終濃度が約０．４９３ｇ／Ｌのｎａｔｉｖｅ－ＬＤＬに最終濃度が約６．５７９μｍｏｌ／Ｌの硫酸銅を３７℃でＨ２時間（０＜Ｈ２＜８）反応させることにより、最終濃度が約０．４７６ｇ／Ｌのｎａｔｉｖｅ－ＬＤＬに最終濃度が約２３．８１μｍｏｌ／Ｌの硫酸銅を３７℃でＨ３時間（０＜Ｈ３＜８）反応させることにより、あるいは最終濃度が約０．４７６ｇ／Ｌのｎａｔｉｖｅ－ＬＤＬに最終濃度が約４７．６２μｍｏｌ／Ｌの硫酸銅を３７℃でＨ４時間（０＜Ｈ４＜８）反応させることにより、軽度酸化ＬＤＬを得ることができ、最終濃度０．４９３ｇ／Ｌのｎａｔｉｖｅ－ＬＤＬに最終濃度３．２９μｍｏｌ／Ｌの硫酸銅を３７℃で少なくとも２４時間反応させることにより、最終濃度が約０．４９３ｇ／Ｌのｎａｔｉｖｅ－ＬＤＬに最終濃度が約６．５７９μｍｏｌ／Ｌの硫酸銅を３７℃でＨ５時間（Ｈ５≧８）反応させることにより、最終濃度が約０．４７６ｇ／Ｌのｎａｔｉｖｅ－ＬＤＬに最終濃度が約２３．８１μｍｏｌ／Ｌの硫酸銅を３７℃でＨ６時間（Ｈ６≧８）反応させることにより、あるいは最終濃度が約０．４７６ｇ／Ｌのｎａｔｉｖｅ－ＬＤＬに最終濃度が約４７．６２μｍｏｌ／Ｌの硫酸銅を３７℃でＨ７時間（Ｈ７≧８）反応させることにより、高度酸化ＬＤＬを得ることができる。
　本発明において、モノクローナル抗体が、軽度酸化ＬＤＬに対する反応の度合いが大であるとともに高度酸化ＬＤＬに対する反応の度合いが小である性質を有するか否かは、例えば、モノクローナル抗体を固相化抗体とし、かつ抗アポリポタンパク質Ｂ抗体を検出用抗体とするＥＬＩＳＡにより確認することができる。すなわち、このＥＬＩＳＡにおいて、軽度酸化ＬＤＬをサンプルとした場合の反応の度合いと比較して、高度酸化ＬＤＬをサンプルとした場合の反応の度合いが小となれば、固相化抗体に用いたモノクローナル抗体は、軽度酸化ＬＤＬに対する反応の度合いが大であるとともに高度酸化ＬＤＬに対する反応の度合いが小である性質を有することとなる。
　本発明において軽度酸化ＬＤＬは、ヒト、マウス、ラット、サル（ヒトを除く霊長目）、ヤギ、イヌ、ブタ、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ニワトリなどの哺乳類や鳥類の軽度酸化ＬＤＬを挙げることができるが、ヒトの軽度酸化ＬＤＬであることが好ましい。また、軽度酸化ＬＤＬはＴＧ－ｒｉｃｈ ＬＤＬであることが好ましい。
　ＴＧ－ｒｉｃｈ ＬＤＬは、少なくとも肝疾患患者血清中に出現するＬＤＬである。ＴＧ－ｒｉｃｈ ＬＤＬは中性脂肪であるトリアシルグリセロール（トリグリセリド、トリ－Ｏ－アシルグリセリン；ＴＧ，ＴＡＧ）の含有量が高いことを特徴とし、この点で、コレステロールの含有量が高い正常なＬＤＬ（ｎａｔｉｖｅ－ＬＤＬ）とは異なるリポタンパク質である。肝疾患の進行に伴いＴＧ－ｒｉｃｈ ＬＤＬの血清中濃度は増加し、肝疾患の末期では血清中に存在するリポタンパク質の大部分を占めるのに対し、超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）、ｎａｔｉｖｅ－ＬＤＬおよび高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）の血清中濃度は極端に減少する（Ｎａｇａｓａｋａ Ｈ．ら、Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒ、第１４６巻、第３２９～３３５頁、２００５年）。
　また、ＴＧ－ｒｉｃｈ ＬＤＬは培養マクロファージを泡沫化する。そして、ＴＧ－ｒｉｃｈ ＬＤＬによるマクロファージ泡沫化率と酸化ＬＤＬの一種であるマロンジアルデヒド修飾ＬＤＬ（ＭＤＡ－ＬＤＬ）の血清中濃度とが正比例すること（Ｎａｇａｓａｋａ Ｈ．ら、Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒ、第１４６巻、第３２９～３３５頁、２００５年）、健常者血漿中には過酸化ＴＧがほとんど検出されないのに対し、肝疾患患者血漿中には、過酸化ＴＧの著しい増加が見られること（Ｈｕｉ ＳＰ．ら、Ｌｉｐｉｄｓ、第３８巻、第１２８７～１２９２頁、２００３年）などから、ＴＧ－ｒｉｃｈ ＬＤＬは酸化ＬＤＬの一種であるとされている。さらに、血清中において、高度酸化ＬＤＬは多量に存在し得ないが、肝疾患患者血清中において、ＴＧ－ｒｉｃｈ ＬＤＬは多量に存在することから、ＴＧ－ｒｉｃｈ ＬＤＬは軽度酸化ＬＤＬの一種と考えられている。
　ＴＧ－ｒｉｃｈ ＬＤＬは、ｎａｔｉｖｅ－ＬＤＬと比較してＴＧの重量割合が大きいＬＤＬである。また、ＴＧ－ｒｉｃｈ ＬＤＬは、マクロファージを泡沫化するＬＤＬである。このようなＴＧ－ｒｉｃｈ ＬＤＬには、中間比重リポタンパク質｛Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ Ｄｅｎｓｉｔｙ Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ；ＩＤＬ（ミッドバンドともいい、分画としてＩＤＬに相当するレムナントリポタンパク質が含まれる）｝の酸化型のもの（すなわち酸化型のレムナントリポタンパク質が含まれる）の他、ｓｍａｌｌ ｄｅｎｓｅ ＬＤＬ（ｓｄ－ＬＤＬ、変性ＬＤＬ）といわれる、粒子径が２５．５ｎｍ以下であり、比重で分画した場合に１．０４０～１．０６３のＬＤＬに相当するリポタンパク質の酸化型のものが含まれる。
　ここで、ＴＧ－ｒｉｃｈ ＬＤＬにおけるＴＧの重量割合について測定した結果の典型例を図１および表１に示す。図１の上下左側の図は、それぞれ、健常者（上図）および肝疾患患者（下図）の血清から超遠心法により分離した総リポタンパク質画分について、２８０ｎｍの吸光度を測定しながらゲル濾過クロマトグラフィーを行った結果を示す図であり、図１の上下右側の図は、それぞれ、健常者（上図）および肝疾患患者（下図）の血清から超遠心法により分離した総リポタンパク質画分についてゲル濾過クロマトグラフィーを行い、得られた各溶出液について各脂質の濃度を測定した結果を示す図である。一方、表１は、肝疾患患者４名および健常者７名について上記の方法により各脂質の濃度を測定し、平均値と標準偏差を算出した結果を示している。
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　図１の上下左側の図に示すように、肝疾患患者においてはＶＬＤＬおよびＨＤＬが消失し、ｎａｔｉｖｅ－ＬＤＬと同様の粒子サイズを有するＴＧ－ｒｉｃｈ ＬＤＬが高濃度に存在する。その高濃度に存在するＴＧ－ｒｉｃｈ ＬＤＬにおけるＴＧの重量割合は、図１右側および表１に示すように、ｎａｔｉｖｅ－ＬＤＬにおけるＴＧの重量割合と比較して明らかに大きい。しかしながら、表１に示すように、ＴＧ－ｒｉｃｈ ＬＤＬにおける各脂質重量割合の標準偏差の値が大きいことから、ＴＧ－ｒｉｃｈ ＬＤＬにおけるＴＧの重量割合には、ある程度のばらつきがあることがわかる。
　また、ＴＧ－ｒｉｃｈ ＬＤＬの粒子サイズは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法や高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法などにより測定することにより、ｎａｔｉｖｅ－ＬＤＬに近似した結果が得られるが、被検者の個体差や疾患の重症度などにより、ある程度異なる場合がある。
　ＴＧ－ｒｉｃｈ ＬＤＬの電荷については、アガロースゲル電気泳動法などにより測定することにより、ｎａｔｉｖｅ－ＬＤＬに近似した結果またはｎａｔｉｖｅ－ＬＤＬと比較してやや負電荷であることを示す結果が得られるが、被検者の個体差や疾患の重症度などにより、ある程度異なる場合がある。
　ＴＧ－ｒｉｃｈ ＬＤＬは、肝疾患患者の血清から採取されるが、肝疾患のみならず、種々の疾患、特に、酸化ストレスの関与する疾患の患者やその罹患が疑われる者の血清に存在すると考えられている。そのような疾患としては、例えば、急性肝炎、慢性肝炎、肝硬変、肝線維症、良性反復性肝内胆汁うっ滞症、胆道閉鎖症、脂肪性肝炎、非アルコール性脂肪肝炎（Ｎｏｎ－ａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ；ＮＡＳＨ）などの肝疾患の他、高コレステロール血症、高ＬＤＬコレステロール血症、低ＨＤＬコレステロール血症、高トリグリセリド血症などの脂質異常症、脳梗塞、虚血性心疾患、大動脈瘤、腎硬化症、閉塞性動脈硬化症などの動脈硬化性疾患、糖尿病、高血圧症などを挙げることができる。
　抗体は、一般に、軽鎖（Ｌ鎖；分子量約２５，０００）および重鎖（Ｈ鎖；分子量約５０，０００～７７，０００）の各２本ずつのポリペプチドが互いにジスルフィド結合で結合したＹ字型のヘテロテトラマーを基本構造としている。Ｙ字型の先端部分を可変領域といい、それ以外の部分を定常領域という。また、軽鎖の可変領域をＶＬ領域、重鎖の可変領域をＶＨ領域という。可変領域は抗原認識部位であり、そのアミノ酸配列は抗体の種類ごとに変化に富む。一方、定常領域のアミノ酸配列は抗体間で比較的変化が少ない。可変領域のうち、直接抗原と接触して抗原に対する結合の中心的役割を担う領域は抗体間におけるアミノ酸配列の変化が特に大きく、この領域を相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ：ＣＤＲ）または超可変領域という。また、可変領域のうちのＣＤＲ以外の領域をフレームワーク領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｇｉｏｎ：ＦＲ）という。一般に、可変領域には、３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）と、３つのＣＤＲを取り囲む４つのＦＲ（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４が存在することが知られている。
　本発明における可変領域（ＶＨ領域およびＶＬ領域）は、本発明に係るモノクローナル抗体が軽度酸化ＬＤＬに対する反応の度合いが大であるとともに高度酸化ＬＤＬに対する反応の度合いが小である性質を有する限り、健常者において酸化型のｓｍａｌｌ ｄｅｎｓｅ ＬＤＬと特異的に反応する性質を有する限り、ＮＡＳＨ患者においてｎａｔｉｖｅ－ＬＤＬと同様の粒子サイズの酸化ＬＤＬと特異的に反応する性質を有する限り、または脂質異常症患者において酸化型のレムナントリポタンパク質と特異的に反応する性質を有する限り、いかなるアミノ酸配列からなるものでもよい。なお、本発明における可変領域（ＶＨ領域およびＶＬ領域）のアミノ酸配列の態様としては、例えば、下記（ｉ）～（ｖ）を挙げることができる。
（ｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列、
（ｉｉ）Ｎ末端から順に、配列番号８のアミノ酸配列、配列番号９のアミノ酸配列および配列番号１０のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列、
（ｉｉｉ）Ｎ末端から順に、配列番号１３のアミノ酸配列、配列番号１４のアミノ酸配列および配列番号１５のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列、
（ｉｖ）配列番号７のアミノ酸配列、
（ｖ）配列番号１２のアミノ酸配列。
　なお、本発明において、可変領域のアミノ酸配列は、常法に従い確認することができる。そのような方法としては、例えば、まず、後述する本発明に係るモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマからＲＮＡを抽出して、逆転写反応を行ってｃＤＮＡを得る。次にこのｃＤＮＡを鋳型として、可変領域の増幅に適した既知の配列のプライマーを用いて可変領域のｃＤＮＡ配列をＰＣＲにより増幅し、必要に応じてクローニングを行った後、シークエンサーを用いてシークエンスを行うことによりＤＮＡ配列を決定する。最後に、決定した可変領域のＤＮＡ配列をトリプレットコドンに従いアミノ酸配列に変換することにより確認することができる。
　なお、本発明において、「反応する」は、「相互作用する」、「結合する」、「認識する」と交換可能に用いられる。また、本発明において、抗体が、ある特定の抗原（免疫原）に対し「特異的に反応する」とは、前記特定抗原に対して反応性があることが明らかであればよい。前記特定抗原に対し「特異的に反応する」とは、他の抗原に全く反応しない場合も含むが、他の抗原に対し反応するとともに前記特定抗原に対し顕著に反応する場合も含む。
　次に、本発明に係るハイブリドーマは、本発明に係るモノクローナル抗体を産生する。本発明に係るハイブリドーマの作製は、当業者により適宜選択可能な任意の方法を用いて行うことができる。そのような方法としては、例えば、ハイブリドーマ法（Ｎａｔｕｒｅ、第２５６巻、第４９５－４９７頁、１９７５年）、トリオーマ法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ、第４巻、第７２頁、１９８３年）およびＥＢＶ－ハイブリドーマ法（ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ ＡＮＤ ＣＡＮＣＥＲ ＴＨＥＲＡＰＹ、第７７－９６頁、Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．、１９８５年）などの方法の他、下記（ｉ）～（ｉｖ）のステップを有する方法を挙げることができる。
（ｉ）まず、免疫原を調製する。免疫原は、どのような方法により調製してもよいが、本発明においては、血清からＴＧ－ｒｉｃｈ ＬＤＬ画分を分離した後、限外濾過により濃縮し、続いて透析することにより調製することができる。ここで、血清にＴＧ－ｒｉｃｈ ＬＤＬが含まれることを確認する方法としては、当業者により適宜選択可能な方法を挙げることができるが、そのような方法として、アガロースゲル電気泳動法を挙げることができる。本発明においては、被検者血清および健常者血清をアガロースゲル電気泳動に供することにより、被検者血清においてα位のバンドが検出されず、かつ健常者血清と比較して陽極側に移動した位置でβ位のバンドが検出された場合に、その被検者血清にはＴＧ－ｒｉｃｈ ＬＤＬが含まれると判定することができる。
　また、血清からＴＧ－ｒｉｃｈ ＬＤＬ画分を分離する方法としては、当業者により適宜選択可能な方法を挙げることができるが、そのような方法としては、例えば、既報（Ｃｈｉｂａ Ｈ．ら、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．、第３８巻、第１２０４－１２１６頁、１９９７年／Ｈｉｒａｎｏ Ｔ．ら、Ｊ．Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ、第１２巻、第６７～７２頁、２００５年）に従い、密度勾配遠心法を用いて血清から分離した総リポタンパク質画分をゲル濾過クロマトグラフィーに供することにより、ＴＧ－ｒｉｃｈ ＬＤＬ画分を分離する方法を挙げることができる。
（ｉｉ）次に、分離したＴＧ－ｒｉｃｈ ＬＤＬ画分を免疫原として動物を免疫する。免疫は、適宜常法を用いて行うことができる。また、免疫の対象となる動物は特に限定されないが、例えば、マウス、ラット、サル（ヒトを除く霊長目）、ヤギ、イヌ、ブタ、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ニワトリなどを挙げることができる。
（ｉｉｉ）続いて、免疫した動物から抗体産生細胞を採取する。抗体産生細胞としては、例えば、脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血細胞などを挙げることができる。さらに、ハイブリドーマを得るため、採取した抗体産生細胞を他の細胞と融合させる。抗体産生細胞を採取する方法および細胞の融合方法は、当業者が適宜選択可能な方法を挙げることができる。また、抗体産生細胞に融合させる細胞としては、増殖能力の強い細胞を用いることが好ましく、例えば、一般に入手可能なミエローマ細胞の細胞株を使用することができる。なお、使用する細胞株は、薬剤選択性を有し、未融合の状態ではＨＡＴ選択培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジンを含む）で生存できず、抗体産生細胞と融合した状態でのみ生存できる性質を有するものが好ましい。
（ｉｖ）次に、作製したハイブリドーマから、ｎａｔｉｖｅ－ＬＤＬに対しては反応の度合いが小さく、かつ金属酸化ＬＤＬに対しては反応の度合いが大きいモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングする。スクリーニングは、ＥＬＩＳＡ法やイムノブロット法などの常法を用いて、当業者が適宜選択可能な手法により行うことができる。ＥＬＩＳＡ法を用いてスクリーニングする場合は、例えば、ｎａｔｉｖｅ－ＬＤＬを固着させたＥＬＩＳＡをハイブリドーマの培養上清について行い、適当な標識をした抗（免疫動物）抗体によりＥＬＩＳＡの反応を検出し、ｎａｔｉｖｅ－ＬＤＬに対しては反応の度合いが小さく、かつ金属酸化ＬＤＬに対しては反応の度合いが大きい培養上清を特定することにより、ハイブリドーマを特定することができる。
　上記（ｉ）～（ｉｖ）のステップを有する方法により得られたハイブリドーマを本発明に係るハイブリドーマとすることができるが、クローニングないしスクリーニングをさらに行うことにより細胞を純化し、本発明に係るハイブリドーマとすることができる。そのようなクローニングないしスクリーニング方法としては、例えば、限界希釈法、トリプシン濾紙法、ペニシリンキャップ法などの方法を挙げることができる。
　また、このようにして得られたハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体を本発明に係るモノクローナル抗体とすることができる他、前記方法のステップ（ｉｉｉ）において採取される抗体産生細胞が産生するモノクローナル抗体を本発明に係るモノクローナル抗体とすることができる。ハイブリドーマまたは抗体産生細胞からモノクローナル抗体を抽出する方法としては、例えば、細胞培養法や腹水形成法などの常法を挙げることができる。抽出したモノクローナル抗体は、例えば、硫安塩析法、ＨＰＬＣ、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどの公知の方法を適宜選択し、またはこれらを組み合わせることにより精製することができる。
　得られたモノクローナル抗体のクラスの判定は、適宜常法に従って行うことができ、例えば、免疫した動物がマウスの場合は、ＩｓｏＳｔｒｉｐマウスモノクローナル抗体アイソタイピングキット（Ｒｏｃｈｅ社）などを用いて行うことができる。なお、本発明に係るモノクローナル抗体のクラスは、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤおよびＩｇＥのいずれも用いることができる。
　本発明に係るモノクローナル抗体は、必要に応じて、ビオチン、放射性同位元素、蛍光物質、酵素などにより標識して用いることができる。また、必要に応じて、ポリスチレン製プレート、ポリプロピレン製プレート、シリコン製プレート、ポリスチレン製マイクロビーズ、磁気ビーズ、ラテックス粒子などの担体に固着させて用いることができる。
　また、本発明に係るモノクローナル抗体は、必要に応じて、ヒト免疫グロブリン産生能を有する動物に免疫することにより、ヒト抗体として得ることができる他、遺伝子工学的手法を用いて、免疫動物由来の可変部とヒト由来の定常部とからなるキメラ抗体として得ることもでき、免疫動物由来の超可変部を有し、それ以外の抗体部分はヒト由来であるヒト化抗体として得ることもできる。
　なお、本発明に係るモノクローナル抗体として、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに２０１０年３月１７日付で受託されており、受託番号がＮＩＴＥ ＢＰ－９１６であるハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体を挙げることができるが、これに限定されるものではない。同様に、本発明に係るハイブリドーマとして、上記の受託番号がＮＩＴＥ ＢＰ－９１６であるハイブリドーマを挙げることができるが、これに限定されるものではない。
　すなわち、後述する実施例に示されるように、健常者において酸化型のｓｍａｌｌ ｄｅｎｓｅ ＬＤＬと特異的に反応するモノクローナル抗体、ＮＡＳＨ患者においてｎａｔｉｖｅ－ＬＤＬと同様の粒子サイズの酸化ＬＤＬと特異的に反応するモノクローナル抗体および脂質異常症患者において酸化型のレムナントリポタンパク質と特異的に反応するモノクローナル抗体も、本発明に係るモノクローナル抗体に包含される。
　本発明において、「健常者」とは、障害がなく健康な人（岩波書店　広辞苑　第六版）の他、少なくとも酸化ＬＤＬが関与する疾患に罹患していない人をいう。
　次に、本発明は、本発明に係る軽度に酸化された酸化ＬＤＬ検出用キットを提供する。本発明に係るキットは、本発明に係るモノクローナル抗体を含んでなるが、二次抗体、標識物質その他の免疫学的検出手段の実施に有用な物質、緩衝液、器具など、その特徴を損なわない限りにおいて、その構成物として含んでもよい。
　さらに、本発明は、被検者から採取した生体試料に含まれる軽度に酸化された酸化ＬＤＬを検出する方法を提供する。なお、本発明に係る軽度に酸化された酸化ＬＤＬを検出する方法には、本発明に係る軽度に酸化された酸化ＬＤＬの検出方法を損なわない限り、インキュベート工程や洗浄工程などを含んでいてもよい。
　本発明に係る軽度に酸化された酸化ＬＤＬを検出する方法は、被検者から採取した生体試料に含まれる酸化ＬＤＬを検出する方法であって、
（ｉ）本発明に係るモノクローナル抗体を、被検者から採取した生体試料に含まれる酸化ＬＤＬに特異的に反応させて複合体を形成させる工程（複合体形成工程）
（ｉｉ）前記複合体を検出する工程（検出工程）
　以上（ｉ）および（ｉｉ）の工程を有する。
　（ｉ）複合体形成工程において複合体を形成させる方法としては、当業者が適宜選択可能な任意の方法を挙げることができる。そのような方法としては、例えば、本発明に係るモノクローナル抗体を含む溶液と生体試料とを混合させて複合体を形成させる方法の他、生体試料を担体に固着させて本発明に係るモノクローナル抗体を含む溶液と反応させる方法、本発明に係るモノクローナル抗体を担体に固着させて生体試料と反応させる方法などを挙げることができる。
　（ｉｉ）検出工程において複合体を検出する方法としては、ＥＬＩＳＡ法、間接抗体法、ラテックス凝集法、比濁法、ＣＬＥＩＡ法などの常法の他、例えば、モノクローナル抗体あるいは生体試料に予め標識をし、この標識を検出する方法を挙げることができる。
　次に、本発明に係る軽度に酸化された酸化ＬＤＬを検出する方法の異なる態様は、被検者から採取した生体試料に含まれる酸化ＬＤＬを検出する方法であって、
（ｉ）本発明に係るモノクローナル抗体を担体に固着する工程（固着工程）
（ｉｉ）担体に固着した前記モノクローナル抗体を、被検者から採取した生体試料に含まれる酸化ＬＤＬに特異的に反応させて複合体を形成させる工程（固着複合体形成工程）
（ｉｉｉ）前記複合体を検出する工程（固着複合体検出工程）
　以上（ｉ）～（ｉｉｉ）の工程を有する。
　（ｉ）固着工程において、本発明に係るモノクローナル抗体を固着する担体は任意のものを用いることができ、そのような担体としては、例えば、上述の担体と同様のものを挙げることができる。また、固着する方法は特に限定されず、用いる担体により適宜設定して行うことができる。
　（ｉｉ）固着複合体形成工程および（ｉｉｉ）固着複合体検出工程における、固着複合体を形成させる方法および固着複合体を検出する方法としては、上述の（ｉ）複合体形成工程および（ｉｉ）検出工程と同様の方法を挙げることができる。
　本発明に係る軽度に酸化された酸化ＬＤＬ検出用キットおよび軽度に酸化された酸化ＬＤＬを検出する方法は、肝疾患のみならず酸化ＬＤＬが関与する種々の疾患の解明、診断、重症度の評価、治療効果の評価の他、リポタンパク質の酸化度の評価などに用いることが可能である。
　以下、本発明に係る軽度に酸化された酸化ＬＤＬに対するモノクローナル抗体、そのモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ、軽度に酸化された酸化ＬＤＬ検出用キットおよび被検者から採取した生体試料に含まれる軽度に酸化された酸化ＬＤＬを検出する方法について、実施例に基づいて説明する。なお、本発明の技術的範囲は、これらの実施例によって示される特徴に限定されない。
＜実施例１＞ＴＧ－ｒｉｃｈ ＬＤＬを免疫原とするモノクローナル抗体の作製
（１）アガロースゲル電気泳動によるＴＧ－ｒｉｃｈ ＬＤＬの確認
　肝疾患末期患者１名および健常者１名から採取した血液を室温で１時間静置した後、３５００ｒｐｍ、４℃の条件下で１０分間遠心分離を行うことにより、肝疾患末期患者血清および健常者血清を得た。得られた血清を１．５μＬずつアガロースゲル（ユニバーサルゲル／８；ヘレナ研究所社）に塗布し、ｐＨ８．６、イオン強度０．０６のバルビタール緩衝液中において、１００Ｖ、１５０Ｗで４５分間電気泳動を行った後、ドライヤーを用いてゲルを乾燥させた。続いて、０．０３％（ｗ／ｖ）のＦａｔ Ｒｅｄ ７Ｂ（ヘレナ研究所社）を含むメタノール２０ｍＬにＴｒｉｔｏｎＸ－１００を２滴加え、さらに０．１ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウム水溶液を４ｍＬ加えることにより調製した染色液に、乾燥させたゲルを１０分間浸漬して染色を行った後、７５％（ｖ／ｖ）メタノール水溶液に１０秒間浸漬することにより脱色を行った。
　図２に示すように、健常者血清（Ｎ）ではＨＤＬに相当するα位およびＬＤＬに相当するβ位にそれぞれバンドが検出された。一方、肝疾患末期患者血清（Ｐ）ではα位のバンドは検出されなかった。また、健常者血清（Ｎ）のβ位のバンドに比して、肝疾患末期患者血清（Ｐ）では陽極側に移動した位置でβ位のバンドが検出された。これらの結果から、この肝疾患末期患者血清にはＨＤＬが含まれず、かつＴＧ－ｒｉｃｈ ＬＤＬが含まれることが確認された。
（２）免疫原の調製
［２－１］密度勾配遠心法による総リポタンパク質画分の分離
　本実施例（１）でＴＧ－ｒｉｃｈ ＬＤＬが含まれることが確認された肝疾患末期患者血清について、既報（Ｃｈｉｂａ Ｈ．ら、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．、第３８巻、第１２０４－１２１６頁、１９９７年／Ｈｉｒａｎｏ Ｔ．ら、Ｊ．Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ、第１２巻、第６７～７２頁、２００５年）に従って密度勾配遠心法を行い、総リポタンパク質画分を得た。具体的には、本実施例（１）の肝疾患末期患者血清に５，５’－ジチオビス（２－ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ；和光純薬工業社）およびＥＤＴＡ－２Ｎａ（同仁化学研究所社）をそれぞれ０．７ｍｍｏｌ／Ｌおよび２．７ｍｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ７．４）となるよう加え、さらに適量の臭化カリウム（関東化学社）を加えることにより比重ｄがｄ＝１．２２５ｋｇ／Ｌとなるように調整し、サンプル溶液とした。続いて、０．２０ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム、０．２７ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡ－２Ｎａ（ｐＨ７．４）および１ｍｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウムを含む水溶液（ｄ＝１．００６ｋｇ／Ｌ）に、適量の臭化カリウム（関東化学社）を加えることにより比重ｄがｄ＝１．２２５ｋｇ／Ｌとなるように調整し、比重液とした。サンプル溶液１２ｍＬを遠心管（４０ＰＡ；日立工機社）に入れ、比重液を満たし、超遠心機ｈｉｍａｃ ＣＰ６０Ｅ ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ（日立工機社）およびローターＲＰＶ－５０Ｔ ｒｏｔｏｒ（日立工機社）を用いて、４００００ｒｐｍ、１５℃の条件下で１８時間遠心分離を行って、上層（ｄ＜１．２２５ｋｇ／Ｌ）を総リポタンパク質画分として回収した。回収した総リポタンパク画分約８ｍＬを、アミコン攪拌式セルＭｏｄｅｌ ８０５０（ミリポア社）および限外濾過膜アミコンＸＭ５０（ミリポア社）を用いて、付属の使用書に従い、窒素ガス雰囲気下で２～３ｍＬに濃縮した。　
［２－２］ゲル濾過クロマトグラフィーによるＴＧ－ｒｉｃｈ ＬＤＬ画分の分離
　本実施例（２）［２－１］の総リポタンパク質画分について、既報（Ｃｈｉｂａ Ｈら、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．、第３８巻、第１２０４～１２１６頁、１９９７年／Ｈｉｒａｎｏ Ｔ．ら、Ｊ．Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ、第１２巻、第６７～７２頁、２００５年）に従ってゲル濾過クロマトグラフィーを行い、ＴＧ－ｒｉｃｈ ＬＤＬ画分を得た。具体的には、以下の器具、試薬および条件を用いて、２８０ｎｍの吸光度を計測しながらゲル濾過クロマトグラフィーを行い、溶出液を３ｍＬずつ分取した。
　サンプル；本実施例（２）［２－１］の総リポタンパク画分２～３ｍＬ（カラム負荷量）
　カラム　；Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ－４Ｂ（ＧＥヘルスケア社）
　緩衝液　；０．１５ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ、０．２７ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡ－２Ｎａ　　　　　　および３ｍｍｏｌ／ＬのＮａＮ３を含む５ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ－ＨＣｌ　　　　　　緩衝液（ｐＨ７．４）２００ｍＬ
　条件　　；クロマトチャンバー　４℃
　　　　　　流速　０．１５ｍＬ／分
　分取した溶出液のうち、吸光度のピークの前後９ｍＬ（３ｍＬ×３画分）ずつ溶出液を集め、ＴＧ－ｒｉｃｈ ＬＤＬ画分１８ｍＬ（３ｍＬ×６画分）を得た。
［２－３］ＴＧ－ｒｉｃｈ ＬＤＬ画分の濃縮および透析
　本実施例（２）［２－２］のＴＧ－ｒｉｃｈ ＬＤＬ画分１８ｍＬを、アミコン攪拌式セルＭｏｄｅｌ ８０５０（ミリポア社）および限外濾過膜アミコンＸＭ５０（ミリポア社）を用いて、付属の使用書に従い、窒素ガス雰囲気下で２～３ｍＬに濃縮した。その後、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）を透析液として、透析膜（セルロースチューブ２０／３２；三光純薬社）を用いて、４℃で一晩透析し、ＴＧ－ｒｉｃｈ ＬＤＬ溶液２～３ｍＬを得た。透析中、透析液の交換を３回行った。
［２－４］ＴＧ－ｒｉｃｈ ＬＤＬ溶液のタンパク質濃度測定
　本実施例（２）［２－３］のＴＧ－ｒｉｃｈ ＬＤＬ溶液について、既報に従い、Ｌｏｗｒｙ変法を用いてタンパク質濃度を測定した（Ｍａｒｋｗｅｌｌ ＭＡ．ら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、第８７巻、第２０６～２１０頁、１９７８年）。具体的には、２％（ｗ／ｖ）の炭酸ナトリウム、０．４％（ｗ／ｖ）の水酸化ナトリウム、０．１６％（ｗ／ｖ）の酒石酸塩および１％（ｗ／ｖ）のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含む水溶液を調製し、この水溶液と４％（ｗ／ｖ）の硫酸銅水溶液とを体積比１００：１に混合した溶液を反応溶液として調製した。また、脱イオン水に等量のフェノール試薬（フォーリン・チオカルト試薬；和光純薬社）を混合してフォーリン・チオカルト試薬液を調製した。また、５００μｇ／ｍＬの牛血清アルブミン（ＢＳＡ）水溶液を標準溶液として調製した。本実施例（２）［２－３］のＴＧ－ｒｉｃｈ ＬＤＬ溶液および標準溶液それぞれ１ｍＬに、調製した反応溶液を３ｍＬずつ加えて室温で３０分間反応させた。続いて、調製したフォーリン・チオカルト試薬液３００μＬを強く撹拌しながら加えた後、室温で４５分間反応させた。その後、６６０ｎｍの吸光度をそれぞれ測定した。標準溶液の測定値との比較から、本実施例（２）［２－３］のＴＧ－ｒｉｃｈ ＬＤＬ溶液のタンパク質濃度を算出した。
［２－５］ＴＧ－ｒｉｃｈ ＬＤＬ溶液のタンパク質濃度調整
　本実施例（２）［２－４］で算出した結果に基づき、本実施例（２）［２－３］のＴＧ－ｒｉｃｈ ＬＤＬ溶液のタンパク質濃度を、ＰＢＳを用いて１ｍｇ／ｍＬに調整した後、４℃で保存した。
（３）ＴＧ－ｒｉｃｈ ＬＤＬを免疫原としたマウスへの免疫およびハイブリドーマの作製
　本実施例（２）［２－５］の０．５～１ｍｇ／ｍＬのＴＧ－ｒｉｃｈ ＬＤＬ溶液０．１ｍＬを孔径０．４５ｍｍのフィルター（ＤＩＳＭＩＣ－２５ＣＳ；ＡＤＶＡＮＴＥＣ社）に通した後、常法に従って、百日咳菌アジュバントを注射したＢＡＬＢ／ｃマウスに３回腹腔内注射することにより免疫を行った。その後、常法に従って、免疫したマウスから脾臓細胞を採取し、５０％ポリエチレングリコール１５００（Ｒｏｃｈｅ社）を用いてマウスミエローマ細胞株Ｐ３Ｕ１と融合させてハイブリドーマを作製した。ハイブリドーマは、常法に従って、ペニシリン／ストレプトマイシン、１０％（ｗ／ｖ）のウシ胎児血清（ＦＣＳ）およびＨＡＴ溶液を含むＲＰＭＩ１６４０培地を用いて、コロニーが確認できるまで約１０日間培養した。
（４）ＴＧ－ｒｉｃｈ ＬＤＬ、ｎａｔｉｖｅ－ＬＤＬおよび金属酸化ＬＤＬを固着させたＥＬＩＳＡによるハイブリドーマのスクリーニング
［４－１］ｎａｔｉｖｅ－ＬＤＬ画分の調製
　本実施例（２）［２－１］、［２－２］、［２－３］、［２－４］および［２－５］に記載の方法に従って、健常者血清からｎａｔｉｖｅ－ＬＤＬ溶液を調製した。
［４－２］金属酸化ＬＤＬ画分の調製
　本実施例（４）［４－１］のｎａｔｉｖｅ－ＬＤＬ溶液１ｍｇ／ｍＬに、２５μｍｏｌ／Ｌとなるよう硫酸銅を添加し、３７℃で２４時間インキュベートした後、ＰＢＳを透析液として４℃で一晩透析を行うことにより、金属酸化ＬＤＬ溶液を調製した。
［４－３］ｎａｔｉｖｅ－ＬＤＬおよび金属酸化ＬＤＬを固着させたＥＬＩＳＡ
　本実施例（４）［４－１］のｎａｔｉｖｅ－ＬＤＬ溶液および本実施例（４）［４－２］の金属酸化ＬＤＬ溶液を、ＰＢＳを用いてそれぞれ２０μｇ／ｍＬに希釈した後、９６穴プレート（Ｎｕｎｃ ＭａｘｉＳｏｒｐ；Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社）に５０μＬ／ウェル入れて４℃で一晩反応させることにより、ｎａｔｉｖｅ－ＬＤＬおよび金属酸化ＬＤＬをそれぞれプレート上に固着させた。液体を除去して１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含むＰＢＳを１５０μＬ／ウェル入れ、３７℃で２時間インキュベートすることによりブロッキングを行った後、０．０５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ－ＰＢＳ）を用いて４回洗浄した。続いて、ｎａｔｉｖｅ－ＬＤＬを固着させたウェルおよび金属酸化ＬＤＬを固着させたウェルに本実施例（３）の各コロニーの培養上清を５０μＬ／ウェル入れて、室温で１時間反応させた後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ－ＰＢＳを用いて４回洗浄した。続いて、ＰＢＳで５００倍に希釈したビオチン標識ラット抗マウスｋ鎖（Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を５０μＬ／ウェルずつ入れ、室温で１時間反応させた後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ－ＰＢＳを用いて４回洗浄した。その後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ－ＰＢＳで５００倍に希釈したアルカリフォスファターゼ標識ストレプトアビジン（ＡＬＰ－ＳＡ；Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を５０μＬ／ウェル入れて室温で３０分間反応させた後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ－ＰＢＳを用いて４回洗浄した。次に、０．５ｍｍｏｌ／ＬのＭｇＣｌ２を含む１０ｍｍｏｌ／ＬのＤｉｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ溶液を用いて１ｍｇ／ｍＬに調整したＤｉｓｏｄｉｕｍ ｐ－ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｈｅｘａｈｙｄｒａｔｅ（和光純薬社）を１００μＬ／ウェル入れて、室温で３０分間反応させた。続いて、マイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を用いて、主波長４０５ｎｍおよび副波長６００ｎｍで吸光度を測定した。ｎａｔｉｖｅ－ＬＤＬを固着させたウェルについては吸光度が小さい培養上清を、金属酸化ＬＤＬを固着させたウェルについては吸光度が大きい培養上清をそれぞれ特定することにより、コロニーの選択を行った。
［４－４］限界希釈法によるクローニングおよびスクリーニング
　本実施例（４）［４－３］で選択したコロニーの細胞を、９６穴プレートに１個／ウェルとなるように播き、ペニシリン－ストレプトマイシン、１０％（ｖ／ｖ）のＦＣＳ、Ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ、ＴｈｙｍｉｄｉｎｅおよびＨｙｂｒｉｄｏｍａ Ｆｕｓｉｏｎ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ社）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（１０％ＦＣＳ－ＨＴ－ＨＦＣＳ－ＲＰＭＩ１６４０）を用いて培養を行った。これらの培養上清について、本実施例（４）［４－３］に記載の方法に従い、再度ＥＬＩＳＡを行い、ｎａｔｉｖｅ－ＬＤＬを固着させたウェルについては吸光度が小さい培養上清を、かつ金属酸化ＬＤＬを固着させたウェルについては吸光度が大きい培養上清を特定することにより、クローンの選択を行った。その結果、得られたハイブリドーマをＧ１１－６と命名した。
（５）Ｇ１１－６抗体の精製
　常法に従って、２，６，１０，１４‐テトラメチル‐２‐ペンタデセン酸（プリステン）を注射したマウスの腹腔内に、本実施例（４）のＧ１１－６を接種して培養し、Ｇ１１－６が産生するモノクローナル抗体（Ｇ１１－６抗体）を含む腹水を得た。
　得られた腹水について、常法に従い飽和硫安（飽和硫酸アンモニウム）沈殿法を行って、粗モノクローナル抗体溶液を得た。具体的には、得られた腹水を氷冷しながら、等量の飽和硫酸アンモニウムをゆっくりと滴下して加えた後、遠心分離を行って上清を除去した。続いて沈殿物に５０％飽和硫酸アンモニウム溶液を加えて再度遠心して上清を除去することで洗浄を行い、沈殿物をＰＢＳに溶解して粗Ｇ１１－６抗体溶液とした。
　続いて、粗Ｇ１１－６抗体溶液３００μＬについて、以下の器具・機器、溶離液および条件を用いて常法に従ってＨＰＬＣ法を行い、溶出液を０．５ｍＬずつ分取することにより、８０μｇ／ｍＬ精製Ｇ１１－６抗体溶液を約１．４ｍＬ得た。
　カラム；Ｓｕｐｅｒｏｓｅ ６ １０／３００ ＧＬ（ＧＥヘルスケア社）
　溶離液；５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＰＢ溶液（ｐＨ７．２）
　システムコントローラ；ＣＢＭ－２０Ａ（島津製作所社）
　送液ポンプ：ＬＣ－２０ＡＤ（島津製作所社）
　オートサンプラー；ＳＩＬ－２０Ａ（島津製作所社）
　カラムオーブン；ＣＴＯ－２０ＡＣ（島津製作所社）
　検出器；ＳＰＤ－２０Ａ（島津製作所社）
　条件；流速　０．５ｍＬ／分
　　　　検出波長　２８０ｎｍ
＜実施例２＞Ｇ１１－６抗体のクラス判定
　ＩｓｏＳｔｒｉｐマウスモノクローナル抗体アイソタイピングキット（Ｒｏｃｈｅ社）を用いて、付属の使用書に従い、イムノクロマトグラフィー法により実施例１（５）のＧ１１－６抗体のクラス判定を行った。その結果、Ｇ１１－６抗体のクラスはＩｇＭであることが明らかになった。
＜実施例３＞Ｇ１１－６抗体の可変領域の配列確認
（１）ＲＮＡの抽出
　実施例１（４）のハイブリドーマＧ１１－６を、１０ｍＬの１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地を入れた２５ｃｍ３のフラスコに播種し、５％ＣＯ２雰囲気および３７℃の条件下で７２時間培養した。続いて、常温、８５００ｒｐｍの条件下で５分間遠心分離を行って、上清を除去し、細胞ペレットを回収した。Ａｂｓｏｌｕｔｅｌｙ ＲＮＡ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）を用いて、付属の使用書に従い、回収した細胞のペレットからＲＮＡの抽出を行った。
　具体的には、まず、４．２μＬのβ－メルカプトエタノールを６００μＬのＬｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒに添加し、これを細胞ペレットに加えた。１８Ｇ（外径１．２ｍｍ、内径０．９４ｍｍ）のシリンジでピペッティングを行った後、全量をＰｒｅｆｉｌｔｅｒ Ｓｐｉｎ Ｃｕｐ（Ｃｕｐ１）に収容して、常温および１４０００ｒｐｍの条件下で５分間遠心分離を行い、濾液約６００μＬを回収した。ここに６００μＬの７０％（ｖ／ｖ）エタノールを加えて転倒混和し、約１２００ｍＬのエタノール混和液を得た。このうち、７００μＬをＲＮＡ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｐｉｎ Ｃｕｐ（Ｃｕｐ２）に移し、常温および１４０００ｒｐｍの条件下で１分間遠心分離を行った後、濾液を除去し、残りのエタノール混和液約５００μＬを加えて、常温および１４０００ｒｐｍの条件下で１分間、再度遠心分離を行った。その後、濾液を除去し、６００μＬのＬｏｗ Ｓａｌｔ Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒを加え、常温および１４０００ｒｐｍの条件下で１分間、さらに遠心分離を行って濾液を除去した。続いて、常温および１４０００ｒｐｍの条件下でさらに２分間遠心分離を行い、濾液を除去した。ＤＮａｓｅ Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ５０μＬとｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅｄ ＲＮａｓｅ－Ｆｒｅｅ ＤＮａｓｅＩ５μＬとを混合してＣｕｐ２に添加し、３７℃で１５分間インキュベートした。さらにその後、Ｃｕｐ２にＨｉｇｈ－Ｓａｌｔ Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ６００μＬを添加し、常温および１４０００ｒｐｍの条件下で１分間遠心分離を行った後、濾液を除去した。Ｃｕｐ２にＬｏｗ Ｓａｌｔ Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ６００μＬを加えて、常温および１４０００ｒｐｍの条件下で１分間遠心分離を行った後、濾液を除去した。さらに、Ｃｕｐ２にＬｏｗ Ｓａｌｔ Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ３００μＬを加えて、常温および１４０００ｒｐｍの条件下で２分間遠心分離を行った後、Ｃｕｐ２を新しい１．５ｍＬエッペンドルフチューブに移した。続いて、６０℃に温めたＥｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ５０μＬをＣｕｐ２に添加して、室温で２分間静置した。その後、常温および１４０００ｒｐｍの条件下で１分間遠心分離を行って濾液を回収し、これをＲＮＡ溶液とした。ＮａｎｏＤｒｏｐ１０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いてそのＲＮＡ溶液のＲＮＡ濃度を測定したところ、１２８ｎｇ／μＬであった。そこで、ＲＮＡ溶液にＤＥＰＣ水の適量を添加することで、ＲＮＡ濃度を約１００ｎｇ／μＬに調製した。
（２）ｃＤＮＡの調製
　本実施例（１）のＲＮＡ溶液を鋳型として、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭ Ｆｉｒｓｔ－Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ＲＴ－ＰＣＲ（インビトロジェン社）を用いて、付属の使用書に従い逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを調製した。具体的には、まず、下記の組成の反応液Ａおよび反応液Ｂを調製した。
　反応液Ａ；約１００ｎｇ／μＬ ＲＮＡ溶液　８μＬ、１０ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰ ｍｉｘ　１μＬ、５０ｎｇ／μＬ Ｒａｎｄｏｍ Ｈｅｘａｍｅｒｓ　１μＬ
　反応液Ｂ；１０×ＲＴ Ｂｕｆｆｅｒ　２μＬ、２５ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ２　４μＬ、０．１ｍｏｌ／Ｌ ＤＴＴ　２μＬ、４０Ｕ／ｍＬ ＲＮａｓｅＯＵＴＴＭ　１μＬ
　反応液Ａを混和して、６５℃で５分間インキュベートした後、１分間氷中に静置した。続いて、反応液Ａに反応液Ｂを添加して、室温で２分間インキュベートした後、１μＬのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＴＭ ＩＩ ＲＴを添加して、室温で１０分間、４２℃で５０分間、７０℃で１５分間の順でインキュベートすることにより逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを調製した。得られたｃＤＮＡ溶液は、４℃で保管した。
（３）Ｇ１１－６抗体の重鎖可変領域（Ｇ１１－６－ＶＨ）および軽鎖可変領域（Ｇ１１－６－ＶＬ）のＤＮＡ配列の増幅
　本実施例（２）のｃＤＮＡ溶液を鋳型として、サーマルサイクラー（ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ２４００；Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いてＰＣＲを行い、Ｇ１１－６抗体の重鎖可変領域（Ｇ１１－６－ＶＨ）およびＧ１１－６抗体の軽鎖可変領域（Ｇ１１－６－ＶＬ）のＤＮＡ配列をそれぞれ増幅した。ＰＣＲに用いたプライマー、ＰＣＲ反応溶液組成およびＰＣＲ反応条件は下記のとおりである。
　ＰＣＲに用いたプライマー｛Ｍｏｕｓｅ Ｉｇ－Ｐｒｉｍｅｒ Ｓｅｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）｝
Ｇ１１－６－ＶＨ（５’プライマー；ＭｕＩｇＶＨ５’－Ｂ）；５’－ＧＧＧＡＡＴＴＣＡＴＧＲＡＡＴＧＳＡＳＣＴＧＧＧＴＹＷＴＹＣＴＣＴＴ－３’（ＲはＡまたはＧ、ＳはＣまたはＧ、ＹはＣまたはＴ、ＷはＡまたはＴを表す。；配列番号１）
Ｇ１１－６－ＶＨ（３’プライマー；ＭｕＩｇＭＶＨ３’）；５’－ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＡＣＧＡＧＧＧＧＧＡＡＧＡＣＡＴＴＴＧＧＧＡＡ－３’（配列番号２）
Ｇ１１－６－ＶＬ（５’プライマー；ＭｕＩｇｋＶＬ５’－Ｂ）；５’－ ＧＧＧＡＡＴＴＣＡＴＧＧＡＧＡＣＡＧＡＣＡＣＡＣＴＣＣＴＧＣＴＡＴ－３’（配列番号３）
Ｇ１１－６－ＶＬ（３’プライマー；ＭｕＩｇｋＶＬ３’）；５’－ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＡＣＴＧＧＡＴＧＧＴＧＧＧＡＡＧＡＴＧＧＡ－３’（配列番号４）
　ＰＣＲ反応溶液組成；１０×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｍｇ２＋フリー）　２．５μＬ、５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ２　０．７５μＬ、２．５ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰ ｍｉｘ　２．０μＬ、２５０ｐｍｏｌ／Ｌ ５’プライマー　１．０μＬ、２５０ｐｍｏｌ／Ｌ ３’プライマー　１．０μＬ、ｃＤＮＡ溶液　１．０μＬ、Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　０．２５μＬ、ＤＥＰＣ水　１６．５μＬ
　ＰＣＲ反応条件；９４℃で２分の反応の後、９４℃で３０秒、５０℃で３０秒、７２℃で２分の各反応を１サイクルとして４０サイクル行い、その後７２℃で６分の反応を行った。
　増幅したＧ１１－６－ＶＨのＤＮＡ配列を含む溶液（ＶＨ－ＰＣＲ産物溶液）および増幅したＧ１１－６－ＶＬのＤＮＡ配列を含む溶液（ＶＬ－ＰＣＲ産物溶液）は、４℃で保存した。
（４）電気泳動によるＰＣＲ産物の確認
　本実施例（３）のＶＨ－ＰＣＲ産物溶液およびＶＨ－ＰＣＲ産物溶液から５μＬずつ分取して、それぞれ２μＬのＬｏａｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（６×Ｏｒａｎｇｅ ＤＮＡ Ｌｏａｄｉｎｇ Ｄｙｅ；Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ社）を添加し、ＶＨ泳動用溶液およびＶＬ泳動用溶液とした。ＶＨ泳動用溶液、ＶＬ泳動用溶液およびＤＮＡラダー（Ｏ’ＧｅｎｅＲｕｌｅｒＴＭ １００ｂｐ ＤＮＡ Ｌａｄｄｅｒ Ｐｌｕｓ；Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ社）を、０．００７％（ｖ／ｖ）エチジウムブロマイド（ニッポンジーン社）を含む３％（ｗ／ｖ）アガロースゲル（ＮｕＳｉｅｖｅ ＧＴＧ Ａｇａｒｏｓｅ；ＣＡＭＢＲＥＸ社）にアプライした後、陽極側の泳動用バッファー（１×ＴＡＥ バッファー；ニッポンジーン社）に２μＬのエチジウムブロマイド（ニッポンジーン社）を添加して混和し、１００Ｖで、約４０分間電気泳動を行った。その後、ＵＶ検出器（Ｄｏｌｐｈｉｎ－Ｖｉｅｗ；ＫＵＲＡＢＯ社）を用いて、泳動像の観察を行った。その結果を図３に示す。
　図３左図に示すように、ＶＨ泳動用溶液では約４５０ｂｐのバンドが、ＶＬ泳動用溶液では約４００ｂｐのバンドがそれぞれ検出された。この結果から、ＶＨ－ＰＣＲ産物溶液においてＧ１１－６－ＶＨのＤＮＡ配列が、ＶＬ－ＰＣＲ産物溶液においてＧ１１－６－ＶＬのＤＮＡ配列がそれぞれ増幅されていることが確認された。
（５）ＰＣＲ産物の回収およびベクターへの挿入
　本実施例（３）のＶＨ－ＰＣＲ産物溶液およびＶＬ－ＰＣＲ産物溶液から１５μＬずつ分取して、実施例（４）に記載の方法により電気泳動を行った。続いて、ＶＨ－ＰＣＲ産物溶液を泳動したアガロースゲルからは約４５０ｂｐのバンドを、ＶＬ－ＰＣＲ産物溶液を泳動したアガロースゲルからは約４００ｂｐのバンドをそれぞれ切り出した後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて、付属の使用書に従い、ＤＮＡ断片を含む溶液を回収し、Ｇ１１－６－ＶＨ－ＤＮＡ溶液およびＧ１１－６－ＶＬ－ＤＮＡ溶液とした。その後、ＴＯＰＯ ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ ｆｏｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて、４μＬのＧ１１－６－ＶＨ－ＤＮＡ溶液、１μＬのＳａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎおよび１μＬのＴＯＰＯベクターからなるＶＨライゲーション反応液と、４μＬのＧ１１－６－ＶＬ－ＤＮＡ溶液、１μＬのＳａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎおよび１μＬのＴＯＰＯベクターからなるＶＬライゲーション反応液とを調製し、室温で５分間静置することにより、ＤＮＡ断片のベクターへの挿入を行った。
（６）形質転換（トランスフォーメーション）および大腸菌の培養
　本実施例（５）のＶＨライゲーション反応液２μＬおよびＶＬライゲーション反応液２μＬに、それぞれ、ＴＯＰ１０ Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ ＴＯＰ１０ Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ．ｃｏｌｉ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を添加して混和した後、氷中で３０分間静置した。続いて、４２℃で３０秒間静置した後、直ちに氷中で冷却し、Ｅ．ｃｏｌｉ増殖用培地であるＳ．Ｏ．Ｃ．ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を２５０μＬずつ加えて３７℃で１時間静置することにより、大腸菌の形質転換を行った。ＶＨライゲーション反応液により形質転換した大腸菌を含む溶液をＶＨ大腸菌液とし、ＶＬライゲーション反応液により形質転換した大腸菌を含む溶液をＶＬ大腸菌液とした。
　１％（ｖ／ｖ）Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を含む４％（ｗ／ｖ）ＬＢ Ａｇａｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）プレートを６枚用意し、３枚ずつ２群に分けてＶＨプレート群およびＶＬプレート群とした。ＶＨプレート群の各プレートにはＶＨ大腸菌液を、ＶＬプレート群の各プレートにはＶＬ大腸菌液を、それぞれ１０μＬ、５０μＬおよび１００μＬずつ添加して塗布した後、全プレートを３７℃で１５時間インキュベートした。続いて、プレートに出現したコロニーを、ＶＨプレート群から計８個、ＶＬプレート群から計７個、滅菌済みのつまようじで拾い上げ、拾い上げた各コロニーを、１％（ｖ／ｖ）Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を含む２％（ｗ／ｖ）ＬＢ Ｂｒｏｔｈ Ｂａｓｅ溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）５ｍＬに添加した。これを、ＢＩＯ－ＳＨＡＫＥＲ ＢＲ－１５（ＴＡＩＴＥＣ社）を用いて、振盪速度２００ｍｉｎ－１で浸透しながら３７℃で１５時間培養することにより、ＶＨ大腸菌培養液（計８サンプル）およびＶＬ大腸菌培養液（計７サンプル）を得た。
（７）プラスミドＤＮＡの精製
　本実施例（６）のＶＨ大腸菌培養液１サンプルおよびＶＬ大腸菌培養液１サンプルについて、常温および３０００ｒｐｍの条件下で１０分間遠心分離を行った後、上清を除去してＶＨ大腸菌ペレットおよびＶＬ大腸菌ペレットを回収した。その後、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ社）を用いてプラスミドの精製を行い、ＶＨプラスミド溶液およびＶＬプラスミド溶液を得た。具体的には、ＶＨ大腸菌ペレットおよびＶＬ大腸菌ペレットのそれぞれにＰ１溶液を２５０μＬずつ加えて懸濁し、１．５ｍＬエッペンドルフチューブに移した後、これにＰ２溶液を２５０μＬずつ加えて転倒混和し、数分静置して大腸菌を溶解させた。続いて、Ｎ３溶液を３５０μＬずつ加えて転倒混和して中和し、常温および１４０００ｒｐｍの条件下で１分間遠心分離を行った後、それぞれ上清を回収して、カラムに添加した。続いて、このカラムを常温および１４０００ｒｐｍの条件下で１分間遠心分離を行って濾液を除去した後、カラムにＰＥ溶液を７５０μＬずつ加えて、常温および１４０００ｒｐｍの条件下で１分間遠心分離を行って濾液を除去することによりカラムを洗浄した。カラムをそれぞれ新しい１．５ｍＬエッペンドルフチューブに移した後、ＥＢ溶液を５０μＬずつ加えて１分間静置した。その後、常温および１４０００ｒｐｍの条件下で２分間遠心分離を行って濾液を回収し、これをプラスミド溶液とした。ＶＬ大腸菌ペレットから得られたプラスミド溶液をＶＬプラスミド溶液とし、ＶＬ大腸菌ペレットから得られたプラスミド溶液をＶＬプラスミド溶液とした。ＶＨプラスミド溶液およびＶＬプラスミド溶液は４℃で保存した。
（８）シークエンス
　本実施例（７）のＶＨプラスミド溶液およびＶＬプラスミド溶液をそれぞれ鋳型ＤＮＡとして、ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）およびＴ３プライマー（ＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＧＡ；配列番号５）を用いてシークエンス反応を行った。シークエンス反応溶液組成およびシークエンス反応条件は以下のとおりである。
　シークエンス反応溶液組成；Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｍｉｘ　２μＬ、Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ　１μＬ、Ｔ３プライマー　１μＬ、ＤＥＰＣ水　５μＬ、鋳型ＤＮＡ　１μＬ
　シークエンス反応条件；９６℃で１０秒間の反応の後、９６℃で１０秒、５０℃で５秒、６０℃で３分の各反応を１サイクルとして２５サイクル行い、その後４℃で静置した。
　続いて、ＶＨプラスミド溶液を鋳型ＤＮＡとしたシークエンス反応溶液（ＶＨシークエンス反応溶液）およびＶＬプラスミド溶液を鋳型ＤＮＡとしたシークエンス反応溶液（ＶＬシークエンス反応溶液）に、ＳＡＭＴＭ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）４５μＬおよびＢｉｇＤｙｅ ＸＴｅｒｍｉｎａｔｏｒＴＭ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）１０μＬを添加した後、ＭｉｃｒｏＭｉｘｅｒ Ｅ－３６（ＴＡＩＴＥＣ社）を用いて、室温および遮光の条件下で３０分間振盪した。その後、常温および１４０００ｒｐｍの条件下で１０秒間遠心分離を行って上清を回収し、シークエンサー（３７３０ｘｌ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｚｅｒ；Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）にセットしてＤＮＡ配列を解析した。続いて、ソフトウェア（ＭａｃＶｅｃｔｏｒ；ＭａｃＶｅｃｔｏｒ社）を用いて、得られたＤＮＡ配列からアミノ酸配列ならびに相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ；ＣＤＲ）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を推定した。その結果を下記に示す。
　Ｇ１１－６－ＶＨのＤＮＡ配列
ＧＴＴＣＡＧＣＴＣＣＡＧＣＡＧＴＣＴＧＧＧＡＣＴＧＴＧＣＴＧＧＣＡＡＧＧＣＣＴＧＧＧＧＣＴＴＣＡＧＴＧＡＡＧＡＴＧＴＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＴＴＣＴＧＧＣＴＡＣＡＣＣＴＴＴＡＣＣＡＧＣＴＡＣＴＧＧＡＴＧＣＡＣＴＧＧＧＴＡＡＡＡＣＡＧＡＧＧＣＣＴＧＧＡＣＡＧＧＧＴＣＴＧＧＡＡＴＧＧＡＴＴＧＧＣＧＣＴＡＴＴＴＡＴＣＣＴＧＧＡＡＡＴＡＧＴＧＡＴＡＣＴＡＧＣＴＡＣＡＡＣＣＡＧＡＡＧＴＴＣＡＡＧＧＧＣＡＡＧＧＣＣＡＡＡＣＴＧＡＣＴＧＣＡＧＴＣＡＣＡＴＣＣＡＣＣＡＧＣＡＣＴＧＣＣＴＡＣＡＴＧＧＡＧＣＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＡＣＡＡＡＴＧＡＧＧＡＣＴＣＴＧＣＧＧＴＣＴＡＴＴＡＣＴＧＴＡＣＡＡＧＡＧＴＣＴＡＣＧＧＴＡＧＧＧＣＴＡＴＧＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＡＧＧＡＡＣＣＴＣＡＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡ（配列番号６）
　Ｇ１１－６－ＶＨのアミノ酸配列（下線は順にＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３の領域を示す）
ＶＱＬＱＱＳＧＴＶＬＡＲＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＷＭＨＷＶＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＡＩＹＰＧＮＳＤＴＳＹＮＱＫＦＫＧＫＡＫＬＴＡＶＴＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＴＮＥＤＳＡＶＹＹＣＴＲＶＹＧＲＡＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳ（配列番号７）
　ＶＨ領域のＣＤＲ１；ＳＹＷＭＨ（配列番号８）
　ＶＨ領域のＣＤＲ２；ＡＩＹＰＧＮＳＤＴＳＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号９）
　ＶＨ領域のＣＤＲ３；ＶＹＧＲＡＭＤＹ（配列番号１０）
　Ｇ１１－６－ＶＬのＤＮＡ配列
ＧＡＣＡＴＴＧＴＧＣＴＧＡＣＡＣＡＧＴＣＴＣＣＴＧＣＴＴＣＣＴＴＡＧＣＴＧＴＡＴＣＴＣＴＧＧＧＧＣＡＧＡＧＧＧＣＣＡＣＣＡＴＣＴＣＡＴＡＣＡＧＧＧＣＣＡＧＣＡＡＡＡＧＴＧＴＣＡＧＴＡＣＡＴＣＴＧＧＣＴＡＴＡＧＴＴＡＴＡＴＧＣＡＣＴＧＧＡＡＣＣＡＡＣＡＧＡＡＡＣＣＡＧＧＡＣＡＧＣＣＡＣＣＣＡＧＡＣＴＣＣＴＣＡＴＣＴＡＴＣＴＴＧＴＡＴＣＣＡＡＣＣＴＡＧＡＡＴＣＴＧＧＧＧＴＣＣＣＴＧＣＣＡＧＧＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＧＴＣＴＧＧＧＡＣＡＧＡＣＴＴＣＡＣＣＣＴＣＡＡＣＡＴＣＣＡＴＣＣＴＧＴＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＴＧＣＴＧＣＡＡＣＣＴＡＴＴＡＣＴＧＴＣＡＧＣＡＣＡＴＴＡＧＧＧＡＧＣＴＴＡＣＡＣＧＴＴＣＧＧＡＧＧＧＧＧＧＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＡＡ（配列番号１１）
　Ｇ１１－６－ＶＬのアミノ酸配列（下線は順にＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３の領域を示す）
ＤＩＶＬＴＱＳＰＡＳＬＡＶＳＬＧＱＲＡＴＩＳＹＲＡＳＫＳＶＳＴＳＧＹＳＹＭＨＷＮＱＱＫＰＧＱＰＰＲＬＬＩＹＬＶＳＮＬＥＳＧＶＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＮＩＨＰＶＥＥＥＤＡＡＴＹＹＣＱＨＩＲＥＬＴＲＳＥＧＧＰＳＷＫ（配列番号１２）
　ＶＬ領域のＣＤＲ１；ＲＡＳＫＳＶＳＴＳＧＹＳＹＭＨ（配列番号１３）
　ＶＬ領域のＣＤＲ２；ＬＶＳＮＬＥＳ（配列番号１４）
　ＶＬ領域のＣＤＲ３；ＱＨＩＲＥＬＴ（配列番号１５）
（９）アミノ酸配列の相同性検索
　本実施例（８）のＧ１１－６－ＶＨ、Ｇ１１－６－ＶＬ、およびそれらのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の各アミノ酸配列について、ソフトウェア（ＭａｃＶｅｃｔｏｒ；ＭａｃＶｅｃｔｏｒ社）を用いて、ＣｌｕｓｔａｌＷ解析およびＢＬＡＳＴ解析を行い、既知のアミノ酸配列との相同性を検索した。相同性検索の結果、相同性が高かった最上位のものを図４～７に示す。
　図４～７に示すように、Ｇ１１－６－ＶＬのアミノ酸配列と１００％一致する既知のアミノ酸配列は検出されたが、Ｇ１１－６－ＶＨのアミノ酸配列と１００％一致する既知のアミノ酸配列は検出されなかった。また、Ｇ１１－６－ＶＨのＣＤＲ１、Ｇ１１－６－ＶＨのＣＤＲ２、Ｇ１１－６－ＶＬのＣＤＲ１、Ｇ１１－６－ＶＬのＣＤＲ２およびＧ１１－６－ＶＬのＣＤＲ３のアミノ酸配列とそれぞれ１００％一致する既知のアミノ酸配列は検出されたが、Ｇ１１－６－ＶＨのＣＤＲ３と１００％一致する既知のアミノ酸配列は検出されなかった。これらの結果から、Ｇ１１－６抗体は新規の抗体であることが確認された。
＜実施例３＞肝疾患患者血清に対するＧ１１－６抗体を固着させたＥＬＩＳＡの反応性
（１）血清サンプルの調製
　肝疾患患者１名および健常者１名からそれぞれ血清を採取し、サンプルとした。
（２）Ｇ１１－６抗体を固着させたＥＬＩＳＡ
［２－１］ビオチン標識抗アポリポタンパク質Ｂ抗体（検出用抗体）の調製
〈２－１－１〉抗アポリポタンパク質Ｂ抗体の精製
　抗アポリポタンパク質Ｂポリクローナル抗体を含むヤギ抗血清（ＷａｔＰａ；Ｅｎｔｅｒｐｒｉｓｅｓ社）について、実施例１（５）に記載の方法により、常法に従い飽和硫安沈殿法を行って、粗抗アポリポタンパク質Ｂ抗体溶液を得た。続いて、粗抗アポリポタンパク質Ｂ抗体溶液について、常法に従いアフィニティカラムクロマトグラフィー法を行って、精製抗アポリポタンパク質Ｂ抗体を得た。具体的には、まず、粗抗アポリポタンパク質Ｂ抗体溶液をＰＢＳで１０倍希釈した後、以下の器具・機器および条件を用いてアフィニティカラムに循環して通過させた。
　カラム；Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（ＧＥヘルスケア社）
　送液ポンプ；ペリスタルティックポンプ（ＳＪ－１２１５；ＡＴＴＯ社）
　条件；４℃、流速約０．２ｍＬ／分
　続いて、ＰＢＳを用いてカラム内を洗浄した後、流速約０．２ｍＬ／分で０．１ｍｏｌ／ＬのＧｌｙｃｉｎｅ－ＨＣｌ（ｐＨ２．７）を流してカラムに結合した抗アポリポタンパク質Ｂ抗体を溶出させ、溶出液を０．５ｍＬずつ分取した。
　分取した溶出液に速やかに１ｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を加えて中和を行った後、各溶出液について波長２８０ｎｍの吸光度を測定して、タンパク質の存在が確認された溶出液を選択した。選択した溶出液を合わせて波長２８０ｎｍの吸光度を測定し、タンパク質濃度を算出したところ、４．７ｍｇ／ｍＬの精製抗アポリポタンパク質Ｂ抗体溶液約３．５ｍＬが得られたことが確認された。続いて、透析膜（セルロースチューブ２０／３２；三光純薬社）を用い、ＰＢＳを透析液として４℃で一晩透析することにより、精製抗アポリポタンパク質Ｂ抗体溶液約３．５ｍＬを得た。透析中、透析液の交換を３回行った。その後、ＰＢＳを用いてタンパク質濃度２ｍｇ／ｍＬに調整した。
〈２－１－２〉抗アポリポタンパク質Ｂ抗体のビオチン標識
　Ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｘｉｄｅ（和光純薬社）に、１０ｍｍｏｌ／ＬとなるようＮ－ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ ｅｓｔｅｒ ｏｆ ｂｉｏｔｉｎ（ＥＺ－Ｌｉｎｋ ＮＨＳ－Ｂｉｏｔｉｎ Ｒｅａｇｅｎｔｓ；サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を溶解することによりビオチン標識液を調製した。本実施例（２）［２－１］〈２－１－１〉の抗アポリポタンパク質Ｂ抗体溶液１ｍＬに、調製したビオチン標識液を２７μＬ添加して、室温で４時間、振盪しながら反応させた後、ＰＢＳを透析液として透析を行い、未反応のビオチンを除去することにより、ビオチン標識抗アポリポタンパク質Ｂ抗体を調製した。その後、ＰＢＳを用いてタンパク質濃度０．０１ｍｇ／ｍＬに希釈した。
［２－２］Ｇ１１－６抗体を固着させたＥＬＩＳＡ
　実施例１（５）のＧ１１－６抗体について、ＰＢＳを用いてタンパク質濃度５μｇ／ｍＬに希釈した。これを、９６穴プレート（Ｎｕｎｃ ＭａｘｉＳｏｒｐ；Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社）に５０μＬ／ウェル入れて、３７℃で２時間インキュベートすることによりＧ１１－６抗体をプレート上に固着させた。液体を除去して１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含むＰＢＳを１５０μＬ／ウェル入れ、３７℃で２時間インキュベートすることによりブロッキングを行った後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ－ＰＢＳを用いて４回洗浄した。続いて、ＰＢＳを用いてそれぞれ２０倍に希釈した本実施例（１）の血清サンプルを５０μＬ／ウェル入れて、４℃で一晩反応させた後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ－ＰＢＳを用いて４回洗浄した。次に、本実施例（２）［２－１］〈２－１－２〉のビオチン標識ヤギ抗アポリポタンパク質Ｂ抗体を５０μＬ／ウェル入れ、室温で１時間反応させた後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ－ＰＢＳを用いて４回洗浄した。続いて、０．０５％Ｔｗｅｅｎ－ＰＢＳで２５０倍に希釈したＡＬＰ－ＳＡ（Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を５０μＬ／ウェル入れて室温で３０分間反応させた後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ－ＰＢＳを用いて４回洗浄した。さらに、０．５ｍｍｏｌ／ＬのＭｇＣｌ２を含む１０ｍｍｏｌ／ＬのＤｉｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ溶液を用いて１ｍｇ／ｍＬに調整したＤｉｓｏｄｉｕｍ ｐ－ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｈｅｘａｈｙｄｒａｔｅ（和光純薬社）を１００μＬ／ウェル入れ、室温で６０分間発色反応を行った後、マイクロプレートリーダー（Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ ＦＣ；サーモサイエンティフィックフィッシャー社）を用いて、主波長４０５ｎｍおよび副波長６２０ｎｍで吸光度を測定した。
（３）抗酸化リン脂質抗体を固着させたＥＬＩＳＡ
　本実施例（１）の血清サンプルについて、酸化ＬＤＬのＥＬＩＳＡキット（酸化ＬＤＬ測定試薬「ＭＸ」；協和メデックス社）を用いて、付属の使用書に従いＥＬＩＳＡの反応を測定した。具体的には、マウス抗酸化リン脂質モノクローナル抗体が固着されたプレートに反応用緩衝液を１００μＬ／ウェル入れ、付属の検体希釈液を用いて本実施例（１）の血清サンプルを２５０倍に希釈し、それぞれ２０μＬ／ウェル入れて３７℃で２時間インキュベートした後、付属の洗浄液を用いて４回洗浄した。続いて、ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトアポリポタンパク質Ｂポリクローナル抗体を１００μＬ／ウェル入れ、３７℃で１時間インキュベートした後、前記洗浄液を用いて４回洗浄した。次に、３，３’，５，５’，－テトラメチルベンジジン溶液を１００μＬ／ウェル入れて３７℃で３０分間インキュベートし、０．５ｍｏｌ／Ｌの硫酸を５０μＬ／ウェル入れることにより反応を停止させた後、マイクロプレートリーダー（Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ ＦＣ；サーモサイエンティフィックフィッシャー社）を用いて、主波長４５０ｎｍおよび副波長６２０ｎｍで吸光度を測定した。
（４）抗ＭＤＡ－ＬＤＬ抗体を固着させたＥＬＩＳＡ
　本実施例（１）の血清サンプルについて、酸化ＬＤＬのＥＬＩＳＡキット（酸化ＬＤＬエライザ「第一」；積水メディカル社）を用いて、付属の使用書に従いＥＬＩＳＡの反応を測定した。具体的には、付属の洗浄液を用いてマウス抗ＭＤＡ－ＬＤＬモノクローナル抗体が固着されたプレートを３回洗浄した。続いて、検体希釈液（ＨＥＰＥＳ緩衝液）を用いて本実施例（１）の血清サンプルを２０００倍に希釈し、それぞれ１００μＬ／ウェル入れて室温で２時間反応させた後、付属の洗浄液を用いて３回洗浄した。続いて、β－ガラクトシダーゼ標識マウス抗アポリポタンパク質Ｂモノクローナル抗体を１００μＬ／ウェル入れ、室温で１時間反応させた後、付属の洗浄液を用いて３回洗浄した。次に、基質であるｏ－ニトロフェニル－β－Ｄ－ガラクトピラノシド溶液を１００μＬ／ウェル入れて、室温で２時間反応させた後、炭酸ナトリウム液を１００μＬ／ウェル入れて反応を停止させ、マイクロプレートリーダー（ＮＯＶＡＰＡＴＨ；Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を用いて、主波長４１５ｎｍおよび副波長６５５ｎｍで吸光度を測定した。
　本実施例（２）、（３）および（４）の結果を図８に示す。図８に示すように、Ｇ１１－６抗体を固着させたＥＬＩＳＡにおいては、肝疾患患者では０．２１２の吸光度が確認されたが、健常者では吸光度がほとんど確認されなかった。これに対し、抗酸化リン脂質抗体を固着させたＥＬＩＳＡにおいては、肝疾患患者では０．６０２の吸光度が、健常者では０．０９４の吸光度がそれぞれ確認された。また、抗ＭＤＡ－ＬＤＬ抗体を固着させたＥＬＩＳＡにおいては、肝疾患患者では０．１４６の吸光度が、健常者では０．１７９の吸光度がそれぞれ確認された。
　これらの結果から、抗酸化リン脂質抗体および抗ＭＤＡ－ＬＤＬ抗体が、肝疾患患者血清のみならず健常者血清に対しても少なからず反応するのに対し、Ｇ１１－６抗体は、肝疾患患者血清に反応するが健常者血清にはほとんど反応しないことから、特異性に優れることが示された。
＜実施例４＞肝疾患重症度とＧ１１－６抗体を固着させたＥＬＩＳＡにおける反応性との相関
（１）アガロースゲル電気泳動による肝疾患重症度の判定
　肝疾患患者９名、健常者１４名からそれぞれ血清を採取し、実施例１（１）に記載の方法に従ってアガロースゲル電気泳動を行った。健常者血清および肝疾患患者血清の典型的な泳動結果を図９に示す。
　図９に示すように、肝疾患患者血清のうち、α位のバンド（ＨＤＬに相当）が完全に欠失したものと欠失していないものがあった。そこでこの結果に基づき、健常者の泳動パターンに比して、α位のバンド（ＨＤＬに相当）が完全に欠失した肝疾患患者を重度群と判定し、α位のバンド（ＨＤＬに相当）が欠失していない肝疾患患者を軽中度群と判定したところ、肝疾患患者９名のうち６名が軽中度群であり、３名が重度群であった。
（２）Ｇ１１－６抗体を固着させたＥＬＩＳＡ
　実施例３（２）［２－２］に記載の方法に従い、Ｇ１１－６抗体を固着させたＥＬＩＳＡを行った。ただし、サンプルは実施例３（１）の血清サンプルに代えて、本実施例（１）の健常者群１４名、軽中度群６名および重度群３名の血清合計２３サンプルをそれぞれ用いた。吸光度の測定値を健常者群、軽中度群および重度群の群別に集計し、平均値を算出した。その結果を図１０に示す。各群間の比較は、一元配置分散分析およびＳｃｈｅｆｆｅの方法による多重比較検定を行い、 Ｐ＜０．０５である場合に、統計学的に有意であるとした。
　図１０に示すように、健常者群の吸光度は０．０５２±０．０２４であったのに対し、軽中度群の吸光度は０．１０５±０．０７４、重度群の吸光度は０．６９９±０．９４２であった。多重比較検定の結果、重度群と健常者群との間はＰ＜０．０５で、有意差が認められた。また、重度群と軽中度群との間はＰ＜０．０５で、有意差が認められた。一方、健常者群と軽中度群との間には有意差が認められなかった。
　これらの結果から、Ｇ１１－６抗体を固着させたＥＬＩＳＡは、肝疾患患者において肝疾患の重症度診断に有用であることが確認された。
＜実施例５＞脂質異常症患者血清に対するＧ１１－６抗体を固着させたＥＬＩＳＡの反応性
（１）血清脂質項目の測定
　健常者１名、脂質異常症患者７名（脂質異常症１、脂質異常症２、・・・脂質異常症７とする）および肝疾患患者１２名（肝疾患１、肝疾患２、・・・肝疾患１２とする）から血清合計２０サンプルを採取し、以下の試薬および日立自動分析装置７１７０（日立ハイテクノロジーズ社）を用いて、付属の使用書に従い、血清中脂質濃度を測定した。続いて、測定値を健常者、脂質異常症患者および肝疾患患者の別に集計して、平均値を算出した。その結果を表２に示す。
　総コレステロール（ＴＣ）；コレステストＣＨＯ（積水メディカル社）
　中性脂肪（ＴＧ）；エクセライザ ＴＧ（積水メディカル社）
　リン脂質（ＰＬ）；ピュアオートＳ ＰＬ（積水メディカル社）　
　高密度リポタンパク質中のコレステロール（ＨＤＬ－Ｃ）；コレステストＮ ＨＤＬ（積水メディカル社）
　低密度リポタンパク質中のコレステロール（ＬＤＬ－Ｃ）；コレステスト ＬＤＬ（積水メディカル社）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
（２）Ｇ１１－６抗体を固着させたＥＬＩＳＡ
　実施例３（２）［２－２］に記載の方法により、Ｇ１１－６抗体を固着させたＥＬＩＳＡを行った。ただし、サンプルは実施例３（１）の血清サンプルに代えて、本実施例（１）の健常者１名、脂質異常症患者７名および肝疾患患者１２名の血清合計２０サンプルを用いた。その結果を図１１のＡに示す。また、各サンプルの吸光度の測定値について、以下の式を用いて、本実施例（１）で測定した各サンプルのＬＤＬ－Ｃの血清中濃度で除した。その結果を図１１のＢに示す。
　式；吸光度の測定値×１００００／本実施例（１）で測定した血清中ＬＤＬ－Ｃ濃度
　図１１のＡに示すように、健常者の吸光度の測定値はほぼゼロである一方、脂質異常症患者１～脂質異常症患者７の吸光度の測定値は、概ね健常者の吸光度の測定値と比較して大きい。特に、脂質異常症患者１の吸光度の測定値は、他の脂質異常症患者の吸光度の測定値と比較して大きく、肝疾患患者１～肝疾患患者１０、肝疾患患者１２の吸光度の測定値と比較しても同程度あるいはそれよりも大きいことが分かる。これに対し、肝疾患患者１～肝疾患患者１２の吸光度は、健常者の吸光度の測定値と比較して大きく、脂質異常症患者の吸光度の測定値と比較しても、概ね大きいことが分かる。これらの結果から、Ｇ１１－６抗体を固着させたＥＬＩＳＡは、健常者では反応が小さい一方、脂質異常症患者および肝疾患患者では比較的反応が大きいことが確認された。
　また、図１１のＢに示すように、各サンプルの吸光度の測定値を各サンプルの血清中ＬＤＬ－Ｃ濃度で除したところ、肝疾患患者の測定値と健常者および脂質異常症患者の測定値との差が大きくなり、肝疾患患者の測定値が大きい一方、健常者および脂質異常症患者の測定値が小さくなった。この結果から、Ｇ１１－６抗体を固着させたＥＬＩＳＡの吸光度の測定値を血清中ＬＤＬ－Ｃ濃度で除することにより、肝疾患特異的に大きな値となることが確認された。
＜実施例６＞各種疾患患者血清のゲル濾過溶出液に対するＧ１１－６抗体を固着させたＥＬＩＳＡの反応性
（１）総リポタンパク質画分のゲル濾過溶出液に対する各種ＥＬＩＳＡの反応性
　健常者から血清を採取し、既報（Ｈｉｒａｎｏ Ｔ．ら、Ｊ．Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ、第１２巻、第６７～７２頁、２００５年）に従って密度勾配遠心法を行い、リポタンパク質を分離した。具体的には、肝疾患患者１名および若年健常者１名から採取したそれぞれの血清２ｍＬを比重ｄがｄ＝１．２２５ｋｇ／Ｌとなるように調整し、超遠心機ＯｐｔｉｍａＭＡＸ ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ（ベックマン・コールター社）およびローターＭＬＮ－８０（ベックマン・コールター社）を用いて、５００００ｒｐｍ、１５℃の条件下で２０時間遠心分離を行った後、上層（ｄ＜１．２２５ｋｇ／Ｌ）を総リポタンパク質画分として回収した。続いて、実施例１（５）に記載の方法によりゲル濾過クロマトグラフィーを行って、溶出液を０．５ｍＬずつ分取し、分取した順に溶出番号１、溶出番号２、・・・・溶出番号２８とした。その後、溶出番号５、７、９、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２５および２８の各溶出液についてコレステストＣＨＯ（積水メディカル社）および日立自動分析装置７１７０（日立ハイテクノロジーズ社）を用いて、付属の使用書に従い、ＴＣ濃度を測定した。
　続いて、溶出番号５、７、９、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２５および２８の各溶出液をサンプルとして、実施例３（２）［２－２］に記載の方法によりＧ１１－６抗体を固着させたＥＬＩＳＡを、また、付属の検体希釈液を用いて溶出番号５、７、９、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２５および２８の各溶出液を１０倍に希釈し、これらをサンプルとして実施例３（３）に記載の方法により抗酸化リン脂質抗体を固着させたＥＬＩＳＡを、さらに、付属の検体希釈液を用いて溶出番号５、７、９、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２５および２８の各溶出液を５００倍に希釈し、これらをサンプルとして実施例３（４）に記載の方法により抗ＭＤＡ－ＬＤＬ抗体を固着させたＥＬＩＳＡを、それぞれ行った。
　ＴＣ濃度測定および各種のＥＬＩＳＡの、肝疾患患者血清についての結果を図１２のＡに、健常者血清についての結果を図１２のＢにそれぞれ示す。
　図１２のＡに示すように、肝疾患患者では溶出番号１３においてＴＣ濃度が最大となった。また、溶出番号１３において、Ｇ１１－６抗体を固着させたＥＬＩＳＡ、抗酸化リン脂質抗体を固着させたＥＬＩＳＡおよび抗ＭＤＡ－ＬＤＬ抗体を固着させたＥＬＩＳＡのいずれも吸光度が最大となった。
　ＴＣ濃度は総リポタンパク質における各リポタンパク質の濃度を示すことから、これらの結果から、Ｇ１１－６抗体は、肝疾患患者に高濃度に存在するＴＧ－ｒｉｃｈ ＬＤＬに特異的に反応することが確認された。また、ＴＣ濃度のピークおよびＧ１１－６抗体を固着させたＥＬＩＳＡにおける反応のピークが、抗酸化リン脂質抗体を固着させたＥＬＩＳＡおよび抗ＭＤＡ－ＬＤＬ抗体を固着させたＥＬＩＳＡ、すなわち市販の酸化ＬＤＬのＥＬＩＳＡにおける反応のピークと一致したことから、ＴＧ－ｒｉｃｈ ＬＤＬが酸化ＬＤＬであること、およびＧ１１－６抗体は酸化ＬＤＬに反応することが確認された。
　一方、図１２のＢに示すように、若年健常者では溶出番号１３においてＴＣ濃度が最大となったのに対し、溶出番号１４において、Ｇ１１－６抗体を固着させたＥＬＩＳＡ、抗酸化リン脂質抗体を固着させたＥＬＩＳＡおよび抗ＭＤＡ－ＬＤＬ抗体を固着させたＥＬＩＳＡのいずれも吸光度が最大となった。
　これらの結果から、健常者にはｎａｔｉｖｅ－ＬＤＬと比較して粒子サイズの小さい、酸化ＬＤＬ、すなわち酸化型のｓｍａｌｌ ｄｅｎｓｅ ＬＤＬが存在すること、Ｇ１１－６抗体はこのような酸化ＬＤＬに対して反応することおよび健常者においては酸化型のｓｍａｌｌ ｄｅｎｓｅ ＬＤＬと特異的に反応することが確認された。
（２）血清のゲル濾過溶出液に対する各種ＥＬＩＳＡの反応性
　肝疾患患者１名、非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）患者１名、脂質異常症患者２名（脂質異常症１、脂質異常症２とする）および健常者２名（健常者１、健常者２とする）から血清合計６サンプルを採取し、実施例１（５）に記載の方法によりゲル濾過クロマトグラフィーを行って、溶出液を０．５ｍＬずつ分取し、分取した順に溶出番号１、溶出番号２、・・・・溶出番号２８とした。その後、溶出番号１～２８の各溶出液について実施例５（１）に記載の方法によりＴＣ濃度、ＴＧ濃度およびＰＬ濃度を測定した。
　続いて、溶出番号１、３、５、８、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１８、２１、２４および２８の各溶出液をサンプルとして、実施例３（２）［２－２］に記載の方法によりＧ１１－６抗体を固着させたＥＬＩＳＡを、付属の検体希釈液を用いて、溶出番号１、３、５、８、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１８、および２４の各溶出液を５００倍に希釈し、これらをサンプルとして実施例３（４）に記載の方法により抗ＭＤＡ－ＬＤＬ抗体を固着させたＥＬＩＳＡを、それぞれ行った。
　脂質濃度測定および各種のＥＬＩＳＡの、肝疾患患者（ｎ＝１）血清についての結果を図１３に、ＮＡＳＨ患者（ｎ＝１）血清についての結果を図１４に、脂質異常症患者（ｎ＝２）血清についての結果を図１５に、健常者（ｎ＝２）血清についての結果を図１６にそれぞれ示す。
　図１３に示すように、肝疾患患者では、溶出番号１３においてＴＣ濃度、ＴＧ濃度、ＰＬ濃度、Ｇ１１－６抗体を固着させたＥＬＩＳＡの吸光度および抗ＭＤＡ－ＬＤＬ抗体を固着させたＥＬＩＳＡの吸光度がいずれも最大となった。
　この結果は本実施例（１）の図１２のＡと同様の結果であり、Ｇ１１－６抗体はＴＧ－ｒｉｃｈ ＬＤＬに特異的に反応すること、ＴＧ－ｒｉｃｈ ＬＤＬが酸化ＬＤＬであることおよびＧ１１－６抗体は酸化ＬＤＬに反応することが確認された。
　また、図１４に示すように、ＮＡＳＨ患者では、溶出番号１４においてＴＣ濃度およびＰＬ濃度が、溶出番号５においてＴＧ濃度が、溶出番号１３においてＧ１１－６抗体を固着させたＥＬＩＳＡの吸光度が、溶出番号１５において抗ＭＤＡ－ＬＤＬ抗体を固着させたＥＬＩＳＡの吸光度が、それぞれ最大となった。
　この結果から、ＮＡＳＨ患者にはｎａｔｉｖｅ－ＬＤＬと同様の粒子サイズの酸化ＬＤＬが存在すること、Ｇ１１－６抗体はそのような酸化ＬＤＬに対して反応することおよびＮＡＳＨ患者においてはｎａｔｉｖｅ－ＬＤＬと同様の粒子サイズの酸化ＬＤＬと特異的に反応することが確認された。また、抗ＭＤＡ－ＬＤＬ抗体がｎａｔｉｖｅ－ＬＤＬと比較して粒子サイズの小さい酸化ＬＤＬ、すなわち酸化型のｓｍａｌｌ ｄｅｎｓｅ ＬＤＬに対して反応が大きいのに対し、Ｇ１１－６抗体が酸化型ｓｍａｌｌ ｄｅｎｓｅ ＬＤＬに対して反応が小さいのは、下記の実施例で示すように、ＮＡＳＨ患者における酸化型ｓｍａｌｌ ｄｅｎｓｅ ＬＤＬが高度に酸化されているためと本発明者らは考えている。
　また、図１５に示すように、脂質異常症患者では、溶出番号１３においてＴＣ濃度、ＴＧ濃度およびＰＬ濃度が、溶出番号１１においてＧ１１－６抗体を固着させたＥＬＩＳＡの吸光度が、溶出番号１４または溶出番号１５において抗ＭＤＡ－ＬＤＬ抗体を固着させたＥＬＩＳＡの吸光度が、それぞれ最大となった。
　この結果から、脂質異常症患者にはｎａｔｉｖｅ－ＬＤＬと比較して粒子サイズの大きい酸化ＬＤＬ、すなわち酸化型のレムナントリポタンパク質が存在すること、Ｇ１１－６抗体はそのような酸化ＬＤＬに対して反応することおよび脂質異常症患者においては酸化型のレムナントリポタンパク質と特異的に反応することが確認された。一方、抗ＭＤＡ－ＬＤＬ抗体は、酸化型のレムナントリポタンパク質に対し、あまり反応しないことが確認された。また、ＮＡＳＨ患者血清の場合と同様、脂質異常症患者血清においては、抗ＭＤＡ－ＬＤＬ抗体がｎａｔｉｖｅ－ＬＤＬと比較して粒子サイズの小さい酸化ＬＤＬ、すなわち酸化型のｓｍａｌｌ ｄｅｎｓｅ ＬＤＬに対して反応が大きいのに対し、Ｇ１１－６抗体が酸化型のｓｍａｌｌ ｄｅｎｓｅ ＬＤＬに対して反応が小さいのは、下記の実施例で示すように、脂質異常症患者における酸化型のｓｍａｌｌ ｄｅｎｓｅ ＬＤＬが高度に酸化されているためと本発明者らは考えている。
　また、図１６に示すように、健常者では、溶出番号１３においてＴＣ濃度およびＰＬ濃度が、溶出番号１３または溶出番号５においてＴＧ濃度が、溶出番号１６においてＧ１１－６抗体を固着させたＥＬＩＳＡの吸光度が、溶出番号１５において抗ＭＤＡ－ＬＤＬ抗体を固着させたＥＬＩＳＡの吸光度が、それぞれ最大となった。
　この結果は本実施例（１）の図１２のＢと同様の結果であり、健常者にはｎａｔｉｖｅ－ＬＤＬと比較して粒子サイズの小さい酸化ＬＤＬ、すなわち酸化型のｓｍａｌｌ ｄｅｎｓｅ ＬＤＬが存在すること、Ｇ１１－６抗体はそのような酸化ＬＤＬに対して反応することおよび健常者においては酸化型のｓｍａｌｌ ｄｅｎｓｅ ＬＤＬと特異的に反応することが再度確認された。
　また、図１３～１６の結果から、密度勾配遠心法による総リポタンパク質画分の分離を行わずに血清を直接ゲル濾過クロマトグラフィーに供して得た溶出液に対しても、Ｇ１１－６抗体を固着させたＥＬＩＳＡは、酸化ＬＤＬを特異的に検出するのに十分な感度を有することが確認された。
＜実施例７＞金属酸化ＬＤＬに対するＧ１１－６抗体を固着させたＥＬＩＳＡの反応性
（１）ｎａｔｉｖｅ－ＬＤＬ画分の調製
［１－１］密度勾配遠心法によるリポタンパク質の分離
　健常者から血清を採取し、既報（Ｈｉｒａｎｏ Ｔ．ら、Ｊ．Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ、第１２巻、第６７～７２頁、２００５年）に従って密度勾配遠心法を行い、リポタンパク質を分離した。具体的には、健常者血清２ｍＬを比重ｄがｄ＝１．０１９ｋｇ／Ｌとなるように調製し、超遠心機ＯｐｔｉｍａＭＡＸ ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ（ベックマン・コールター社）およびローターＭＬＮ－８０（ベックマン・コールター社）を用いて、４００００ｒｐｍ、１５℃の条件下で２０時間遠心分離を行った後、上層（ｄ＜１．０１９ｋｇ／Ｌ）をＡ画分として回収した。続いて、下層を比重ｄがｄ＝１．０６３ｋｇ／Ｌとなるように調製し、上記の超遠心機およびローターを用いて５００００ｒｐｍ、１５℃の条件下で１８時間遠心分離を行った。ここで得られた上層（１．０１９ｋｇ／Ｌ＜ｄ＜１．０６３ｋｇ／Ｌ）をＢ画分とし、下層をＣ画分としてそれぞれ回収した。
［１－２］ポリアクリルアミドゲル電気泳動法によるリポタンパク質の確認
　本実施例（１）［１－１］の健常者血清、Ａ画分、Ｂ画分およびＣ画分について、市販リポタンパク質分析キット（リポフォー；常光社）を用いて、付属の使用書に従い、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法を行った。その結果を図１７に示す。
　図１７に示すように、Ｂ画分はＡ画分およびＣ画分と異なり、ＨＤＬを含まないとともにＬＤＬを含むことから、Ｂ画分をｎａｔｉｖｅ－ＬＤＬ溶液とした。
［１－３］ｎａｔｉｖｅ－ＬＤＬ溶液のタンパク質濃度測定
　本実施例（１）［１－１］のＢ画分すなわちｎａｔｉｖｅ－ＬＤＬ溶液について、ＰＢＳを透析液として４℃で一晩透析を行った。その後、実施例１（２）［２－４］に記載の方法によりタンパク質濃度測定を行い、ＰＢＳを用いて０．５ｍｇ／ｍＬに希釈した。
（２）金属酸化ＬＤＬの調製
　本実施例（１）［１－３］のｎａｔｉｖｅ－ＬＤＬ溶液（０．５ｍｇ／ｍＬ）１２０μＬに、下記の濃度および量の硫酸銅を添加し、３７℃で０．５時間、１時間、２時間、４時間、８時間および２４時間インキュベートすることにより、下記の通り様々な酸化度の金属酸化ＬＤＬ溶液を調製した。
〈ａ－〉　　２５０μｍｏｌ／Ｌ硫酸銅１．６μＬ　透析なし　酸化処理終了直後に使用
〈ａ－１〉　２５０μｍｏｌ／Ｌ硫酸銅１．６μＬ　透析なし　４℃で２４時間保管
〈ａ－１ｗ〉２５０μｍｏｌ／Ｌ硫酸銅１．６μＬ　透析なし　４℃で１週間保管
〈ａ＋１〉　２５０μｍｏｌ／Ｌ硫酸銅１．６μＬ　透析あり　４℃で一晩透析
〈ａ＋１ｗ〉２５０μｍｏｌ／Ｌ硫酸銅１．６μＬ　透析あり　４℃で一晩透析の後、４℃で６日間保管
〈ｂ－〉　　５００μｍｏｌ／Ｌ硫酸銅１．６μＬ　透析なし　酸化処理終了直後に使用
〈ｃ－〉　　５００μｍｏｌ／Ｌ硫酸銅６．０μＬ　透析なし　酸化処理終了直後に使用
〈ｄ－〉　１０００μｍｏｌ／Ｌ硫酸銅６．０μＬ　透析なし　酸化処理終了直後に使用
　上記〈ａ－〉、〈ｂ－〉、〈ｃ－〉および〈ｄ－〉については、各設定時間のインキュベート後、速やかに使用した。上記〈ａ－１〉については各設定時間のインキュベートに続き、４℃で２４時間保管した後に使用した。上記〈ａ－１ｗ〉については各設定時間のインキュベートに続き、４℃で１週間保管した後に使用した。上記〈ａ＋１〉については、各設定時間のインキュベートに続き、ＰＢＳを透析液として４℃で一晩透析を行った後に使用した。上記〈ａ＋１ｗ〉については各設定時間のインキュベートに続き、ＰＢＳを透析液として４℃で一晩透析を行い、続いて４℃で６日間保管した後に使用した。
（３）金属酸化ＬＤＬの酸化度の確認
　本実施例（２）の〈ａ＋１〉の金属酸化ＬＤＬ溶液について、実施例１（１）に記載の方法により、アガロースゲル電気泳動を行った。その結果を図１８に示す。
　図１８に示すように、金属酸化ＬＤＬでは、ｎａｔｉｖｅ－ＬＤＬに比較して陽極側に移動した位置でバンドが検出された。また、陽極側への移動距離は、硫酸銅添加後のインキュベート時間に比例して大きくなった。この結果から、硫酸銅添加後のインキュベート時間が長さに比例して、ｎａｔｉｖｅ－ＬＤＬの酸化が進行することが確認された。
（４）金属酸化ＬＤＬに対するＧ１１－６抗体を固着させたＥＬＩＳＡの反応性（硫酸銅添加量についての比較）
　実施例３（２）［２－２］に記載の方法により、Ｇ１１－６抗体を固着させたＥＬＩＳＡを行った。ただし、サンプルは実施例３（１）の血清サンプルに代えて、本実施例（２）の〈ａ－〉、〈ｂ－〉、〈ｃ－〉および〈ｄ－〉の金属酸化ＬＤＬをそれぞれ用いた。その結果を図１９に示す。
　図１９に示すように、〈ａ－〉では、酸化時間２時間まで吸光度が上昇し、酸化時間４時間以上では吸光度が低下し、酸化時間２４時間においてｎａｔｉｖｅ－ＬＤＬと同程度の吸光度となった。〈ｂ－〉では、酸化時間１時間まで吸光度が上昇し、酸化時間２時間以上では吸光度が低下し、酸化時間８時間以上においてｎａｔｉｖｅ－ＬＤＬと同程度の吸光度となった。〈ｃ－〉および〈ｄ－〉では、酸化時間０．５時間で吸光度が最大となり、酸化時間１時間以上では吸光度が低下し、酸化時間８時間以上においてｎａｔｉｖｅ－ＬＤＬと同程度の吸光度となった。
　これらの結果から、Ｇ１１－６抗体を固着させたＥＬＩＳＡは、軽度に酸化された酸化ＬＤＬ（軽度酸化ＬＤＬ）に対しては反応が大きく、酸化されていないｎａｔｉｖｅ－ＬＤＬおよび高度に酸化された酸化ＬＤＬ（高度酸化ＬＤＬ）に対しては反応が小さいことが確認された。
（５）ＴＢＡＲＳ法による金属酸化ＬＤＬの過酸化脂質濃度測定
　本実施例（２）の〈ａ－〉および〈ｃ－〉の金属酸化ＬＤＬについて、ＴＢＡＲＳ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（ケイマンケミカル社）を用いて、付属の使用書に従い過酸化脂質濃度測定を行った。具体的には、等量の酢酸と水酸化ナトリウムを混合し、３６．８ｍｍｏｌ／ＬとなるようＴｈｉｏｂａｒｂｉｔｕｒｉｃ ａｃｉｄを加えて溶解することにより発色試薬を調製した。本実施例（２）の〈ａ－〉および〈ｃ－〉の金属酸化ＬＤＬ溶液２５μＬずつに対し、１ｍＬの発色試薬および２５μＬのＳＤＳ溶液をそれぞれ加えて混合し、１００℃で１時間インキュベートした後、１分間氷中に置いて反応を停止させた。続いて室温、１２０００ｒｐｍの条件下で１０分間遠心分離を行った後、上清を回収して９６穴マイクロプレート（住友ベークライト社）に１５０μＬ／ウェル入れ、波長５５０ｎｍの吸光度をマイクロプレートリーダー（Ｍｏｄｅｌ６８０；Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を用いて測定した。〈ａ－〉についての結果を、本実施例（４）の〈ａ－〉についての結果と合わせて図２０のＡに、〈ｃ－〉についての結果を、本実施例（４）の〈ｃ－〉についての結果と合わせて図２０のＢに、それぞれ示す。
　図２０のＡおよび図２０のＢに示すように、過酸化脂質濃度は〈ａ－〉と〈ｃ－〉とで同様の変化が検出された。すなわち、いずれの場合も酸化時間が２時間を経過するまでは過酸化脂質濃度が上昇し、酸化時間が４時間を経過すると過酸化脂質濃度が緩やかに低下した。一方、Ｇ１１－６抗体を固着させたＥＬＩＳＡでは、〈ａ－〉と〈ｃ－〉とで異なる吸光度の変化が検出された。すなわち、〈ａ－〉の場合は酸化時間が２時間を経過するまでは吸光度が上昇し、酸化時間が４時間を経過すると吸光度が急激に低下し、酸化時間が２４時間でｎａｔｉｖｅ－ＬＤＬと同程度の吸光度となったのに対し、〈ｃ－〉の場合は酸化時間が０．５時間で吸光度が最大となり、酸化時間が１時間を経過すると吸光度が急激に低下し、酸化時間が８時間でｎａｔｉｖｅ－ＬＤＬと同程度の吸光度となった。
　これらの結果から、Ｇ１１－６抗体を固着させたＥＬＩＳＡの反応性が、軽度酸化ＬＤＬに対して大きく、高度酸化ＬＤＬに対して小さいのに対し、チオバルビツール酸の反応性が、軽度酸化ＬＤＬと高度酸化ＬＤＬのいずれに対しても同様であることが確認された。
（６）金属酸化ＬＤＬに対するＧ１１－６抗体を固着させたＥＬＩＳＡの反応性（金属酸化ＬＤＬの２４時間保管および透析処理の有無についての比較）
　実施例３（２）［２－２］に記載の方法により、Ｇ１１－６抗体を固着させたＥＬＩＳＡを行った。ただし、サンプルは実施例３（１）の血清サンプルに代えて、本実施例（２）の〈ａ－１〉および〈ａ＋１〉の金属酸化ＬＤＬをそれぞれ用いた。その結果を、本実施例（４）の〈ａ－〉についての結果と合わせて図２１のＡに示す。
　また、本実施例（２）の〈ａ－１〉および〈ａ＋１〉の金属酸化ＬＤＬについて、本実施例（５）に記載の方法により過酸化脂質濃度測定を行った。その結果を、本実施例（５）の〈ａ－〉についての結果と合わせて図２１のＢに示す。
　図２１のＡに示すように、Ｇ１１－６抗体を固着させたＥＬＩＳＡでは、〈ａ－１〉の場合は、酸化時間が１時間を経過するまでは吸光度が上昇し、酸化時間が２時間を経過すると吸光度が低下し、酸化時間が約１６時間でｎａｔｉｖｅ－ＬＤＬと同程度の吸光度となった。また、〈ａ＋１〉の場合は、酸化時間が２時間を経過するまでは吸光度が上昇し、酸化時間が４時間を経過すると吸光度が下降し、酸化時間が約１６時間でｎａｔｉｖｅ－ＬＤＬと同程度の吸光度となった。
　これらの結果から、Ｇ１１－６抗体を固着させたＥＬＩＳＡで、〈ａ－〉および〈ａ＋１〉の場合と比較して、〈ａ－１〉の場合は、より短い酸化時間の金属酸化ＬＤＬに対して吸光度が最大となることから、金属酸化ＬＤＬは４℃での保管中に酸化が進むことが確認された。また、〈ａ－〉の場合と比較して、〈ａ＋１〉の場合は、吸光度がほぼ同値か若干小さい値となることから、金属酸化ＬＤＬにおけるＧ１１－６抗体の抗原は、透析により除去される物質ではないことが確認された。また、〈ａ－〉と比較して、〈ａ－１〉および〈ａ＋１〉において酸化時間が２時間を経過した場合では、吸光度が若干小さい値となることから、酸化時間が２時間を経過した金属酸化ＬＤＬは、透析処理の有無にかかわらず、４℃で２４時間保管することによりＧ１１－６抗体に対する反応性が低下することが確認された。
　一方、図２１のＢに示すように、〈ａ－１〉の場合、過酸化脂質濃度は酸化時間が４時間を経過するまでは上昇し、酸化時間が８時間を経過すると緩やかに低下した。これに対し、〈ａ＋１〉の場合は、〈ａ－〉および〈ａ－１〉の場合と比較して、酸化時間にかかわらず過酸化脂質濃度が顕著に低下した。
　これらの結果から、〈ａ－１〉の場合は過酸化脂質濃度の変化が〈ａ－〉の場合と相似していることから、４℃で保管することにより、チオバルビツール酸への反応性を担う過酸化脂質濃度は変化しないことが確認された。また、金属酸化ＬＤＬにおけるチオバルビツール酸反応性物質は、透析により除去され得る物質であることが確認された。
（７）金属酸化ＬＤＬに対するＧ１１－６抗体を固着させたＥＬＩＳＡの反応性（金属酸化ＬＤＬの１週間保管および透析処理の有無についての比較）
　実施例３（２）［２－２］に記載の方法により、Ｇ１１－６抗体を固着させたＥＬＩＳＡを行った。ただし、サンプルは実施例３（１）の血清サンプルに代えて、本実施例（２）の〈ａ－１ｗ〉および〈ａ＋１ｗ〉の金属酸化ＬＤＬのうち、硫酸銅添加後のインキュベート時間が０．５時間、１時間、２時間および４時間のものをそれぞれ用いた。その結果を、本実施例（６）のＧ１１－６抗体を固着させたＥＬＩＳＡの結果と合わせて図２２に示す。
　図２２に示すように、〈ａ－１ｗ〉と〈ａ＋１ｗ〉とで同様の吸光度の変化が検出され、いずれの場合も、酸化時間０．５時間で吸光度が最大となり、酸化時間が１時間を経過すると吸光度が低下した。また、〈ａ－〉、〈ａ－１〉および〈ａ＋１〉と比較して、〈ａ－１ｗ〉および〈ａ＋１ｗ〉では、酸化時間が１時間を経過すると吸光度が低下した。
　これらの結果から、酸化時間が１時間を経過した金属酸化ＬＤＬは、透析処理の有無にかかわらず、４℃で１週間保管することによってＧ１１－６抗体に対する反応性が低下することが確認された。
＜実施例８＞金属酸化ＬＤＬに対するＧ１１－６抗体を固着させたＥＬＩＳＡの反応性（各種の抗体を固着させたＥＬＩＳＡの反応性との比較）
（１）金属酸化ＬＤＬの調製
　実施例７（１）［１－３］のｎａｔｉｖｅ－ＬＤＬ溶液（０．５ｍｇ／ｍＬ）１２０μＬに、３．３３μｍｏｌ／Ｌとなるよう硫酸銅を添加し、３７℃で０．５時間、１時間、２時間、３時間、４時間、６時間、８時間および２４時間インキュベートすることにより、様々な酸化度の金属酸化ＬＤＬ溶液を調製した。調製した金属酸化ＬＤＬ溶液は速やかにＥＬＩＳＡのサンプルとして使用した。
（２）金属酸化ＬＤＬに対する各種のＥＬＩＳＡ
　本実施例（１）で調製した金属酸化ＬＤＬをサンプルとして、実施例３（２）［２－２］に記載の方法によりＧ１１－６抗体を固着させたＥＬＩＳＡを、付属の検体希釈液を用いて、本実施例（１）で調製した金属酸化ＬＤＬを２５００倍に希釈し、これらをサンプルとして実施例３（３）に記載の方法により抗酸化リン脂質抗体を固着させたＥＬＩＳＡを、付属の検体希釈液を用いて、本実施例（１）で調製した金属酸化ＬＤＬを１０００倍に希釈し、これらをサンプルとして実施例３（４）に記載の方法により抗ＭＤＡ－ＬＤＬ抗体を固着させたＥＬＩＳＡを、それぞれ行った。
　また、各酸化時間の金属酸化ＬＤＬにおけるアポリポタンパク質Ｂの状態を確認するため、抗アポリポタンパク質Ｂ抗体を固相化抗体とし、かつ抗アポリポタンパク質Ｂ抗体を検出用抗体とするサンドイッチＥＬＩＳＡを行った。具体的には、実施例３（２）［２－２］に記載の方法によりＥＬＩＳＡを行った。ただし、５μｇ／ｍＬの実施例１（５）のＧ１１－６抗体に代えて、１０μｇ／ｍＬの実施例３（２）〈２－１－２〉のヤギ抗アポリポタンパク質Ｂポリクローナル抗体を用いた。また、２０倍に希釈した実施例３（１）の血清サンプルに代えて、０．１μｇ／ｍＬに希釈した本実施例（１）で調製した金属酸化ＬＤＬ溶液を用いた。また、２５０倍に希釈したＡＬＰ－ＳＡ（Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）に代えて５００倍に希釈したＡＬＰ－ＳＡ（Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を用いた。
（３）ＴＢＡＲＳ法による金属酸化ＬＤＬの過酸化脂質濃度測定
　実施例７（５）に記載の方法によりＴＢＡＲＳ法を行い、本実施例（１）で調製した金属酸化ＬＤＬの過酸化脂質濃度を測定した。
（４）金属酸化ＬＤＬの共役ジエンの測定
　脂質の酸化の指標とするため、各酸化時間の金属酸化ＬＤＬにおける共役ジエンを測定した。具体的には、ＰＢＳを用いて本実施例（１）で調製した金属酸化ＬＤＬを０．０４ｍｇ／ｍＬに希釈し、分光光度計（Ｖ－５３０；日本分光社）を用いて波長２３４ｎｍの吸光度を測定した。
　本実施例（２）、（３）および（４）の結果を図２３に示す。図２３に示すように、Ｇ１１－６抗体を固着させたＥＬＩＳＡでは、酸化時間が３時間を経過するまでは吸光度が上昇し、酸化時間が４時間を経過すると吸光度が低下し、酸化時間が８時間でｎａｔｉｖｅ－ＬＤＬと同程度の吸光度となり、酸化時間が２４時間では酸化前より吸光度が低くなった。一方、抗酸化リン脂質抗体を固着させたＥＬＩＳＡでは、酸化時間が８時間を経過するまでは吸光度が上昇し、酸化時間２４時間で吸光度がやや低下した。抗ＭＤＡ－ＬＤＬ抗体を固着させたＥＬＩＳＡでは、酸化時間が３時間を経過するまでは吸光度が上昇し、酸化時間が４時間を経過すると吸光度が低下し、酸化時間が２４時間でｎａｔｉｖｅ－ＬＤＬと同程度の吸光度となった。抗アポリポタンパク質Ｂ抗体を固相化抗体および検出用抗体とするＥＬＩＳＡでは、酸化時間が８時間を経過するまでは吸光度が高く、酸化時間が２４時間で吸光度がやや低下した。ＴＢＡＲＳ法においては、過酸化脂質濃度は、酸化時間が４時間を経過するまでは上昇し、酸化時間が８時間を経過するとやや低下した。共役ジエンの測定では、酸化時間が３時間を経過するまでは吸光度が急激に上昇し、４時間を経過すると酸化時間においても吸光度は徐々に上昇した。
　これらの結果から、Ｇ１１－６抗体を固着させたＥＬＩＳＡは、軽度酸化ＬＤＬに反応が大きく、酸化されていないｎａｔｅｖｅ－ＬＤＬおよび高度酸化ＬＤＬに対しては反応が小さいことが確認された。また、Ｇ１１－６抗体を固着させたＥＬＩＳＡの吸光度の変化は、抗ＭＤＡ－ＬＤＬ抗体を固着させたＥＬＩＳＡおよび抗酸化リン脂質抗体を固着させたＥＬＩＳＡの、いずれの吸光度の変化とも異なることから、Ｇ１１－６抗体は酸化ＬＤＬにおいて、抗ＭＤＡ－ＬＤＬ抗体および抗酸化リン脂質抗体とは異なる部位を抗原として認識することが確認された。さらに、Ｇ１１－６抗体が抗原とする部位は、チオバルビツール酸および共役ジエンへの反応性を担う過酸化脂質濃度およびアポリポタンパク質Ｂとも相関するものではないことが確認された。
[規則26に基づく補充 01.06.2011]　
Figure WO-DOC-RO134

Claims (16)

  1. 　モノクローナル抗体を固相化抗体とし、かつ抗アポリポタンパク質Ｂ抗体を検出用抗体とするＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）において、下記（ａ）で示される抗原と前記モノクローナル抗体との反応の度合いと比較して、下記（ｂ）で示される抗原と前記モノクローナル抗体との反応の度合いが小となる、酸化低密度リポタンパク質に対し特異的に反応するモノクローナル抗体；
    （ａ）最終濃度０．４９３ｇ／Ｌの正常な低密度リポタンパク質（ｎａｔｉｖｅ－ＬＤＬ）に最終濃度３．２９μｍｏｌ／Ｌの硫酸銅を３７℃で０．５時間反応させて得られる金属酸化低密度リポタンパク質、
    （ｂ）最終濃度０．４９３ｇ／Ｌの正常な低密度リポタンパク質（ｎａｔｉｖｅ－ＬＤＬ）に最終濃度３．２９μｍｏｌ／Ｌの硫酸銅を３７℃で２４時間反応させて得られる金属酸化低密度リポタンパク質。
  2. 　酸化低密度リポタンパク質がトリグリセリド高含有低密度リポタンパク質（ＴＧ－ｒｉｃｈ ＬＤＬ）である、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
  3. 　酸化低密度リポタンパク質がヒトの酸化低密度リポタンパク質である、請求項１または請求項２に記載のモノクローナル抗体。
  4. 　健常者において酸化型のｓｍａｌｌ ｄｅｎｓｅ ＬＤＬと特異的に反応するモノクローナル抗体。
  5. 　非アルコール性脂肪性肝炎（Ｎｏｎ－ａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ；ＮＡＳＨ）患者においてｎａｔｉｖｅ－ＬＤＬと同様の粒子サイズの酸化ＬＤＬと特異的に反応するモノクローナル抗体。
  6. 　脂質異常症患者において酸化型のレムナントリポタンパク質と特異的に反応するモノクローナル抗体。
  7. 　配列番号１０のアミノ酸配列を含む可変領域を含んでなる、請求項１から請求項６のいずれかに記載のモノクローナル抗体。
  8. 　下記（ａ）の可変領域および／または（ｂ）の可変領域を含んでなる、（１）から（７）のいずれかに記載のモノクローナル抗体；（ａ）Ｎ末端から順に、配列番号８のアミノ酸配列、配列番号９のアミノ酸配列および配列番号１０のアミノ酸配列を含む可変領域、（ｂ）Ｎ末端から順に、配列番号１３のアミノ酸配列、配列番号１４のアミノ酸配列および配列番号１５のアミノ酸配列を含む可変領域。
  9. 　配列番号７のアミノ酸配列からなる可変領域を含んでなる、請求項１から請求項８のいずれかに記載のモノクローナル抗体。
  10. 　配列番号１２のアミノ酸配列からなる可変領域を含んでなる、請求項１から請求項９のいずれかに記載のモノクローナル抗体。
  11. 　受託番号がＮＩＴＥ ＢＰ－９１６であるハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体。
  12. 　請求項１から請求項１１のいずれかに記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
  13. 　受託番号がＮＩＴＥ ＢＰ－９１６である、請求項１２に記載のハイブリドーマ。
  14. 　請求項１から請求項１１のいずれかに記載のモノクローナル抗体を含んでなる、酸化低密度リポタンパク質検出用キット。
  15. 　被検者から採取した生体試料に含まれる酸化低密度リポタンパク質を検出する方法であって、
    　請求項１から請求項１１のいずれかに記載のモノクローナル抗体を、被検者から採取した生体試料に含まれる酸化低密度リポタンパク質に特異的に反応させて複合体を形成させる工程と、
    　前記複合体を検出する工程と
    　を有する、前記方法。
  16. 　被検者から採取した生体試料に含まれる酸化低密度リポタンパク質を検出する方法であって、
    　請求項１から請求項１１のいずれかに記載のモノクローナル抗体を担体に固着する工程と、
    　担体に固着した前記モノクローナル抗体を、被検者から採取した生体試料に含まれる酸化低密度リポタンパク質に特異的に反応させて複合体を形成させる工程と、
    　前記複合体を検出する工程と
    　を有する、前記方法。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104914255A (zh) * 2015-05-21 2015-09-16 北京协和洛克生物技术有限责任公司 一种检测样本中氧化低密度脂蛋白浓度的试剂盒及其制备方法
CN111855988A (zh) * 2019-04-25 2020-10-30 常州博闻迪医药股份有限公司 一种氧化低密度脂蛋白荧光检测试剂盒及制备方法
WO2022049858A1 (ja) * 2020-09-07 2022-03-10 国立大学法人北海道大学 非アルコール性脂肪性肝炎の診断方法
EP4080221A4 (en) * 2020-02-04 2023-06-28 Denka Company Limited Method for assisting detection of non-alcoholic steatohepatitis

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103630695A (zh) * 2013-11-20 2014-03-12 中国人民解放军南京军区南京总医院 一种同时测定人血清氧化脂蛋白（a）和氧化低密度脂蛋白的化学发光成像免疫分析方法
US10858422B2 (en) 2016-05-31 2020-12-08 Abcentra, Llc Methods for treating systemic lupus erythematosus with an anti-apolipoprotein B antibody
US10434141B2 (en) 2016-05-31 2019-10-08 Abcentra, Llc Methods for treating systemic lupus erythematosus with an anti-apolipoprotein B antibody
US11725002B2 (en) * 2017-04-28 2023-08-15 Ken-ichi YAMADA Detection reagents and kit for identifying oxidized state and glycated state of low-density lipoproteins
CN110749731A (zh) * 2019-10-18 2020-02-04 北京协和洛克生物技术有限责任公司 定量检测氧化低密度脂蛋白的时间分辨免疫层析试剂盒及应用
CN115003319A (zh) * 2019-11-12 2022-09-02 艾比中心有限责任公司 用于治疗癌症的方法和组合物
CN112904027A (zh) * 2019-12-04 2021-06-04 苏州普瑞斯生物科技有限公司 一种氧化型低密度脂蛋白的检测试剂盒及制备方法
CN116836940B (zh) * 2023-07-27 2024-01-09 广州市进德生物科技有限公司 一种氧化低密度脂蛋白的单克隆抗体及分泌其单克隆抗体的杂交瘤细胞株与应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH04159300A (ja) * 1989-12-15 1992-06-02 Eli Lilly & Co ヒトアテローム関連抗原と反応するモノクローナル抗体

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH095323A (ja) 1995-04-21 1997-01-10 Wako Pure Chem Ind Ltd 酸化低比重リポ蛋白質の測定方法
CN1981054A (zh) * 2004-05-14 2007-06-13 加利福尼亚大学董事会 用抗wnt2单克隆抗体和sirna治疗癌症的方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH04159300A (ja) * 1989-12-15 1992-06-02 Eli Lilly & Co ヒトアテローム関連抗原と反応するモノクローナル抗体

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
NAGASAKA H. ET AL.: "Evaluation of risk for atherosclerosis in Alagille syndrome and progressive familial intrahepatic cholestasis: two congenital cholestatic diseases with different lipoprotein metabolisms", J. PEDIATR., vol. 146, no. 3, March 2005 (2005-03-01), pages 329 - 335 *
SATOKO ABE: "Sanka LDL Elisa 'Daiichi' no Goshokai", THE SAITAMA JOURNAL OF MEDICAL TECHNOLOGY, vol. 56, no. 2, 2009, pages 240 - 241 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104914255A (zh) * 2015-05-21 2015-09-16 北京协和洛克生物技术有限责任公司 一种检测样本中氧化低密度脂蛋白浓度的试剂盒及其制备方法
CN111855988A (zh) * 2019-04-25 2020-10-30 常州博闻迪医药股份有限公司 一种氧化低密度脂蛋白荧光检测试剂盒及制备方法
EP4080221A4 (en) * 2020-02-04 2023-06-28 Denka Company Limited Method for assisting detection of non-alcoholic steatohepatitis
WO2022049858A1 (ja) * 2020-09-07 2022-03-10 国立大学法人北海道大学 非アルコール性脂肪性肝炎の診断方法

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