JP2020507775A

JP2020507775A - 喘息またはアレルギー疾患迅速診断用キット

Info

Publication number: JP2020507775A
Application number: JP2019543793A
Authority: JP
Inventors: キム，チャン−クン
Original assignee: インジェユニバーシティインダストリーアカデミックコーポレーションファウンデーション
Priority date: 2017-02-10
Filing date: 2018-02-09
Publication date: 2020-03-12
Anticipated expiration: 2038-02-09
Also published as: CN110352352B; CN110352352A; US11009506B2; KR20180093179A; US20200041506A1; WO2018147679A1; JP6807615B2

Abstract

基底部と、前記基底部上に形成される第１反応部と、前記第１反応部と前記基底部との間に形成された展開膜とを含むストリップを含む喘息診断用キットであり、前記第１反応部は、寄託番号ＫＣＬＲＦ−ＢＰ００３８９（寄託日：２０１７年１月９日、寄託機関：韓国細胞株研究財団（ＫＣＬＲＦ））のハイブリドーマ細胞株から発現される単一クローン抗体を含み、前記第２反応部は、寄託番号ＫＣＬＲＦ−ＢＰ００３８９（寄託日：２０１７年１月９日、寄託機関：韓国細胞株研究財団（ＫＣＬＲＦ））のハイブリドーマ細胞株から発現された単一クローン抗体を含む、喘息診断用キットが提供される。【選択図】図１

Description

本発明は、喘息またはアレルギー疾患診断用キットに関する。本発明は、従来、乳幼児または小児で診断が容易でなかった喘息またはアレルギー疾患を外部（病院、外来）または家で免疫クロマトグラフィー方法を利用して２０分以内に迅速に診断することができるキットに関する。

喘息とアレルギー疾患は、全世界的に有病率と重症度が増加している。アメリカでは、７％の小児が喘息を患っており、かつ気管支喘息と類似した気道疾患である慢性副鼻腔炎も１５％が訴えている。このような疾患の診断は容易ではなく、最近まで医者の診断を手伝うか、疾病が悪化しないように予防するための簡単な診断法がない。喘息やアレルギー疾患患者の気道内に慢性気道炎症反応が起きているということは一般的に知られているが、気道炎症反応を測定するような研究目的のいくつかの実験実績免疫測定法の他に簡単な臨床的診断法がないのが実情である。

特に、気道炎症が細菌感染のような微生物の感染によるものであるか、それとも喘息のようなアレルギー疾患におけるアレルギー免疫反応によるものであるかは区別し難い。このような理由により、喘息やアレルギー疾患のある患者が長年間抗生剤の投与を受けるなどの誤った治療を受ける場合が多い。

現在、気管支喘息の診断に利用される肺機能検査及びメタコリン気道過敏性検査は、様々な利用上の困難を有しているが、正確な結果を得るために、よく管理された装置、熟練の検査者、患者の積極的な呼応が必要であり、このような理由により、患者の呼応が難しい６歳以下の乳幼児または小児、高齢者、障害者、現在喘息が大きく悪化した患者などでは検査が難しいのが事実である。

また、大きな体力の消耗が要されるため、患者が検査に対する拒否感を持ち易く、繰り返して検査を進行し難い場合が多い。従って、過去から喘息の診断に役立つ非侵襲的または血液的な検査を開発しようとする試みがあったが、現在喘息患者で補助的に利用されている血中好酸球数、好酸球カチオン性タンパク質（ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｃａｔｉｏｎｉｃｐｒｏｔｅｉｎ；
ＥＣＰ）などがこれにあたる。これらは、正常人、その他のアレルギー疾患、喘息などで全て個人的な差が大きいと知られており、診断に利用することはできない。

従って、喘息とアレルギー疾患で最も重要な免疫反応である好酸球数炎症反応で測定可能な簡単な診断道具が開発できれば、喘息のような疾患の診断と治療に画期的な寄与ができるはずである。

本発明が解決しようとする課題は、喘息またはアレルギー疾患を、信頼性が高く迅速に診断できるキットを提供することにある。

本発明の喘息診断キットは、基底部と、前記基底部上に位置し、ハイブリドーマ細胞株（寄託番号ＫＣＬＲＦ−ＢＰ−００３８９）から発現される単一クローン抗体を含む第１反応部と、前記第１反応部と前記基底部との間に位置し、ハイブリドーマ細胞株（寄託番号ＫＣＬＲＦ−ＢＰ−００３８９）から発現される単一クローン抗体を含む第２反応部を含む展開膜とを含むストリップを含むことができる。

本発明のアレルギー診断キットは、基底部と、前記基底部上に位置し、ハイブリドーマ細胞株（寄託番号ＫＣＬＲＦ−ＢＰ−００３８９）から発現される単一クローン抗体を含む第１反応部と、前記第１反応部と前記基底部との間に位置し、ハイブリドーマ細胞株（寄託番号ＫＣＬＲＦ−ＢＰ−００３８９）から発現される単一クローン抗体を含む第２反応部を含む展開膜とを含むストリップを含むことができる。

本発明は、喘息またはアレルギー疾患を高信頼性で迅速に診断することができ、喘息またはアレルギー疾患の予後予測及びモニタリングキットを提供する。

本発明の一実施例による喘息診断キットに含まれるストリップの模式図である。喘息症状点数とＥＬＩＳＡ法で測定したＥＤＮ、ＥＣＰ、及び総好酸球数を比較した結果である。図２のａはＥＤＮ、図２のｂはＥＣＰ、図２のｃは総好酸球数と喘息症状点数の結果である。本発明による喘息診断キットとＥＬＩＳＡ法による診断時に相関関係を示したものである。本発明による喘息診断キットとＭＢＬによる診断の相関関係（ｒ＝０．８９３３）を示すものである。本発明による喘息診断キットとＢＦによる診断の相関関係（ｒ＝０．８７４８）を示すものである。

添付の図面を参考して、実施例によって本発明が属する技術分野で通常の知識を持った者が容易に実施できるように詳しく説明する。本発明は、様々な異なる形態で実現されることができ、ここで説明する実施例に限定されない。図面で本発明を明確に説明するために説明と関係ない部分は省略し、明細書全体を通じて同一または類似した構成要素については同一の名称を使用した。

本明細書において、「上部」と「下部」は図面を基準として定義したものであり、視点によって「上部」が「下部」に、「下部」が「上部」に変更されることができ、「上（ｏｎ）」または「上（ｏｎ）」と指称されるものは、直上だけでなく、中間に他の構造を介在した場合も含むことができる。一方、「直接上（ｄｉｒｅｃｔｌｙｏｎ）」または「真上」と指称されるものは、中間に他の構造を介在しないことを表す。

本明細書において、用語「ハイブリドーマ」は、２個の異なる種類の細胞を人工的に融合して作った細胞を意味する。ハイブリドーマ細胞は、ポリエチレングリコールなどの細胞融合を起こす物質や特定種のウイルスを使用して二つ以上の同種細胞や異種細胞を融合させることで製造されるが、ハイブリドーマ細胞を形成させることで、それぞれ異なる細胞が持つ異なる機能を一つの細胞に統合させることができるようになる。本発明の目的上、寄託番号ＫＣＬＲＦ−ＢＰ−００３８９（寄託日：２０１７年１月９日、寄託機関：韓国細胞株研究財団（ＫＣＬＲＦ））のハイブリドーマ細胞株から製造された単一クローン抗体を利用することができる。試料に含まれた好酸球由来ニューロトキシン（ＥＤＮ：ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌ−ｄｅｒｉｖｅｄｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ）が第１反応部１２０で単一クローン抗体と結合した後、展開膜１３０を通じて移動しながら第２反応部１４０に到逹すれば、第２反応部１４０で単一クローン抗体と結合して検出することができる。

本発明で使用される用語である「単一クローン抗体」とは、当該分野に公知された用語であり、単一抗原性部位（エピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅ））に対して指示される高度の特異的な抗体を意味する。通常、異なるエピトープに対して指示される異なる抗体を含む多クローン抗体とは違って、単一クローン抗体は、抗原上の単一エピトープに対して指示される。単一クローン抗体は、抗原−抗体結合を利用する診断及び分析学的分析法の選択性と特異性を改善させる長所があり、また融合細胞株（ハイブリドーマ（ｈｙｂｒｉｄｏｍａ））の培養またはファージディスプレイ（ｐｈａｇｅｄｉｓｐｌａｙ）方法によって生産されることができるため、他の兔疫グロブリンによって汚染しないという長所を持つ。

本発明の単一クローン抗体は、精製しない状態で使用されることができるが、当業界で通常使用される方法によって必要に応じて精製して使用されることができる。このような精製方法の例としては、透析、塩沈殿、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィーなどがあるが、上記例によって本発明の抗体精製方法が制限されるものではない。

また、本発明の単一クローン抗体は、抗原の特定エピトープを認識して抗原−抗体複合体の結合特性を持つ限り、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を有する形態だけでなく、抗体分子の機能的な断片を含む。上記抗体分子の機能的な断片とは、少なくとも抗原結合機能を保有している断片を意味し、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖなどであることができる。

本発明の単一クローン抗体は、軽鎖可変部位及び重鎖可変部位を全て含む単一クローン抗体であることができる。本発明の単一クローン抗体の軽鎖及び重鎖の可変部位は、「相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ−ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇｒｅｓｉｏｎ、ＣＤＲ）」と知られた３個の多変可能な領域及び４個の「構造領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋｒｅｇｉｏｎ、ＦＲ）」を含む。

上記ＣＤＲは、主に抗原のエピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅ）に結合する役割をする。それぞれの鎖のＣＤＲは、典型的にＮ−末端から順次にＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３と呼ばれ、また特定ＣＤＲが位置している鎖によって識別される。一方、本発明の単一クローン抗体は、相補性決定領域（ＣＤＲ）に公知の治療用抗体の構造領域（ＦＲ）を接合させて製造することができる。本発明では、上記単一クローン抗体の重鎖及び軽鎖の可変部位に対するＣＤＲｓの塩基配列を提供する。

抗原の特定エピトープを認識して抗原−抗体複合体を形成する抗体の主要部位である重鎖と軽鎖の可変部位、特にＣＤＲ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇｒｅｇｉｏｎ）が複合体の親和力を決めるので、既単一クローン抗体遺伝子をクローニングして抗体重鎖と軽鎖の可変部位に対する遺伝子塩基配列を分析することができる。塩基配列を分析するために、融合細胞株からＲＮＡを抽出してＭｏｕｓｅＩｇ−Ｐｒｉｍｅｒｓｅｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ、ＣＡ、ＵＳＡ）などを利用してＲＴ−ＰＣＲを行うことができる。

本明細書において、用語「キット」は、分析方法に適合した一種類またはそれ以上の他の構成成分組成物、溶液または装置が含まれることができる。

本発明の目的上、寄託番号ＫＣＬＲＦ−ＢＰ−００３８９（寄託日：２０１７年１月９日、寄託機関：韓国細胞株研究財団（ＫＣＬＲＦ））のハイブリドーマ細胞株から製造された単一クローン抗体を利用することができる。試料に含まれた好酸球由来ニューロトキシン（ＥＤＮ：ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌ−ｄｅｒｉｖｅｄｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ）が第１反応部１２０で単一クローン抗体と結合した後、展開膜１３０を通じて移動しながら第２反応部１４０に到達すれば、第２反応部１４０で単一クローン抗体と結合して検出することができる。上記単一クローン抗体は、マーカー、例えば、金、ＨＲＰ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）、アルカリフォスファターゼ（ａｌｋａｌｉｎｅｐｈｏｓｐｈｔａｓｅ）、蛍光物質（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）及び色素からなる群より選択された１種以上のマーカーを含むので、第２反応部の発色が表れれば喘息またはアレルギー疾患として検出することができる。

また、上記キットは、抗体生産細胞株の選別に必要な全ての生物学的または化学的試薬、案内書を含むことができる。案内書は、キットの使い方、例えば、提示される反応条件などを説明する印刷物である。案内書は、パンフレットまたはチラシ形態の案内ブック、キットに付着したラベル、及びキットを含むパッケージの表面上に説明を含むことができる。また、案内書は、インターネットのように電気媒体を通じて公開されるか提供される情報を含むことができる。

本明細書において、用語「喘息」は、呼吸困難、咳、荒い息の音などの症状が繰り返し、発作的に表れる疾患であり、「アレルギー」は、ある外来性物質と接した生体がその物質に対して正常とは異なる反応を表す現象を意味する。上記アレルギーは、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型及びＩＶ型に分類される。本発明の目的上、寄託番号ＫＣＬＲＦ−ＢＰ−００３８９（寄託日：２０１７年１月９日、寄託機関：韓国細胞株研究財団（ＫＣＬＲＦ））のハイブリドーマ細胞株から製造された単一クローン抗体を利用することができる。試料に含まれた好酸球由来ニューロトキシン（ＥＤＮ）が第１反応部１２０で単一クローン抗体と結合した後、展開膜１３０を通じて移動しながら第２反応部１４０に到逹すれば、第２反応部１４０で単一クローン抗体と結合して、喘息及びアレルギー、喘鳴（ｗｈｅｅｚｉｎｇ）を診断及び検出することができる。

本発明の一実施例による喘息診断キットを図１を参考して説明する。図１は、本発明の一実施例による喘息診断キットに含まれるストリップの模式図である。

図１を参考すると、本実施例による喘息診断のためのストリップ１００は、基底部１１０、基底部１１０上に形成され、単一クローン抗体を含む第１反応部１２０、及び第１反応部１２０と基底部１１０との間に形成された展開膜１３０を含むことができる。展開膜１３０は、第１反応部１２０と接している。展開膜１３０は、単一クローン抗体を含む第２反応部１４０及び第２反応部１４０と所定の間隔で離隔した対照部１５０を含む。

本実施例による喘息診断キットは、試料に含まれた好酸球由来ニューロトキシン（ＥＤＮ：ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌ−ｄｅｒｉｖｅｄｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ）が第１反応部１２０で単一クローン抗体と結合した後、展開膜１３０を通じて移動しながら第２反応部１４０に到逹すれば、第２反応部１４０で単一クローン抗体と結合して検出される。第２反応部１４０でＥＤＮと結合した第１反応部由来の単一クローン抗体と第２反応部由来の単一クローン抗体との結合を確認することで、試料中にＥＤＮがあることが確認できるため、試料が採取された患者に喘息があることを判断することができる。本実施例による喘息診断キットは、抗原ＥＤＮと単一クローン抗体間の免疫反応を利用した免疫クロマトグラフィーによって喘息またはアレルギー疾患を診断することができる。ＥＤＮは、喘息とアレルギー疾患のある患者の方が正常人に比べて高い。

前記試料は、被検体から採取されるもので、例えば、全血、血清、血漿、鼻腔洗浄液、気管支肺胞洗浄液、喀痰、リンパまたは細胞間液を含むことができる。被検体、即ち検査対象は特に制限されないが、乳幼児または小児になることができる。

本実施例による診断キットは、ＥＤＮに結合する第１反応部由来の単一クローン抗体と第２反応部由来の単一クローン抗体を通じて２段階で喘息を診断することで、喘息をより正確かつ迅速に診断することができる。

第１反応部由来の単一クローン抗体は、ＥＤＮ中のｅｐｉｔｏｐｅ部位が相補性決定領域［ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇｒｅｇｉｏｎ（ＣＤＲ）］のｉｄｉｏｔｙｐｅに付く。単一クローン抗体として、寄託番号ＫＣＬＲＦ−ＢＰ−００３８９（寄託日：２０１７年１月９日、寄託機関：韓国細胞株研究財団（ＫＣＬＲＦ））のハイブリドーマ細胞株から製造されることができる。ハイブリドーマ細胞株は、当業者に知られた通常の方法で製造されることができる。例えば、ＥＤＮ抗原を接種させたマウスの脾臓細胞とマウス由来の骨髓種細胞を融合して製造されることができるが、これに制限されない。ハイブリドーマ細胞株から単一クローン抗体を得る方法は、当業者に知られた通常の方法による。

第２反応部由来の単一クローン抗体は、ＥＤＮ中のｅｐｉｔｏｐｅ部位が相補性決定領域［ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇｒｅｇｉｏｎ（ＣＤＲ）］のｉｄｉｏｔｙｐｅに付く。単一クローン抗体として、寄託番号ＫＣＬＲＦ−ＢＰ−００３８９（寄託日：２０１７年１月９日、寄託機関：韓国細胞株研究財団（ＫＣＬＲＦ））のハイブリドーマ細胞株から発現されることができる。第２反応部由来の単一クローン抗体は、単一クローン抗体に酵素を結合させて製造されることができる。前記酵素は、ＨＲＰ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）、アルカリフォスファターゼ（ａｌｋａｌｉｎｅｐｈｏｓｐｈｔａｓｅ）などになることができる。抗体に酵素を結合させる方法は、当業者に知られた通常の方法による。

本発明による免疫クロマトグラフィー方法を利用した喘息またはアレルギー疾患応急診断用ストリップを利用すれば、喘息とアレルギー疾患患者で高い数値で表れるＥＤＮを手軽くて経済的に検査して、従来乳幼児または小児で診断が容易でなかった喘息またはアレルギー疾患を迅速に外部や家で診断することができる。

以下では、本発明の一実施例による喘息診断キットについてさらに詳しく説明する。

基底部１１０は、第１反応部、展開膜を支持するもので、当業者に通常知られた材質で製造されることができる。例えば、基底部１１０は、プラスチック、金属材質、ニトロセルロース膜で形成されることができる。

第１反応部１２０は、単一クローン抗体を含むことができる。第１反応部１２０は、単一クローン抗体自体を含むこともできるが、単一クローン抗体に金が結合することで、展開膜中で発色効果を得ることもできる。金が結合した単一クローン抗体は、ピンク色を表すことができる。単一クローン抗体に金を結合させる方法は、単一クローン抗体と金イオン含有化合物（例：コロイドゴールド）を混合した後、金イオンを還元させることで、金粒子が単一クローン抗体に結合するようにできる。金粒子の平均粒径は、１０ｎｍ〜１００ｎｍになることができる。上記範囲において、さらに優れた検出効果があることができる。

第１反応部１２０は、試料注入部と連結されて患者から採取された試料を受けることができる。図１に示していないが、第１反応部１２０には、フィルターパッドが連結され、患者から採取された試料が第１反応部１２０に注入される前にフィルターパッドを経ることで不純物などを除去して注入されるようにして、喘息診断の信頼性をさらに高めることができる。

第１反応部１２０は、ポリエステル繊維、ガラス繊維または植物繊維で形成された結合パッドに形成されることで、第１単一クローン抗体を安定して含ませることができる。例えば、結合パッドは、セルロースパッドであることができる。

展開膜１３０は、第１反応部１２０と接しており、第１反応部１２０から毛細管現象を通じて移動した試料中のＥＤＮと単一クローン抗体の結合物が第２反応部１４０及び対照部１５０を通じて移動するようにできる。

第２反応部１４０には、単一クローン抗体が含まれており、ＥＤＮと結合することができる。ＥＤＮと第１反応部由来の単一クローン抗体及び第２反応部由来の単一クローン抗体の結合結果は、発色を通じて確認することができる。発色の結果、第２反応部はピンク色になることができる。発色は上述したように、第１反応部由来の単一クローン抗体に金粒子を付着させることもできるが、その他に通常の方法でＨＲＰ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）、アルカリフォスファターゼ（ａｌｋａｌｉｎｅｐｈｏｓｐｈｔａｓｅ）、蛍光物質（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）、及び色素などのマーカーが使用されることができる。発色を誘導するための発色基質は、発色反応をするマーカーによって使用することが好ましく、ＴＭＢ（３，３’，５，５’−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）、ＡＢＴＳ［２，２’−ａｚｉｎｏ−ｂｉｓ（３−ｅｔｈｙｌｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｉｎｅ−６−ｓｕｌｆｏｎｉｃａｃｉｄ）］及びＯＰＤ（ｏ−ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ）などを使用することができる。

展開膜１３０には対照部１５０が形成され、診断キットが正常に作動して診断検査が完了したか否かを判別できるようにする。

対照部１５０は、試料がＥＤＮを含むか否かに関係なく、試料が第１反応部と第２反応部を移動して検査が完了したことを知らせる。対照部１５０には、ウサギ由来の抗マウス免疫グロブリン（ＩｇＧ）抗体が含まれており、第１反応部に含まれた単一クローン抗体中のＥＤＮと結合しないものが展開膜を通じて移動しながら対照部に到逹すれば、抗マウス免疫グロブリン抗体と反応して検査終了が分かる。ウサギ由来の抗マウス兔疫グロブリン結合した単一クローン抗体はピンク色を表し、対照部にピンク色が表れれば診断が完了したことを意味する。

展開膜１３０は、多孔性の薄膜型フィルムであり、試料が第２反応部１４０と対照部１５０に展開されるようにナイロン、ポリエステル、セルロース、ポリスルホン、ポリビニリデンフルオライド、セルロースアセテート、ポリウレタン、ガラス繊維、ニトロセルロースのいずれか一つ以上を含むことができる。展開試薬は、リン酸塩緩衝液、食塩水、トリス−ＨＣｌ、水などを利用することが好ましい。

図１に示すように、ストリップ１００は、吸収パッド１６０を含むことができる。吸収パッドは、対照部１５０を通過した試料、抗体残余物が吸収されるようにできる。

図１に示していないが、本実施例による喘息診断キットは、ストリップ１００を固定し、第１反応部、第２反応部及び対照部の外部接触と汚染を防止するためにハウジング（ｈｏｕｓｉｎｇ）をストリップ上に含むことができる。ハウジングは、如何なる試薬とも反応しない素材で形成されるが、例えば、ガラスやプラスチックで形成されることができる。

また、本発明の診断キットは、単一クローン抗体によってＥＤＮを定量化することもでき、従来使用されたＴＥＣやＥＣＰにと比べて優れて喘息またはアレルギー疾患を診断することができ、重症度別差異を反映することができる。

以上、本発明の一実施例による喘息診断キットを説明したが、ＥＤＮがアレルギー疾患でも有効な抗原であるだけに、アレルギー疾患の診断にも使用されることができる。

以下では、本発明の好ましい実施例を通じて本発明の構成及び作用をさらに詳しく説明する。但し、これは本発明の好ましい例示として提示されたものであり、如何なる意味でもこれにより本発明が制限されると解釈されてはならない。

実施例１：ハイブリドーマ細胞株の製造
フロイントの完全アジュバント（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓｃｏｍｐｌｅｔｅａｄｊｕｖａｎｔ）に溶解させた天然ＥＤＮ抗原５０〜１００マイクログラムを雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（６〜８週齢）に静脈注射した。ＰＢＳまたは不完全アジュバントに溶解させたＥＤＮ抗原５０〜１００マイクログラムを２週〜３週間隔で注射した。ＥＤＮ抗原を最終注射した後、抗体形成をマウス目における出血で確認した。抗体形成が一旦確認されれば、１００〜２００マイクログラムの抗体を３日〜４日連続的に注入した。マウスを切開し、７０％アルコールに入れて滅菌した。脾臓を除去し、脾臓細胞を洗浄した後、円心分離して得て無血清培地に懸濁させた。

脾臓細胞をＰ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３マウス細胞株から得た骨髓種細胞と１．５：１．１の割合で融合した。これからハイブリドーマ細胞株を選択した。製造したハイブリドーマ細胞株を韓国細胞株研究財団（ＫＣＬＲＦ）に２０１７年１月９日付で寄託して、寄託番号ＫＣＬＲＦ−ＢＰ−００３８９を受けた。

実施例２：単一クローン抗体の製造
実施例のハイブリドーマ細胞株を組織培養フラスコで培養して単一クローン抗体を生産した。具体的に、７５ｃｍ^２組織培養フラスコでＤＭＥＭ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）２５ｍｌに５×１０^６個の細胞を添加した後、３７細胞培養機で４〜５日間過多増殖させた後、細胞培養液を収去した。収去された細胞培養液は、１５００ｒｐｍで１５分間円心分離を実施して細胞成分を除去し、細胞上層液のみを回収することで単一クローン抗体生産を完了した。生産された単一クローン抗体は、試験に使うまで４℃または−２０℃で保管した。

単一クローン抗体に金コロイドを結合させた。即ち、塩化金をクエン酸ナトリウム溶液で還元させてプレーンゴールド（ｐｌａｉｎｇｏｌｄ）を製造した後、製造した単一クローン抗体を添加しながら、４０ｎｍの大きさの抗体が結合された金粒子を波長５３２ｎｍで吸光度が１０±１になるように製造した。金粒子に結合された抗体を安定化するために、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）溶液で処理した。これを通じて単一クローン抗体を製造した。

実施例３：単一クローン抗体の製造
前記単一クローン抗体の製造時に金コロイドを結合させないことを除いては、同一の方法で製造した。

実施例４：診断キットの製造
上記実施例２で製造した金粒子と単一クローン抗体が結合された金接合体をストリップ１個当り８．３マイクロリットル／ストリップを混合し、ポリエステル繊維またはガラス繊維に濡らして乾燥させ、第１反応部を含む結合パッドを製造した。

上記実施例３で製造した単一クローン抗体をストリップ１個当り０．７５マイクログラム／ストリップの濃度でＰＢＳで希釈し、ニトロセルロース展開膜上で第２反応部の位置にコーティングさせて第２反応部を形成した。展開膜の中で対照部の位置には、ウサギ抗マウス抗体を０．７５マイクログラム／ストリップの濃度でコーティングさせて対照部を形成した。

上記製造した展開膜に上記製造した結合パッドを重畳しておいた後、４．４５ｍｍ／ストリップの大きさで切断した後、プラスチックハウジングに装着して、喘息またはアレルギー疾患診断キットを製造した。

実験例１：喘息またはアレルギー疾患迅速診断用のバイオマーカーの選別
喘息またはアレルギー診断のために既存に使用された総好酸球数（ｔｏｔａｌｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｃｏｕｎｔ’ ＴＥＣ）やＥＣＰ（ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｃａｔｉｏｎｉｃｐｒｏｔｅｉｎ）に比べて本発明で喘息またはアレルギー診断に使用するＥＤＮが優れることを立証するために、喘息またはアレルギー症状点数とＥＬＩＳＡ法で測定したＥＤＮ、ＥＣＰ、及び総好酸球数を比べた。その結果、図２のように、ＥＤＮがＴＥＣやＥＣＰに比べて、各喘息またはアレルギー症状点数の重症度別差異を最もよく反映した。従って、ＥＤＮが喘息またはアレルギー診断時に有用な抗原として使用可能なことを確認した。

実験例２：ＥＬＩＳＡとの診断結果の比較
喘息またはアレルギーとして診断された５歳の幼児でＥＤＮ濃度が０．６２ｎｇ／ｍｌ以上の血清８０個検体、そして同一年齢で喘息またはアレルギーのない正常の血清５０個検体を求め、本発明の診断キットとＥＬＩＳＡ法で検査した。図３のように、本発明の診断キットとＥＬＩＳＡ法による検査時に相関関係がｒ＝０．６０３、Ｐ＜０．００１と優れて表れたことで、本発明の診断キットが迅速診断キットとして使用するのに十分な結果を表した。

実験例３：ＭＢＬ、ＢＦキットとの診断結果の比較
実験例２と同一検体に対して、本発明の診断キット（Ｒａｐｉｄ）と、従来の喘息及びアレルギー診断キットとして知られたＭＢＬ（ＭＥＤＩＣＡＬ＆ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳＣＯ．，ＬＴＤ）キット、ＢＦキットについて比較検査した。図４及び図５のように、本発明の診断キットとＭＢＬキット、ＢＦキットによる検査時に相関関係がそれぞれｒ＝０．８９３３、ｒ＝０．８７４８と優れて表れることで、本発明の診断キットが迅速診断キットとして使用するのに十分な結果を表した。

本発明の単純な変形または変更は、この分野の通常の知識を持った者によって容易に実施されることができ、このような変形や変更は、いずれも本発明の領域に含まれるといえる。

［寄託番号］
寄託機関名：韓国細胞株研究財団（ＫＣＬＲＦ）
寄託番号：ＫＣＬＲＦ−ＢＰ−００３８９
寄託日付：２０１７年１月９日

Claims

基底部と、
前記基底部上に位置し、ハイブリドーマ細胞株（寄託番号ＫＣＬＲＦ−ＢＰ−００３８９）から発現される単一クローン抗体を含む第１反応部と、
前記第１反応部と前記基底部との間に位置し、ハイブリドーマ細胞株（寄託番号ＫＣＬＲＦ−ＢＰ−００３８９）から発現される単一クローン抗体を含む第２反応部を含む展開膜と、を含むストリップを含む、喘息診断用キット。
前記単一クローン抗体は、金、ＨＲＰ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）、アルカリフォスファターゼ（ａｌｋａｌｉｎｅｐｈｏｓｐｈｔａｓｅ）、蛍光物質（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）及び色素からなる群より選択された１種以上のマーカーが結合されたものである、請求項１に記載の喘息診断用キット。
前記展開膜は、抗マウス免疫グロブリン（ＩｇＧ）抗体を含む対照部をさらに含むものである、請求項１に記載の喘息診断用キット。
前記喘息診断用キットは、第２反応部の発色が表れれば喘息として診断するものである、請求項１に記載の喘息診断用キット。
基底部と、
前記基底部上に位置し、ハイブリドーマ細胞株（寄託番号ＫＣＬＲＦ−ＢＰ−００３８９）から発現される単一クローン抗体を含む第１反応部と、
前記第１反応部と前記基底部との間に位置し、ハイブリドーマ細胞株（寄託番号ＫＣＬＲＦ−ＢＰ−００３８９）から発現される単一クローン抗体を含む第２反応部を含む展開膜と、を含むストリップを含む、アレルギー疾患診断用キット。
前記単一クローン抗体は、金、ＨＲＰ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）、アルカリフォスファターゼ（ａｌｋａｌｉｎｅｐｈｏｓｐｈｔａｓｅ）、蛍光物質（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）及び色素からなる群より選択された１種以上のマーカーが結合されたものである、請求項５に記載のアレルギー疾患診断用キット。
前記展開膜は、抗マウス免疫グロブリン（ＩｇＧ）抗体を含む対照部をさらに含むものである、請求項５に記載のアレルギー疾患診断用キット。
前記アレルギー疾患診断用キットは、第２反応部の発色が表れればアレルギーとして診断するものである、請求項５に記載のアレルギー疾患診断用キット。