CN110257274B - 一种伪结核棒状杆菌致弱方法及应用 - Google Patents

一种伪结核棒状杆菌致弱方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种伪结核棒状杆菌致弱方法及应用，可以实现对伪结核棒状杆菌的人工致弱，通过本方法对伪结核棒状杆菌实现长期传代致弱，可将其作为疫苗株应用于畜禽免疫产业，日后其推广和应用具有巨大的市场需求，能够产生可观的经济和社会效益。

Description

一种伪结核棒状杆菌致弱方法及应用
技术领域
本发明涉及微生物及生物技术领域，更具体的说是涉及一种伪结核棒状杆菌致弱方法及应用。
背景技术
伪结核棒状杆菌(Corynebacterium Pseudotuberculosis)是引起动物干酪性淋巴结炎(Caseous Lymphadenitis，CLA)的重要病原，以感染羊和骆驼等动物多见，同时可感染人。在全球范围内多数国家均有关于伪结核棒状杆菌感染羊群引发羊干酪性淋巴结炎的报道。近年来，我国关于羊伪结核棒状杆菌感染所致的羊干酪性淋巴结炎报道也逐渐增多，而且国内山羊发病感染情况较绵羊更为严重。
伪结核棒状杆菌一旦感染羊群，则环境中难以清除。由于抗生素难以穿透病变部位包囊直达病灶，导致治疗效果较差；另一方面，待脓变组织成熟后，多用外科排脓手段进行治疗，操作不当则易于造成环境污染。在多种因素综合作用下，导致该病的治疗效果欠佳，因此，开展针对伪结核棒状杆菌的疫苗研究对于该病的预防有重大意义。
关于伪结核棒状杆菌疫苗的研究，主要以基因敲除疫苗、灭活疫苗和类毒素制剂为主，但多停留在科研阶段，目前实际生产中尚无市场普及且保护率极其可靠的疫苗。伪结核棒状杆菌为兼性胞内寄生菌，在机体免疫系统中，体液免疫和细胞免疫均发挥重要作用，在该菌的疫苗制剂中弱毒活疫苗具有较大潜力。
因此，提供一种伪结核棒状杆菌致弱方法及在疫苗中的应用是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种伪结核棒状杆菌致弱方法及应用，通过人工传代致弱方法使伪结核棒状杆菌毒力减弱，最终将致弱株应用于疫苗领域，旨在研发出有良好保护力的疫苗株，为当前伪结核棒状杆菌引起的羊干酪性淋巴结炎起到预防作用，进而减小经济损失。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种伪结核棒状杆菌致弱方法，将伪结核棒状杆菌菌株进行连续传代培养，获得人工致弱菌株。
进一步，所述连续传代培养的培养温度为37℃。
进一步，所述连续传代培养的培养基为10％绵羊血琼脂平板。
进一步，所述连续传代培养为传至200代。
进一步，所述的人工致弱菌株作为疫苗株的应用。
进一步，所述的人工致弱菌株在制备疫苗中的应用。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种伪结核棒状杆菌致弱方法及应用，根据在不同温度条件下连续培养传代实现伪结核棒状杆菌菌株的人工致弱，通过不同温度条件连续传代培养致弱伪结核棒状杆菌的方法目前还未有报道；经过动物实验证实，传代株与原代菌株相比，其引起的病理变化程度和死亡率均明显下降，证实传代菌株的致病力在逐步减弱。本发明方法可以实现对伪结核棒状杆菌的人工致弱，通过本方法对伪结核棒状杆菌实现长期传代致弱，便有可能将其作为疫苗株应用于畜禽免疫产业，日后其推广和应用具有巨大的市场需求，能够产生可观的经济和社会效益。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1附图为本发明LX1菌株37℃培养条件下不同代次菌株小鼠病变面积；阴性对照为注射生理盐水；
图2附图为本发明LX1-37-200代小鼠致病性试验结果；
其中，1-5分别代表试验所用的1-5号小鼠。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实验动物：健康昆明系雌性小白鼠。
实施例1
采集陕西铜川和陇县的发病奶山羊(干酪性淋巴结炎)体表新鲜脓汁，分别接种于10％绵羊血琼脂平板中37℃分离培养和鉴定，铜川株命名TC11，陇县株命名LX1。
将分离的菌株TC11和LX1分别接种于10％绵羊血琼脂平板中，并分别于30℃和37℃连续培养传代，对原代菌和传代菌进行小鼠致病性试验。其中，LX1株动物实验设计方案见表1，TC11株动物实验设计方案见表2；表1和表2中所用菌液浓度均为1.5×108cfu/ml。
表1 LX1株动物实验设计方案
Figure BDA0002060376040000031
Figure BDA0002060376040000041
表2 TC11株动物实验设计方案
Figure BDA0002060376040000042
通过上述方法进行小鼠致病性试验，观察比较不同代次和不同培养条件下各菌株引起的小鼠病理变化，结果见表3和表4。
表3 LX1株动物试验结果
Figure BDA0002060376040000043
Figure BDA0002060376040000051
表4 TC11株动物试验结果
Figure BDA0002060376040000052
上述结果表明，LX1菌株37℃培养条件下致弱效果最佳，见图1。
实施例2
由实施例1结果可知，LX1菌株37℃培养条件下致弱效果最佳，故从130代后只对LX1菌株于37℃连续传代，即LX1菌株30℃、TC11菌株30℃和37℃均不再传代培养。
利用致弱效果最明显的LX1菌株37℃培养传代至第200代菌株进行小鼠致病性试验，观察第200代菌株(LX1-37-200)致弱后致病力，发现LX1-37-200菌株致弱效果已基本稳定，引起的小鼠局部病变面积差别较小。同时将LX1-37-200菌株作为假定疫苗制剂，用原代菌株进行攻菌试验观测其疫苗潜力。
(1)LX1-37-200菌株的毒力致弱稳定性试验
将LX1-37-200代菌株接种5只小鼠，即每只小鼠腹部皮下注射0.2ml浓度为1.5×108cfu/ml的菌液，观察记录小鼠死亡和发病状况，未死亡小鼠均于第7d处死解剖观察病变。
结果发现，小鼠注射LX1-37-200菌液后7d内无死亡小鼠，于第7d处死解剖小鼠，其腹部皮下菌液接种位置病变部位面积见表5，图2。
表5 LX1-37-200菌株的小鼠致病性试验
Figure BDA0002060376040000061
结果表明，利用LX-37-200代菌株接种小鼠后，小鼠均不死亡，且7d后病变部位面积在0～3mm，经多次重复试验表明，LX1-37-200菌株其小鼠致病性试验批件差异小，试验结果较为相似，表明其毒力致弱作用已较为稳定。
(2)LX1-37-200菌株的免疫保护试验
将20只健康小鼠随机分为两组，实验组每只腹部皮下注射0.2ml浓度为1.5×108cfu/ml的LX1-37-200菌液，对照组每只腹部皮下注射0.2ml无菌生理盐水。于14d后在20只小鼠腹部皮下均注射0.2ml浓度为1.5×108cfu/ml的LX1菌株菌液，观察记录两组小鼠注射原代菌株后的死亡发病情况，结果见表6；未死亡小鼠于第7d处死解剖。
表6 LX1-37-200菌株小鼠免疫保护试验
Figure BDA0002060376040000062
结果表明，LX1-37-200接种小鼠获得较好免疫，可以为感染提供免疫保护，适合作为疫苗株使用。
上述结果表明，利用人工连续传代方法可使伪结核棒状杆菌毒力致弱；LX1-37菌株，连续传代200代以上，毒力稳定，且接种小鼠获得较好免疫，可以为感染提供免疫保护，适合作为疫苗株使用。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (1)

1.一种伪结核棒状杆菌致弱方法，其特征在于，将伪结核棒状杆菌菌株进行连续传代培养，获得人工致弱菌株；所述连续传代培养的培养温度为37℃；所述连续传代培养的培养基为10％绵羊血琼脂平板；所述连续传代培养为传至200代。
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