CN110898218A - 一种鸭坦布苏病毒病灭活疫苗及其制备方法 - Google Patents

一种鸭坦布苏病毒病灭活疫苗及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种鸭坦布苏病毒病灭活疫苗及其制备方法，本发明的鸭坦布苏病毒病灭活疫苗的制备方法，包括如下步骤：a提供鸭坦布苏病毒液；b纯化；c灭活；d乳化制备疫苗。本发明方法生产鸭坦布苏病毒病灭活疫苗，可有效降低杂蛋白含量，提高有效抗原含量，提升疫苗免疫效果，解决低日龄雏鸭发病问题。

Description

一种鸭坦布苏病毒病灭活疫苗及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种鸭坦布苏病毒病灭活疫苗及其制备方法。
背景技术
2010年，鸭坦布苏病毒病(曾用名：鸭出血性卵巢炎)首次发现于中国浙江，随后在江苏、山东、河北和北京等地区发生。主要见于开产蛋鸭，感染鸭群发病率几乎100％，死亡率为5％-30％，产蛋率可下降至10-30％甚至10％以下，给养鸭业带来巨大的经济损失，由于该病是病毒性疾病，目前无特效治疗方法，及时应用疫苗预防性接种是防治该病唯一有效手段。
目前，国内已有2种疫苗可以用于该病的防控：一是组织毒灭活疫苗，另一种细胞毒活疫苗。活疫苗存在毒力返强和散毒的危险；灭活疫苗杂蛋白含量偏高，时有副反应发生，生产过程中抗原损失较大，生产成本较高。2018年以来国内部分地区鸭场出现小日龄鸭鸭坦布苏病毒感染病例(20日龄左右雏鸭发病)。14日龄以内雏鸭母源抗体较高，不适合免疫；14日龄以后免疫，到20日龄左右，由于疫苗免疫时间短，尚未产生免疫保护。
因此，需要一种免疫副反应低、有效抗原含量高、能突破雏鸭母源抗体干扰的鸭坦布苏病毒病灭活疫苗及其制备方法以解决上述问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种免疫副反应低、有效抗原含量高、能突破雏鸭母源抗体干扰的鸭坦布苏病毒病灭活疫苗及其制备方法。
本发明的技术方案如下：本发明的一种鸭坦布苏病毒病灭活疫苗的制备方法，包括如下步骤：所述灭活疫苗由鸭坦布苏病毒液经纯化、灭活和乳化而得，
a提供鸭坦布苏病毒液，所述病毒液为鸭胚培养液或细胞培养液，病毒含量≥106.1EID50/0.1ml；
b纯化：鸭坦布苏病毒液按体积比(V/V)加入0.01％-0.6％羧甲基纤维素钠，搅拌混匀后，2-8℃静置过夜或经管式离心机离心，取上清液备用；
c灭活：将上述上清液预温至37℃，然后按体积比(V/V)1％加入抗原稳定剂，充分混匀，并维持时间为1-2小时；加入质量浓度(M/V)为37％的甲醛液并使其最终含量达0.05％-0.15％，充分混匀；37℃灭活2-4小时，20-22℃灭活16-18小时；
d乳化：水相制备：在灭活病毒液中按(V/V)2％加入卡波姆溶液，按(V/V)4％-6％加入吐温-80，不断搅拌，使其充分溶解；油相制备：在注射用白油中按(W/V)0.4％-1.0％加入硬脂酸铝，按(V/V)6％加入司本-80，灭菌后为油相；将水相和油相按1:1.67-1:3比例混合乳化，制得鸭坦布苏病毒病灭活疫苗，病毒含量不低于105.5ELD50/羽份。
进一步地，在步骤c中，所述的抗原稳定剂为聚乙烯吡咯烷酮PVP和氯化锌的混合溶液，所述的聚乙烯吡咯烷酮PVP和氯化锌的质量体积浓度均为0.5％-2％。
进一步地，在步骤d中，所述的卡波姆溶液的浓度为25-100g/L。
更进一步地，在步骤d中，所述的注射用白油为Marcl52和Pripure3759混合液，其中Pripure 3759占混合液总体积的2％-6％。
本发明采用所述的制备方法制得的鸭坦布苏病毒病灭活疫苗。
与现有技术相比，有如下特点：
(1)首次将羧甲基纤维素钠用于病毒液纯化，有效降低杂蛋白含量，减少成品疫苗免疫副反应的发生几率。
(2)在灭活过程中，PVP、氯化锌作为抗原稳定剂与甲醛的变温灭活相结合，有效减少灭活过程中抗原损失，提高有效抗原含量，降低生产成本。
(3)PVP、卡波姆等的联合应用，降低母源抗体对抗原的中和作用，提升疫苗免疫反应性，从而增强疫苗免疫效果。使得疫苗也适用于有母源抗体的雏鸭免疫，解决了低日龄雏鸭发病问题。
(4)本发明方法生产鸭坦布苏病毒病灭活疫苗，可有效降低杂蛋白含量，提高有效抗原含量，提升疫苗免疫效果，解决低日龄雏鸭发病问题。
具体实施方式
下面结合具体实施方式做进一步的说明，这些实例仅用于说明，而不用于限制本专利的保护范围。
实施例1
本发明的一种鸭坦布苏病毒病灭活疫苗的制备方法，包括如下步骤：所述灭活疫苗由鸭坦布苏病毒液经纯化、灭活和乳化而得，
a提供鸭坦布苏病毒液，所述病毒液为细胞培养液，病毒含量＝106.1EID50/0.1ml；
b纯化：鸭坦布苏病毒液按体积比(V/V)加入0.01％羧甲基纤维素钠，搅拌混匀后，8℃静置过夜，取上清液备用；
c灭活：将上述上清液预温至37℃，然后按体积比(V/V)1％加入抗原稳定剂，充分混匀，并维持时间为2小时；加入质量浓度(M/V)为37％的甲醛液并使其最终含量达0.05％，充分混匀；37℃灭活4小时，20℃灭活17小时；所述的抗原稳定剂为聚乙烯吡咯烷酮PVP和氯化锌的混合溶液，所述的聚乙烯吡咯烷酮PVP和氯化锌的质量体积浓度均为2％。
d乳化：水相制备：在灭活病毒液中按(V/V)2％加入卡波姆溶液，按(V/V)5％加入吐温-80，不断搅拌，使其充分溶解；油相制备：在注射用白油中按(W/V)0.4％加入硬脂酸铝，按(V/V)6％加入司本-80，灭菌后为油相；将水相和油相按1:3比例混合乳化，制得鸭坦布苏病毒病灭活疫苗，病毒含量不低于105.5ELD50/羽份。所述的卡波姆溶液的浓度为100g/L。所述的注射用白油为Marcl52和Pripure 3759混合液，其中Pripure 3759占混合液总体积的4％。
本发明采用所述的制备方法制得的鸭坦布苏病毒病灭活疫苗。
实施例2
实施例2与实施例1的区别在于：本发明的一种鸭坦布苏病毒病灭活疫苗的制备方法，包括如下步骤：所述灭活疫苗由鸭坦布苏病毒液经纯化、灭活和乳化而得，
在步骤a中，提供鸭坦布苏病毒液，所述病毒液为鸭胚培养液，病毒含量＞106.1EID50/0.1ml；
在步骤b中，纯化：鸭坦布苏病毒液按体积比(V/V)加入0.6％羧甲基纤维素钠，搅拌混匀后，2℃静置过夜，取上清液备用；
在步骤c中，灭活：将上述上清液预温至37℃，然后按体积比(V/V)1％加入抗原稳定剂，充分混匀，并维持时间为1.5小时；加入质量浓度(M/V)为37％的甲醛液并使其最终含量达0.15％，充分混匀；37℃灭活2小时，22℃灭活16小时；所述的抗原稳定剂为聚乙烯吡咯烷酮PVP和氯化锌的混合溶液，所述的聚乙烯吡咯烷酮PVP和氯化锌的质量体积浓度均为0.5％。
在步骤d中，乳化：水相制备：在灭活病毒液中按(V/V)2％加入卡波姆溶液，按(V/V)4％加入吐温-80，不断搅拌，使其充分溶解；油相制备：在注射用白油中按(W/V)1.0％加入硬脂酸铝，按(V/V)6％加入司本-80，灭菌后为油相；将水相和油相按1:1.67比例混合乳化，制得鸭坦布苏病毒病灭活疫苗，病毒含量不低于105.5ELD50/羽份。所述的卡波姆溶液的浓度为25g/L。所述的注射用白油为Marcl52和Pripure 3759混合液，其中Pripure 3759占混合液总体积的2％。
实施例3
实施例3与实施例1的区别在于：
本发明的一种鸭坦布苏病毒病灭活疫苗的制备方法，包括如下步骤：所述灭活疫苗由鸭坦布苏病毒液经纯化、灭活和乳化而得，
在步骤b中，纯化：鸭坦布苏病毒液按体积比(V/V)加入0.4％羧甲基纤维素钠，搅拌混匀后，6℃静置过夜，取上清液备用；
在步骤c中，灭活：将上述上清液预温至37℃，然后按体积比(V/V)1％加入抗原稳定剂，充分混匀，并维持时间为1小时；加入质量浓度(M/V)为37％的甲醛液并使其最终含量达0.1％，充分混匀；37℃灭活3小时，21℃灭活18小时；所述的抗原稳定剂为聚乙烯吡咯烷酮PVP和氯化锌的混合溶液，所述的聚乙烯吡咯烷酮PVP和氯化锌的质量体积浓度均为0.15％。
在步骤d中，乳化：水相制备：在灭活病毒液中按(V/V)2％加入卡波姆溶液，按(V/V)6％加入吐温-80，不断搅拌，使其充分溶解；油相制备：在注射用白油中按(W/V)0.6％加入硬脂酸铝，按(V/V)6％加入司本-80，灭菌后为油相；将水相和油相按1:2比例混合乳化，制得鸭坦布苏病毒病灭活疫苗，病毒含量不低于105.5ELD50/羽份。所述的卡波姆溶液的浓度为80g/L。所述的注射用白油为Marcl52和Pripure 3759混合液，其中Pripure 3759占混合液总体积的6％。
实施例4
实施例4与实施例1的区别在于：
本发明的一种鸭坦布苏病毒病灭活疫苗的制备方法，包括如下步骤：所述灭活疫苗由鸭坦布苏病毒液经纯化、灭活和乳化而得，
在步骤b中，纯化：鸭坦布苏病毒液按体积比(V/V)加入0.6％羧甲基纤维素钠，搅拌混匀后，经管式离心机离心，取上清液备用。
试验例1
纯化效果比对
按照专利CN201110255115方法制备鸭坦布苏病毒鸭胚培养液，病毒含量106.5EID50/0.1ml，然后按体积比(V/V)加入0.5％羧甲基纤维素钠，搅拌混匀后，2-8℃静置过夜，取上清液备用。
取样，测定纯化前和纯化后鸭胚培养液病毒含量；10000r/min离心10min，观察液体澄清度和有无沉淀析出；同时按常规工艺制备疫苗，用坦布苏抗体阴性产蛋鸭进行安全检验。结果见表1。
表1
Figure BDA0002346173540000061
本发明纯化方法，操作简单，纯化后病毒含量基本没有降低，能有效去除鸭坦布苏病毒鸭胚培养液中的杂蛋白，提升抗原的澄清度。用纯化前和纯化后2种抗原制备的疫苗免疫产蛋鸭，纯化前组免疫鸭1/10出现副反应，纯化后组免疫鸭采食、精神均无异常，说明本发明纯化方法能有效降低杂蛋白含量，减少副反应发生几率。
试验例2
灭活效果比对
将上述纯化处理后上清液预温至37℃，然后按体积比(V/V)1％加入抗原稳定剂，抗原稳定剂为PVP、氯化锌的混合溶液，两组分质量体积浓度均为1％，充分混匀，并维持2小时；加入质量浓度(M/V)为37％的甲醛液并使其最终含量达0.1％，充分混匀；37℃灭活2小时，21℃灭活16小时，即为灭活病毒液；
将上述灭活病毒液用0.1M pH7.2 PBS稀释2倍后，按常规方法乳化制备灭活疫苗。同时用实施例1纯化抗原，按CN201110255115的方法制备常规灭活工艺对照疫苗。进行疫苗效力检验，结果见表2。
表2
组别 效力检验
本发明纯化、灭活工艺疫苗 10/10保护
常规灭活工艺对照疫苗 9/10保护
空白对照 10/10发病
用本发明的纯化、灭活工艺制备的抗原，稀释2倍后制备的疫苗攻毒保护率仍优于常规灭活工艺对照疫苗(抗原不稀释)，证明本发明灭活工艺能有效减少灭活过程中抗原损失。
试验例3
乳化工艺及有母源抗体鸭免疫效果比对
水相制备：将实施例2中灭活病毒液用无菌0.1M PBS稀释至105.5ELD50/羽份，按(V/V)2％加入卡波姆溶液，卡波姆溶液的浓度为100g/L，按(V/V)4％加入吐温-80，不断搅拌，使其充分溶解；
油相制备：在注射用白油中按(W/V)1.0％加入硬脂酸铝，按(V/V)6％加入司本-80，灭菌后为油相；其中注射用白油为94份Marcl52和6份Pripure 3759混合液。
将水相和油相按1:3比例混合乳化，即成鸭坦布苏病毒病灭活疫苗。
同时按CN201110255115的方法制备常规工艺对照疫苗。
将上述2种疫苗，同时免疫1日龄HI抗体为1:20的雏鸭，每只鸭接种1羽份，免疫后14日进行效力检验，结果见表3。
表3
Figure BDA0002346173540000081
本发明方法制备的疫苗免疫1日龄雏鸭，基本不受母源抗体影响，免疫后14日HI抗体GMT值高达1:80，且能提供良好的免疫攻毒保护。
试验例4
按照专利CN201110255115方法制备鸭坦布苏病毒细胞培养液，同试验例1-3的本发明方法制备鸭坦布苏病毒病灭活疫苗。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，本发明要求保护范围由所附的权利要求书、说明书及其等效物界定。

Claims (5)

1.一种鸭坦布苏病毒病灭活疫苗的制备方法，其特征在于包括如下步骤：所述灭活疫苗由鸭坦布苏病毒液经纯化、灭活和乳化而得，
a提供鸭坦布苏病毒液，所述病毒液为鸭胚培养液或细胞培养液，病毒含量≥106.1EID50/0.1ml；
b纯化：鸭坦布苏病毒液按体积比V/V加入0.01％-0.6％羧甲基纤维素钠，搅拌混匀后，2-8℃静置过夜或经管式离心机离心，取上清液备用；
c灭活：将上述上清液预温至37℃，然后按体积比V/V 1％加入抗原稳定剂，充分混匀，并维持时间为1-2小时；加入质量浓度(M/V)为37％的甲醛液并使其最终含量达0.05％-0.15％，充分混匀；37℃灭活2-4小时，20-22℃灭活16-18小时；
d乳化：水相制备：在灭活病毒液中按V/V 2％加入卡波姆溶液，按V/V 4％-6％加入吐温-80，不断搅拌，使其充分溶解；油相制备：在注射用白油中按W/V 0.4％-1.0％加入硬脂酸铝，按V/V 6％加入司本-80，灭菌后为油相；将水相和油相按1:1.67-1:3比例混合乳化，制得鸭坦布苏病毒病灭活疫苗，病毒含量不低于105.5ELD50/羽份。
2.根据权利要求1所述的鸭坦布苏病毒病灭活疫苗的制备方法，其特征在于：在步骤c中，所述的抗原稳定剂为聚乙烯吡咯烷酮PVP和氯化锌的混合溶液，所述的聚乙烯吡咯烷酮PVP和氯化锌的质量体积浓度均为0.5％-2％。
3.根据权利要求2所述的鸭坦布苏病毒病灭活疫苗的制备方法，其特征在于：在步骤d中，所述的卡波姆溶液的浓度为25-100g/L。
4.根据权利要求3所述的鸭坦布苏病毒病灭活疫苗的制备方法，其特征在于：在步骤d中，所述的注射用白油为Marcl52和Pripure3759混合液，其中Pripure 3759占混合液总体积的2％-6％。
5.采用权利要求1至4任一项所述的制备方法制得的鸭坦布苏病毒病灭活疫苗。
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