CN102488893A - 一种用细胞系生产鸭出血性卵巢炎灭活疫苗的方法及其制品 - Google Patents

Abstract

一种用细胞系生产鸭出血性卵巢炎灭活疫苗的方法及其制品，属于生物技术领域。本发明所述方法中的细胞系选自仓鼠肾细胞系或非洲绿猴肾细胞系，并经过（1）选育毒株、（2）建立毒种种子批、（3）制备细胞毒液、（4）灭活病毒、（5）洗涤与浓缩细胞毒液、（6）乳化等步骤完成疫苗的制备。本发明方法具有生产工艺简单稳定、易操作、安全性高等特点，制备的鸭出血性卵巢炎灭活疫苗质量高、产量大、成本低、批间差异小、安全性好、免疫效力高。

Description

一种用细胞系生产鸭出血性卵巢炎灭活疫苗的方法及其制品

技术领域

本发明涉及一种疫苗的制备方法及其制品，更具体地说涉及一种用细胞系生产鸭出血性卵巢炎灭活苗的方法及其制品，属于生物技术领域。

背景技术

鸭出血性卵巢炎（Duck Hemorrhagic Ovaritis，DHO）是一种新近流行的、急性、高度接触性鸭传染病，其病原为鸭出血性卵巢炎病毒（Duck Hemorrhagic Ovaritis Virus，DHOV），在病毒分类上属于黄病毒科的成员。该病毒感染不同日龄鸭，产蛋鸭主要表现采食量急剧下降，产蛋率急剧下降，部分鸭出现瘫痪现象。剖解病变主要表现为卵巢出血，卵泡变形、变性，卵巢、卵黄、睾丸、输卵管和输精管萎缩，肝脏表面有粟粒状结节。商品肉鸭表现为死淘率增加。

新近科学研究情况：在病毒分类地位的研究中，曹贞贞、张存等人通过对鸭出血性卵巢炎病毒与黄病毒属恩塔亚病毒群（Ntay a virus group，NTAV群）和乙型脑炎病毒群（Japanese encepHalitis virus group，JEV群）中选NS1序列已知的病毒进行序列同源性分析和进化分析，发现该病毒与黄病毒科黄病毒属的巴格扎病毒的遗传距离位于病毒分类学种的水平。苏敬良、万春和、施少华等人的研究也表明分离获得的引起种（蛋）鸭产蛋骤降新病毒的核苷酸序列第9～777位与坦布苏病毒（TMUV）的同源性最高，为88.7％；遗传进化分析表明WR株病毒与坦布苏病毒、圣路易斯脑炎病毒（SLEV）、以色列火鸡脑膜炎病毒（ITV）、恩塔亚病毒（NTAV）具有相似的祖先。在诊断方面，曹贞贞、万春和、苏敬良、滕巧泱等人报道可以采用临床症状、大体及组织病理变化、PCR扩增和病毒分离等方法确诊该病。

该病的流行情况：2010年4月，自中国浙江首先发现以产蛋鸭产蛋量急剧下降为主要特征的疾病以来，先后在江苏、山东、河北、北京等省市发生类似的疾病。鸭出血性卵巢炎已经成为近期危害中国养鸭业的主要疫病之一。各种蛋鸭、樱桃谷种鸭和台湾白改种鸭均有发生，但主要见于开产蛋鸭。受染鸭群几乎100%发病，死亡率为5%～30%不等，蛋鸭产蛋率由80%以上下降至10%~30%甚至10%以下，严重者停产，虽然产蛋率可逐渐恢复，但从发病至恢复正常，约需1~2月；种鸭发病后种蛋的受精率和孵化率降低；商品肉鸭感染后死淘率明显增加。因此，该病给养鸭业带来巨大的经济损失，这使得养鸭业一度陷入绝境。

疾病的防控：目前，鸭出血性卵巢炎发生后，养殖户通常采用的控制措施是药物防治，大剂量使用各种抗菌素和抗病毒药，但往往无济于事，在部分鸭场甚至出现药物中毒的现象进一步增加了疫病的严重性。专家推荐的防治该病有效措施是注射疫苗，但目前尚未找到较好的疫苗株、大规模和高效价培养病毒的细胞系，疫苗评价模型尚未建立，制约着目前疫苗的开发。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术之缺陷提供一种用细胞系生产鸭出血性卵巢炎灭活疫苗的方法及其产品。

本发明所述技术问题是由以下技术方案实现的。

一种用细胞系生产鸭出血性卵巢炎灭活疫苗的方法，所述细胞系选自仓鼠肾细胞系或非洲绿猴肾细胞系。

上述方法，它包括如下步骤：

（1）选育毒株：将鸭出血性卵巢炎病毒鸭胚适应株在细胞系中连续传代培养3次，取传代适应毒株利用蚀斑纯化技术对其连续纯化培养三次，选取在仓鼠肾细胞系或非洲绿猴肾细胞系中培养效价高、免疫原性好的毒株作为候选病毒株；

（2）建立毒种种子批：将步骤（1）所得候选株病毒接种至细胞系中，传代培养至第15代，取第5～15代作为毒种种子批；

（3）制备细胞毒液：弃去形成良好单层细胞的细胞生长液，接种步骤（2）所得毒种种子批，吸附0.5～1h后，加入细胞维持液，继续培养，48～120h后细胞病变（CPE）达到80%以上时收获细胞毒液，该细胞毒液病毒含量≥10^6.5 TCID₅₀/1ml；

（4）灭活病毒：取步骤（3）所得细胞毒液冻融两次后，加入细胞毒液总量（V/V）0.1～0.2%的灭活剂，在37℃下振荡灭活16～24h；

（5）洗涤与浓缩细胞毒液：将步骤（4）所得灭活好的细胞毒液浓缩至原来体积的1/2，然后用等量pH值为7.0～7.2的PBS溶液洗涤，再进行浓缩，如此反复2～3遍，随后进行最后一次浓缩，将细胞毒液浓缩为原来体积的1/5～1/10，细胞毒液蛋白含量应不大于400ug/ml；

（6）乳化：向步骤（5）所得浓缩好的细胞毒液加入（V/V）4%～8%吐温80，搅拌均匀为水相，按照油相与水相的体积比1.5～3：1进行乳化，乳化后即得成品。

上述方法，所述蚀斑纯化技术为0.1%中性红蚀斑纯化技术。

上述方法，所述细胞生长液的组成为：体积百分含量90%～92% DMEM液、8%～10%新生牛血清，pH值调整为7.2～7.4。

上述方法，所述接种的剂量为细胞生长液体积的0.3%～1.0%。

上述方法，所述细胞维持液的组成为：体积百分含量95%～98% DMEM液、2%～5%新生牛血清，pH值调整为7.2～7.4。

上述方法，所述灭活剂为质量浓度37%的甲醛溶液。

上述方法，所述浓缩中其使用截留分子量50kd的密里博超滤膜包进行超滤浓缩。

上述方法，所述油相的制备方法为：在白油中按（V/V）4%～8%加入司班80，按（W/V）1%～2%加入硬脂酸铝，灭菌后即得油相。

一种鸭出血性卵巢炎灭活疫苗，它采用由上述所述的方法制备而成。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

⑴ 鸭出血性卵巢炎病毒用本发明筛选的仓鼠肾细胞系或非洲绿猴肾细胞系进行培养，病毒适应性好、效价高；

⑵ 经蚀斑克隆纯化筛选出的候选病毒株效价高、免疫原性好；

⑶ 细胞毒液先灭活后浓缩，减少了强毒的扩散几率，具有更好的安全性；

⑷ 细胞毒液灭活后用PBS去除残留的甲醛和杂蛋白，使疫苗的副作用降低，减小对鸭尤其是产蛋鸭生产性能的影响，提高了疫苗的安全性；

⑸ 用细胞系生产鸭出血性卵巢炎灭活疫苗批间质量差异小，具有生产工艺简单稳定、易操作、产量大、成本低、外源病毒污染几率小等特点，具备工业化大生产的可行性和可放大性，具有很好的经济效益和应用前景。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的描述。

实施例1  病毒适应性细胞系的筛选

根据病毒特性选择牛胚肾细胞系（MDBK）、仓鼠肾细胞系（BHK21）、猪肾细胞系（PK15）、非洲绿猴肾细胞系（Vero）4种细胞系分别进行鸭出血性卵巢炎病毒HB株的传代培养，筛选鸭出血性卵巢炎病毒适应性细胞系。

4种细胞均购自中国兽医药品监察所。

鸭出血性卵巢炎病毒HB株，保藏号为CCTCC V201122，2011年7月1日保藏于中国典型培养物保藏中心。所述病毒是ssRNA病毒，有囊膜；病毒颗粒大体呈球状，直径40～60nm；该病毒对外界环境的抵抗力较强，在4℃中存放几周，在-20℃中存放几个月，其感染力均不受影响；该病毒对乙醚、氯仿敏感；大多数去污剂能将它迅速灭活；在37℃条件下，用0.1％福尔马林熏蒸6h便可把它灭活；该病毒不能凝集鸡、鸭、火鸡的红细胞，可以凝集1%鸽红血球；所述病毒可在9～13日龄鸭胚尿囊腔、胚绒毛尿囊膜，9～10日龄鸡胚尿囊腔、胚绒毛尿囊膜，6日龄鸡胚卵黄囊，7～8日龄鸭胚卵黄囊中培养。

1 实验方法

用鸭出血性卵巢炎病毒HB株鸭胚适应株分别接种上述4种细胞系，连续传代6次后观察细胞病变，用免疫荧光法（IFA）检测病毒细胞培养物是否有鸭出血性卵巢炎病毒，出现细胞病变的细胞系对其病毒培养物进行效价检测。

2 实验结果

鸭出血性卵巢炎病毒HB株不能在牛胚肾细胞系（MDBK）、猪肾细胞系（PK15）中增殖，可以在仓鼠肾细胞系（BHK21）、非洲绿猴肾细胞系（Vero）中增殖并产生细胞病变（结果见表1）。

表1  应用不同细胞系传代培养结果

注：+代表阳性，﹣代表阴性，–––代表未测定。

实施例2  鸭出血性卵巢炎病毒毒株的选育及毒种种子批建立

1 试验方法

1.1 毒株的选育

1.1.1 病毒纯化：将鸭出血性卵巢炎病毒HB株鸭胚适应株分别在仓鼠肾细胞系（BHK21）、非洲绿猴肾细胞系（Vero）上连续传代3次，取细胞传代适应毒株利用0.1%中性红蚀斑纯化技术对其进行纯化培养，连续纯化三次，并进行效价测定；

1.1.2 病毒的灭活：分别取纯化毒株的细胞毒液，冻融两次后加入细胞毒液总量（V/V）0.1%的甲醛灭活，37℃振荡灭活24h；

1.1.3 毒液的洗涤与浓缩：灭活好的细胞毒液经截留分子量为50kd的密里博超滤膜包进行超滤浓缩，浓缩至原来体积的1/2，然后用等量pH为7.2的PBS洗涤，再进行浓缩，如此反复3遍，随后进行最后一次浓缩，将细胞毒液浓缩为原来的1/10体积；

1.1.4 乳化：向浓缩好的细胞毒液加入（V/V）6%吐温80，搅拌均匀为水相；在白油中按（V/V）6%加入司班80，按（W/V）1.5%加入硬脂酸铝，灭菌后为油相；按照油相与水相的体积比2：1进行乳化，乳化后即得成品疫苗，并将成品疫苗定量分装；

1.1.5 效力检验：将纯化毒株制备的鸭出血性卵巢炎灭活疫苗分别免疫产蛋鸭，免疫后，对免疫鸭及对照鸭攻击鸭出血性卵巢炎病毒HB株，统计分析攻毒结果。

1.2 毒种种子批建立

根据上述结果选择病毒效价高、攻毒保护率高的鸭出血性卵巢炎病毒毒株作为候选病毒株，在仓鼠肾细胞系（BHK21）和非洲绿猴肾细胞系（Vero）中分别传代，增殖至第15代，收获培养物标识为：B₁～B₁₅和V₁～V₁₅。按照《中国兽药典》进行无菌、支原体、外源病毒检验和效价测定，并采用上述方法制备成鸭出血性卵巢炎灭活苗进行效力检验。检验合格后，B₅～B₁₅和V₅～V₁₅作为毒种种子批。

2 实验结果

2.1毒株选育结果

蚀斑纯化试验结果显示：仓鼠肾细胞系（BHK21）中斑病毒和非洲绿猴肾细胞系（Vero）小斑病毒对细胞系的适应性好，攻毒保护率最高，选为候选病毒株（结果见表2）。

表2  毒株选育结果

2.2毒种种子批检测结果 

毒种种子批病毒效价稳定，均高于10^7.0TCID₅₀/ 1ml，攻毒保护率稳定在80%以上，且各项检验均合格（结果见表3）。

表3  毒种种子批检测结果

实施例3  用细胞系制备鸭出血性卵巢炎灭活疫苗

1 试验材料

细胞系：仓鼠肾细胞（BHK21）；

种毒：实施例2中增殖的鸭出血性卵巢炎病毒B₁₃批；

细胞生长液：组成为体积百分含量90% DMEM液、10%新生牛血清，pH值为7.2；

细胞维持液：组成为体积百分含量97% DMEM液、3%新生牛血清，pH值为7.3。

2 试验方法

2.1 细胞传代培养

仓鼠肾细胞（BHK21）经EDTA-胰酶细胞分散液消化后，加入细胞生长液，37℃继续培养，待细胞长成良好单层后备用；

2.2 病毒接种及收获

取已形成良好单层的BHK21细胞培养瓶，弃去细胞生长液，按细胞生长液体积的0.3%剂量接种鸭出血性卵巢炎病毒B₁₃批，吸附1h后，加入细胞维持液，37℃培养72h后CPE达到80%以上，收获病毒。经效价测定，半成品病毒含量为10^6.97 TCID₅₀/1ml；

2.3 病毒的灭活

取冻融两次的细胞毒液，加入细胞毒液总量（V/V）0.15%的甲醛进行灭活，37℃振荡灭活20h；

2.4 毒液的洗涤与浓缩

灭活好的细胞毒液经截留分子量为50kd的密里博超滤膜包进行超滤浓缩，浓缩至原来体积的1/2，然后用等量pH为7.2的PBS洗涤，再进行浓缩，如此反复3遍；随后进行最后一次浓缩，将细胞毒液浓缩为原来的1/10体积。经测定浓缩后细胞毒液蛋白含量为278 ug/ml；

2.5 乳化

向浓缩好的细胞毒液加入（V/V）5%吐温80，搅拌均匀为水相；在白油中按（V/V）5%加入司班80，按（W/V）1.2%加入硬脂酸铝，灭菌后为油相；按照油相与水相的体积比3：1进行乳化，乳化后即得成品疫苗，并将成品疫苗定量分装。

3 实验结果

制备出一批BHK21细胞系源鸭出血性卵巢炎灭活疫苗，批号：BHK201101。

实施例4  不同生产方法制备的鸭出血性卵巢炎灭活疫苗应用评价

1 材料与方法

1.1 实验用疫苗

实验室研制的BHK21细胞系源鸭出血性卵巢炎灭活疫苗，批号：BHK201101；

用相同方法制备的Vero细胞系源鸭出血性卵巢炎灭活疫苗，批号：Vero201101；

用相同方法各增殖一批BHK21和Vero细胞系源鸭出血性卵巢炎病毒细胞毒液，不经PBS洗涤去甲醛，直接进行浓缩制苗，得到两批鸭出血性卵巢炎灭活疫苗，批号：BHK201102、Vero201102。

1.2 半成品效价及蛋白含量测定

按照常规方法分别对BHK201101、BHK201102、Vero201101、Vero201102四批次疫苗进行收获细胞毒液效价测定及浓缩后细胞毒液蛋白含量测定。

1.3甲醛含量测定

按照常规方法分别对BHK201101、BHK201102、Vero201101、Vero201102四批次成品疫苗进行甲醛含量测定。

1.4 安全检验

取5～8周龄SPF鸭20只，随机分为4组，按2倍剂量（1.0ml）经胸部肌肉接种BHK201101、BHK201102、Vero201101和Vero201102四批次疫苗，隔离饲养。观察14天，免疫鸭不应出现明显的精神沉郁、采食量下降和拉绿色或白色稀便的临床症状。

1.5 效力检验

取5～8周龄SPF鸭100只，随机分为5组，每组20只，其中4组分别免疫BHK201101、BHK201102、Vero201101和Vero201102四批次疫苗，0.5ml/只，另1组用相同剂量的无病毒细胞液乳化剂接种作为阴性对照。免疫后28天，对所有免疫鸭及对照鸭攻击鸭出血性卵巢炎病毒HB株，统计分析攻毒结果。

1.6 疫苗对产蛋鸭生产性能的影响

取28周龄鸭出血性卵巢炎抗体阴性产蛋鸭500只，随机分为5组，每组100只，其中4组分别免疫BHK201101、BHK201102、Vero201101和Vero201102四批次疫苗，0.5ml/只，另1组用相同剂量的无病毒细胞液乳化剂接种作为阴性对照。免疫后连续观察10天，记录采食、产蛋情况，统计分析结果。

2 结果

2.1 半成品效价及蛋白含量测定结果

四批次疫苗半成品的效价均高于10^6.5 TCID₅₀/1ml。BHK201101、Vero201101两批次疫苗半成品的蛋白含量均低于400ug/ml，BHK201102、Vero201102两批次疫苗半成品的蛋白含量均高于500ug/ml（结果见表4）。

表4  半成品效价及蛋白含量测定结果

2.2 成品甲醛含量检测结果

经检测BHK201101、BHK201102、Vero201101、Vero201102四批次疫苗的甲醛含量分别为0.05%、0.12%、0.04%和0.11%。

2.3 安全检验结果

4个免疫组，免疫后观察14天，精神状态、采食、粪便均未见任何异常，均判定为合格。

2.4 效力检验结果

四批疫苗免疫鸭，攻毒保护率均在80%以上，效力检验合格（结果见表5）。

表5  成品效力检验结果

2.5 疫苗对产蛋鸭生产性能的影响

BHK201101、Vero201101疫苗免疫组（经PBS溶液洗涤组）产蛋鸭采食率、产蛋率受到的影响均低于BHK201102、Vero201102疫苗免疫组（未经PBS溶液洗涤组）（结果见表6）。

表6  疫苗免疫产蛋鸭检测结果

研究结果表明，用本发明方法制备的鸭出血性卵巢炎灭活疫苗病毒含量高，蛋白含量低，免疫效力高，免疫鸭能达到80%以上攻毒保护。PBS洗涤可有效降低甲醛和小分子蛋白含量，有效降低副反应，提高产品安全性。

Claims (10)

1.一种用细胞系生产鸭出血性卵巢炎灭活疫苗的方法，其特征在于，所述细胞系选自仓鼠肾细胞系或非洲绿猴肾细胞系。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，它包括如下步骤：

（1）选育毒株：将鸭出血性卵巢炎病毒鸭胚适应株在细胞系中连续传代培养3次，取传代适应毒株利用蚀斑纯化技术对其连续纯化培养三次，选取在仓鼠肾细胞系或非洲绿猴肾细胞系中培养效价高、免疫原性好的毒株作为候选病毒株；

（2）建立毒种种子批：将步骤（1）所得候选株病毒接种至细胞系中，传代培养至第15代，取第5～15代作为毒种种子批；

（3）制备细胞毒液：弃去形成良好单层细胞的细胞生长液，接种步骤（2）所得毒种种子批，吸附0.5～1h后，加入细胞维持液，继续培养，48～120h后细胞病变CPE达到80%以上时收获细胞毒液，该细胞毒液病毒含量≥10^6.5 TCID₅₀/1ml；

（4）灭活病毒：取步骤（3）所得细胞毒液冻融两次后，加入细胞毒液总量（V/V）0.1～0.2%的灭活剂，在37℃下振荡灭活16～24h；

（5）洗涤与浓缩细胞毒液：将步骤（4）所得灭活好的细胞毒液浓缩至原来体积的1/2，然后用等量pH值为7.0～7.2的PBS溶液洗涤，再进行浓缩，如此反复2～3遍，随后进行最后一次浓缩，将细胞毒液浓缩为原来体积的1/5～1/10，细胞毒液蛋白含量应不大于400ug/ml；

（6）乳化：向步骤（5）所得浓缩好的细胞毒液加入（V/V）4%～8%吐温80，搅拌均匀为水相，按照油相与水相的体积比1.5～3：1进行乳化，乳化后即得成品。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（1）中所述蚀斑纯化技术为0.1%中性红蚀斑纯化技术。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述细胞生长液的组成为：体积百分含量90%～92%的 DMEM液、8%～10%新生牛血清，pH值调整为7.2～7.4。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述接种的剂量为细胞生长液体积的0.3%～1.0%。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述细胞维持液的组成为：体积百分含量95%～98% DMEM液、2%～5%新生牛血清，pH值调整为7.2～7.4。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述灭活剂为质量浓度37%的甲醛溶液。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述浓缩中其使用截留分子量50kd的密里博超滤膜包进行超滤浓缩。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述油相的制备方法为：在白油中按（V/V）4%～8%加入司班80，按（W/V）1%～2%加入硬脂酸铝，灭菌后即得油相。

10.一种鸭出血性卵巢炎灭活疫苗制品，其特征在于，它采用如权利要求1～9任一权利要求所述的方法制备而成。