CN115449502A - 无血清全悬浮培养型bhk-21-c细胞株及其构建方法与应用 - Google Patents

无血清全悬浮培养型bhk-21-c细胞株及其构建方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，公开了无血清全悬浮培养型BHK‑21‑C细胞株及其构建方法与应用。该无血清全悬浮培养型BHK‑21‑C细胞株，名称为乳仓鼠肾细胞BHK‑21‑C悬浮细胞，于2022年1月11日保藏于位于中国.武汉.武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C202216，细胞生长稳定，密度可达5.0～6.0×106cells/mL；该无血清全悬浮培养型BHK‑21‑C细胞株可用于培养、分离、检测病毒，制备病毒疫苗，筛选用于预防或治疗病毒感染所致的疾病的药物，尤其是新型鸭呼肠孤病毒。

Description

无血清全悬浮培养型BHK-21-C细胞株及其构建方法与应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及无血清全悬浮培养型BHK-21-C细胞株及其构建方法与应用。
背景技术
呼肠孤病毒病(ARV)是由禽呼肠孤病毒引起的一种传染病。禽呼肠孤病毒可分为鸡源呼肠孤病毒和水禽源呼肠孤病毒。水禽源呼肠孤病毒又分为番鸭呼肠孤病毒(基因1型，MDRV)及新型鸭呼肠孤病毒(基因2型，NDRV)，其中以新型鸭呼肠孤病毒感染为主。新型鸭呼肠孤病毒病又称为番鸭、半番鸭(6～25日龄)“新肝病”，会导致肝脏出现不同程度的点、斑块状出血和坏死，脾脏肿大坏死、心脏和法氏囊出血等，也可导致鹅发生出血性坏死性肝炎和樱桃谷鸭、麻鸭发生鸭脾坏死病。该病无明显季节性，一年四季均可发生，冬春季节多发，同时分布广泛。此外，由于其垂直传播的特点，雏鸭出壳后即携带该病毒，除造成发病外，还会造成严重的免疫抑制，导致雏鸭后期死淘率增加，危害巨大。
目前国内兽用疫苗市场仅有青岛易邦生物工程有限公司取得了番鸭呼肠孤病毒活疫苗(CA株)的批准文号，而新型鸭呼肠孤病毒相关疫苗尚无批准文号及生产厂家。因此，筛选一株合适的对新型鸭呼肠孤病毒敏感的无血清悬浮细胞、以之作为载体生产新型鸭呼肠孤病毒疫苗，是控制新型鸭呼肠孤病毒的关键。
发明内容
本发明第一方面的目的，在于提供一种无血清全悬浮培养型BHK-21-C细胞株。
本发明第二方面的目的，在于提供第一方面的无血清全悬浮培养型BHK-21-C细胞株的构建方法。
本发明第三方面的目的，在于提供第一方面的无血清全悬浮培养型BHK-21-C细胞株的应用。
本发明第四方面的目的，在于提供一种培养病毒的方法。
本发明第五方面的目的，在于提供一种病毒疫苗的制备方法。
本发明第六方面的目的，在于提供一种病毒疫苗。
为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一个方面，提供一种无血清全悬浮培养型BHK-21-C细胞株，名称为乳仓鼠肾细胞BHK-21-C悬浮细胞，于2022年1月11日保藏于位于中国.武汉.武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C202216。
本发明的第二个方面，提供本发明第一方面的无血清全悬浮培养型BHK-21-C细胞株的构建方法，包括如下步骤：1)对BHK-21贴壁细胞进行单克隆驯化，得到生长良好的无血清全悬浮培养的BHK-21单克隆细胞株；2)将新型鸭呼肠孤病毒接种至生长良好的无血清全悬浮培养的BHK-21单克隆细胞株，筛选对新型鸭呼肠孤病毒敏感的BHK-21单克隆细胞株，命名为BHK-21-C。
优选地，所述新型鸭呼肠孤病毒为NDRV-CM株。
本发明的第三个方面，提供本发明第一方面的无血清全悬浮培养型BHK-21-C细胞株的应用：
本发明第一方面的无血清全悬浮培养型BHK-21-C细胞株在培养病毒中的应用；
本发明第一方面的无血清全悬浮培养型BHK-21-C细胞株在制备培养病毒的产品中的应用；
本发明第一方面的无血清全悬浮培养型BHK-21-C细胞株在分离病毒中的应用；
本发明第一方面的无血清全悬浮培养型BHK-21-C细胞株在制备分离病毒的产品中的应用；
本发明第一方面的无血清全悬浮培养型BHK-21-C细胞株在非诊断治疗目的地检测病毒中的应用；
本发明第一方面的无血清全悬浮培养型BHK-21-C细胞株在制备检测病毒的产品中的应用；
本发明第一方面的无血清全悬浮培养型BHK-21-C细胞株在制备疫苗中的应用；
本发明第一方面的无血清全悬浮培养型BHK-21-C细胞株在药物筛选中的应用，所述药物为用于预防或治疗病毒感染所致的疾病的药物。
优选地，所述病毒包含新型鸭呼肠孤病毒、新城疫病毒、狂犬病毒中的至少一种；进一步包含新型鸭呼肠孤病毒；更进一步包含新型鸭呼肠孤病毒弱毒株(NDRV-CM株)。
本发明的第四个方面，提供一种培养病毒的方法，将病毒接种至本发明第一方面的无血清全悬浮培养型BHK-21-C细胞株的细胞悬液，培养。
优选地，所述病毒包含新型鸭呼肠孤病毒、新城疫病毒、狂犬病毒中的至少一种；进一步包含新型鸭呼肠孤病毒；更进一步包含新型鸭呼肠孤病毒弱毒株(NDRV-CM株)。
优选地，所述病毒的接毒量为0.5v/v‰～5v/v‰，即为无血清全悬浮培养型BHK-21-C细胞株的细胞悬液的0.5v/v‰～5v/v‰；进一步为0.5v/v‰～2v/v‰；更进一步为1v/v‰～2v/v‰。
优选地，所述无血清全悬浮培养型BHK-21-C细胞悬液通过无血清全悬浮培养型BHK-21-C细胞悬液母液与无血清悬浮培养基混合得到。
优选地，所述无血清全悬浮培养型BHK-21-C细胞悬液母液与无血清悬浮培养基的体积比为1：1～2：1；进一步为1：1。
优选地，所述无血清全悬浮培养型BHK-21-C细胞悬液母液的密度为5×106～6×106cell s/mL；进一步为5.3×106～6×106cells/mL。
优选地，所述培养的温度为32～39℃；进一步为33～37℃；更进一步为33～35℃。
优选地，所述培养的转速为50～150r/min；进一步为100～130r/min。
优选地，所述培养的CO2浓度为4～10％；进一步为5～10％。
优选地，所述无血清全悬浮培养型BHK-21-C细胞悬液母液通过如下方法制得：将无血清全悬浮培养型BHK-21-C细胞接种于无血清悬浮培养基中，培养。
优选地，所述无血清全悬浮培养型BHK-21-C细胞的接种密度为1～10×105cells/mL。
优选地，所述无血清悬浮培养基为BS-SFM IV。
优选地，所述培养条件为32～39℃，4～6％CO2，120～140r/min培养44～52h。
本发明的第五个方面，提供一种病毒疫苗的制备方法，将病毒接种至本发明第一方面的无血清全悬浮培养型BHK-21-C细胞株的细胞悬液，培养，灭活，得到病毒疫苗。
优选地，所述病毒包含新型鸭呼肠孤病毒、新城疫病毒、狂犬病毒中的至少一种；进一步包含新型鸭呼肠孤病毒；更进一步包含新型鸭呼肠孤病毒弱毒株(NDRV-CM株)。
优选地，所述病毒的接毒量为0.5v/v‰～5v/v‰，即为无血清全悬浮培养型BHK-21-C细胞株的细胞悬液的0.5v/v‰～5v/v‰；进一步为0.5v/v‰～2v/v‰；更进一步为1v/v‰～2v/v‰。
优选地，所述无血清全悬浮培养型BHK-21-C细胞悬液通过无血清全悬浮培养型BHK-21-C细胞悬液母液与无血清悬浮培养基混合得到。
优选地，所述无血清全悬浮培养型BHK-21-C细胞悬液母液与无血清悬浮培养基的体积比为1：1～2：1；进一步为1：1。
优选地，所述无血清全悬浮培养型BHK-21-C细胞悬液母液的密度为5×106～6×106cell s/mL；进一步为5.3×106～6×106cells/mL。
优选地，所述培养的温度为32～39℃；进一步为33～37℃；更进一步为33～35℃。
优选地，所述培养的转速为50～150r/min；进一步为100～130r/min。
优选地，所述培养的CO2浓度为4～10％；进一步为5～10％。
优选地，所述无血清全悬浮培养型BHK-21-C细胞悬液母液通过如下方法制得：将无血清全悬浮培养型BHK-21-C细胞接种于无血清悬浮培养基中，培养。
优选地，所述无血清全悬浮培养型BHK-21-C细胞的接种密度为1～10×105cells/mL。
优选地，所述无血清悬浮培养基为BS-SFM IV。
优选地，所述培养条件为32～39℃，4～6％CO2，pH6.8～7.2，120～140r/min培养44～52h。
本发明的第六个方面，提供一种病毒疫苗，通过本发明第五方面的制备方法得到。
本发明的有益效果是：
本发明通过发明人的大量创造性劳动，首次构建得到无血清全悬浮培养型BHK-21-C细胞株，名称为乳仓鼠肾细胞BHK-21-C悬浮细胞，于2022年1月11日保藏于位于中国.武汉.武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C202216，细胞生长稳定，密度可达5.0～6.0×106cells/mL；该无血清全悬浮培养型BHK-21-C细胞株可用于培养、分离、检测病毒，制备病毒疫苗，筛选用于预防或治疗病毒感染所致的疾病的药物，尤其是新型鸭呼肠孤病毒。
本发明构建得到的无血清全悬浮培养型BHK-21-C细胞株可适应无血清全悬浮培养，培养批次内细胞密度大，有利于培养基中的营养物质和细胞充分接触，而且易于在连续密闭的系统中进行，减少了污染的几率，悬浮培养的细胞仍保持对病毒的敏感性和生物学特性，可用于培养病毒、制备病毒疫苗；此外还便于连续扩大生产，容易控制培养条件如温度、pH等，安全性有保证，能够大幅度降低实际生产中的场地和人力投入，有利于大规模生产，产生可观的经济效益。
进一步地，本发明首次公开了新型鸭呼肠孤病毒的无血清全悬浮培养方法，填补了国内水禽呼肠孤病毒活疫苗全悬浮培养的空白，该方法简单，同时可提高培养基的使用效率、节省成本。
附图说明
图1是实施例1中BHK-21-C细胞接种新型鸭呼肠孤病毒(NDRV-CM株)病变图：其中，a是未接种新型鸭呼肠孤病毒(NDRV-CM株)的BHK-21-C细胞状态图；b是接种新型鸭呼肠孤病毒(NDRV-CM株)48h后的BHK-21-C细胞状态图；c是接种新型鸭呼肠孤病毒(NDRV-CM株)72h后的BHK-21-C细胞状态图。
图2是实施例1中BHK-21-C悬浮细胞生长曲线图。
具体实施方式
以下通过具体的实施例对本发明的内容作进一步详细的说明。
应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。本实施例中所使用的材料、试剂等，如无特别说明，为从商业途径得到的试剂和材料。
新型鸭呼肠孤病毒(CM株)由佛山科技学院黄淑坚老师课题组鉴定并提供，其名称为NDRV-CM，分类命名为新型鸭呼肠孤病毒，于2021年12月13日保藏于位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO：45061。
本实施例中所使用的试剂均为分析纯级试剂，且可从正规渠道商购获得。
实施例1新型鸭呼肠孤病毒敏感无血清悬浮细胞株的筛选
1.悬浮培养的BHK-21单克隆化细胞株的制备：取生长良好的BHK-21贴壁细胞(来源于华南农业大学教研室，该细胞已在文献：高潇祎.稳定过表达鸡ATG12和ATG16L1的BHK-21细胞株的构建及其对新城疫病毒增殖的影响.中公开)，消化离心后加入无血清全悬浮培养基(BS-SFM IV，购自苏州沃美生物技术有限公司)，吹打悬浮细胞并计数，将细胞用无血清全悬浮培养基稀释为10cells/mL，取细胞悬液100μL/孔加入96孔细胞培养板；挑选出多个仅有1个细胞/孔的培养孔，再从中挑选出生长良好的细胞单株，持续放大培养。通过稀释法筛选出20个单克隆细胞株，同时对各单克隆细胞株的平均生长密度(每个传代的代次的细胞数目的平均数)进行统计，各细胞株代次及数据如表1所示。
表1不同单克隆株的平均生长密度及传代代次
Figure BDA0003797485660000051
待细胞增殖到足够数量后，调整细胞初始密度为1.0×106cells/mL，培养条件为37℃，5％CO2，130r/min摇床培养，每两天传代一次，连续传代15次以上，完成BHK-21细胞的单克隆驯化。
2.新型鸭呼肠孤病毒敏感细胞株的筛选：将单克隆驯化的BHK-21细胞株以1.0×106cells/mL接种于无血清悬浮培养基中，培养条件为37℃，5％CO2，130r/min摇床培养48h后，接种体积比为2‰的新型鸭呼肠孤病毒(CM株，TCID50＝10-4.0/0.1mL)，接毒后细胞于35℃，5％CO2，130r/min摇床持续培养72h，观察细胞状态(见图1，以BHK-21-C细胞株为例，a为健康细胞：在镜下观察是透亮，边缘轮廓光滑，且视野内细胞数目多，b为接毒后48h细胞状态：视野内细胞数目未见明显减少，但部分细胞状态开始变差，镜下观察可见边缘粗糙，且透亮度降低，c为接毒后72h细胞状态：视野范围内细胞数大量减少，能观察到很多细胞碎片，大部分细胞透亮度差，且细胞边缘毛糙)，检测病毒滴度，结果如表2所示：其中编号为C的BHK-21细胞株的滴度最高，可达TCID50＝10-6.83/0.1mL，命名为无血清全悬浮培养型BHK-21-C细胞株。连续传代15代结果表明该细胞株生长稳定、迅速，48h细胞密度可达5.0～6.0×106cells/mL，细胞活率在98％以上，具体生长曲线见图2。该细胞株名称为乳仓鼠肾细胞BHK-21-C悬浮细胞，于2022年1月11日保藏于位于中国.武汉.武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C202216。
表2单克隆细胞株接种水禽新型呼肠孤病毒TCID50结果
Figure BDA0003797485660000061
3.与目前普通BHK细胞接种新型鸭呼肠孤病毒病毒滴度对比：取本发明的BHK-21-C悬浮细胞及普通BHK细胞(来源于佛山科学技术学院预防兽医学实验室，该细胞已在文献：李文俊,杨惠湖,姚鑫炎,等.鸭坦布苏病毒SCCD2020株的分离鉴定及其E基因,NS1基因序列分析[J].广东畜牧兽医科技,2021.中公开)培养，传代稳定后，分别接种体积比为2‰的新型鸭呼肠孤病毒(CM株，TCID50＝10-4.0/0.1mL)，接毒后细胞于35℃，5％CO2，130r/min摇床持续培养至72h，检测病毒效价。结果如表3所示，BHK-21-C细胞株接种病毒后，产毒较快，48h病毒效价可达TCID50＝10-4.1/0.1mL，而普通BHK细胞仅为TCID50＝10-3.5/0.1mL；同时相较于普通BHK细胞，本细胞株最终病毒效价也更高，可达TCID50＝10-8.17/0.1mL，而普通BHK细胞仅为TCID50＝10-6.37/0.1mL。
表3不同细胞对病毒增殖的影响
Figure BDA0003797485660000071
实施例2一种培养新型鸭呼肠孤病毒的方法
1.新型鸭呼肠孤病毒(CM株)最佳接毒密度的确定
取细胞密度为5.3×106cells/mL、5.5×106cells/mL、5.7×106cells/mL、6.0×106cells/mL的无血清全悬浮培养型BHK-21-C细胞悬液，取无血清全悬浮培养基分别按细胞悬液与无血清全悬浮培养基的体积比为1：1，1：2和2：1进行稀释，同时以细胞悬液与无血清全悬浮培养基的总体积的2‰接种剂量接种新型鸭呼肠孤病毒(CM株，NDRV-CM，TCID50＝10-4.0/0.1mL)，于35℃，5％CO2，130r/min摇床持续培养至72h，检测病毒滴度TCID50，结果如表4所示：不同细胞密度的细胞悬液按体积比1：1进行稀释后接种新型鸭呼肠孤病毒，病毒效价均是三种稀释比例方法中的最高值，其中当细胞密度为6.0×106cells/mL时，按体积比1：1进行稀释后接种新型鸭呼肠孤病毒后TCID50＝10-8.38/0.1mL；当按体积比1：2进行稀释后接种新型鸭呼肠孤病毒，整体的病毒效价最低；当按体积比2：1进行稀释后的病毒效价介于两者之间；可见，当BHK-21-C的细胞密度在5.3～6.0×106cells/mL时，按体积比为1：1进行稀释，此时接毒效果最佳。
表4不同接毒密度对病毒增殖的影响
Figure BDA0003797485660000072
Figure BDA0003797485660000081
2.新型鸭呼肠孤病毒(CM株)最佳接毒量
取细胞密度为5.7×106cells/mL的无血清全悬浮培养型BHK-21-C细胞悬液，取无血清全悬浮培养基按细胞悬液与培养基体积比为1：1进行稀释，同时以细胞悬液与无血清全悬浮培养基的总体积的0.5‰、1‰、2‰、5‰接毒剂量接种新型鸭呼肠孤病毒(CM株，NDRV-CM，TCID50＝10-4.0/0.1mL)，于35℃，5％CO2，130r/min摇床持续培养至72h，检测病毒滴度TCID50。结果如表5所示：以2‰接种后病毒增殖效果较好，病毒滴度TCID50＝10-8.17/0.1mL；以5‰接毒72小时后，由于接毒量较大，细胞死亡速度较快，导致72小时收样时候活毒数目较低，TCID50＝10-6.37/0.1mL；而以0.5‰接毒量接种后，72小时病毒滴度TCID50＝10-7.50/0.1mL；以1‰接毒量接种后，72小时病毒滴度TCID50＝10-7.62/0.1mL；可见，最佳接毒剂量确定为2‰。
表5不同病毒接种量对病毒增殖的影响
Figure BDA0003797485660000082
3.NDRV-CM株病毒最佳培养温度的确定
取细胞密度为5.6×106cells/mL的无血清全悬浮培养型BHK-21-C细胞悬液，取无血清全悬浮培养基按细胞悬液与培养基体积比为1：1进行稀释，同时以细胞悬液与无血清全悬浮培养基的总体积的2‰接毒剂量接种新型鸭呼肠孤病毒(CM株，NDRV-CM，TCID50＝10-4.0/0.1mL)，转速130转/分钟、温度为33、35、37或39℃、5％CO2的条件下培养72小时，检测病毒滴度，结果如表6所示：在35℃培养下，病毒滴度较高，TCID50＝10-8.37/0.1mL，而在33℃培养下，细胞病变较慢，TCID50＝10-7.50/0.1mL；在37℃和39℃下，病毒活性较高，细胞死亡速度较快，72小时病毒发生死亡，导致病毒滴度较低，TCID50≤10-6.83/0.1mL；因此，35℃为最佳病毒培养温度。
表6不同温度对病毒增殖的影响
Figure BDA0003797485660000091
4.一种培养新型鸭呼肠孤病毒的方法
1)从液氮罐中复苏冻存的BHK-21-C悬浮种细胞，用吸管将细胞液加入到250mL三角摇瓶中，加入pH为7.1±0.1的过滤除菌无血清全悬浮培养基至100mL；细胞培养约48h后，当细胞密度达到5.5～6.0×106cells/mL之间时进行接毒；
2)采用新鲜无血清清培养基将1)中培养48h细胞按细胞悬液与培养基体积比1：1进行稀释，接毒量的体积比为2‰，接毒后置于于35℃，5％CO2，130r/min摇床持续培养至72h。
上述培养新型鸭呼肠孤病毒的方法进行3个批次的摇瓶工艺重复和15L反应器工艺验证，每个批次中细胞悬液的密度如表7所示，病毒滴度TCID50结果如表7所示：病毒滴度均可达TCID50＝10-8.17/0.1mL，最高可达10-8.38/0.1mL。
表7摇瓶工艺和反应器工艺重复验证结果
实验类型 细胞密度(*10<sup>6</sup>cells/mL) 病毒效价(TCID<sub>50</sub>/0.1mL)
1000ml摇瓶(第一次) 5.5 10<sup>-8.17</sup>
1000ml摇瓶(第二次) 5.7 10<sup>-8.17</sup>
1000ml摇瓶(第三次) 5.9 10<sup>-8.38</sup>
15L反应器(第一次) 5.8 10<sup>-8.38</sup>
15L反应器(第二次) 5.9 10<sup>-8.38</sup>
15L反应器(第三次) 5.5 10<sup>-8.17</sup>
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种无血清全悬浮培养型BHK-21-C细胞株，名称为乳仓鼠肾细胞BHK-21-C悬浮细胞，于2022年1月11日保藏于位于中国.武汉.武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C202216。
2.权利要求1所述的无血清全悬浮培养型BHK-21-C细胞株在(1)～(4)中任一项中的应用；
(1)培养病毒；
(2)制备培养病毒的产品；
(3)分离病毒；
(4)制备分离病毒的产品。
3.权利要求1所述的无血清全悬浮培养型BHK-21-C细胞株在(5)～(6)中任一项中的应用；
(5)非诊断治疗目的地检测病毒；
(6)制备检测病毒的产品。
4.权利要求1所述的无血清全悬浮培养型BHK-21-C细胞株在(7)～(8)中任一项中的应用；
(7)制备病毒疫苗；
(8)药物筛选；
所述药物为用于预防或治疗病毒感染所致的疾病的药物。
5.根据权利要求2～4中任一项所述的应用，其特征在于：
所述病毒包含新型鸭呼肠孤病毒、新城疫病毒、狂犬病毒中的至少一种。
6.一种培养病毒的方法，将病毒接种至权利要求1所述的无血清全悬浮培养型BHK-21-C细胞株的细胞悬液，培养。
7.一种制备病毒疫苗的方法，将病毒接种至权利要求1所述的无血清全悬浮培养型BHK-21-C细胞株的细胞悬液，培养，灭活，得到病毒疫苗。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于：
所述病毒包含新型鸭呼肠孤病毒、新城疫病毒、狂犬病毒中的至少一种。
9.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于：
所述病毒的接毒量为0.5v/v‰～5v/v‰；
优选地，所述培养的温度为32～39℃。
10.一种病毒疫苗，通过权利要求7所述的方法得到。
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