CN1458273A - 人胎儿背根神经节干细胞的分离、制备及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种背根神经节(dorsal root ganglion，DRG)干细胞的制备及分离方法。涉及了利用有丝分裂因子EGF和bFGF，首次从周围神经系统分离出背根神经节(dorsal root ganglion，DRG)干细胞，并进行体外和诱导分化培养。这类细胞具有明显的干细胞特征，能分化为大小感觉神经元、卫星细胞和雪旺氏细胞的潜能。体内定位分布和周围神经损伤后的活性研究表明，DRG干细胞主要定位在成熟节细胞周围，受损伤刺激后部分细胞进入增殖分裂期。另外，DRG干细胞能够进行体外－196℃保存和复苏，复苏后细胞仍具有干细胞特性。这就为体外大量扩增、储存干细胞，用于治疗各种先天性或获得性神经系统疾病引起的神经细胞缺损、神经系统肿瘤以及周围神经损伤特别是神经根性撕脱伤提供了新途径。

Description

人胎儿背根神经节干细胞的分离、制备及应用
本发明涉及了利用有丝分裂因子EGF和bFGF，首次从周围神经系统分离出背根神经节(dorsal root ganglion，DRG)干细胞，并进行体外和诱导分化培养。这类细胞具有明显的干细胞特征，能分化为大小感觉神经元、卫星细胞和雪旺氏细胞的潜能。体内定位分布和周围神经损伤后的活性研究表明，DRG干细胞主要定位在成熟节细胞周围，受损伤刺激后部分细胞进入增殖分裂期。另外，DRG干细胞能够进行体外-196℃保存和复苏，复苏后细胞仍具有干细胞特性。这就为体外大量扩增、储存干细胞，用于治疗各种先天性或获得性神经系统疾病引起的神经细胞缺损、神经系统肿瘤以及周围神经损伤特别是神经根性撕脱伤提供了新途径。
目前，神经系统很多部位都分离出了神经干细胞，包括啮齿类成年和胚胎个体的脑室下区、端脑、海马、纹状体、脊髓，甚至人神经组织的大脑、脊髓和嗅球，这些科学进展为研究神经系统发育和治疗神经系统的疾病带来了前所未有光明前景。然而，这些神经干细胞都来自于中枢神经系统，治疗研究的方向也集中在中枢神经系统。实际上，我国乃至整个世界上，每年因各种原因所导致的周围神经损伤的病人不计其数。目前，周围神经损伤，特别是根部撕脱性损伤尚无很好的治疗解决办法。本实验小组在国际上首次体外培养出了周围神经来源的人背根神经节干细胞(dorsal root ganglion stem cell，DRG stem cell)，并发现了体外诱导分化、储存的有效方法及体内的定位，为DRG用于治疗周围神经损伤，特别是根性撕脱伤打下基础。
本发明的目的是通过下述方法实现的：
本发明通过分离流产胎儿脊髓两侧的DRG，制成单细胞悬液，培养于加有EGF和bFGF的DMEM/F12(GIBCO)无血清完全培养基中，3-5天后聚集形成悬浮生长的神经球，并可进行传代扩增。其中胶质细胞占大部分，神经元仅占2-10％。免疫组化结果显示神经球细胞表达nestin蛋白--一种神经干/祖细胞表达的神经内皮中间纤维丝蛋白；胶质细胞GFAP和S100染色阳性，神经元NF染色阳性。本发明显示，DRG干细胞对血清很敏感，少量血清能导致细胞发生分化，即具有多潜能分化特性。DRG干细胞能够进行体外-196℃保存和复苏，复苏后细胞仍具有干细胞特性。胎儿DRG经过固定后进行石蜡切片，采用nestin单克隆抗体和荧光标记的二抗对组织切片进行免疫显色检测，发现DRG干细胞分布在成熟节细胞的周边；从后肢根部切断SD大鼠坐骨神经，腹腔注射BrdU，对组织切片进行免疫荧光检测，显示相应DRG的节细胞周边出现S期细胞，说明当受到损伤刺激后，这些细胞被激活进入分裂增生期。
附图说明
图1示出背根神经节细胞接种培养3-5天后，细胞开始聚集并逐渐形成细胞球
图2示出诱导分化第14天，可见带有很长神经纤维丝的假单极或多极神经元，具有明显的感觉神经元形态特征
图3示出10％血清诱导分化第14天，感觉神经元细胞明显减少
人胎儿背根神经节干细胞的分离、制备及应用例作：一.人胎儿背根神经节干细胞的分离和扩增
获得16-26周的流产胎儿，无菌条件下仔细分离脊髓两侧的DRG，HanK’s缓冲盐溶液(HBSS)清洗，组织采用显微剪充分剪碎后胰蛋白酶室温常规消化30分钟，洗涤，经100目不锈钢网过滤，单细胞悬液接种于24孔板，于37℃，5％CO2条件下培养，培养液为补充N2添加剂(GIBCO)的DMEM/F12(GIBCO)无血清完全培养基，并加入有丝分裂因子EGF和bFGF，及青霉素和链霉素，二性霉素B。以上体系每3-4天换液一次，7-10天传代一次。胎儿DRG细胞早期贴附在塑料壁底，在有丝分裂因子EGF和bFGF的刺激下，少部分细胞(10％)发生分裂增殖，3-5DIV形成具有干细胞特征的神经球。二.克隆分析
为了研究能否产生第二代神经球。将体外培养10天左右的神经球，胰蛋白酶常规消化打散后，采用无限稀释法接种到96孔板，使每孔细胞数不超过50个/ml，添加上述完全培养基和有丝分裂因子EGF和bFGF，3-4天换液一次，并每天添加生长因子，观察神经细胞生长情况。原代DRG干细胞形成的神经球分散成单细胞，接种后第7天，细胞分裂增殖形成第二代小神经球。经过免疫组化染色鉴定，神经球细胞表达nestin蛋白--一种神经干/祖细胞表达的神经内皮中间纤维丝蛋白。通过比较我们的实验资料，结果发现DRG干细胞体外生长过程与脑、脊髓神经干细胞很相似，但DRG干细胞体积较脑、脊髓神经干细胞稍大，生长速度快，体外培养3-5天即可形成悬浮生长的神经球，而人胎儿脑、脊髓神经干细胞一般要7-10天才形成神经球。随着体外培养时间的延长，第10DIV左右，DRG干细胞神经球周围出现一个或多个大的空泡状细胞，这一现象在脑、脊髓神经干细胞培养过程中并不出现。可能是少数细胞祖细胞或前体细胞，随培养时间的延长出现了分化的结果。事实上，当加入血清诱导分化时，这种空泡状细胞很快贴壁发生分化现象。三.人胎儿背根神经节干细胞的多潜能分化
收集体外培养7天的DRG干细胞神经球，机械打散分离，低密度接种到铺有多聚赖氨酸(poly-L-lysine)的盖玻片上，撤除有丝分裂因子，采用加入1％或10％血清的完全培养基体外培养7-14天，10％中性福尔马林固定分化好的细胞，并进行SABC法免疫组化染色鉴定。血清能够诱导DRG干细胞的体外分化，分化产生的子代细胞包括胶质细胞和神经元，其中胶质细胞占大部分，神经元仅占2-10％。通过免疫组化鉴定，胶质细胞GFAP和S100染色阳性，神经元NF染色阳性。在诱导分化的早期(第5-7天)，产生的神经元胞体小，有1-2个突起，呈单极和双极细胞。到2周左右，神经元表现更成熟，胞体变大并且常常只有1根长的神经纤维丝，长的神经纤维分叉与其它神经元纤维丝相联系，细胞表现为明显的假单极神经元。这一分化过程与感觉神经元的正常发育极其相似：单极神经元在成熟个体内少见，此种类型细胞仅见于胚胎时期的成神经细胞(neuroblast，一种神经母细胞)；假单极神经元在胚胎早期是双极，后来逐渐成熟，两极在胞体附近合并成为单极]。在这些大神经元之间，还有一种胞体很小的神经元，带有2-3根长的神经纤维丝，这类细胞NF染色也呈阳性，并且可清楚看到沿神经纤维排列的髓鞘细胞。上述特征与正常背根神经节组成是一致的，正常DRG内含有感觉神经元、卫星细胞、雪旺氏细胞(Schwann cell)。神经节内以假单极神经节细胞最多，细胞可分为三种：即大中小细胞。大细胞发出粗大有髓纤维，小细胞发出有髓或无髓的细纤维。与脑神经干细胞一样，诱导分化产生的神经元的比例受体外诱导因素的影响，本研究显示，DRG干细胞对血清很敏感，少量血清能导致细胞发生分化，且0.1％血清诱导产生的神经元比例(8-10％)明显多于10％血清组(2-5％)。因此，我们认为DRG干细胞具有分化为体内相应胶质细胞和感觉神经元细胞的能力，即多潜能分化特性。四.细胞的冻存和复苏
体外培养30天的DRG干细胞，常规消化打散成单细胞后，离心收集细胞，更换新鲜的完全培养基和10％DMSO，混匀细胞，使终浓度为106/ml，转入2ml冻存管，然后逐渐冷却进入液氮保存。
细胞冻存15天后，迅速37℃温水复苏，复苏后细胞仍具有干细胞特性。五.背根神经节干细胞在体研究
为研究DRG干细胞的体内分布，我们把16-26周人胎儿DRG经过固定后进行石蜡切片，采用nestin单克隆抗体和荧光(FITC)标记的二抗对组织切片进行免疫显色检测，发现DRG干细胞分布在成熟节细胞的周边，
为研究DRG干细胞在体内的增殖，我们采用成年的SD大鼠(150g左右)，从动物后肢根部切断坐骨神经，经腹腔注射BrdU，处死动物，免疫荧光显示相应DRG的节细胞周边出现S期细胞，说明部分细胞被激活进入增殖期。
本发明的优点：
1.本发明首次报道人胎儿背根神经节干细胞的分离和扩增过程，并证明了DRG细胞的多分化潜能，操作方法简单可行；
2.本发明确定了DRG干细胞体外保存和复苏的条件，复苏后细胞仍具有干细胞特性，这就为干细胞移植治疗各种周围神经损伤、先天性神经系统疾病以及神经系统肿瘤打下基础；
3.本发明为神经干细胞的研究增加了一个新来源，使神经系统的可塑性研究成为可能；
4.本发明为分子生物学、药理学提供了一种工具细胞。

Claims (4)

1、首次从周围神经系统分离出背根神经节(dorsal rootganglion，DRG)干细胞，并利用有丝分裂因子EGF和bFGF进行体外和诱导分化培养。其特征在于：这类细胞具有明显的干细胞特征，具有分化为大小感觉神经元、卫星细胞和雪旺氏细胞的潜能。体内定位分布和周围神经损伤后的活性研究表明，DRG干细胞主要定位在成熟节细胞周围，受损伤刺激后部分细胞进入增殖分裂期。另外，DRG干细胞能够进行体外-196℃保存和复苏，复苏后细胞仍具有干细胞特性。实现了体外大量扩增、储存干细胞，作为治疗各种先天性或获得性神经系统疾病引起的神经细胞缺损、神经系统肿瘤以及周围神经损伤特别是神经根性撕脱伤的新途径。
2、据权利要求1所述的方法，其特征在于：人胎儿背根神经节干细胞的分离、培养、诱导分化、冻存和复苏；
3、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：人胎儿背根神经节干细胞作为一种细胞模型研究神经系统的正常或畸形发育过程，用于研究感觉神经元、卫星细胞和Schwann Cells的分化调节过程，还可作为分子生物学、药理学的工具细胞；
4、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：背根神经节干细胞用于治疗各种先天性或获得性神经系统疾病引起的神经细胞缺损、神经系统肿瘤以及周围神经损伤特别是神经根性撕脱伤。
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