CN103789264B - 一种分离纯化背根神经元的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种分离纯化背根神经元的方法该方法包括以下步骤：步骤一、细胞混合液的制备；步骤二、细胞悬浮液的制备；步骤三、对细胞悬浮液进行纯化，得到背根神经节神经元。采用该方法节省了纯化步骤和时间，同时解决了纯化时间过长导致细胞被细菌污染的几率大的问题。
Description
技术领域
本发明属于细胞分离技术领域，具体涉及一种分离纯化背根神经元的方法。
背景技术
在体外进行神经元细胞研究时，非神经元细胞常常会造成严重的干扰。背根神经元易于识别，能很容易地与非神经元细胞区分，被广泛应用于神经元细胞的体外研究，如用于研究神经元轴突生长、髓鞘形成等。众多研究表明哺乳动物的背根神经元细胞能够再体外生存并且能够再生。如何分离得到纯度较高、功能不受影响的背根神经元显得尤为重要。
目前，分离纯化背根神经元的方法为抗有丝分裂试剂，如氟脱氧尿苷等处理共培养体系从而纯化背根神经元。然而，这种方法存在的缺点是：需要使用抗有丝分裂试剂多次重复处理细胞（通常3次以上），通常需要两周时间才能获得纯度较高的细胞，费时费力，而且这种长时间的纯化过程增加了被细菌污染的几率。
发明内容
本发明的目的是提供一种分离纯化背根神经元的方法，采用该分离纯化方法减少了纯化背根神经元的步骤，缩短了纯化背根神经元所需的时间。
本发明所采用的技术方案是，一种分离纯化背根神经元的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
步骤一、细胞混合液的制备：
切取大鼠胚胎的背根神经节放入培养基中进行培养；将得到的背根神经节放入培养皿中，然后加入质量浓度为0.03%～0.15%的胰酶/EDTA溶液进行消化，消化时间为10min～30min，消化后得到细胞混合液；
步骤二、细胞悬浮液的制备：
收集步骤一中所得的细胞混合液中的细胞，向其中加入含胎牛血清和DNA酶的培养基，然后将其吹散，并将吹散后的细胞用细胞过滤器进行过滤，采用神经元基础培养液洗涤过滤后的细胞，得到细胞悬浮液；
步骤三、对细胞悬浮液进行纯化，得到背根神经节神经元：
将多熔素和层粘连蛋白包被的盖玻片放入细胞培养板中，再向每孔中加入步骤二中得到的细胞悬浮液，第一次细胞培养18h～26h后，然后加入N-乙基顺丁烯二酰亚胺，得到N-乙基顺丁烯二酰亚胺的质量浓度为45μg/ml～95μg/ml的混合液，第二次细胞培养68h～75h，用培养基第一次置换1/2～2/3的混合液，然后每间隔46h～50h用培养基进行第二次和第三次置换1/2～2/3的混合液，共换液三次后得背根神经节神经元。
进一步地，该培养基为L15培养基。
进一步地，该步骤一中的胰酶/EDTA溶液的质量浓度为0.05%～0.125%。
进一步地，该步骤二中采用的细胞过滤器的孔径为40μm。
进一步地，该步骤三中的第一次细胞培养为在温度为37℃，通有5%CO2的培养箱中培养时间为20h～24h。
进一步地，该步骤三中的细胞悬浮液中N-乙基顺丁烯二酰亚胺的浓度为55μg/ml～90μg/ml。
本发明一种分离纯化背根神经元的方法，使用高浓度的N-乙基顺丁烯二酰亚胺，使得仅执行一次纯化的步骤，即可获得纯度较高的细胞。节省了纯化的步骤和时间，也解决了因纯化步骤过多以及纯化时间过长细胞被污染的问题。
附图说明
图1为采用本发明的方法分离纯化背根神经元的流程图；
图2为采用本发明实施例4的方法得到的背根神经元的纯度检测；其中，A图为未采用任何试剂处理培养72小时；B图为未采用任何试剂处理培养7天;C图为本发明实施例4的方法培养72小时；D图为本发明实施例4的方法培养7天；
图3为采用本发明实施例4的方法得到的背根神经元的纯度检测结果示意图；其中，A、B、C图为非背根神经元细胞，D图和E图为背根神经元细胞，F图为量化结果；
图4为采用本发明实施例4的方法得到的背根神经元的生存能力的检测结果示意图；
图5为本发明提供的一种检测分离纯化后的背根神经元的神经突形成能力的结果示意图；其中，A、B、C、D图分别为现有传统方法分离得到的背根神经元细胞第1、3、5、7天时神经突的生长情况；E、F、G、H图分别为采用本发明实施例4的方法分离得到的背根神经元细胞第1、3、5、7天时神经突的生长情况；I图为量化比较结果；
图6为采用本发明实施例3的方法得到的背根神经元的髓鞘形成能力的检测结果示意图；其中，其中，A图为外周蛋白0；B图为髓鞘碱性蛋白；C图为A图和B图的叠加图；D图为Caspr蛋白；E图为Nav1.6；F图为D图和E图的叠加图。
具体实施方式
采用传统方法进行背根神经元神经节的分离时，需要使用抗有丝分裂试剂，对细胞进行三次或三次以上的处理：即采用低浓度的N-乙基顺丁烯二酰亚胺处理48h后，再用培养基对细胞培养24h，此两个步骤需要重复三次或者三次以上。如图1所示，采用本发明的方法，只需采用高浓度的N-乙基顺丁烯二酰亚胺对细胞进行一次处理，再用培养基置换混合液，减少了细胞被污染的几率。
本发明实施例中使用的实验动物为怀孕15天的大鼠，购自第四军医大学实验动物中心；饲养环境为：无菌环境，室温为25℃，昼夜各12小时。
实施例1
步骤一、细胞混合液的制备：
取怀孕15天的大鼠胚胎，切取其背根神经节放入L15培养基中进行培养；将得到的背根神经节放入培养皿中，然后加入2mL质量浓度为0.10%的胰酶/EDTA溶液进行消化，在37℃的条件下消化15min，消化后得到细胞混合液。
步骤二、细胞悬浮液的制备：
收集步骤一中所得的细胞混合液中的细胞，转入15mL的尖底离心管，离心管中加入5mL含10%胎牛血清（Hyclone Labs.,Logan,UT)和10μg/mL DNase（Sigma-Aldich,Saint Louis,MO)的L15培养基，用微量移液器将细胞吹散，使用孔径40μM的细胞过滤器过滤细胞，使用神经元基础培养基洗涤1-2次，得到培养基悬浮细胞。
步骤二中的神经元基础培养液中包含质量浓度为2%的B27、谷氨酸盐、质量浓度为0.4%的葡萄糖和质量浓度为50ng/ml2.5S神经生长因子。
步骤三、对细胞悬浮液进行纯化，得到背根神经节神经元：
在无菌条件下使用多熔素和层粘连蛋白包被盖玻片（12mm），然后将包被好的盖玻片放入4孔板中（Nunc,Naperville,IL），每孔加入100μL背根神经元细胞悬浮液（约含5000-10000个细胞），在温度为37℃，通有5%CO2保护气的培养箱中第一次培养20小时后，然后加入N-乙基顺丁烯二酰亚胺，得到N-乙基顺丁烯二酰亚胺的质量浓度为75μg/ml的混合液，第二次细胞培养68h，用培养基第一次置换1/2的混合液，然后每间隔46h用培养基进行第二次和第三次置换1/2的混合液，共换液三次后得背根神经节神经元。
本发明实施例中的N-乙基顺丁烯二酰亚胺浓度的上限可以为能够实现分离纯化背根神经元的过程的浓度，其中，所使用的大鼠的品种不同，该上限可以不同。
实施例2
步骤一、细胞混合液的制备：
取怀孕15天的大鼠胚胎，切取其背根神经节放入L15培养基中进行培养；将得到的背根神经节放入培养皿中，然后加入2mL质量浓度为0.05%的胰酶/EDTA溶液进行消化，在37℃的条件下消化25min，消化后得到细胞混合液。
步骤二、细胞悬浮液的制备：
收集步骤一中所得的细胞混合液中的细胞，转入15mL的尖底离心管，离心管中加入5mL含10%胎牛血清（Hyclone Labs.,Logan,UT)和10μg/mL DNase（Sigma-Aldich,Saint Louis,MO)的L15培养基，用微量移液器将细胞吹散，使用孔径40μM的细胞过滤器过滤细胞，使用神经元基础培养基洗涤1-2次，得到培养基悬浮细胞。
步骤三、对细胞悬浮液进行纯化，得到背根神经节神经元：
在无菌条件下使用多熔素和层粘连蛋白包被盖玻片（12mm），然后将包被好的盖玻片放入4孔板中（Nunc,Naperville,IL），每孔加入100μL背根神经元细胞悬浮液（约含5000-10000个细胞），在温度为37℃，通有5%CO2保护气的培养箱中第一次培养24小时后，然后加入N-乙基顺丁烯二酰亚胺，得到N-乙基顺丁烯二酰亚胺的质量浓度为60μg/ml的混合液，第二次细胞培养75h，用培养基第一次置换2/3的混合液，然后每间隔46h用培养基进行第二次和第三次置换2/3的混合液，共换液三次后得背根神经节神经元。
实施例3
步骤一、细胞混合液的制备：
取怀孕15天的大鼠胚胎，切取其背根神经节放入L15培养基中进行培养；将得到的背根神经节放入培养皿中，然后加入2mL质量浓度为0.03%的胰酶/EDTA溶液进行消化，在37℃的条件下消化10min，消化后得到细胞混合液。
步骤二、细胞悬浮液的制备：
收集步骤一中所得的细胞混合液中的细胞，转入15mL的尖底离心管，离心管中加入5mL含10%胎牛血清（Hyclone Labs.,Logan,UT)和10μg/mL DNase（Sigma-Aldich,Saint Louis,MO)的L15培养基，用微量移液器将细胞吹散，使用孔径40μM的细胞过滤器过滤细胞，使用神经元基础培养基洗涤1-2次，得到培养基悬浮细胞。
步骤三、对细胞悬浮液进行纯化，得到背根神经节神经元：
在无菌条件下使用多熔素和层粘连蛋白包被盖玻片（12mm），然后将包被好的盖玻片放入4孔板中（Nunc,Naperville,IL），每孔加入100μL背根神经元细胞悬浮液（约含5000-10000个细胞），在温度为37℃，通有5%CO2保护气的培养箱中第一次培养18小时后，然后加入N-乙基顺丁烯二酰亚胺，得到N-乙基顺丁烯二酰亚胺的质量浓度为45μg/ml的混合液，第二次细胞培养75h，用培养基第一次置换1/2的混合液，然后每间隔48h用培养基进行第二次和第三次置换1/2的混合液，共换液三次后得背根神经节神经元。
实施例4
步骤一、细胞混合液的制备：
取怀孕15天的大鼠胚胎，切取其背根神经节放入L15培养基中进行培养；将得到的背根神经节放入培养皿中，然后加入2mL质量浓度为0.125%的胰酶/EDTA溶液进行消化，在37℃的条件下消化30min，消化后得到细胞混合液。
步骤二、细胞悬浮液的制备：
收集步骤一中所得的细胞混合液中的细胞，转入15mL的尖底离心管，离心管中加入5mL含10%胎牛血清（Hyclone Labs.,Logan,UT)和10μg/mL DNase（Sigma-Aldich,Saint Louis,MO)的L15培养基，用微量移液器将细胞吹散，使用孔径40μM的细胞过滤器过滤细胞，使用神经元基础培养基洗涤1-2次，得到培养基悬浮细胞。
步骤三、对细胞悬浮液进行纯化，得到背根神经节神经元：
在无菌条件下使用多熔素和层粘连蛋白包被盖玻片（12mm），然后将包被好的盖玻片放入4孔板中（Nunc,Naperville,IL），每孔加入100μL背根神经元细胞悬浮液（约含5000-10000个细胞），在温度为37℃，通有5%CO2保护气的培养箱中第一次培养26小时后，然后加入N-乙基顺丁烯二酰亚胺，得到N-乙基顺丁烯二酰亚胺的质量浓度为45μg/ml的混合液，第二次细胞培养75h，用培养基第一次置换2/3的混合液，然后每间隔50h用培养基进行第二次和第三次置换2/3的混合液，共换液三次后得背根神经节神经元。
实施例5
步骤一、细胞混合液的制备：
取怀孕15天的大鼠胚胎，切取其背根神经节放入L15培养基中进行培养；将得到的背根神经节放入培养皿中，然后加入2mL质量浓度为0.10%的胰酶/EDTA溶液进行消化，在37℃的条件下消化25min，消化后得到细胞混合液。
步骤二、细胞悬浮液的制备：
收集步骤一中所得的细胞混合液中的细胞，转入15mL的尖底离心管，离心管中加入5mL含10%胎牛血清（Hyclone Labs.,Logan,UT)和10μg/mL DNase（Sigma-Aldich,Saint Louis,MO)的L15培养基，用微量移液器将细胞吹散，使用孔径40μM的细胞过滤器过滤细胞，使用神经元基础培养基洗涤1-2次，得到培养基悬浮细胞。
步骤三、对细胞悬浮液进行纯化，得到背根神经节神经元：
在无菌条件下使用多熔素和层粘连蛋白包被盖玻片（12mm），然后将包被好的盖玻片放入4孔板中（Nunc,Naperville,IL），每孔加入100μL背根神经元细胞悬浮液（约含5000-10000个细胞），在温度为37℃，通有5%CO2保护气的培养箱中第一次培养22小时后，然后加入N-乙基顺丁烯二酰亚胺，得到N-乙基顺丁烯二酰亚胺的质量浓度为70μg/ml的混合液，第二次细胞培养70h，用培养基第一次置换2/3的混合液，然后每间隔46h用培养基进行第二次和第三次置换2/3的混合液，共换液三次后得背根神经节神经元。
实施例6
步骤一、细胞混合液的制备：
取怀孕15天的大鼠胚胎，切取其背根神经节放入L15培养基中进行培养；将得到的背根神经节放入培养皿中，然后加入2mL质量浓度为0.15%的胰酶/EDTA溶液进行消化，在37℃的条件下消化30min，消化后得到细胞混合液。
步骤二、细胞悬浮液的制备：
收集步骤一中所得的细胞混合液中的细胞，转入15mL的尖底离心管，离心管中加入5mL含10%胎牛血清（Hyclone Labs.,Logan,UT)和10μg/mL DNase（Sigma-Aldich,Saint Louis,MO)的L15培养基，用微量移液器将细胞吹散，使用孔径40μM的细胞过滤器过滤细胞，使用神经元基础培养基洗涤1-2次，得到培养基悬浮细胞。
步骤三、对细胞悬浮液进行纯化，得到背根神经节神经元：
在无菌条件下使用多熔素和层粘连蛋白包被盖玻片（12mm），然后将包被好的盖玻片放入4孔板中（Nunc,Naperville,IL），每孔加入100μL背根神经元细胞悬浮液（约含5000-10000个细胞），在温度为37℃，通有5%CO2保护气的培养箱中第一次培养26小时后，然后加入N-乙基顺丁烯二酰亚胺，得到N-乙基顺丁烯二酰亚胺的质量浓度为45μg/ml的混合液，第二次细胞培养75h，用培养基第一次置换1/2的混合液，然后每间隔46h用培养基进行第二次和第三次置换1/2的混合液，共换液三次后得背根神经节神经元。
实施例7
实施例7与实施例1的其他条件相同，其不同条件为：
步骤三、对细胞悬浮液进行纯化，得到背根神经节神经元：
在无菌条件下使用多熔素和层粘连蛋白包被盖玻片（12mm），然后将包被好的盖玻片放入4孔板中（Nunc,Naperville,IL），每孔加入100μL背根神经元细胞悬浮液（约含5000-10000个细胞），在温度为37℃，通有5%CO2保护气的培养箱中第一次培养26小时后，然后加入N-乙基顺丁烯二酰亚胺，得到N-乙基顺丁烯二酰亚胺的质量浓度为90μg/ml的混合液，第二次细胞培养75h，用培养基第一次置换2/3的混合液，然后每间隔50h用培养基进行第二次和第三次置换2/3的混合液，共换液三次后得背根神经节神经元。
实施例8
实施例8与实施例1的其他条件相同，其不同条件为：
步骤三、对细胞悬浮液进行纯化，得到背根神经节神经元：
在无菌条件下使用多熔素和层粘连蛋白包被盖玻片（12mm），然后将包被好的盖玻片放入4孔板中（Nunc,Naperville,IL），每孔加入100μL背根神经元细胞悬浮液（约含5000-10000个细胞），在温度为37℃，通有5%CO2保护气的培养箱中第一次培养22小时后，然后加入N-乙基顺丁烯二酰亚胺，得到N-乙基顺丁烯二酰亚胺的质量浓度为55μg/ml的混合液，第二次细胞培养75h，用培养基第一次置换2/3的混合液，然后每间隔46h用培养基进行第二次和第三次置换2/3的混合液，共换液三次后得背根神经节神经元。
实施例9
实施例9与实施例1的其他条件相同，其不同条件为：
步骤三、对细胞悬浮液进行纯化，得到背根神经节神经元：
在无菌条件下使用多熔素和层粘连蛋白包被盖玻片（12mm），然后将包被好的盖玻片放入4孔板中（Nunc,Naperville,IL），每孔加入100μL背根神经元细胞悬浮液（约含5000-10000个细胞），在温度为37℃，通有5%CO2保护气的培养箱中第一次培养20小时后，然后加入N-乙基顺丁烯二酰亚胺，得到N-乙基顺丁烯二酰亚胺的质量浓度为55μg/ml的混合液，第二次细胞培养68h，用培养基第一次置换1/2的混合液，然后每间隔50h用培养基进行第二次和第三次置换1/2的混合液，共换液三次后得背根神经节神经元。
实施例10
实施例10与实施例1的其他条件相同，其不同条件为：
步骤三、对细胞悬浮液进行纯化，得到背根神经节神经元：
在无菌条件下使用多熔素和层粘连蛋白包被盖玻片（12mm），然后将包被好的盖玻片放入4孔板中（Nunc,Naperville,IL），每孔加入100μL背根神经元细胞悬浮液（约含5000-10000个细胞），在温度为37℃，通有5%CO2保护气的培养箱中第一次培养26小时后，然后加入N-乙基顺丁烯二酰亚胺，得到N-乙基顺丁烯二酰亚胺的质量浓度为95μg/ml的混合液，第二次细胞培养75h，用培养基第一次置换1/2的混合液，然后每间隔50h用培养基进行第二次和第三次置换1/2的混合液，共换液三次后得背根神经节神经元。
实施例11
实施例11与实施例1的其他条件相同，其不同条件为：
步骤三、对细胞悬浮液进行纯化，得到背根神经节神经元：
在无菌条件下使用多熔素和层粘连蛋白包被盖玻片（12mm），然后将包被好的盖玻片放入4孔板中（Nunc,Naperville,IL），每孔加入100μL背根神经元细胞悬浮液（约含5000-10000个细胞），在温度为37℃，通有5%CO2保护气的培养箱中第一次培养26小时后，然后加入N-乙基顺丁烯二酰亚胺，得到N-乙基顺丁烯二酰亚胺的质量浓度为80μg/ml的混合液，第二次细胞培养75h，用培养基第一次置换2/3的混合液，然后每间隔46h用培养基进行第二次和第三次置换2/3的混合液，共换液三次后得背根神经节神经元。
采用现有技术分离施旺细胞，将背根神经元与施旺细胞的共培养，可以采用现有多种技术，如相差显微镜观察法、免疫荧光法等方法检测背根神经元的纯度。如图2所示，采用本发明实施例4的方法得到的背根神经元的纯度的检测结果示意图，其中，A图为未采用任何试剂处理培养72小时；B图为未采用任何试剂处理培养7天;C图为本发明实施例4的方法培养72小时；D图为本发明实施例4的方法培养7天。检测方法为相差显微镜观察法。由图2可知，采用本发明方法可以得到纯度较高的背根神经元细胞。
如图3所示，采用本发明实施例4的方法得到的背根神经元的纯度的检测结果示意图，其中，A、B、C图为非背根神经元细胞，D图和E图为背根神经元细胞，F图为量化结果。检测方法为免疫荧光法。由图3可知，采用本发明方法可以得到纯度较高的背根神经元细胞。
如图4所示，采用本发明实施例4的方法得到的背根神经元的生存能力的检测结果示意图，其中，检测方法可以为台盼蓝法等。由图4可知，采用本发明方法得到的背根神经元细胞生存能力良好，与传统方法得到的背根神经元细胞生存能力无显著性差异。
采用现有技术分离施旺细胞，将背根神经元与施旺细胞的共培养。如图5所示，采用本发明实施例4的方法得到的背根神经元的神经突形成能力的检测结果示意图，其中，A、B、C、D图分别为分离得到的背根神经元细胞第1、3、5、7天时神经突的生长情况；E、F、G、H图分别为本发明方法分离得到的背根神经元细胞第1、3、5、7天时神经突的生长情况；I图为量化比较结果。检测方法为相差显微镜观察法。由图5可知，采用本发明方法得到的背根神经元神经突形成能力良好，与传统方法得到的背根神经元细胞神经突形成能力无显著性差异。
采用现有技术分离施旺细胞，将背根神经元与施旺细胞的共培养，髓鞘的形成可以采用现有多种技术检测，如采用免疫荧光法以髓鞘碱性蛋白（MBP）、髓鞘蛋白0（P0）、caspr和Nav1.6指示髓鞘的形成。如图6所示，采用本发明实施例3的方法得到的背根神经元的髓鞘形成能力的检测结果示意图，其中，A图为外周蛋白0；B图为髓鞘碱性蛋白；C图为A图和B图的叠加图；D图为Caspr蛋白；E图为Nav1.6；F图为D图和E图的叠加图。检测方法为免疫荧光法。由图6可知，采用本发明方法得到的背根神经元髓鞘形成能力良好，与传统方法得到的背根神经元细胞髓鞘形成能力无显著性差异。
Claims (4)
1.一种分离纯化背根神经元的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
步骤一、细胞混合液的制备：
切取大鼠胚胎的背根神经节放入培养基中进行培养；将得到的背根神经节放入培养皿中，然后加入质量浓度为0.03％～0.15％的胰酶-EDTA溶液进行消化，消化时间为10min～30min，消化后得到细胞混合液；
步骤二、细胞悬浮液的制备：
收集步骤一中所得的细胞混合液中的细胞，向其中加入含胎牛血清和DNA酶的培养基，然后将其吹散，并将吹散后的细胞用孔径为40μm的细胞过滤器进行过滤，采用神经元基础培养基洗涤过滤后的细胞，得到细胞悬浮液；
步骤三、对细胞悬浮液进行纯化，得到背根神经节神经元：
将多熔素和层粘连蛋白包被的盖玻片放入细胞培养板中，再向每孔中加入步骤二中得到的细胞悬浮液，在温度为37℃，通有5％CO2的培养箱中进行第一次细胞培养，培养18h～26h后，然后加入N-乙基顺丁烯二酰亚胺，得到N-乙基顺丁烯二酰亚胺的质量浓度为45μg/ml～95μg/ml的混合液，第二次细胞培养68h～75h，用培养基第一次置换1/2～2/3的混合液，然后每间隔46h～50h用培养基进行第二次和第三次置换1/2～2/3的混合液，共换液三次后得背根神经节神经元；
所述步骤一至三中的培养基均为L15培养基。
2.根据权利要求1所述的一种分离纯化背根神经元的方法，其特征在于，所述步骤一中的胰酶-EDTA溶液的质量浓度为0.05％～0.125％。
3.根据权利要求1所述的一种分离纯化背根神经元的方法，其特征在于，所述步骤三中的第一次细胞培养时间为20h～24h。
4.根据权利要求1所述的一种分离纯化背根神经元的方法，其特征在于，所述步骤三中的细胞悬浮液中N-乙基顺丁烯二酰亚胺的浓度为55μg/ml～90μg/ml。
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