CN112301033A - miR-30a-5p及其在促进神经再生和修复周围神经损伤方面的应用 - Google Patents
miR-30a-5p及其在促进神经再生和修复周围神经损伤方面的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种miR‑30a‑5p及其在促进神经再生和修复周围神经损伤方面的应用,所述miR‑30a‑5p为周围神经损伤修复的分子靶点,用于制备促进神经再生和修复神经损伤的药物。其在促进DRG神经元轴突再生和周围神经损伤修复方面的应用包括如下验证步骤:S1、培养原代DRG神经元细胞,观察体外过表达miR‑30a‑5p促进DRG神经元轴突生长情况;S2、培养原代DRG神经元细胞,观察体外过表达miR‑30a‑5p促进DRG神经元轴突再生情况;S3、提取原代DRG神经元细胞,观察体外过表达miR‑30a‑5p抑制NRP1 mRNA和蛋白表达情况。本发明以miR‑30a‑5p作为分子干预靶点,过表达miR‑30a‑5p,促进DRG神经元轴突的生长与再生。本发明利用微流体在体外DRG神经元,转染miR‑30a‑5p mimic,可以显著促进原代培养的DRG神经元轴突的生长与再生。
Description
技术领域
本发明属于生物医学技术领域,具体涉及一种miR-30a-5p及其在促进神经再生和修复周围神经损伤方面的应用。
背景技术
周围神经损伤修复是临床上的常见难题,给社会及家庭造成极大的负担。周围神经受损后可以自发的再生,但由于再生速度有限,最终导致功能难以恢复。因此,充分探索周围神经损伤再生的细胞与分子机制,有助于促进周围神经功能修复,为临床治疗提供理论基础。
microRNA (miRNA )是内源性非编码的小 RNA,长度约为 21-23个核苷酸,其主要作用是通过与靶基因 3’端的非翻译区完全或不完全结合,抑制靶基因翻译或直接降解靶基因。miRNA 在周围神经系统中不仅能够抑制神经元的凋亡,促进神经元轴突的再生,还能参与调节胶质细胞的增殖与迁移。研究发现,DRG神经元轴突生长有助于周围神经损伤修复,为此,需提供一种促进DRG神经元轴突的生长、有助于神经损伤后的治疗新的靶点。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种miR-30a-5p及其在促进神经再生和修复周围神经损伤方面的应用,体外过表达miR-30a-5p,可以靶向Nrp1显著促进DRG神经元轴突的生长以及再生,为周围神经损伤修复提供新的靶点。
为解决上述技术问题,本发明的实施例提供一种miR-30a-5p,为周围神经损伤修复的分子靶点。
本发明还提供一种miR-30a-5p的用途,用于制备促进神经再生和修复神经损伤的药物。
其中,所述神经损伤为周围神经系统坐骨神经损伤。
本发明还提供一种miR-30a-5p在促进 DRG 神经元轴突再生和周围神经损伤修复方面的应用,包括如下验证步骤:
S1、培养原代DRG神经元细胞,观察体外过表达miR-30a-5p促进DRG神经元轴突生长情况;
S2、培养原代DRG神经元细胞,观察体外过表达miR-30a-5p促进DRG神经元轴突再生情况;
S3、提取原代DRG神经元细胞,观察体外过表达miR-30a-5p抑制NRP1 mRNA和蛋白表达情况。
其中,步骤S1的具体步骤为:
S1.1、微流体培养原代DRG神经元细胞
S1.1.1、DRG 神经元来自1d SD大鼠红皮,将背根神经节取出后放到解剖液HA中, 3mg/ml胶原酶消化,37℃,30min;
S1.1.2、弃胶原酶,加0.25%的胰酶消化,37℃,20min;
S1.1.3、用含有10%胎牛血清的 DMEM 终止胰酶作用,离心后弃上清;
S1.1.4、用含有5% FBS的DMEM重悬细胞,过200目筛网后种到用多聚赖氨酸包被的微流体小室中,培养4h后,替换为含有2% B-27、2mM谷氨酰胺及10ng/ml的NGF的Neurobasal培养基,10mM的阿糖胞苷用于去除非神经元细胞;
S1.2、神经元细胞mimics转染
待细胞贴壁后,用转染试剂混匀miR-30a-5p mimics及阴性对照后加入到步骤S1.1培养的神经元细胞中,培养8h后更换为神经元培养基;
S1.3、细胞免疫荧光染色及轴突生长长度测量
S1.3.1、DRG神经元细胞转染72h后将细胞培养基弃掉,用PBS润洗一遍,加入4%的多聚甲醛,固定30min;
S1.3.2、弃掉多聚甲醛后,PBS洗三遍,每遍5min;
S1.3.3、加入免疫组化封闭液,室温封闭1h;
S1.3.4、用免疫组化一抗稀释液稀释一抗anti-Tuj1 antibody(1:400,abcam),加好一抗后,4℃过夜;
S1.3.5、弃掉一抗,PBS洗3遍,每遍5min;
S1.3.6、用免疫组化二抗稀释液稀释荧光二抗Cy3 sheep anti-mouse IgG (1:400,Sigma),加好二抗后,避光室温2h;
S1.3.7、弃掉二抗,PBS洗3遍,每遍5min;
S1.3.8、加入适量PBS,ZEISS正置荧光显微镜下观察,拍照,观察DRG神经元轴突生长情况,拍照并统计各组突起长度的分布。
其中,步骤S2的具体步骤为:
S2.1、微流体培养原代DRG神经元细胞
S2.1.1、DRG 神经元来自1d SD大鼠红皮,将背根神经节取出后放到解剖液HA中, 3mg/ml胶原酶消化,37℃,30min;
S2.1.2、弃胶原酶,加0.25%的胰酶消化,37℃,20min;
S2.1.3、用含有10%胎牛血清的 DMEM 终止胰酶作用,离心后弃上清;
S2.1.4、用含有5% FBS的DMEM重悬细胞,过200目筛网后种到用多聚赖氨酸包被的微流体小室中,培养4h后,替换为含有2% B-27、2mM谷氨酰胺及10ng/ml的NGF的Neurobasal培养基,10mM的阿糖胞苷用于去除非神经元细胞;
S2.2、神经元细胞mimics转染
待细胞贴壁后,用转染试剂混匀miR-30a-5p mimics及阴性对照后加入到培养的神经元中,培养8h后更换为神经元培养基;
S2.3、细胞免疫荧光染色及轴突再生长度测量
S2.3.1、DRG神经元细胞转染72h后,利用负压将小室中细胞的轴突去除掉,24h后将细胞培养基弃掉后,用PBS润洗一遍,加入4%的多聚甲醛,固定30min;
S2.3.2、弃掉多聚甲醛后,PBS洗三遍,每遍5min;
S2.3.3、加入免疫组化封闭液,室温封闭1h;
S2.3.4、用免疫组化一抗稀释液稀释一抗anti-Tuj1 antibody,加好一抗后,4℃过夜;
S2.3.5、弃掉一抗,PBS洗3遍,每遍5min;
S2.3.6、用免疫组化二抗稀释液稀释荧光二抗Cy3 sheep anti-mouse IgG,加好二抗后,避光室温2h;
S2.3.7、弃掉二抗,PBS洗3遍,每遍5min;
S2.3.8、加入适量PBS,ZEISS正置荧光显微镜下观察,拍照,观察DRG神经元轴突的再生情况,拍照并统计各组突起长度的分布。
其中,步骤S3的具体步骤为:
S3.1、原代DRG神经元细胞的提取
S3.1.1、DRG 神经元来自1d SD大鼠红皮,将背根神经节取出后放到解剖液 HA 中,适量 3mg/ml 胶原酶消化,37℃,30min;
S3.1.2、弃胶原酶,加适量 0.25%的胰酶消化,37℃,20min;
S3.1.3、用含有10%胎牛血清的 DMEM 终止胰酶作用,离心后弃上清;
S3.1.4、用神经元培养基重悬细胞,过200目筛网后种到用多聚赖氨酸包被的6孔板中;
S3.2、神经元细胞mimics转染
待细胞贴壁后,用转染试剂混匀miR-30a-5p mimics及阴性对照后加入到培养的神经元中,培养8h后更换为神经元培养基;
S3.3、DRG细胞RNA提取及qRT-PCR
S3.3.1、收取体外培养3d的DRG神经元细胞,提取RNA;
S3.3.2、使用反转录试剂盒进行逆转录;
S3.3.3、逆转录后,采用RT-PCR 试剂盒进行qRT-PCR;
PCR仪反应程序:
Stage 1:95℃ 6min;
Stage 2:95℃ 10s,60℃ 30S,72℃ 10S;
Stage 3:95℃ 15s,60℃ 1min,95℃ 15s;
NRP1引物序列:
Forward:CGCCTGAACTACCCTGAA,
Reverse:CCCCACAGCAGTAACGA。
S3.4、Western blot试验
S3.4.1、收取体外培养3d的DRG神经元细胞,PBS润洗一遍,加入含1%的蛋白酶抑制剂的细胞裂解液,冰上裂解 5-10min,至细胞完全裂解;4℃离心,13000rpm,10min,收集上清;
S3.4.2、BCA法蛋白定量;
S3.4.3、进行SDS-PAGE电泳,转膜后用5%的脱脂牛奶,室温封闭2h;
S3.4.4、孵育一抗,用一抗稀释液稀释 anti- NRP1 Polyclonal antibody(1:400),室温孵育,过夜;
S3.4.5、1×TBS洗3遍,每遍 10min;
S3.4.6、用5%的脱脂牛奶稀释二抗羊抗兔 HRP,室温孵育,120min;
S3.4.7、1×TBST洗3遍,每遍 10min;
S3.4.8、1×TBS洗1遍,10min;
S3.4.9、在膜上孵育ECL显色液,室温,1-3min,显影,观察Western blot结果,待胶片晾干后用扫膜仪将结果传输到电脑。
本发明的上述技术方案的有益效果如下:
1、本发明以miR-30a-5p作为分子干预靶点,过表达miR-30a-5p,促进DRG神经元轴突的生长与再生。
2、本发明利用微流体在体外DRG神经元,转染miR-30a-5p mimic,可以显著促进原代培养的DRG神经元轴突的生长与再生。
3、本发明提供的miR-30a-5p可以通过调节DRG神经元轴突生长参与周围神经损伤修复,有助于更好地理解miRNA在神经损伤修复过程中的重要作用,并为神经损伤后的治疗提供新的靶点。
附图说明
图1为本发明实施例一中体外过表达miR-30a-5p可以显著促进DRG神经元轴突生长的示意图;
图2为本发明实施例二中体外过表达miR-30a-5p可以显著促进损伤后DRG神经元轴突再生的示意图;
图3为本发明实施例三中体外过表达miR-30a-5p可以显著抑制DRG神经元中NRP1的mRNA和蛋白表达的示意图。
具体实施方式
为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚,下面将结合附图及具体实施例进行详细描述。
本发明提供一种miR-30a-5p,作为周围神经损伤修复的分子靶点,在周围神经损伤修复过程中对 DRG 神经元进行调控,靶向Nrp1显著促进DRG神经元轴突的生长以及再生。
miR-30a-5p用于制备促进神经再生和修复神经损伤的药物,其中的神经损伤为周围神经系统坐骨神经损伤。
本发明还提供一种miR-30a-5p在促进 DRG 神经元轴突再生和周围神经损伤修复方面的应用,包括如下验证步骤:
S1、培养原代DRG神经元细胞,观察体外过表达miR-30a-5p促进DRG神经元轴突生长情况;
S2、培养原代DRG神经元细胞,观察体外过表达miR-30a-5p促进DRG神经元轴突再生情况;
S3、提取原代DRG神经元细胞,观察体外过表达miR-30a-5p抑制NRP1 mRNA和蛋白表达情况。
下面结合几个具体实施例进一步阐述本发明的技术方案。
实施例1:培养原代DRG神经元细胞,观察体外过表达miR-30a-5p促进DRG神经元轴突生长情况,具体步骤为:
1.1、微流体培养原代DRG神经元细胞
1.1.1、DRG 神经元来自1d SD大鼠红皮,将背根神经节取出后放到解剖液HA中,适量3mg/ml胶原酶消化,37℃,30min;
1.1.2、弃胶原酶,加适量0.25%的胰酶消化,37℃,20min;
1.1.3、用含有10%胎牛血清的 DMEM 终止胰酶作用,离心后弃上清;
1.1.4、用含有5% FBS的DMEM重悬细胞,过200目筛网后种到用多聚赖氨酸包被的微流体小室中,培养4h后,替换为含有2% B-27、2mM谷氨酰胺及10ng/ml的NGF的Neurobasal培养基,10mM的阿糖胞苷用于去除非神经元细胞。
1.2、神经元细胞mimics转染
待细胞贴壁后,用Lipofectamine® RNAiMAX Reagent混匀miR-30a-5p mimics及阴性对照(广州锐博生物公司,终浓度为100nM)后加入到步骤S1.1培养的神经元细胞中,培养8h后更换为神经元培养基。
1.3、细胞免疫荧光染色及轴突生长长度测量
1.3.1、DRG神经元细胞转染72h后将细胞培养基弃掉,用PBS润洗一遍,加入4%的多聚甲醛,固定30min;
1.3.2、弃掉多聚甲醛后,PBS洗三遍,每遍5min;
1.3.3、加入免疫组化封闭液,室温封闭1h;
1.3.4、用免疫组化一抗稀释液稀释一抗anti-Tuj1 antibody(1:400,abcam),加好一抗后,4℃过夜;
1.3.5、弃掉一抗,PBS洗3遍,每遍5min;
1.3.6、用免疫组化二抗稀释液稀释荧光二抗Cy3 sheep anti-mouse IgG (1:400,Sigma),加好二抗后,避光室温2h;
1.3.7、弃掉二抗,PBS洗3遍,每遍5min;
1.3.8、加入适量PBS,ZEISS正置荧光显微镜下观察,拍照,观察DRG神经元轴突生长情况,拍照并统计各组突起长度的分布。
结果显示,过表达miR-30a-5p(miR-30a-5p mimics)可以显著促进DRG神经元轴突的生长(图1),其中,图1A为Mimic Negative control(Mimic-NC,阴性对照)或miR-30a-5pmimics分别转染体外微流体中培养的DRG神经元,72h后细胞免疫组化染色。红光为 Tuj1/Cy3,再经Photshop 转换成灰度图,Bar=200μm。图1B为体外DRG神经元转染Mimic-NC与miR-30a-5p mimics后,至少15根最长轴突的平均值。*P < 0.05,***P < 0.001。
实施例2:培养原代DRG神经元细胞,观察体外过表达miR-30a-5p促进DRG神经元轴突再生情况,具体步骤为:
2.1、微流体培养原代DRG神经元细胞
2.1.1、DRG 神经元来自1d SD大鼠红皮,将背根神经节取出后放到解剖液HA中,适量3mg/ml胶原酶消化,37℃,30min;
2.1.2、弃胶原酶,加适量0.25%的胰酶消化,37℃,20min;
2.1.3、用含有10%胎牛血清的 DMEM 终止胰酶作用,离心后弃上清;
2.1.4、用含有5% FBS的DMEM重悬细胞,过200目筛网后种到用多聚赖氨酸包被的微流体小室中,培养4h后,替换为含有2% B-27、2mM谷氨酰胺及10ng/ml的NGF的Neurobasal培养基,10mM的阿糖胞苷用于去除非神经元细胞。
2.2、神经元细胞mimics转染
待细胞贴壁后,用Lipofectamine® RNAiMAX Reagent混匀miR-30a-5p mimics及阴性对照(广州锐博生物公司,终浓度为100nM)后加入到培养的神经元中,培养8h后更换为神经元培养基。
2.3、细胞免疫荧光染色及轴突再生长度测量
2.3.1、DRG神经元细胞转染72h后,利用负压将小室中细胞的轴突去除掉,24h后将细胞培养基弃掉后,用PBS润洗一遍,加入4%的多聚甲醛,固定30min;
2.3.2、弃掉多聚甲醛后,PBS洗三遍,每遍5min;
2.3.3、加入免疫组化封闭液,室温封闭1h;
2.3.4、用免疫组化一抗稀释液稀释一抗anti-Tuj1 antibody(1:400,abcam),加好一抗后,4℃过夜;
2.3.5、弃掉一抗,PBS洗3遍,每遍5min;
2.3.6、用免疫组化二抗稀释液稀释荧光二抗Cy3 sheep anti-mouse IgG (1:400,Sigma),加好二抗后,避光室温2h;
2.3.7、弃掉二抗,PBS洗3遍,每遍5min;
2.3.8、加入适量PBS,ZEISS正置荧光显微镜下观察,拍照,观察DRG神经元轴突的再生情况,拍照并统计各组突起长度的分布。
结果显示,过表达miR-30a-5p(miR-30a-5p mimics)可以显著促进DRG神经元轴突的再生(图2),其中,图2A为Mimic Negative control(Mimic-NC,阴性对照)或miR-30a-5pmimics分别转染体外微流体中培养的DRG神经元,3d后负压吸引去掉生长的轴突。24h后细胞免疫组化染色。红光为 Tuj1/Cy3,再经Photshop 转换成灰度图,Bar=100μm。图2B为体外DRG神经元转染Mimic-NC与 miR-30a-5p mimics后,至少15根最长轴突的平均值。*P <0.05,***P < 0.001。
实施例3:提取原代DRG神经元细胞,观察体外过表达miR-30a-5p抑制NRP1 mRNA和蛋白表达情况,具体步骤为:
3.1、原代DRG神经元细胞的提取
3.1.1、DRG 神经元来自1d SD大鼠红皮,将背根神经节取出后放到解剖液 HA 中,适量3mg/ml 胶原酶消化,37℃,30min;
3.1.2、弃胶原酶,加适量 0.25%的胰酶消化,37℃,20min;
3.1.3、用含有10%胎牛血清的 DMEM 终止胰酶作用,离心后弃上清;
3.1.4、用神经元培养基重悬细胞,过200目筛网后种到用多聚赖氨酸包被的6孔板中。
3.2、神经元细胞mimics转染
待细胞贴壁后,用Lipofectamine® RNAiMAX Reagent混匀miR-30a-5p mimics及阴性对照(广州锐博生物公司,终浓度为100nM)后加入到培养的神经元中,培养8h后更换为神经元培养基。
3.3、DRG细胞RNA提取及qRT-PCR
3.3.1、收取体外培养3d的DRG神经元细胞,提取RNA;按TRIZOL® Reagent(Invitrogen)说明书提取RNA。
3.3.2、使用QIAGEN反转录试剂盒进行逆转录;
3.3.3、逆转录后,采用SYBR® PrimeScript RT-PCR Kit(QIAGEN)进行qRT-PCR;操作按试剂盒说明书进行(以GAPDH作为内参),
PCR仪反应程序:
Stage 1:95℃ 6min;
Stage 2 (Cycle:40):95℃ 10s,60℃ 30S,72℃ 10S;
Stage 3:95℃ 15s,60℃ 1min,95℃ 15s;
NRP1引物序列:
Forward:CGCCTGAACTACCCTGAA,
Reverse:CCCCACAGCAGTAACGA。
qRT-PCR结果如图3A所示,结果显示与Mimic Negative control组相比,过表达miR-30a-5p可以显著抑制DRG神经元中NRP1的mRNA 水平。其中,图3A为Mimic Negativecontrol(Mimic-NC,阴性对照)或miR-30a-5p mimics分别转染体外培养的DRG神经元,72h后qRT-PCR检测NRP1 mRNA的表达情况,内参为GAPDH。***P < 0.001。图3B为MimicNegative control(Mimic-NC,阴性对照)或miR-30a-5p mimics分别转染体外培养的DRG神经元,72 h后Western blot检测NRP1 蛋白表达情况,内参为β-actin。**P < 0.01。
3.4、Western blot试验
3.4.1、收取体外培养3d的DRG神经元细胞,PBS润洗一遍,加入适量的含1%的蛋白酶抑制剂的细胞裂解液,冰上裂解 5-10min,至细胞完全裂解;4℃离心,13000rpm,10min,收集上清;
3.4.2、BCA法蛋白定量;
3.4.3、进行SDS-PAGE电泳,转膜后用5%的脱脂牛奶,室温封闭2h;
3.4.4、孵育一抗,用一抗稀释液稀释 anti- NRP1 Polyclonal antibody(1:400),室温孵育,过夜;
3.4.5、1×TBS洗3遍,每遍 10min;
3.4.6、用5%的脱脂牛奶稀释二抗羊抗兔 HRP(1:1000),室温孵育,120min;
3.4.7、1×TBST洗3遍,每遍 10min;
3.4.8、1×TBS洗1遍,10min;
3.4.9、在膜上孵育ECL显色液,室温,1-3min,显影,观察Western blot结果,待胶片晾干后用扫膜仪将结果传输到电脑。Western blot结果如图3B所示,结果显示与MimicNegative control组相比,过表达miR-30a-5p可以显著抑制DRG神经元中NRP1的蛋白水平。
以上所述是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明所述原理的前提下,还可以作出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 南通大学
<120> miR-30a-5p及其在促进神经再生和修复周围神经损伤方面的应用
<141> 2020-11-23
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工合成(Artificial synthesis)
<400> 1
Cys Gly Cys Cys Thr Gly Ala Ala Cys Thr Ala Cys Cys Cys Thr Gly
1 5 10 15
Ala Ala
<210> 2
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工合成(Artificial synthesis)
<400> 2
Cys Cys Cys Cys Ala Cys Ala Gly Cys Ala Gly Thr Ala Ala Cys Gly
1 5 10 15
Ala
Claims (7)
1.一种miR-30a-5p,其特征在于,为周围神经损伤修复的分子靶点。
2.一种miR-30a-5p的用途,其特征在于,用于制备促进神经再生和修复神经损伤的药物。
3.根据权利要求2所述的miR-30a-5p的用途,其特征在于,所述神经损伤为周围神经系统坐骨神经损伤。
4.miR-30a-5p在促进 DRG 神经元轴突再生和周围神经损伤修复方面的应用,其特征在于,包括如下验证步骤:
S1、培养原代DRG神经元细胞,观察体外过表达miR-30a-5p促进DRG神经元轴突生长情况;
S2、培养原代DRG神经元细胞,观察体外过表达miR-30a-5p促进DRG神经元轴突再生情况;
S3、提取原代DRG神经元细胞,观察体外过表达miR-30a-5p抑制NRP1 mRNA和蛋白表达情况。
5.根据权利要求4所述的miR-30a-5p在促进 DRG 神经元轴突再生和周围神经损伤修复方面的应用,其特征在于,
步骤S1的具体步骤为:
S1.1、微流体培养原代DRG神经元细胞
S1.1.1、DRG 神经元来自1d SD大鼠红皮,将背根神经节取出后放到解剖液HA中,3mg/ml胶原酶消化,37℃,30min;
S1.1.2、弃胶原酶,加0.25%的胰酶消化,37℃,20min;
S1.1.3、用含有10%胎牛血清的 DMEM 终止胰酶作用,离心后弃上清;
S1.1.4、用含有5% FBS的DMEM重悬细胞,过200目筛网后种到用多聚赖氨酸包被的微流体小室中,培养4h后,替换为含有2% B-27、2mM谷氨酰胺及10ng/ml的NGF的Neurobasal培养基,10mM的阿糖胞苷用于去除非神经元细胞;
S1.2、神经元细胞mimics转染
待细胞贴壁后,用转染试剂混匀miR-30a-5p mimics及阴性对照后加入到步骤S1.1培养的神经元细胞中,培养8h后更换为神经元培养基;
S1.3、细胞免疫荧光染色及轴突生长长度测量
S1.3.1、DRG神经元细胞转染72h后将细胞培养基弃掉,用PBS润洗一遍,加入4%的多聚甲醛,固定30min;
S1.3.2、弃掉多聚甲醛后,PBS洗三遍,每遍5min;
S1.3.3、加入免疫组化封闭液,室温封闭1h;
S1.3.4、用免疫组化一抗稀释液稀释一抗anti-Tuj1 antibody,加好一抗后,4℃过夜;
S1.3.5、弃掉一抗,PBS洗3遍,每遍5min;
S1.3.6、用免疫组化二抗稀释液稀释荧光二抗Cy3 sheep anti-mouse IgG,加好二抗后,避光室温2h;
S1.3.7、弃掉二抗,PBS洗3遍,每遍5min;
S1.3.8、加入适量PBS,ZEISS正置荧光显微镜下观察,拍照,观察DRG神经元轴突生长情况,拍照并统计各组突起长度的分布。
6.根据权利要求4所述的miR-30a-5p在促进 DRG 神经元轴突再生和周围神经损伤修复方面的应用,其特征在于,
步骤S2的具体步骤为:
S2.1、微流体培养原代DRG神经元细胞
S2.1.1、DRG 神经元来自1d SD大鼠红皮,将背根神经节取出后放到解剖液HA中,3mg/ml胶原酶消化,37℃,30min;
S2.1.2、弃胶原酶,加0.25%的胰酶消化,37℃,20min;
S2.1.3、用含有10%胎牛血清的 DMEM 终止胰酶作用,离心后弃上清;
S2.1.4、用含有5% FBS的DMEM重悬细胞,过200目筛网后种到用多聚赖氨酸包被的微流体小室中,培养4h后,替换为含有2% B-27、2mM谷氨酰胺及10ng/ml的NGF的Neurobasal培养基,10mM的阿糖胞苷用于去除非神经元细胞;
S2.2、神经元细胞mimics转染
待细胞贴壁后,用转染试剂混匀miR-30a-5p mimics及阴性对照后加入到培养的神经元中,培养8h后更换为神经元培养基;
S2.3、细胞免疫荧光染色及轴突再生长度测量
S2.3.1、DRG神经元细胞转染72h后,利用负压将小室中细胞的轴突去除掉,24h后将细胞培养基弃掉后,用PBS润洗一遍,加入4%的多聚甲醛,固定30min;
S2.3.2、弃掉多聚甲醛后,PBS洗三遍,每遍5min;
S2.3.3、加入免疫组化封闭液,室温封闭1h;
S2.3.4、用免疫组化一抗稀释液稀释一抗anti-Tuj1 antibody,加好一抗后,4℃过夜;
S2.3.5、弃掉一抗,PBS洗3遍,每遍5min;
S2.3.6、用免疫组化二抗稀释液稀释荧光二抗Cy3 sheep anti-mouse IgG,加好二抗后,避光室温2h;
S2.3.7、弃掉二抗,PBS洗3遍,每遍5min;
S2.3.8、加入适量PBS,ZEISS正置荧光显微镜下观察,拍照,观察DRG神经元轴突的再生情况,拍照并统计各组突起长度的分布。
7.根据权利要求4所述的miR-30a-5p在促进 DRG 神经元轴突再生和周围神经损伤修复方面的应用,其特征在于,
步骤S3的具体步骤为:
S3.1、原代DRG神经元细胞的提取
S3.1.1、DRG 神经元来自1d SD大鼠红皮,将背根神经节取出后放到解剖液 HA 中,适量 3mg/ml 胶原酶消化,37℃,30min;
S3.1.2、弃胶原酶,加适量 0.25%的胰酶消化,37℃,20min;
S3.1.3、用含有10%胎牛血清的 DMEM 终止胰酶作用,离心后弃上清;
S3.1.4、用神经元培养基重悬细胞,过200目筛网后种到用多聚赖氨酸包被的6孔板中;
S3.2、神经元细胞mimics转染
待细胞贴壁后,用转染试剂混匀miR-30a-5p mimics及阴性对照后加入到培养的神经元中,培养8h后更换为神经元培养基;
S3.3、DRG细胞RNA提取及qRT-PCR
S3.3.1、收取体外培养3d的DRG神经元细胞,提取RNA;
S3.3.2、使用反转录试剂盒进行逆转录;
S3.3.3、逆转录后,采用RT-PCR 试剂盒进行qRT-PCR;
PCR仪反应程序:
Stage 1:95℃ 6min;
Stage 2:95℃ 10s,60℃ 30S,72℃ 10S;
Stage 3:95℃ 15s,60℃ 1min,95℃ 15s;
NRP1引物序列:
forward:CGCCTGAACTACCCTGAA,
Reverse:CCCCACAGCAGTAACGA;
S3.4、Western blot试验
S3.4.1、收取体外培养3d的DRG神经元细胞,PBS润洗一遍,加入含1%的蛋白酶抑制剂的细胞裂解液,冰上裂解 5-10min,至细胞完全裂解;4℃离心,13000rpm,10min,收集上清;
S3.4.2、BCA法蛋白定量;
S3.4.3、进行SDS-PAGE电泳,转膜后用5%的脱脂牛奶,室温封闭2h;
S3.4.4、孵育一抗,用一抗稀释液稀释 anti- NRP1 Polyclonal antibody(1:400),室温孵育,过夜;
S3.4.5、1×TBS洗3遍,每遍 10min;
S3.4.6、用5%的脱脂牛奶稀释二抗羊抗兔 HRP,室温孵育,120min;
S3.4.7、1×TBST洗3遍,每遍 10min;
S3.4.8、1×TBS洗1遍,10min;
S3.4.9、在膜上孵育ECL显色液,室温,1-3min,显影,观察Western blot结果,待胶片晾干后用扫膜仪将结果传输到电脑。
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