CN111643681A - Nr4a3在促进神经再生和修复神经损伤方面的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开Nr4a3在制备促进神经再生和修复神经损伤药物中的应用；所述神经损伤为周围神经系统坐骨神经损伤。所述药物以Nr4a3作为分子干预靶点，干扰Nr4a3，促进DRG神经元轴突生长。本发明还公开一种促进神经再生和修复神经损伤药物，所述药物至少包括Nr4a3的小干扰RNA。本发明另外还公开Nr4a3在促进神经再生和修复神经损伤方面的应用，其特征在于，包括以下过程：S1、大鼠DRG神经元体外培养并检测其中Nr4a3的表达情况；S2、体外干扰Nr4a3，能够促进DRG神经元轴突生长。本发明以Nr4a3作为分子干预靶点，干扰Nr4a3，促进DRG神经元轴突生长，为神经损伤后的治疗提供新的靶点。

Description

Nr4a3在促进神经再生和修复神经损伤方面的应用
技术领域
本发明属于生物医学技术领域，涉及Nr4a3在促进神经再生和修复神经损伤方面的应用；具体涉及Nr4a3在制备促进神经再生和修复神经损伤药物中的应用、Nr4a3在制备促进神经再生和修复神经损伤药物中的应用及Nr4a3在促进神经再生和修复神经损伤方面的应用。
背景技术
周围神经受损后可以自发的再生，但由于再生速度有限，功能难以恢复，致残率高，给社会及家庭造成了极大的经济和伦理负担。充分深入的理解周围神经损伤再生的细胞与分子机制，有助于提高周围神经功能修复的成功率，同时这也为解决中枢神经系统再生中遇到的问题提供参考，具有重大的理论基础和潜在的临床价值。本发明探索基因Nr4a3在促进神经再生和修复神经损伤方面的应用。
发明内容
发明目的：针对现有技术中存在问题或不足，本发明提供一种Nr4a3在促进神经再生和修复神经损伤方面的应用。
为实现上述发明目的，本发明的实施例提供Nr4a3在制备促进神经再生和修复神经损伤药物中的应用。
进一步的，所述神经损伤为周围神经系统坐骨神经损伤。
进一步的，所述药物以Nr4a3作为分子干预靶点，干扰Nr4a3，促进DRG神经元轴突生长。
本发明的实施例还一种促进神经再生和修复神经损伤药物，其特征在于，所述药物至少包括Nr4a3的小干扰RNA。
进一步的，所述Nr4a3的小干扰RNA包括Nr4a3 siRNA-1或Nr4a3 siRNA-2，所述Nr4a3 siRNA-1序列为GCGTACAGATAGTCTGAAA，所述Nr4a3siRNA-2序列为GCCTTTGATCAAGATGGAA。
本发明的实施例另外还Nr4a3在促进神经再生和修复神经损伤方面的应用，其特征在于，包括以下过程：S1、大鼠DRG 神经元体外培养并检测其中Nr4a3的表达情况；S2、体外干扰Nr4a3，能够促进DRG神经元轴突生长。
其中，所述步骤S1具体包括以下过程：
S1-1、原代DRG神经元细胞的提取
S1-1-1、DRG 神经元来自成年雄性大鼠，将背根神经节取出后放到解剖液 HA 中，加3.3 mg/ml 胶原酶消化，37 ℃，90 min；
S1-1-2、弃胶原酶，加 0.25%的胰酶消化，37 ℃，20 min；
S1-1-3、用含有10%胎牛血清的 PBS 终止胰酶作用，离心后弃上清；
S1-1-4、用 15%的牛血清白蛋白悬浮细胞后离心，弃掉上清；
S1-1-5、用神经元培养基重悬细胞，过200目筛网后种到用多聚赖氨酸包被的板孔里；
S1-2、DRG细胞RNA提取及qRT-PCR
S1-2-1、收取体外培养不同时间点的DRG神经元细胞，提取RNA；
S1-2-2、使用 TaqMan 反转录试剂盒进行逆转录；
S1-2-3、逆转录后，进行qRT-PCR，以GAPDH作为内参， PCR仪反应程序： Stage 1：95℃2 min， Stage 2：95℃ 15 s，60℃ 1 min；Stage 3：95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s；Nr4a3引物序列forward: 5’-CGAGCTCGAAGCCTGAGCAGAGAGCTACTT -3’, reverse: 5’-CCGCTCGAGCGGAGACTAAAGCAAAAATGAT -3’；
S1-3、Western blot
S1-3-1、收取体外培养不同时间点的DRG神经元细胞，PBS 润洗一遍，加入的细胞裂解液，冰上裂解 5-10 min，至细胞完全裂解；
S1-3-2、4 ℃离心，13000 rpm，10 min，收集上清；BCA法蛋白定量；
S1-3-3、进行SDS-PAGE电泳，转膜后用5%的脱脂牛奶，室温封闭2 h；
S1-3-4、孵育一抗，用一抗稀释液稀释 Rabbit anti-Nr4a3 Polyclonal antibody（1：400），室温孵育，过夜；1×TBS 洗3遍，每遍 10 min；
S1-3-5、用 5%的脱脂牛奶稀释二抗羊抗兔 HRP（1：1000），室温孵育，120 min；1×TBST洗 3 遍，每遍 10min，1×TBS 洗 1 遍，10 min；
S1-3-6、在膜上孵育 ECL 显色液，室温，1-3 min；显影，观察结果；待胶片晾干后用扫膜仪将结果传输到电脑。
其中，所述步骤S2具体包括以下过程：
S2-1、DRG神经元细胞siRNA转染
Nr4a3 siRNA-1序列：GCGTACAGATAGTCTGAAA，Nr4a3 siRNA-2序列：GCCTTTGATCAAGATGGAA，使用浓度100 nM；
使用转染试剂 Lipofectamine™ RNAiMAX 在原代培养的DRG神经元细胞中转染Nr4a3siRNA及阴性对照，12 h 后更换为正常神经元培养基，48 h后提取细胞总RNA，进行qRT-PCR，检测siRNA处理后，DRG神经元细胞中Nr4a3的mRNA表达水平；
S2-2、细胞免疫荧光染色及轴突生长长度测量
S2-2-1、DRG神经元细胞Nr4a3 siRNA处理72 h后将细胞培养基弃掉后，用 PBS 润洗一遍，加入4%的多聚甲醛，固定30 min；
S2-2-2、弃掉多聚甲醛后，PBS 洗三遍，每遍5 min；
S2-2-3、加入免疫组化封闭液，室温封闭1 h；
S2-2-4、用免疫组化一抗稀释液稀释一抗anti-Tuj1 antibody（1：200，Sigma），加好一抗后，4 ℃过夜； 弃掉一抗，PBS洗3遍，每遍5 min；
S2-2-5、用免疫组化二抗稀释液稀释荧光二抗Cy3 sheep anti-rabbit IgG （1：400，Sigma），加好二抗后，避光室温2 h；弃掉二抗，PBS洗3遍，每遍5 min；
S2-2-6、用PBS稀释Hoechest，加好Hoechest后，室温10 min； 弃掉Hoechest，PBS洗3遍，每遍5 min；
S2-2-7、加入适量荧光封片液，ZEISS正置荧光显微镜下观察，拍照；观察突起的生长情况，拍照并统计各组最长突起长度和各组突起长度的分布。
本发明的上述技术方案的有益效果如下：本发明提供了一种促进神经再生和修复神经损伤的药物应用，以Nr4a3作为分子干预靶点，干扰Nr4a3，促进DRG神经元轴突生长。本发明的Nr4a3有可能通过调节DRG神经元轴突生长参与周围神经损伤修复，为神经损伤后的治疗提供新的靶点。
本发明的实施例中，qRT-PCR和western blot发现DRG 神经元体外培养模型(模拟体内坐骨神经损伤)中，随着时间点Nr4a3表达显著下降。同时，通过体外DRG转染Nr4a3siRNA，验证了干扰Nr4a3可以显著促进原代培养的DRG神经元轴突的生长，为周围神经损伤修复提供新的靶点。
附图说明
图1为本发明的实施例1中大鼠DRG 神经元体外培养中Nr4a3的qRT-PCR及Westernblot结果图；其中，图1A为DRG 神经元体外培养，qRT-PCR检测不同时间点Nr4a3的表达情况图；图1B为 Western blot结果显示图。
图2为本发明的实施例2中体外干扰Nr4a3可以显著促进DRG神经元轴突的生长图。其中，图2 A为qRT-PCR检测siRNA处理后，DRG神经元细胞中Nr4a3的mRNA表达水平图。图2B为 DRG神经元细胞Nr4a3 siRNA处理72 h后，细胞免疫组化染色图。其中，左侧：红光为Tuj1， Bar=50 μm；右：Nr4a3 siRNA后，测量所有神经元轴突长度分布图。图2C为体外DRG神经元转染 Nr4a3 siRNA后，所有神经元最长轴突的平均值统计图。
具体实施方式
为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合具体实施例进行详细描述。
实施例1 考察大鼠DRG 神经元体外培养中Nr4a3的表达变化
一、原代DRG神经元细胞的提取
DRG 神经元来自成年雄性大鼠，将背根神经节取出后放到解剖液 HA 中，适量 3.3mg/ml 胶原酶消化，37 ℃，90 min。弃胶原酶，加适量 0.25%的胰酶消化，37 ℃，约 20min。用含有10%胎牛血清的 PBS 终止胰酶作用，离心后弃上清。为了去除杂的胶质细胞，用15%的牛血清白蛋白悬浮细胞后离心，弃掉上清。用神经元培养基重悬细胞，过200目筛网后种到用多聚赖氨酸包被的板孔里。
二、DRG细胞RNA提取及qRT-PCR
收取体外培养不同时间点的DRG神经元细胞，提取RNA。 按TRIZOL® Reagent（Invitrogen）说明书提取RNA。使用 TaqMan 反转录试剂盒进行逆转录。逆转录后，采用SYBR® PrimeScript RT-PCR Kit（Takara）进行qRT-PCR，操作按试剂盒说明书进行（以GAPDH作为内参）, PCR仪反应程序： Stage 1：95℃ 2 min， Stage 2 (Cycle：40)：95℃ 15s，60℃ 1 min；Stage 3：95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s。Nr4a3引物序列forward: 5’-CGAGCTCGAAGCCTGAGCAGAGAGCTACTT -3’, reverse: 5’-CCGCTCGAGCGGAGACTAAAGCAAAAATGAT -3’。qRT-PCR结果如图1A所示，结果显示与0 h相比，体外培养的DRG神经元细胞中的Nr4a3表达不断下调。
三、Western blot
收取体外培养不同时间点的DRG神经元细胞，PBS 润洗一遍，加入适量的细胞裂解液（含1%的蛋白酶抑制剂），冰上裂解 5-10 min，至细胞完全裂解；4 ℃离心，13000 rpm，10min，收集上清。BCA法蛋白定量。进行SDS-PAGE电泳，转膜后用5%的脱脂牛奶，室温封闭2 h。孵育一抗，用一抗稀释液稀释 Rabbit anti-Nr4a3 Polyclonal antibody（1：400），室温孵育，过夜。1×TBS 洗3遍，每遍 10 min。用 5%的脱脂牛奶稀释二抗羊抗兔 HRP（1：1000），室温孵育，120 min。1×TBST 洗 3 遍，每遍 10min，1×TBS 洗 1 遍，10 min。在膜上孵育ECL 显色液，室温，1-3 min。显影，观察结果。待胶片晾干后用扫膜仪将结果传输到电脑。Western blot结果如图1B所示，结果显示与0 h相比，体外培养的DRG神经元细胞中的Nr4a3表达不断下调。
实施例2 体外干扰Nr4a3促进DRG神经元轴突生长
一、DRG神经元细胞siRNA转染
Nr4a3的 siRNA 来源于广州锐博生物公司，siRNA-1序列：GCGTACAGATAGTCTGAAA，siRNA-2序列：GCCTTTGATCAAGATGGAA，.使用浓度100 nM。使用转染试剂 Lipofectamine™RNAiMAX 在原代培养的DRG神经元细胞中转染Nr4a3 siRNA及阴性对照 (Control)，12 h后更换为正常神经元培养基，48 h后提取细胞总RNA，按实施例1中进行qRT-PCR，检测siRNA处理后，DRG神经元细胞中Nr4a3的mRNA表达水平。如图2A所示，qRT-PCR结果表明，Nr4a3siRNA1和siRNA2均能显著降低DRG神经元细胞中Nr4a3的mRNA表达水平。
二、细胞免疫荧光染色及轴突生长长度测量
DRG神经元细胞Nr4a3 siRNA处理72 h后将细胞培养基弃掉后，用 PBS 润洗一遍，加入4%的多聚甲醛，固定30 min。弃掉多聚甲醛后，PBS 洗三遍，每遍5 min。加入免疫组化封闭液，室温封闭1 h。 用免疫组化一抗稀释液稀释一抗anti-Tuj1 antibody（1：200，Sigma），加好一抗后，4 ℃过夜。 弃掉一抗，PBS洗3遍，每遍5 min。用免疫组化二抗稀释液稀释荧光二抗Cy3 sheep anti-rabbit IgG （1：400，Sigma），加好二抗后，避光室温2 h。弃掉二抗，PBS洗3遍，每遍5 min。 用PBS稀释Hoechest，加好Hoechest后，室温10 min。 弃掉Hoechest，PBS洗3遍，每遍5 min。加入适量荧光封片液，ZEISS正置荧光显微镜下观察，拍照。观察突起的生长情况，拍照并统计各组最长突起长度和各组突起长度的分布。结果显示，Nr4a3 siRNA1和siRNA2体外干扰DRG神经元细胞中的Nr4a3，可以显著促进DRG神经元轴突的生长，且对所有神经元轴突长度的分布进行统计，表明干扰Nr4a3 后，轴突生长的长度偏向长的区间分布，如图2B所示。进一步对体外DRG神经元转染 Nr4a3 siRNA后所有神经元最长轴突的平均值进行计算，发现Nr4a3干扰后，显著增加神经元最长轴突的平均值，如图2C所示，表明干扰DRG神经元细胞中的Nr4a3，可以显著促进DRG神经元轴突的生长。
以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 南通大学
<120> Nr4a3在促进神经再生和修复神经损伤方面的应用
<141> 2020-06-18
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> Nr4a3的小干扰RNA 1 序列(Nr4a3 siRNA-1)
<400> 1
gcgtacagat agtctgaaa 19
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> Nr4a3的小干扰RNA 2 序列(Nr4a3siRNA-2)
<400> 2
gcctttgatc aagatggaa 19

Claims (8)

1.Nr4a3在制备促进神经再生和修复神经损伤药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的Nr4a3在制备促进神经再生和修复神经损伤药物中的应用，其特征在于，所述神经损伤为周围神经系统坐骨神经损伤。
3.根据权利要求1所述的Nr4a3在制备促进神经再生和修复神经损伤药物中的应用，其特征在于，所述药物以Nr4a3作为分子干预靶点，干扰Nr4a3，促进DRG神经元轴突生长。
4.一种促进神经再生和修复神经损伤药物，其特征在于，所述药物至少包括Nr4a3的小干扰RNA。
5.根据权利要求4所述的一种促进神经再生和修复神经损伤药物，其特征在于，所述Nr4a3的小干扰RNA包括Nr4a3 siRNA-1或Nr4a3 siRNA-2，所述Nr4a3 siRNA-1序列为GCGTACAGATAGTCTGAAA，所述Nr4a3siRNA-2序列为GCCTTTGATCAAGATGGAA。
6.Nr4a3在促进神经再生和修复神经损伤方面的应用，其特征在于，包括以下过程：S1、大鼠DRG 神经元体外培养并检测其中Nr4a3的表达情况；S2、体外干扰Nr4a3，能够促进DRG神经元轴突生长。
7.根据权利要求6的Nr4a3在促进神经再生和修复神经损伤方面的应用，其特征在于，所述步骤S1具体包括以下过程：
S1-1、原代DRG神经元细胞的提取
S1-1-1、DRG 神经元来自成年雄性大鼠，将背根神经节取出后放到解剖液 HA 中，加3.3 mg/ml 胶原酶消化，37 ℃，90 min；
S1-1-2、弃胶原酶，加 0.25%的胰酶消化，37 ℃，20 min；
S1-1-3、用含有10%胎牛血清的 PBS 终止胰酶作用，离心后弃上清；
S1-1-4、用 15%的牛血清白蛋白悬浮细胞后离心，弃掉上清；
S1-1-5、用神经元培养基重悬细胞，过200目筛网后种到用多聚赖氨酸包被的板孔里；
S1-2、DRG细胞RNA提取及qRT-PCR
S1-2-1、收取体外培养不同时间点的DRG神经元细胞，提取RNA；
S1-2-2、使用 TaqMan 反转录试剂盒进行逆转录；
S1-2-3、逆转录后，进行qRT-PCR，以GAPDH作为内参， PCR仪反应程序： Stage 1：95℃2 min， Stage 2：95℃ 15 s，60℃ 1 min；Stage 3：95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s；Nr4a3引物序列forward: 5’-CGAGCTCGAAGCCTGAGCAGAGAGCTACTT -3’, reverse: 5’-CCGCTCGAGCGGAGACTAAAGCAAAAATGAT -3’；
S1-3、Western blot
S1-3-1、收取体外培养不同时间点的DRG神经元细胞，PBS 润洗一遍，加入的细胞裂解液，冰上裂解 5-10 min，至细胞完全裂解；
S1-3-2、4 ℃离心，13000 rpm，10 min，收集上清；BCA法蛋白定量；
S1-3-3、进行SDS-PAGE电泳，转膜后用5%的脱脂牛奶，室温封闭2 h；
S1-3-4、孵育一抗，用一抗稀释液稀释 Rabbit anti-Nr4a3 Polyclonal antibody（1：400），室温孵育，过夜；1×TBS 洗3遍，每遍 10 min；
S1-3-5、用 5%的脱脂牛奶稀释二抗羊抗兔 HRP（1：1000），室温孵育，120 min；1×TBST洗 3 遍，每遍 10min，1×TBS 洗 1 遍，10 min；
S1-3-6、在膜上孵育 ECL 显色液，室温，1-3 min；显影，观察结果；待胶片晾干后用扫膜仪将结果传输到电脑。
8.根据权利要求6的Nr4a3在促进神经再生和修复神经损伤方面的应用，其特征在于，所述步骤S2具体包括以下过程：
S2-1、DRG神经元细胞siRNA转染
Nr4a3 siRNA-1序列：GCGTACAGATAGTCTGAAA，Nr4a3 siRNA-2序列：GCCTTTGATCAAGATGGAA，使用浓度100 nM；
使用转染试剂 Lipofectamine™ RNAiMAX 在原代培养的DRG神经元细胞中转染Nr4a3siRNA及阴性对照，12 h 后更换为正常神经元培养基，48 h后提取细胞总RNA，进行qRT-PCR，检测siRNA处理后，DRG神经元细胞中Nr4a3的mRNA表达水平；
S2-2、细胞免疫荧光染色及轴突生长长度测量
S2-2-1、DRG神经元细胞Nr4a3 siRNA处理72 h后将细胞培养基弃掉后，用 PBS 润洗一遍，加入4%的多聚甲醛，固定30 min；
S2-2-2、弃掉多聚甲醛后，PBS 洗三遍，每遍5 min；
S2-2-3、加入免疫组化封闭液，室温封闭1 h；
S2-2-4、用免疫组化一抗稀释液稀释一抗anti-Tuj1 antibody（1：200，Sigma），加好一抗后，4 ℃过夜； 弃掉一抗，PBS洗3遍，每遍5 min；
S2-2-5、用免疫组化二抗稀释液稀释荧光二抗Cy3 sheep anti-rabbit IgG （1：400，Sigma），加好二抗后，避光室温2 h；弃掉二抗，PBS洗3遍，每遍5 min；
S2-2-6、用PBS稀释Hoechest，加好Hoechest后，室温10 min； 弃掉Hoechest，PBS洗3遍，每遍5 min；
S2-2-7、加入适量荧光封片液，ZEISS正置荧光显微镜下观察，拍照；观察突起的生长情况，拍照并统计各组最长突起长度和各组突起长度的分布。
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