CN108048393A - 一种新型的快速扩增皮肤表皮基底干细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种新型的快速扩增皮肤表皮基底干细胞的方法，包括如下步骤：制备包被瓶、制备真皮组织和干细胞增殖；本发明获得细胞数量多，培养周期短，成本较传统方法低廉，应用前景良好细胞得率高、分化效率高等优点分离容易，且能获得活性更高、数量更多的细胞，重现率很高、将丝素蛋白，壳聚糖和VC高分子材料添加到干细胞活细胞悬液中，可以提高细胞活率，延长细胞存活时间，通过皮肤基底干细胞增殖用组合物，便于使基底干细胞快速扩增。

Description

一种新型的快速扩增皮肤表皮基底干细胞的方法
技术领域
本发明涉及干细胞技术领域，具体为一种新型的快速扩增皮肤表皮基底干细胞的方法。
背景技术
皮肤最重要的作用是在外部损伤以及细菌侵入时扮演保护人体的防御屏障的角色，与此同时还能防止内部的热和水分等的损失。从大的来说，皮肤的结构包括表皮和真皮，表皮可分为由平面六角形的死细胞构成的基底层和活的表皮。活的表皮包含基底层、有棘层、颗粒层和透明层4个层。其中，基底层位于皮肤基底干细胞上，皮肤基底干细胞持续分裂将形成过渡扩增细胞。此类细胞再进行数次分裂，在皮肤产生过程的中/后期形成在皮肤屏障机能中扮演重要角色的基底细胞。基底细胞进行分化，借此在皮肤产生过程的最后期上升成皮肤表面。在这个过程中，基底细胞的分化和基底化是不断地形成基底层的来源，最后，基底细胞从基底层剥落出。人随着年龄的增长，这种皮肤基底干细胞和过渡扩增细胞的增殖能力将降低。一旦形成基底细胞的能力降低，将出现皮肤再生能力减退、皮肤弹性降低等老化现象加剧的结果。
发明内容
本发明提供一种新型的快速扩增皮肤表皮基底干细胞的方法，获得细胞数量多，培养周期短，成本较传统方法低廉，应用前景良好细胞得率高、分化效率高等优点分离容易，且能获得活性更高、数量更多的细胞，重现率很高、将丝素蛋白，壳聚糖和VC高分子材料添加到干细胞活细胞悬液中，可以提高细胞活率，延长细胞存活时间，通过皮肤基底干细胞增殖用组合物，便于使基底干细胞快速扩增，可以有效解决上述背景技术中的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种新型的快速扩增皮肤表皮基底干细胞的方法，包括如下步骤：
1）制备包被瓶：将人IV型胶原溶解并用PBS稀释至0.1g/L制成包被液；取5ml包被液加入培养瓶中，平放，置冰箱中过夜；弃上清，置于超净工作台中干燥；包被瓶置冰箱中保存备用；
2）制备真皮组织：取皮肤，消毒，冲洗，剔除皮下脂肪层，保留真皮及表皮层；剪成小块，用0.25％胰酶在4°C冰箱中过夜；用等体积含10％胎牛血清的DMEM高糖培养基终止消化，冲洗，表皮在冲洗的过程中被脱离、洗去，未分离的表皮使用镊子分离去除，得真皮组织；将皮肤切成小块，用PBS冲洗三次；组织块置于无菌平皿中，真皮面朝下，用含有1U/ml中性蛋白酶II的消化液，4°C，过夜消化；用眼科镊子分离表皮，并弃之，然后将真皮层切成1mm3的小块；用含体积分数为0.5％I型胶原酶的消化液，于37°C，对真皮层小块轻摇消化1h；再加入等量的DMEM/F12培养基，终止消化，再将细胞悬液以180g离心10min；将上述细胞悬液用过滤器过滤，去除残余的组织块，调整细胞密度为1×105/ml；将上述细胞悬液接种于包被有IV型胶原的T25培养瓶中，置于37°C、5％CO2培养箱中，贴壁10-20min后，吸弃上清液，留用贴壁细胞；再向T25培养瓶中加入10ml细胞培养液，置于37°C、5％CO2的饱和湿度的培养箱中培养，每2-3天换液一次；细胞融合度达到80％以上后，吸干培养液，用PBS液轻洗细胞两次；
3）干细胞增殖：培养瓶内加入体积分数为0.25％胰蛋白酶消化液+0.01％EDTA，置于37°C，5％的CO2温箱2-3min后，倒置显微镜下观察到细胞回缩，细胞间隙增大，再向培养瓶里加入10ml干细胞悬液制剂终止消化；用吸管反复吹打瓶底，使细胞脱落，再将细胞悬液180g离心，5min；将上述细胞按1:3的比例分瓶传代，加入皮肤基底干细胞增殖用组合物，继续培养，细胞传至2-5代，即可。
根据上述技术方案，所述干细胞悬液制剂的制备方法为：取人的表皮组织，采用胰蛋白酶与EDTA消化混合液消化，血清终止，用吸管轻轻吹打至表皮片呈半透明，过200目网筛过滤后，再离心，弃上清液得细胞液；将上述细胞液接种在IV型胶原蛋白表面修饰的培养瓶中，快速黏附10-20min后，收集黏附细胞进行培养，加入无血清DMEM，置37℃、CO2浓度为5％的培养箱中培养，每3天换液1次，待细胞长成70％-80％融和状态时，加入丝素蛋白，壳聚糖和VC，制成表皮干细胞悬液制剂。
根据上述技术方案，所述皮肤基底干细胞增殖用组合物含有选自4’,7,8-三羟基异黄酮、4’,6,7-三羟基异黄酮、及3’,4’,7-三羟基异黄酮的至少一种的o-二羟基异黄酮衍生物，其制备方法，是将上述原料4’,7,8-三羟基异黄酮、4’,6,7-三羟基异黄酮、及3’,4’,7-三羟基异黄酮的至少一种的o-二羟基异黄酮衍生物进行均匀混合即可。
根据上述技术方案，所述以皮肤基底干细胞增殖用组合物全体的重量为基准时，所述o-二羟基异黄酮衍生物的含量是0.001-30重量％。
根据上述技术方案，所述在加入丝素蛋白，壳聚糖和VC之前，还包括在高温高压下，对丝素蛋白，壳聚糖和VC进行灭菌。
根据上述技术方案，所述步骤2）中皮肤切片后的规格为0.5mm×0.5mm。
根据上述技术方案，所述步骤1）中冰箱的温度调节为4°C。
与现有技术相比，本发明的有益效果：获得细胞数量多，培养周期短，成本较传统方法低廉，应用前景良好细胞得率高、分化效率高等优点分离容易，且能获得活性更高、数量更多的细胞，重现率很高、将丝素蛋白，壳聚糖和VC高分子材料添加到干细胞活细胞悬液中，可以提高细胞活率，延长细胞存活时间，通过皮肤基底干细胞增殖用组合物，便于使基底干细胞快速扩增。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。
在附图中：
图1为发明的流程框图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例：如图1所示，本发明提供一种新型的快速扩增皮肤表皮基底干细胞的方法，包括如下步骤：
1）制备包被瓶：将人IV型胶原溶解并用PBS稀释至0.1g/L制成包被液；取5ml包被液加入培养瓶中，平放，置冰箱中过夜；弃上清，置于超净工作台中干燥；包被瓶置冰箱中保存备用；
2）制备真皮组织：取皮肤，消毒，冲洗，剔除皮下脂肪层，保留真皮及表皮层；剪成小块，用0.25％胰酶在4°C冰箱中过夜；用等体积含10％胎牛血清的DMEM高糖培养基终止消化，冲洗，表皮在冲洗的过程中被脱离、洗去，未分离的表皮使用镊子分离去除，得真皮组织；将皮肤切成小块，用PBS冲洗三次；组织块置于无菌平皿中，真皮面朝下，用含有1U/ml中性蛋白酶II的消化液，4°C，过夜消化；用眼科镊子分离表皮，并弃之，然后将真皮层切成1mm3的小块；用含体积分数为0.5％I型胶原酶的消化液，于37°C，对真皮层小块轻摇消化1h；再加入等量的DMEM/F12培养基，终止消化，再将细胞悬液以180g离心10min；将上述细胞悬液用过滤器过滤，去除残余的组织块，调整细胞密度为1×105/ml；将上述细胞悬液接种于包被有IV型胶原的T25培养瓶中，置于37°C、5％CO2培养箱中，贴壁10-20min后，吸弃上清液，留用贴壁细胞；再向T25培养瓶中加入10ml细胞培养液，置于37°C、5％CO2的饱和湿度的培养箱中培养，每2-3天换液一次；细胞融合度达到80％以上后，吸干培养液，用PBS液轻洗细胞两次；
3）干细胞增殖：培养瓶内加入体积分数为0.25％胰蛋白酶消化液+0.01％EDTA，置于37°C，5％的CO2温箱2-3min后，倒置显微镜下观察到细胞回缩，细胞间隙增大，再向培养瓶里加入10ml干细胞悬液制剂终止消化；用吸管反复吹打瓶底，使细胞脱落，再将细胞悬液180g离心，5min；将上述细胞按1:3的比例分瓶传代，加入皮肤基底干细胞增殖用组合物，继续培养，细胞传至2-5代，即可。
根据上述技术方案，所述干细胞悬液制剂的制备方法为：取人的表皮组织，采用胰蛋白酶与EDTA消化混合液消化，血清终止，用吸管轻轻吹打至表皮片呈半透明，过200目网筛过滤后，再离心，弃上清液得细胞液；将上述细胞液接种在IV型胶原蛋白表面修饰的培养瓶中，快速黏附10-20min后，收集黏附细胞进行培养，加入无血清DMEM，置37℃、CO2浓度为5％的培养箱中培养，每3天换液1次，待细胞长成70％-80％融和状态时，加入丝素蛋白，壳聚糖和VC，制成表皮干细胞悬液制剂。
根据上述技术方案，所述皮肤基底干细胞增殖用组合物含有选自4’,7,8-三羟基异黄酮、4’,6,7-三羟基异黄酮、及3’,4’,7-三羟基异黄酮的至少一种的o-二羟基异黄酮衍生物，其制备方法，是将上述原料4’,7,8-三羟基异黄酮、4’,6,7-三羟基异黄酮、及3’,4’,7-三羟基异黄酮的至少一种的o-二羟基异黄酮衍生物进行均匀混合即可。
根据上述技术方案，所述以皮肤基底干细胞增殖用组合物全体的重量为基准时，所述o-二羟基异黄酮衍生物的含量是0.001-30重量％。
根据上述技术方案，所述在加入丝素蛋白，壳聚糖和VC之前，还包括在高温高压下，对丝素蛋白，壳聚糖和VC进行灭菌。
根据上述技术方案，所述步骤2）中皮肤切片后的规格为0.5mm×0.5mm。
根据上述技术方案，所述步骤1）中冰箱的温度调节为4°C。
基于上述，本发明的优点在于，获得细胞数量多，培养周期短，成本较传统方法低廉，应用前景良好细胞得率高、分化效率高等优点分离容易，且能获得活性更高、数量更多的细胞，重现率很高、将丝素蛋白，壳聚糖和VC高分子材料添加到干细胞活细胞悬液中，可以提高细胞活率，延长细胞存活时间，通过皮肤基底干细胞增殖用组合物，便于使基底干细胞快速扩增。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种新型的快速扩增皮肤表皮基底干细胞的方法，其特征在于：包括如下步骤：
1）制备包被瓶：将人IV型胶原溶解并用PBS稀释至0.1g/L制成包被液；取5ml包被液加入培养瓶中，平放，置冰箱中过夜；弃上清，置于超净工作台中干燥；包被瓶置冰箱中保存备用；
2）制备真皮组织：取皮肤，消毒，冲洗，剔除皮下脂肪层，保留真皮及表皮层；剪成小块，用0.25％胰酶在4°C冰箱中过夜；用等体积含10％胎牛血清的DMEM高糖培养基终止消化，冲洗，表皮在冲洗的过程中被脱离、洗去，未分离的表皮使用镊子分离去除，得真皮组织；将皮肤切成小块，用PBS冲洗三次；组织块置于无菌平皿中，真皮面朝下，用含有1U/ml中性蛋白酶II的消化液，4°C，过夜消化；用眼科镊子分离表皮，并弃之，然后将真皮层切成1mm3的小块；用含体积分数为0.5％I型胶原酶的消化液，于37°C，对真皮层小块轻摇消化1h；再加入等量的DMEM/F12培养基，终止消化，再将细胞悬液以180g离心10min；将上述细胞悬液用过滤器过滤，去除残余的组织块，调整细胞密度为1×105/ml；将上述细胞悬液接种于包被有IV型胶原的T25培养瓶中，置于37°C、5％CO2培养箱中，贴壁10-20min后，吸弃上清液，留用贴壁细胞；再向T25培养瓶中加入10ml细胞培养液，置于37°C、5％CO2的饱和湿度的培养箱中培养，每2-3天换液一次；细胞融合度达到80％以上后，吸干培养液，用PBS液轻洗细胞两次；
3）干细胞增殖：培养瓶内加入体积分数为0.25％胰蛋白酶消化液+0.01％EDTA，置于37°C，5％的CO2温箱2-3min后，倒置显微镜下观察到细胞回缩，细胞间隙增大，再向培养瓶里加入10ml干细胞悬液制剂终止消化；用吸管反复吹打瓶底，使细胞脱落，再将细胞悬液180g离心，5min；将上述细胞按1:3的比例分瓶传代，加入皮肤基底干细胞增殖用组合物，继续培养，细胞传至2-5代，即可。
2.根据权利要求1所述的一种新型的快速扩增皮肤表皮基底干细胞的方法，其特征在于：所述干细胞悬液制剂的制备方法为：取人的表皮组织，采用胰蛋白酶与EDTA消化混合液消化，血清终止，用吸管轻轻吹打至表皮片呈半透明，过200目网筛过滤后，再离心，弃上清液得细胞液；将上述细胞液接种在IV型胶原蛋白表面修饰的培养瓶中，快速黏附10-20min后，收集黏附细胞进行培养，加入无血清DMEM，置37℃、CO2浓度为5％的培养箱中培养，每3天换液1次，待细胞长成70％-80％融和状态时，加入丝素蛋白，壳聚糖和VC，制成表皮干细胞悬液制剂。
3.根据权利要求1所述的一种新型的快速扩增皮肤表皮基底干细胞的方法，其特征在于：所述皮肤基底干细胞增殖用组合物含有选自4’,7,8-三羟基异黄酮、4’,6,7-三羟基异黄酮、及3’,4’,7-三羟基异黄酮的至少一种的o-二羟基异黄酮衍生物，其制备方法，是将上述原料4’,7,8-三羟基异黄酮、4’,6,7-三羟基异黄酮、及3’,4’,7-三羟基异黄酮的至少一种的o-二羟基异黄酮衍生物进行均匀混合即可。
4.根据权利要求3所述的一种新型的快速扩增皮肤表皮基底干细胞的方法，其特征在于：所述以皮肤基底干细胞增殖用组合物全体的重量为基准时，所述o-二羟基异黄酮衍生物的含量是0.001-30重量％。
5.根据权利要求2所述的一种新型的快速扩增皮肤表皮基底干细胞的方法，其特征在于：所述在加入丝素蛋白，壳聚糖和VC之前，还包括在高温高压下，对丝素蛋白，壳聚糖和VC进行灭菌。
6.根据权利要求1所述的一种新型的快速扩增皮肤表皮基底干细胞的方法，其特征在于：所述步骤2）中皮肤切片后的规格为0.5mm×0.5mm。
7.根据权利要求1所述的一种新型的快速扩增皮肤表皮基底干细胞的方法，其特征在于：所述步骤1）中冰箱的温度调节为4°C。
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