JP2017511878A - 癌の予後診断のためのバイオマーカーおよび療法のためのターゲットとしてのｐｒｌ−３ - Google Patents

Abstract

以前、本発明者らは、癌関連ＰＲＬ−３細胞内ホスファターゼが、ＰＲＬ−３抗体療法のための潜在的な療法ターゲットであることを示してきた。ＰＲＬ−３は、最近、癌予後診断、特に癌転移の予測のための潜在的に有用なバイオマーカーとして浮かび上がってきている（Ｍａｔｓｕｋａｗａら、２０１０； Ｒｅｎら、１２ ２００９）。本明細書において、本発明者らは、ＰＲＬ−３が、癌に関する独立の予後マーカーとして作用しうることを立証する。【選択図】図８

Description

本発明は、ＰＲＬ３、そして特に、排他的ではないが、抗ＰＲＬ３抗体、ならびにＰＲＬ３の検出および定量化を通じた癌の予後診断のための方法に関する。

急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）は、分化におけるブロックおよび未成熟骨髄細胞の悪性クローンの制御されない増殖によって特徴付けられる（Ｌｏｗｅｎｂｅｒｇら、１９９９）。未知の機構を通じて生じる後天性突然変異の不均一性が高いため、療法アプローチは限定された有効性しか持たず、そしてＡＭＬ患者の臨床転帰は劣っている（ＳｔｅｒｎｂｅｒｇおよびＬｉｃｈｔ、２００５）。ｆｍｓ様チロシンキナーゼ−３（ＦＬＴ３）における活性化突然変異は、ＡＭＬにおけるより頻繁な遺伝子改変の１つに相当し（Ｒｏｃｋｏｖａら、２０１１）、ＦＬＴ３の膜近傍（ＪＭ）ドメインにおける内部タンデム複製（ＩＴＤ）を伴う（Ｎａｋａｏ、１９９６）。ＦＬＴ３−ＩＴＤの恒常的活性化は、多数の下流シグナル伝達経路の、上昇し、そして維持される活性化を導き、最終的には、造血細胞の増殖因子非依存性増殖への形質転換を生じる（Ｍｉｚｕｋｉら、２０００）。ＡＭＬ細胞における本質的な増殖促進性および抗アポトーシス性の役割のため、ＦＬＴ３における活性化突然変異は、ＡＭＬの治療の有望な分子ターゲットと提唱されてきている。しかし、薬剤発見の進歩およびＦＬＴ３突然変異の分子機構の理解にもかかわらず、ＦＬＴ３阻害剤を用いた臨床試験は、これまでのところ、薬剤耐性および劣った臨床反応のため、限定された成功しか示してきていない（Ｗｅｉｓｂｅｒｇら、２０１０）。これは、ＦＬＴ３突然変異の根底にある機構の理解が、よりよい療法戦略の発展を補助しうることを示唆する。

ＦＬＴ３−ＩＴＤ突然変異は、ＡＭＬ患者の２５〜３０％で検出され、そしてこれは劣った予後に関連する。ＦＬＴ３−ＩＴＤ突然変異のターゲティングは、ＡＭＬに関する有望な療法アプローチであるが、ＦＬＴ３阻害剤を用いた臨床試験は、限定された成功しか示してきていない。ＦＬＴ３突然変異がどのようにして疾患を導くかへの洞察は、新規療法機会を提供するであろう。

以前、本発明者らは、癌関連ＰＲＬ−３細胞内ホスファターゼがＰＲＬ−３抗体療法の潜在的な療法ターゲットであることを示してきている。ＰＲＬ−３は、１９９４年および１９９８年に同定されたＰＲＬ（再生肝のホスファターゼ）ファミリーにおける３つのメンバー（ＰＲＬ−１、２、および３）の１つである。３つのＰＲＬは、プロテインチロシンホスファターゼ（ＰＴＰ）ファミリーの下位群を形成する。

以前、ＰＲＬ−３は、転移性結腸直腸癌細胞において、特異的に上方制御されることが最初に発見され（Ｓａｈａら、２００１）、そして続いて、乳癌、肝癌および胃癌などの多くの他のタイプの癌転移と関連することが報告された（Ｂｅｓｓｅｔｔｅら、２００８）。細胞遊走、浸潤、増殖、血管新生、および転移を含む、癌進行におけるＰＲＬ−３の多様な役割は、腫瘍発生におけるＰＲＬ−３の重要性を強調する最近の報告に強調されてきている（Ａｌ−ＡｉｄａｒｏｏｓおよびＺｅｎｇ、２０１０； Ｌｉａｎｇら、１０ ２００７）。

ＰＲＬ−３は、最近、癌予後診断、特に癌転移予測のために潜在的に有用なバイオマーカーとして浮かび上がってきている（Ｍａｔｓｕｋａｗａら、２０１０； Ｒｅｎら、１２ ２００９）。本明細書において、本発明者らは、ＰＲＬ−３が、癌に関する独立の予後マーカーとして作用しうることを立証する。

Lowenbergら、1999, N. Engl. J. Med., .341: 1051-1062 SternbergおよびLicht、2005, Curr. Opin. Hematol., 12: 7-13 Rockovaら、2011, Blood, 118: 1069-1076 Nakaoら、1996, Leukemia, 10: 1911-1918 Mizukiら、2000, Blood, 96: 3907-3914 Weisbergら、2010, Oncogene, 29: 5120-5134 Sahaら、2001 Bessetteら、2008, Cancer Metastasis Rev., 27: 231-252 Al-AidaroosおよびZeng、2010, J. Cell Biochem., 111:1087-1098 Liangら、2007, J. Biol. Chem., 282: 5413-5419 Matsukawaら、2010, Pathobiology, 77: 155-162 Renら、2009, Pathol. Oncol. Res., 15:555-560

本発明は、個体における癌の予後診断のための方法を提供する。該方法は、個体の生存率を決定する工程を伴うことも可能である。該方法は、患者由来の試料におけるＰＲＬ３の発現、活性またはレベルを決定する工程を伴うことも可能である。該方法は、試料におけるＰＲＬ３の発現、活性またはレベルが調節されているかどうか決定する工程を伴うことも可能である。調節は、対照、例えば該個体由来の非癌試料または癌を持たない別の個体由来の非癌試料に比較して決定することも可能である。

出願人は、癌の予後診断のための方法、すなわち患者の癌の転帰を予測するための方法を提供する。該方法は、患者から得た試料におけるＰＲＬ３タンパク質またはＰＲＬ３核酸の量を決定し、そしてＰＲＬ３タンパク質またはＰＲＬ３核酸の量を、対照におけるＰＲＬ３タンパク質またはＰＲＬ３核酸の量に比較する工程を含む。対照におけるより、患者から得た試料におけるＰＲＬ３のレベルがより高ければ、劣った予後の指標となる。いくつかの場合、対照におけるより、患者から得た試料におけるＰＲＬ３のレベルが１０％多ければ、劣った予後の指標となる。

いくつかの場合、該方法は、白血病患者の転帰の予後診断のために用いられる。いくつかの場合、白血病は、骨髄性白血病、例えば急性骨髄性白血病または慢性骨髄性白血病である。

患者から得られている体液試料に対して、方法を行ってもよい。試料は、骨髄試料、例えば骨髄吸引物であってもよい。いくつかの場合、正常核型を有する患者、または正常核型を有する癌を有する患者に関して予後診断を行う。予後診断の方法は、患者の核型を決定する工程を伴うことも可能である。

ＦＬＴ３−ＩＴＤ陽性癌を有する患者に関して、予後診断を行ってもよい。該方法は、試料がＦＬＴ３−ＩＴＤ陽性試料であることを決定する工程を伴ってもよい。癌は、ＦＬＴ３−ＩＴＤ陽性癌を有すると以前決定されていてもよい。患者は、ＦＬＴ３阻害療法で以前治療されていてもよいし、または該療法を経験中であってもよい。いくつかの場合、ＦＬＴ３阻害療法は成功していなくてもよいし、または部分的にしか成功していなくてもよい。

本明細書に記載する予後診断法において、試料中のＰＲＬ３タンパク質レベルをイムノアッセイによって決定してもよい。いくつかの場合、ＰＲＬ３核酸レベル、特にＰＲＬ３ ｍＲＮＡレベルをｑＲＴ−ＰＣＲによって決定する。

本明細書にやはり記載するのは、白血病治療法において使用するための抗ＰＲＬ３抗体、および白血病治療用の薬剤製造のための抗ＰＲＬ３抗体の使用である。白血病は、骨髄性白血病、例えば急性骨髄性白血病または慢性骨髄性白血病であってもよい。

いくつかの場合、ＦＬＴ３阻害療法、例えばリニファニブまたはリニファニブおよびＳＡＨＡ療法を以前経験しているか、または経験中である患者の治療において使用するために、抗ＰＲＬ３抗体を提供してもよい。患者はこの療法に反応していなくてもよいし、またはこの療法に部分的にしか反応していなくてもよい。

本明細書記載の抗ＰＲＬ３抗体、抗ＰＲＬ３抗体の投与を伴う治療法は、ＦＬＴ３を阻害し、そして特にＦＬＴ３−ＩＴＤを阻害する化合物、例えばリニファニブの投与をさらに伴ってもよい。

ＰＲＬ−３ ｍＲＮＡレベルは、ＦＬＴ３−ＩＴＤ陽性ＡＭＬ試料において上昇している。Ａ． ＦＬＴ３−ＩＴＤ突然変異に関して陰性（ＩＴＤ ＮＥＧ；ｎ＝１２）または陽性（ＩＴＤ ＰＯＳ；ｎ＝７）のいずれかであるＡＭＬ患者由来の１９の骨髄試料におけるＰＲＬ−３ ｍＲＮＡ発現レベルのＲＴ−ＰＣＲ分析。ＭＯＬＭ−１４およびＭＶ４−１１ ＡＭＬ細胞株をＦＬＴ３−ＩＴＤ陽性対照として用いた。β−アクチン、装填対照。Ｂ．（ａ〜ｄ）４つの独立の患者コホート（総数ｎ＝１１５８）におけるＦＬＴ−ＩＴＤ陽性（ＰＯＳ）またはＦＬＴ３−ＩＴＤ陰性（ＮＥＧ）患者中のＰＲＬ−３ ｍＲＮＡレベルのマイクロアレイデータ分析。ａ.コホート１、正常核型を有するＡＭＬ患者（ｎ＝１０１、ｐ＝０．００１）。ｂ. ＧＳＥ１１５９ ＡＭＬ患者コホート（ｎ＝２８５、ｐ＜０．００１）。ｃ. ＧＳＥ６８９１ ＡＭＬ患者コホート（ｎ＝５２１、ｐ＜０．００１）。ｄ. ＧＳＥ１５４３４ ＡＭＬ患者コホート（ｎ＝２５１、ｐ＜０．００１）。カイ二乗検定を用いて、ＩＴＤ−ＰＯＳおよびＩＴＤ−ＮＥＧ患者の間の統計的相違を決定した。ＰＲＬ−３発現レベルを４群に分ける；非常に高い、高い、中程度、低い。 ＰＲＬ−３ ｍＲＮＡレベルは、ＦＬＴ３−ＩＴＤ陽性ＡＭＬ試料において上昇している。Ｃ． ４つのＡＭＬ細胞株におけるＰＲＬ−３タンパク質レベルのウェスタンブロット分析。Ｄ． ＦＬＴ３発現のｓｉＲＮＡ仲介性ノックダウンに際してのＭＯＬＭ−１４およびＭＶ４−１１細胞におけるＰＲＬ−３のウェスタンブロット分析。ＮＳ、対照非サイレンシングｓｉＲＮＡ。ＧＡＰＤＨ、装填対照。 ＡＭＬ細胞株におけるＦＬＴ３またはＳｒｃ阻害に際して、ＰＲＬ−３タンパク質発現は減少する。ＴＦ１−ＩＴＤおよびＭＯＬＭ−１４細胞を、多様な濃度のＦＬＴ３阻害剤（ＰＫＣ４１２、ＣＥＰ−７０１）またはＳｒｃ阻害剤（ＳＵ６６５６、ＰＰ２）と２４時間インキュベーションした。全細胞溶解物を、示す抗体を用いたウェスタンブロット分析に供した。ＧＡＰＤＨ、装填対照。Ａ．（ａ〜ｄ）ＦＬＴ３阻害に際してのＡＭＬ細胞のウェスタンブロット分析。ＰＫＣ４１２およびＣＥＰ−７０１は、ＴＦ１−ＩＴＤ（ａ〜ｂ）およびＭＯＬＭ−１４（ｃ〜ｄ）細胞両方において、ＦＬＴ３およびＳＴＡＴ５の両方のリン酸化、ならびにＰＲＬ−３タンパク質レベルを用量依存方式で阻害した。Ｂ．（ａ〜ｄ）ＦＬＴ３阻害に際してのＡＭＬ細胞のウェスタンブロット分析。ＰＫＣ４１２およびＣＥＰ−７０１は、ＴＦ１−ＩＴＤ（ａ〜ｂ）およびＭＯＬＭ−１４（ｃ〜ｄ）細胞両方において、Ｓｒｃのリン酸化を用量依存方式で阻害したが、ＪＡＫを阻害しなかった。Ｃ．（ａ〜ｂ）Ｓｒｃ阻害に際してのＡＭＬ細胞のウェスタンブロット分析。ＳＵ６６５６（ａ）およびＰＰ２（ｂ）は、ＴＦ１−ＩＴＤ細胞において、ＳｒｃおよびＳＴＡＴ５のリン酸化、ならびにＰＲＬ−３タンパク質レベルを用量依存方式で阻害した。 ＳＴＡＴ５ＡはＰＲＬ−３発現の直接転写制御因子である。Ａ． ＴＲＡＮＳＦＡＣによって予測されるような、ＰＲＬ−３の遠位５’隣接領域における、２つの推定上のＳＴＡＴ５結合部位（Ｓ１およびＳ２；ＤＮＡ配列を例示する）。Ｂ． ＴＦ−１またはＴＦ１−ＩＴＤ細胞のいずれかに由来する核酸抽出物とインキュベーションされたＳ１およびＳ２ビオチン化ＤＮＡプローブ（Ｓ１およびＳ２）を用いたＥＭＳＡ分析。矢印、シフトしたタンパク質／プローブ複合体。Ｃ． １０倍モル過剰の非標識ＳＴＡＴ５競合剤の存在下での、（Ｂ）と同様のＥＭＳＡ分析。 ＳＴＡＴ５ＡはＰＲＬ−３発現の直接転写制御因子である。Ｄ．プローブＳ１を用いたストレプトアビジン−アガロース・プルダウン分画（未結合または結合）のウェスタンブロット分析。Ｅ．左パネル、それぞれ、ルシフェラーゼレポーターベクターを含む、ＰＲＬ−３の５．４ｋｂ上流配列およびその５’連続欠失配列の模式図（ｐＧＬ３−Ｓ１ａ、Ｓ１ｂ、Ｓ１ｃ、およびＳ１ｄ）。右パネル、ＳＴＡＴ５ＡまたはＳＴＡＴ５Ｂ発現ベクターを、ＰＲＬ−３ルシフェラーゼレポーターベクターとともに、ＴＦ−１細胞に同時トランスフェクションし、そしてルシフェラーゼ活性を測定した。エラーバーは、３回の独立の実験由来の平均±ＳＤを示す。Ｆ． ＰＲＬ−３発現は、ＡＭＬ細胞において、ｓｉＲＮＡ仲介性ＳＴＡＴ５枯渇に際して下方制御される。ＮＳ、対照非サイレンシングｓｉＲＮＡ。（ａ）ＳＴＡＴ５遺伝子のノックダウン後のＰＲＬ−３ ｍＲＮＡレベルの定量的リアルタイムＰＣＲ分析、ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡに対して規準化。スチューデントのｔ検定を用いて、２群間の統計的相違を決定した（平均±ＳＤ、ｎ＝３、^＊＊ｐ＜０．０１）。（ｂ）ＳＴＡＴ５遺伝子のノックダウン後のＰＲＬ−３タンパク質レベルのウェスタンブロット分析。ＧＡＰＤＨ、装填対照。 ＰＲＬ−３は、ＥＲＫおよびＪＮＫシグナル伝達経路を通じて、ｃ−Ｊｕｎを特異的に活性化する。Ａ． ＧＦＰ（ＴＦ１−ＧＦＰ）またはＧＦＰ−ＰＲＬ−３（ＴＦ１−ＰＲＬ−３）を過剰発現しているＴＦ−１細胞において、ＡＰ−１活性を測定するＳＥＡＰレポーターアッセイ結果（平均±ＳＤ、ｎ＝３）。Ｂ．（ａ〜ｂ）ＰＲＬ−３はｃ−Ｊｕｎを特異的に上方制御するが、ｃ−Ｆｏｓを上方制御しない。（ａ）ＴＦ１−ＧＦＰ、ＴＦ１−ＰＲＬ−３およびＴＦ１−ＩＴＤ細胞のウェスタンブロット分析。（ｂ）ＴＦ１−ＩＴＤ細胞における内因性ＰＲＬ−３のノックダウン後のウェスタンブロット分析。ＧＡＰＤＨ、装填対照。ＮＳ、対照非サイレンシングｓｉＲＮＡ。Ｃ．（ａ〜ｄ）ｃ−ＪｕｎのＰＲＬ−３仲介性上方制御は、ＥＲＫおよびＪＮＫ経路に依存する。（ａ）ＴＦ１−ＩＴＤおよびＭＯＬＭ−１４細胞における内因性ＰＲＬ−３のノックダウン後のウェスタンブロット分析。（ｂ）ＴＦ１−ＧＦＰおよびＴＦ１−ＰＲＬ−３細胞のウェスタンブロット分析。（ｃ〜ｄ）ＴＦ１−ＰＲＬ−３細胞におけるＥＲＫ１／２またはＪＮＫのノックダウン後のウェスタンブロット分析。ＧＡＰＤＨ、装填対照。ＮＳ、対照非サイレンシングｓｉＲＮＡ。Ｄ．（ａ〜ｃ）多様な時点で、ＥＲＫ特異的阻害剤（Ｕ０１２６）、ＪＮＫ特異的阻害剤（ＳＰ６００１２５）、または一般的なＡＰ−１阻害剤（クルクミン）で処理した後の生存ＴＦ１−ＰＲＬ−３細胞の数を反映するＭＴＳアッセイ結果。エラーバーは、３回の独立の実験由来の平均±ＳＤを示す。 ＰＲＬ−３は、サイトカイン喪失に際して、ＴＦ−１白血病細胞の増殖を促進し、そしてアポトーシスを抑制する。Ａ．右パネル、多様な期間に関する、サイトカインの非存在下での培養後の生存ＴＦ１−ＧＦＰおよびＴＦ１−ＰＲＬ−３細胞の数を反映するＭＴＳアッセイ結果。エラーバーは、３回の独立の実験からの平均±ＳＤを示す。左パネル、ＴＦ１−ＧＦＰおよびＴＦ１−ＰＲＬ−３細胞のウェスタンブロット分析。ＧＡＰＤＨ、装填対照。Ｂ．サイトカインの非存在下で４８時間培養した後のヨウ化プロピジウム染色したＴＦ１−ＧＦＰおよびＴＦ１−ＰＲＬ−３のフローサイトメトリー分析。アポトーシス細胞を反映するサブＧ１ピーク／集団の相違に注目されたい。３回の独立の実験由来の代表的なデータを示す。Ｃ．左パネル、サイトカインの非存在下で４８時間培養した後のアネキシン−Ｖおよび７−ＡＡＤ染色したＴＦ１−ＧＦＰおよびＴＦ１−ＰＲＬ−３のフローサイトメトリー分析。上部左象限における割合は、分析した全細胞集団におけるアネキシン−Ｖ陽性アポトーシス細胞の分画を示す。右パネル、３回の独立の実験におけるアネキシン−Ｖ陽性アポトーシス集団の定量化。スチューデントのｔ検定を用いて、２つの群間の統計的相違を決定した（平均±ＳＤ、ｎ＝３、ｐ＜０．００１）。 ＰＲＬ−３枯渇は、ＦＬＴ３−ＩＴＤ陽性ＡＭＬ細胞の増殖を阻害する。ＰＲＬ３枯渇ＭＯＬＭ−１４およびＭＶ４−１１ ＦＬＴ３−ＩＴＤ陽性ＡＭＬ細胞の増殖を、ＭＴＳアッセイおよびフローサイトメトリーによって分析した。Ａ． ａ. ＰＲＬ−３のノックダウンは、ＦＬＴ３−ＩＴＤ陽性ＭＯＬＭ−１４細胞の細胞数を減少させた（平均±ＳＤ、ｎ＝３）。ｂ． ＰＲＬ−３の枯渇は、ＭＯＬＭ−１４細胞においてＧ１期の細胞を集積させた。Ｂ． ａ． ＰＲＬ−３のノックダウンは、ＦＬＴ３−ＩＴＤ陽性ＭＶ４−１１細胞の細胞数を減少させた（平均±ＳＤ、ｎ＝３）。ｂ． ＰＲＬ−３の枯渇は、ＭＶ４−１１細胞においてＧ１期の細胞を集積させた。３回の独立の実験由来の代表的なデータ（右パネル）を示す。 ＰＲＬ−３ ｍＡｂは、ＡＭＬのマウスモデルにおいて、抗腫瘍療法効果を発揮する。Ａ．（ａ〜ｂ）ＡＭＬのマウスモデルにおける肝臓および脾臓サイズに対する免疫療法の結果。（ａ）正常ヌードマウス（上部左パネル）、あるいは対照ＩｇＧ（上部右パネル）、ＰＲＬ−３ ｍＡｂ（下部左パネル）またはＦＬＴ３ ｍＡｂ（下部右パネル）の週２回のｉ.ｖ.投与を伴うＴＦ１−ＩＴＤ細胞のｉ.ｖ.注射の１２〜１４日後のヌードマウスから採取した肝臓および脾臓の代表的な画像。（ｂ）（ａ）に記載したようなマウスの肝臓および脾臓重量の定量化。スチューデントのｔ検定を用いて、データ群間の統計的相違を決定した（平均±ＳＤ、ｎ＝１１、^＊＊ｐ＜０．００１）。Ｂ．（ａ〜ｂ）ＡＭＬのマウスモデルにおけるマウス骨髄（ＢＭ）細胞中の白血病浸潤に対する免疫療法およびＰＲＬ−３ノックダウンの結果。（ａ）（Ｉ）ＴＦ１、（ＩＩ）対照ＩｇＧまたは（ＩＩＩ）ＰＲＬ−３ ｍＡｂ（下部左パネル）の週２回のｉ.ｖ.投与を伴うＴＦ１−ＩＴＤ細胞、あるいは（ＩＶ）内因性ＰＲＬ−３が枯渇したＴＦ１−ＩＴＤ細胞のｉ.ｖ.注射の１２〜１４日後のヌードマウス由来のＢＭ細胞を、ＴＦ１ヒト由来ＡＭＬ細胞を区別するためにヒト特異的マーカーＣＤ４５＋を用いたフローサイトメトリー分析を用いて分析した。割合は、分析したＢＭ集団におけるＣＤ４５＋細胞の比率を示す。（ｂ）（ａ）に記載するようなＣＤ４５＋生着細胞の定量化。スチューデントのｔ検定を用いて、２群間の統計的相違を決定した（平均±ＳＤ、ｎ＝５、^＊＊＊ｐ＜０．０００１）。Ｃ． ＴＦ１−ＩＴＤ白血病マウスモデルにおけるＰＲＬ−３ ｍＡｂ処置（ｎ＝７）または対照ＩｇＧ処置（ｎ＝７）マウスのカプラン−メイヤー生存分析（ｐ＜０．００１）。 ＰＲＬ−３発現上昇は、３つの独立のＡＭＬ患者コホートにおいて、より短い生存と相関する。（Ａ）コホート１ ＡＭＬ患者、ｎ＝１０１、（Ｂ）ＧＳＥ６８９１、ｎ＝２２７、および（Ｃ）ＧＳＥ１２４１７、ｎ＝１６３において、ＰＲＬ−３ ｍＲＮＡ発現に関する正常核型ＡＭＬ患者における全生存（ＯＳ）のカプラン−メイヤー分析。統計的に有意なｐ値（ログランク検定を用いる）を図中に示す。 多変数コックス回帰分析は、ＰＲＬ−３が独立の予後マーカーであることを明らかにする。ＰＲＬ−３は、ＡＭＬにおいて、新規予後マーカーとして働く。ｐ＞０．０５の除去限界を伴う後方条件付け段階的方法を用いた多変数コックス回帰分析によって、ＰＲＬ−３は、本発明者らのコホート１において、より劣った患者生存に関する重要な独立予測因子の１つを構成した（ｎ＝２２１）。 本研究で用いたすべてのヒトＡＭＬ患者データセットの詳細。１９９８年に本発明者らが同定したホスファターゼであるＰＲＬ−３（Ｚｅｎｇら、１９９８）は、最近、ＡＭＬ細胞において、リニファニブ（ＡＢＴ−８６９、ＦＬＴ３阻害剤）およびスベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤）の組み合わせ療法によってユニークに下方制御されるコア遺伝子シグネチャーの一部であることが見出された（Ｚｈｏｕら、２０１１）。興味深いことに、ＰＲＬ−３は、最近、白血病細胞の薬剤耐性において潜在的な役割を伴う、ＦＬＴ３−ＩＴＤシグナル伝達のありうる下流ターゲットと報告され（Ｚｈｏｕら、２０１１）、ＰＲＬ−３発現レベルが、ＡＭＬ治療転帰に寄与する重要な因子でありうることが示された。 高いＰＲＬ−３ ｍＲＮＡ発現は、ＦＬＴ３−ＩＴＤ突然変異を有するＡＭＬ患者と関連した。定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）分析によって、１９のＡＭＬ患者骨髄試料において、ＰＲＬ−３ ｍＲＮＡレベルを評価した。ＦＬＴ３−ＩＴＤ陰性突然変異を有する患者（ＮＥＧ、ｎ＝１２）＃１、＃６、および＃１０において、そしてＦＬＴ３−ＩＴＤ陽性突然変異を有する患者（ＰＯＳ、ｎ＝７）＃１３、＃１５、＃１７、＃１８、および＃１９において、ＰＲＬ−３ ｍＲＮＡの上方制御が示された。相対ＰＲＬ−３ ｍＲＮＡレベルの定量化のため、患者＃１を参照のため、１として設定した。エラーバーは、３回の独立の実験由来の平均±ＳＤに相当する。ＮＥＧ、陰性；ＰＯＳ、陽性。 異なるレポーター構築物を発現するＴＦ−１細胞において、類似のＳＴＡＴ５ＡおよびＳＴＡＴ５Ｂタンパク質発現レベルが検出された。ルシフェラーゼレポーターアッセイのため、ＴＦ−１細胞において、ｐＣＭＶ６−ＳＴＡＴ５ＡまたはｐＣＭＶ６−ＳＴＡＴ５Ｂ発現ベクターを、ｐＧＬ−Ｌｕｃ−Ｓ１ａ、−Ｓ１ｂ、−Ｓ１ｃ、または−Ｓ１ｄ構築物とそれぞれ同時トランスフェクションした。ウェスタンブロットは、すべての条件において、ＳＴＡＴ５ＡおよびＳＴＡＴ５Ｂの類似の発現レベルを示した。 ＰＲＬ−３過剰発現はＡＰ−１活性を活性化する。２つの固形腫瘍細胞株、ＤＬＤ−１およびＨＣＴ１１６を用いて、ＡＰ−１活性の活性化を調べた。ＧＦＰまたはＧＦＰ−ＰＲＬ−３発現ベクターのいずれかと一緒に、ＡＰ−１ ＳＥＡＰレポーターベクターで、各細胞株を一過性に同時トランスフェクションした。ＰＲＬ−３の過剰発現は、ＤＬＤ−１およびＨＣＴ１１６細胞において、それぞれ、ＡＰ−１活性の６．５倍および＞２．５倍の増加を導いた。エラーバーは、３回の独立の実験由来の平均±ＳＤに相当する。 ２つのサイトカイン非依存性細胞株、ＭＯＬＭ−１４およびＭＶ４−１１において、ＰＲＬ−３枯渇は、アポトーシス集団の実質的な増分を示さない。アネキシン−Ｖおよび７−ＡＡＤ染色後、ＦＡＣＳ分析によって、ＰＲＬ−３のアポトーシス活性を評価した。アネキシンＶ陽性細胞集団は、各パネルの左上部隅に示される。ＭＯＬＭ−１４およびＭＶ４−１１偽ノックダウン細胞は、アネキシン−Ｖ陽性細胞のほぼ７．９％および１０．４％を示し、そしてＰＲＬ−３枯渇ＭＯＬＭ−１４およびＭＶ４−１１細胞（ＭＯＬＭ−１４ ＰＲＬ−３ ＫＤおよびＭＶ４−１１ ＰＲＬ−３ ＫＤ）は、〜１０．３％および〜１２．６％のアポトーシス集団を示した。Ａ．左パネル、４８時間培養後のアネキシン−Ｖおよび７−ＡＡＤ染色ＭＯＬＭ−１４およびＭＯＬＭ−１４ ＰＲＬ−３−ＫＤ細胞のフローサイトメトリー分析。右パネル、３回の独立の実験におけるアネキシン−Ｖ陽性アポトーシス集団の定量化（平均±ＳＤ、ｎ＝３）。Ｂ．左パネル、４８時間培養後のアネキシン−Ｖおよび７−ＡＡＤ染色ＭＶ４−１１およびＭＶ４−１１ ＰＲＬ−３−ＫＤ細胞のフローサイトメトリー分析。右パネル、３回の独立の実験におけるアネキシン−Ｖ陽性アポトーシス集団の定量化（平均±ＳＤ、ｎ＝３）。 ヒトＰＲＬ３の配列。 抗体可変ドメインの配列

組み合わせが明らかに許容されえないかまたは明確に回避される場合を除いて、本発明には、記載する側面および好ましい特徴の組み合わせが含まれる。
本明細書で用いるセクション見出しは、構成上の目的のみのためであり、そして記載する主題を限定するとは見なされないものとする。

このテキストに言及するすべての文書は、本明細書に援用される。
本明細書に開示するように、本発明者らは、ＦＬＴ３−ＩＴＤ陽性ＡＭＬ細胞および患者試料におけるＰＲＬ−３の役割を調べた。本発明者らは、ＡＭＬ細胞におけるＦＬＴ３−Ｓｒｃ−ＳＴＡＴ５シグナル伝達によるＰＲＬ−３の制御を記載する。ＰＲＬ−３発現は、ＡＭＬ患者において、ＦＬＴ３−ＩＴＤ突然変異と正に相関した。ＰＲＬ−３過剰発現は、ｃ−Ｊｕｎ癌原遺伝子の活性化および細胞増殖と関連した。最後に、本発明者らは、ＡＭＬ患者における、ＰＲＬ−３発現上昇およびより短い全生存の間の臨床的関係を記載し、そしてＰＲＬ−３発現上昇をＡＭＬの独立の予後マーカーとして特徴付ける。白血病マウスモデルにおいて、ＰＲＬ−３ターゲティング免疫療法を用いて、白血病誘発におけるＰＲＬ−３の非常に重要な役割が明らかになり、ＰＲＬ−３がＡＭＬの潜在的な療法ターゲットでありうることが示唆された。

本研究は、ＦＬＴ３−ＩＴＤ突然変異に関連する白血病細胞株およびＡＭＬ患者試料において、転移関連ホスファターゼであるＰＲＬ−３の制御および機能を調べた。ＰＲＬ−３過剰発現は、白血病細胞において、ＦＬＴ３−Ｓｒｃ−ＳＴＡＴ５シグナル伝達経路によって仲介され、ＥＲＫおよびＪＮＫ経路を通じて、ＡＰ−１転写因子の活性化を生じる。ＰＲＬ−３の枯渇は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、細胞増殖および細胞周期進行を減弱する一方、ＰＲＬ−３の過剰発現は、ｉｎ ｖｉｖｏで、白血病発展を増進する。ＰＲＬ−３抗体療法は、白血病マウスモデルにおいて、腫瘍負荷を減少させた。ＦＬＴ３−ＩＴＤ突然変異は、総数１１５８人のＡＭＬ患者における４つの独立コホートにおいて、ＰＲＬ−３発現増加と臨床的に関連づけられた。より高いＰＲＬ−３発現は、ＡＭＬ患者において、より短い生存と有意に（ｐ≦０．００１）関連した。

ＦＬＴ３−ＩＴＤ−ＳＴＡＴ５シグナル伝達が仲介するＰＲＬ−３制御に関する機構の知見は、細胞増殖および腫瘍負荷を生じる、ＰＲＬ−３発現上昇の根底にある機構を明らかにする。ＰＲＬ−３のターゲティングは、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで、ＦＬＴ３−ＩＴＤ ＡＭＬモデルにおける発癌作用を逆転させ、ＰＲＬ−３が有望な療法ターゲットであることを示唆した。コホート１の２２１人のＡＭＬ患者における多変数コックス回帰を実行し、ＰＲＬ−３を、他の臨床パラメータとは独立の新規予後マーカーと同定した。

本発明の１またはそれより多い態様の詳細を、例えば、本発明を実行するために本発明者らによって意図される最適の様式の特定の詳細を含めて、以下の付随する説明に示す。当業者には、これらの特定の詳細に関する限定なしに、本発明を実施可能であることが明らかであろう。

ＰＲＬ−３
ＰＲＬ−３はまた、プロテイン−チロシン・ホスファターゼ４Ａ型３；ＰＴＰ４Ａ３としても知られる。ＰＲＬ−３の染色体位置は、遺伝子マップ遺伝子座８ｑ２４．３である。ＰＲＬ−３は、１９９４年および１９９８年^５、６に同定されたＰＲＬ（再生肝のホスファターゼ）の３つのメンバー（ＰＲＬ−１、−２、および−３）の１つである。３つのＰＲＬは、プロテイン・チロシン・ホスファターゼ（ＰＴＰ）ファミリー^７の下位群を形成する。

心臓において、プロテインキナーゼは、収縮性、イオン輸送、代謝および遺伝子発現を制御する。ホスファターゼは、脱リン酸化における役割に加えて、心臓肥大および機能不全に関与する。

ＰＲＬ−３はまず、２００１年に、結腸直腸癌転移に関連づけられた。Ｓａｈａら（２００１， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９４：１３４３−１３４６）は、原発性癌、良性結腸直腸腫瘍および結腸直腸上皮と転移性結腸直腸癌の全体的な遺伝子発現プロファイルを比較した。ＰＲＬ３は、研究した１８の癌転移各々で高レベルで発現されたが、非転移性腫瘍および正常結腸直腸上皮ではより低いレベルで発現された。調べた１２の転移のうち３つで、染色体８ｑ２４．３に位置する小さいアンプリコン内に、多コピーのＰＲＬ３遺伝子が見出された。Ｓａｈａらは、ＰＲＬ３遺伝子が結腸直腸癌転移に重要であると結論づけた。続いて、個々のＰＲＬ−ＰＴＰの上方制御が、正常対応物と比較した際、進行したヒト転移性癌の多数のタイプと相関していると報告された^９。

ＰＲＬホスファターゼは、ヒト癌におけるバイオマーカーおよび療法ターゲットとして検証されたタンパク質の興味深い群に相当する^１０。ＰＲＬは、細胞内Ｃ末端プレニル化ホスファターゼであり、一方、プレニル化シグナルを欠くＰＲＬの突然変異型は、しばしば、核中に位置する^{１１、１２}。

形質膜および初期エンドソームの内部小葉へのＰＲＬ−１およびＰＲＬ−３の局在が、ＥＭ免疫金ラベリングによって明らかになってきている^１３。ＰＲＬ癌細胞を除去するための外因性試薬によるＰＲＬターゲティングは、細胞内への浸透が必要であり、そして困難な課題である。

本明細書に記載する方法および組成物は、以下に詳細に記載するＰＲＬ−３ポリペプチドを利用する。本明細書において、用語「ＰＲＬ−３」は、以下より選択される配列を指すよう意図される。

「ＰＲＬ−３ポリペプチド」は、ヒトＰＲＬ−３ポリペプチド、例えばＵｎｉｇｅｎｅ寄託番号ＡＦ０４１４３４．１を有する配列を含むかまたはこうした配列からなることも可能である。

これらのポリペプチドのいずれか、いくつかまたはすべての相同変異体および誘導体もまた含まれる。例えば、ＰＲＬ−３には、Ｕｎｉｇｅｎｅ寄託番号ＢＣ０６６０４３．１も含まれることも可能である。

ＰＲＬ３ポリペプチドの変異体、誘導体および相同体
本明細書記載の方法は、ＰＲＬ３ポリペプチド、あるいはこうしたポリペプチドの変異体、相同体または誘導体の検出または定量化を含むことも可能である。

細胞ＰＲＬ３は、本明細書に示すような既知のＰＲＬ３配列と同一でなくてもよく、そして既知の配列に対して１またはそれより多い突然変異を所持してもよい。
したがって、こうした配列は、本文書に示す特定の配列に限定されず、相同配列、例えば関連する細胞性相同体、他の種由来の相同体およびその変異体または誘導体もまた含む。

本開示は、したがって、本文書に示すアミノ酸配列の変異体、相同体または誘導体、ならびに本明細書に開示するヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列の変異体、相同体または誘導体を含む。

用語「変異体」または「誘導体」には、本明細書に記載するアミノ酸配列に関連して、配列の置換、変動、修飾、交換、配列からのまたは配列への１（またはそれより多い）アミノ酸の欠失または付加のいずれも含まれる。生じるアミノ酸配列は、未修飾配列と実質的に同じ活性を保持してもよいし、または特定の配列変異体が、細胞の癌性表現型と関連することも可能である。

細胞内ＰＲＬ３の天然変異体は、保存的アミノ酸置換を含むことも可能である。保存的置換は、例えば以下の表にしたがって定義可能である。第二の縦列中の同じブロックのアミノ酸、例えば第三の縦列中の同じ列のものは、互いに置換可能である：

方法は、必ずしも、完全ポリペプチド、変異体、相同体または誘導体の検出または定量化を必要とせず、そしてその代わり、断片の検出または定量化を伴ってもよい。
上に示すように、配列同一性に関して、「相同体」は、例えば、適切な配列に対して、少なくとも５％同一性、少なくとも１０％同一性、少なくとも１５％同一性、少なくとも２０％同一性、少なくとも２５％同一性、少なくとも３０％同一性、少なくとも３５％同一性、少なくとも４０％同一性、少なくとも４５％同一性、少なくとも５０％同一性、少なくとも５５％同一性、少なくとも６０％同一性、少なくとも６５％同一性、少なくとも７０％同一性、少なくとも７５％同一性、少なくとも８０％同一性、少なくとも８５％同一性、少なくとも９０％同一性、または少なくとも９５％同一性を有する。

ポリヌクレオチド
本発明の方法は、ＰＲＬ−３ポリヌクレオチドの検出を伴うことも可能である。これらは、ＤＮＡまたはＲＮＡを含むことも可能である。

ポリヌクレオチドが二本鎖である場合、二重鎖の両方の鎖を個々にまたは組み合わせて検出することも可能である。ポリヌクレオチドが一本鎖である場合、ポリヌクレオチドの相補配列もまた含まれることが理解されるものとする。

該方法は、染色体ＤＮＡ、細胞ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｃＤＮＡまたは他の核酸の検出または定量化を伴うことも可能である。
ＰＲＬ３ポリヌクレオチドの変異体、相同体および誘導体
本文書に記載するヌクレオチド配列に関連する用語「変異体」、「相同体」または「誘導体」には、配列の置換、変動、修飾、交換、配列からのまたは配列への１（またはそれより多い）ヌクレオチドの欠失または付加のいずれも含まれる。ポリヌクレオチドは、非癌性組織におけるＰＲＬ３に比較して、一部切除されるかまたは伸長していてもよい。

上に示すように、配列同一性に関して、「相同体」は、例えば、適切な配列に対して、少なくとも５％同一性、少なくとも１０％同一性、少なくとも１５％同一性、少なくとも２０％同一性、少なくとも２５％同一性、少なくとも３０％同一性、少なくとも３５％同一性、少なくとも４０％同一性、少なくとも４５％同一性、少なくとも５０％同一性、少なくとも５５％同一性、少なくとも６０％同一性、少なくとも６５％同一性、少なくとも７０％同一性、少なくとも７５％同一性、少なくとも８０％同一性、少なくとも８５％同一性、少なくとも９０％同一性、または少なくとも９５％同一性を有する。

必ずしも、完全または損なわれていない（ｉｎｔａｃｔ）核酸を検出する必要はない。方法は、その代わり、ＰＲＬ３ポリヌクレオチドの断片の検出または定量化を伴ってもよい。

患者
治療される患者は、任意の動物またはヒトであってもよい。患者は、好ましくは、非ヒト哺乳動物、より好ましくはヒト患者である。患者は男性または女性であってもよい。患者は癌を有してもよいし、または有すると推測されてもよい。

試料
本明細書記載の方法を、患者から得られている試料に対して行ってもよい。したがって、こうした方法をｅｘ ｖｉｖｏで行ってもよい。これらをｉｎ ｖｉｔｒｏで行ってもよい。

試料を任意の組織または体液から採取してもよい。試料は、癌性組織の試料、例えば腫瘍試料または生検であってもよい。試料は、外科的方法、例えば腫瘍摘出術または乳腺腫瘍摘出術中に除去されていてもよい。

いくつかの好ましい設定において、方法を骨髄試料または生検に対して行う。骨髄試料は、好ましくは、骨髄芽細胞を含有する。骨髄試料を骨盤または胸骨、あるいは任意の他の適切な骨から採取してもよい。針を用いて、試料または生検を得てもよい。骨髄生検は、トレフィン生検であってもよい。いくつかの場合で、骨髄吸引試料を得る。骨髄吸引物において、液体骨髄を個体から除去する。

いくつかの設定において、試料は体液、より好ましくは身体を循環するものから採取される。したがって、試料は血液試料またはリンパ試料であってもよい。
試料は：ある量の血液；フィブリン塊および血球を除去した後に得られる、血液の液体部分を含んでもよい、個体の血液由来のある量の血清；ある量の膵液；組織試料または生検；あるいは前記個体から単離された細胞を含んでもよいし、またはこれらに由来してもよい。

試料は血液試料または血液由来試料であってもよい。血液由来試料は、患者血液の選択された分画、例えば選択された細胞含有分画あるいは血漿または血清分画であってもよい。

選択された細胞含有分画は、白血球（ＷＢＣ）、特に末梢血単核細胞（ＰＢＣ）および／または顆粒球、および／または赤血球（ＲＢＣ）を含んでもよい、関心対象の細胞種を含有してもよい。したがって、本発明記載の方法は、血液、白血球、末梢血単核細胞、顆粒球および／または赤血球における、ＰＲＬ３ポリペプチドまたは核酸の検出を伴ってもよい。

予後診断
予後診断、予後診断することおよび予後診断する、は、臨床および非臨床特性に基づいて、個体における将来の転帰のリスクを推定することを指す。特に、本明細書に用いるような予後を決定する方法は、個体または患者の癌の転帰または将来の経過の予測を指す。予後診断には、患者の生存の予測が含まれる。予後診断は、適切な療法治療を決定するために有用でありうる。予後試験は、以前診断されなかった癌性状態の診断とともに（例えば同時に）行ってもよいし、あるいは現存する（以前診断された）状態に関連してもよい。

予後診断の方法は、患者試料に対して、または患者試料のプロセシング後に行うｉｎ ｖｉｔｒｏ法であってもよい。試料が収集されたら、予後診断ｉｎ ｖｉｔｒｏ法が実行されるために、患者が居合わせる必要はなく、そしてしたがって、方法は、ヒトまたは動物の身体に対して行わないものであることも可能である。

本明細書に開示するように、ＰＲＬ３発現レベルを用いて、患者癌の予後を示すことも可能である。本明細書において、上昇したＰＲＬ３発現および活性は、より短い全生存と相関した。したがって、ＰＲＬ３遺伝子発現の上方制御またはＰＲＬ３タンパク質レベルの増加は、劣った予後、例えば生存時間減少を示すことも可能である。

したがって、本明細書記載の予後診断法は、ＰＲＬ３発現または活性の同定または定量化を伴う。該方法は、ＰＲＬ３タンパク質、あるいはＰＲＬ３をコードするＤＮＡまたはＲＮＡの検出を伴ってもよい。該方法は、ＰＲＬ３ ｍＲＮＡの検出を伴ってもよい。あるいは、該方法は、ＰＲＬ３タンパク質の検出を伴ってもよい。該方法は、ＰＲＬ３の定量化を伴ってもよい。

ＰＲＬ−３レベルは腫瘍の攻撃性に伴って多様であるため、ＰＲＬ−３発現、量または活性の検出を用いて、癌を有する個体の生存率を予測することもまた可能であり、すなわち、どちらも正常レベルのＰＲＬ−３を有する個体または同族（cognate）集団に比較した際、高レベルのＰＲＬ−３は、より低い生存率または可能性を示し、そして低レベルのＰＲＬ−３は、より高い生存率または可能性を示す。ＰＲＬ−３の発現、量または活性の検出は、したがって、癌、例えば白血病を有する個体の予後診断法として使用可能である。

ＰＲＬ３は、独立の予後指標として働きうる。したがって、ＰＲＬ３のレベルを用いて、他の予後指標分子または他の予後指標遺伝子（すなわちその発現、活性またはレベルが癌において調節されている、ＰＲＬ３以外の遺伝子）を分析する必要を伴わず、個体の予後を予測することも可能である。いくつかの場合、本明細書記載の予後診断法は、ＰＲＬ３に基づいて癌の予後が決定されるが、他の予後指標遺伝子に基づかない癌の予後診断を伴う。いくつかの場合、他の予後指標遺伝子を、ＰＲＬ３に加えて評価する。

ＰＲＬ３レベルを単変数分析として計算することも可能である。すなわち、いかなる他の予後指標の分析も存在しない。
あるいは、ＰＲＬ３を多変数予後診断試験の一部として用いてもよく、ここで、ＰＲＬ３に加えて、他の予後診断因子を分析する。ＰＲＬ３を多変数予後診断モデルまたは予測モデルの一部として用いてもよい。

さらなる予後指標には、タンパク質または核酸、例えば癌原遺伝子または既知の予後マーカー遺伝子の発現レベルまたは活性、既知の突然変異体タンパク質、核酸または遺伝子の発現、あるいは患者の年齢、性別、全身健康状態、症状、徴候、試験結果または病歴などの他の要因の分析が含まれることも可能である。臨床および非臨床予後指標は、関連する業の当業者に容易に認識されるであろう。

予後診断は、正常核型を有する試料または患者に関するものであることも可能である。いくつかの場合、試料または患者は、異常核型、例えば染色体の異常な数または構造あるいは他の細胞遺伝学的合併症を示す可能性もある。

試料は、抗癌療法、例えば化学療法、放射療法またはホルモン治療ですでに治療されてきている患者由来であってもよい。いくつかの場合、癌は、抗癌療法に反応しないであろう。

予後診断を用いて、個体の無病生存時間、無進行生存時間、疾患特異的生存時間、生存率、または生存時間を予測することも可能である。
生存率（全生存としても知られる）は、予後診断の後、所定の期間生きている人の割合である。例えば、予後診断を行った後、１ヶ月、３ヶ月、６ヶ月、１２ヶ月、１８ヶ月、２４ヶ月、３年、４年、５年、１０年またはそれより長く生存しているヒトの割合である。生存率は、患者が特定の期間、生きているであろうパーセント尤度であることも可能であり、例えば患者が、１ヶ月、３ヶ月、６ヶ月、１２ヶ月、１８ヶ月、２４ヶ月、３年、４年、５年、１０年またはそれより長く生存している、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９０％または１００％の尤度である。

生存時間は、患者の人生の残りの期間である。例えば、予後診断の後、概算１ヶ月、３ヶ月、６ヶ月、１２ヶ月、１８ヶ月、２４ヶ月、３年、４年、５年、１０年またはそれより長く生存していることを指す。

無病生存時間（ＤＦＳ）は、ある癌の一次治療が終了した後、その癌の徴候または症状を伴わずに患者が生存している時間の長さである。
無進行生存時間は、疾患が悪くならない時間の長さである。

生存時間は、疾患特異的生存時間であってもよく、これは、予後診断の後、所定の期間生存しているヒトの割合であり、癌以外の他の原因による死は、集団から取り除かれるように処理し、これは生存を低下させず、そしてしたがって、もはや観察されていない患者（例えば研究期間の終わりに到達したため）に匹敵する。

劣った予後は、癌などの疾患が再発するかまたは悪化する予測である。これは患者が疾患または癌で死ぬことを示してもよい。劣った予後は、より攻撃性である癌を示してもよい。短い生存時間、短い生存率、短い無病生存時間、短い無進行生存時間、短い疾患特異的生存時間は、劣った予後の指標である。

診断
診断は、疾患、例えば癌の同定を指す。本明細書に記載する方法を用いて、癌を検出することも可能である。これらを用いて、特定の癌のサブタイプまたはサブクラスを診断してもよい。

本発明の方法にしたがって、ＰＲＬ３ポリペプチドまたは核酸の試料における検出を、患者における癌性状態の診断、癌性状態に対する素因の診断の目的のために、あるいは癌性状態の予後（予後診断）を決定するために、使用可能である。診断または予後診断は、存在する（以前診断された）良性または悪性であってもよい癌性状態に関連することも可能であり、推測される癌性状態に関連することも可能であり、または患者における癌性状態（以前未診断であってもよい）に関してスクリーニングすることに関連することも可能である。

他の診断試験は、本明細書に記載するものと組み合わせて用い、癌性状態の診断または予後診断の正確さを増進するか、あるいは本明細書記載の試験を用いることによって得られる結果を確認することも可能である。

診断法は、患者試料に対して、または患者試料のプロセシング後に実行されるｉｎ ｖｉｔｒｏ法であってもよい。試料が収集されたら、診断のｉｎ ｖｉｔｒｏ法が実行されるために、患者が居合わせる必要はなく、そしてしたがって、方法は、ヒトまたは動物の身体に対して行わないものであることも可能である。

他の診断試験を、本明細書に記載するものと組み合わせて用いて、診断または予後診断の正確さを増進してもよいし、あるいは本明細書記載の試験を用いることによって得た結果を確認してもよい。

検出および定量化
本明細書に開示する方法は、ＰＲＬ３の検出および／または定量化を伴う。本明細書において、検出は、定量化を伴わないＰＲＬ３の測定を指す。ＰＲＬ３ヌクレオチドおよびタンパク質の検出および定量化のための方法は、当該技術分野に周知であり、そして当業者によって容易に認識されるであろう。

タンパク質は、例えば、イムノアッセイによって検出または定量化可能である。イムノアッセイ法は、当該技術分野に周知であり、そして一般的に：（ａ）前記タンパク質に対する抗体によって結合可能なエピトープを含むポリペプチドを提供し；（ｂ）抗体−抗原複合体の形成を可能にする条件下で、前記ポリペプチドと生物学的試料をインキュベーションし；そして（ｃ）前記ポリペプチドを含む抗体−抗原複合体が形成されるかどうかを決定する工程を含むであろう。イムノアッセイ法には、ウェスタンブロッティングおよびＥＬＩＳＡが含まれる。

イムノアッセイには、限定されるわけではないが、酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、側方流動試験、ラテックス凝集、イムノクロマトグラフィの他の型、ウェスタンブロット、および／または磁気イムノアッセイが含まれる。

タンパク質はまた、質量分析を用いて、検出または定量化可能である。例えば、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）またはマトリックス補助レーザー脱離／イオン化（ＭＡＬＤＩ）を用いた質量分析。

タンパク質定量化の他の方法には、分光法に基づく方法が含まれる。こうした方法は、比色アッセイまたは分光光度測定アッセイを伴うことも可能である。
核酸を検出し、そして定量化するための方法が当該技術分野に周知である。方法には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づく方法およびハイブリダイゼーション法が含まれる。

ポリメラーゼ連鎖反応に基づく方法には、ＰＣＲ、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、および定量的ＲＴ−ＰＣＲが含まれる。こうした方法は、関心対象のＤＮＡ配列に特異的に結合するプライマー、または小分子ＤＮＡ断片を利用する。方法前にまたは方法中に、ＲＮＡをＤＮＡに転写することも可能である。

上昇した発現または活性
本明細書に開示するように、上昇したＰＲＬ３発現は、癌患者の劣った予後の指標である。本明細書において、上昇した発現は増加した発現または高発現と交換可能に用いられる。

上昇した発現は、ＰＲＬ３タンパク質または核酸のレベルの増加を意味する。発現は、例えば特定の組織または細胞タイプ内で、例えば腫瘍内または骨髄内で、局所的にまたは全体として上昇していてもよく、あるいは患者の身体全体で上昇していてもよい。上昇した発現は、そのタンパク質または核酸の産生増加によって、あるいはそのタンパク質または核酸の除去または破壊の減少によって、あるいはその両方によって、引き起こされていてもよい。

上昇した活性は、タンパク質または核酸の量の増加によって、あるいは各個々の分子の活性の増加によって引き起こされていてもよい。これは、遺伝子またはタンパク質配列の突然変異、例えば活性化突然変異によって引き起こされてもよいし、あるいは翻訳後変化、例えば異常なタンパク質リン酸化のためであってもよい。

いくつかの場合、ＰＲＬ３の発現は、非癌個体または非癌組織の発現に比較して、患者または試料において有意に上方制御されている。
対照に比較したＰＲＬ３の過剰発現または活性増加は、劣った予後および劣った生存の指標である。ＰＲＬ３の非常に高い過剰発現または非常に高い活性は、非常に劣った予後、および非常に劣った生存の指標である。

いくつかの場合、対照の発現または活性より５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１５０％、２００％、３００％、４００％、５００％、７５０％または１０００％あるいはそれより高い割合は、劣った予後の指標である。

いくつかの場合、対照の発現または活性よりも１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、３５倍、４０倍、４５倍、５０倍、１００倍、またはそれより多い発現または活性は、劣った予後の指標である。

対照
いくつかの場合、方法は、１またはそれより多い対照試料におけるＰＲＬ３と、患者由来の試料におけるＰＲＬ３を比較する工程を含む。

比較は、対照試料の分析が、患者由来の試料の分析と同時にまたは連続して行われることを必要としない可能性もある。その代わり、比較は、対照試料から以前得られた結果、例えばデータベースに保存されている結果と行うことも可能である。

対照試料は、癌の開始前、または癌に関連する症状の観察前に、患者から得られた試料であることも可能である。
対照試料は、別の個体、例えば癌を持たない個体から得た試料であってもよい。個体は、１またはそれより多い特性、例えば性別、年齢、病歴、民族、体重または特定のマーカーの発現にしたがって、患者にマッチしていてもよい。対照試料は、身体の位置から得られていてもよいし、あるいは患者から得た試料と同じ組織または試料タイプのものであってもよい。

対照試料は、いくつかの異なる個体または組織に渡る代表値を提供する、試料のコレクションであってもよい。
ハイブリダイゼーション
本明細書に記載する特定の方法は、本明細書に記載するＰＲＬ３配列いずれかに、または上記のいずれかの相補体に、選択的にハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列を含む。ヌクレオチド配列は、長さ少なくとも１ヌクレオチド、例えば長さ少なくとも２０、３０、４０または５０ヌクレオチドであってもよい。

用語「ハイブリダイゼーション」は、本明細書において、「核酸鎖が塩基対形成を通じて相補鎖と連結するプロセス」、ならびにポリメラーゼ連鎖反応技術において行われるような増幅プロセスを含むものとする。

本明細書に提示するヌクレオチド配列に、またはその相補体に、選択的にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドは、一般的に、少なくとも２０、例えば少なくとも２５または３０、例えば少なくとも４０、６０または１００またはそれより多い連続ヌクレオチドの領域に渡って、本明細書に提示する対応するヌクレオチド配列に、少なくとも７０％、例えば少なくとも８０または９０％そして例えば少なくとも９５％または９８％相同であろう。

用語「選択的にハイブリダイズ可能」は、ターゲットポリヌクレオチドがバックグラウンドより有意に高いレベルでプローブにハイブリダイズすることが見出される条件下で、プローブとして用いられるポリヌクレオチドが用いられることを意味する。バックグラウンドハイブリダイゼーションは、例えばスクリーニングされているｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡライブラリー中に存在する他のポリヌクレオチドのために生じうる。この事象において、バックグラウンドは、ターゲットＤＮＡで観察される特異的相互作用よりも、１０倍、例えば１００倍強度が低い、プローブおよびライブラリーの非特異的ＤＮＡメンバーの間の相互作用によって生成されるシグナルレベルを示す。相互作用の強度は、例えばプローブの、例えば^３２Ｐでの放射標識によって測定可能である。

ハイブリダイゼーション条件は、ＢｅｒｇｅｒおよびＫｉｍｍｅｌ（1987, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, Vol 152, Academic Press, カリフォルニア州サンディエゴ）に解説されるように、核酸結合複合体の融解温度（Ｔｍ）に基づき、そして以下に説明するような、定義される「ストリンジェンシー」を与える。

本明細書記載のポリヌクレオチドを用いて、プライマー、例えばＰＣＲプライマー、代替増幅反応のためのプライマー、例えば放射性または非放射性標識を用いた慣用的手段によって明らかになる標識で標識されているプローブを産生することも可能であるし、あるいはポリヌクレオチドをベクターにクローニングしてもよい。こうしたプライマー、プローブおよび他の断片は、長さ少なくとも１５、例えば少なくとも２０、例えば少なくとも２５、３０または４０ヌクレオチドであろうし、そしてまた、本明細書に用いるような用語、ポリヌクレオチドによって含まれる。断片は、５００、２００、１００、５０、または２０ヌクレオチド未満であってもよい。

ポリヌクレオチド、例えばＤＮＡポリヌクレオチドおよびプローブを、組換え的、合成的、または当業者に明らかな任意の手段によって産生してもよい。また、これらを標準技術によってクローニングしてもよい。

一般的に、プライマーは、１回に１ヌクレオチドの望ましい核酸配列の段階的製造を伴う合成手段によって産生されるであろう。自動化技術を用いて、これを達成するための技術は、当該技術分野において、容易に利用可能である。

より長いポリヌクレオチドは、一般的に、組換え手段を用いて、例えばＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）クローニング技術を用いて、産生されるであろう。これは、クローニングが望ましい配列の領域に隣接するプライマー（例えば約１５〜３０ヌクレオチド）の対を作製し、プライマーを、動物またはヒト細胞から得られるｍＲＮＡまたはｃＤＮＡと接触させ、望ましい領域の増幅を達成する条件下でポリメラーゼ連鎖反応を実行し、増幅された断片を単離し（例えばアガロースゲル上で反応混合物を精製することによる）、そして増幅されたＤＮＡを回収することを含むであろう。プライマーが適切な制限酵素認識部位を含有し、したがって増幅されたＤＮＡが適切なクローニングベクター内にクローニングされるように、プライマーを設計してもよい。

癌
「癌」は、以下の任意の１またはそれより多くを含むことも可能である：急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、副腎皮質癌、肛門癌、膀胱癌、血液癌、骨癌、脳腫瘍、乳癌、女性生殖器系癌、男性生殖器系癌、中枢神経系リンパ腫、子宮頸癌、小児横紋筋肉腫、小児肉腫、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、結腸および直腸癌、結腸癌、子宮内膜癌、子宮内膜肉腫、食道癌、眼の癌、胆嚢癌、胃癌、胃腸管癌、毛様細胞白血病、頭頸部癌、肝細胞癌、ホジキン病、下咽頭癌、カポジ肉腫、腎癌、喉頭癌、白血病、白血病、肝臓癌、肺癌、悪性線維性組織球腫、悪性胸腺腫、黒色腫、中皮腫、多発性骨髄腫、骨髄腫、鼻腔および副鼻腔癌、鼻咽頭癌、神経系癌、神経芽腫、非ホジキンリンパ腫、口腔癌、中咽頭癌、骨肉腫、卵巣癌、膵臓癌、副甲状腺癌、陰茎癌、咽頭癌、下垂体腫瘍、形質細胞新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、前立腺癌、直腸癌、呼吸器、網膜芽細胞腫、唾液腺癌、皮膚癌、小腸癌、軟組織肉腫、胃癌、胃癌、精巣癌、甲状腺癌、泌尿器系癌、子宮肉腫、膣癌、血管系、ワルデンストレーム・マクログロブリン血症およびウィルムス腫瘍。

癌は特定のタイプのものであってもよい。癌のタイプの例には、星状細胞腫、癌腫（例えば腺癌、肝細胞癌、髄様癌、乳頭癌、扁平細胞癌）、神経膠腫、リンパ腫、髄芽腫、黒色腫、骨髄腫、髄膜腫、神経芽腫、肉腫（例えば血管肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫）が含まれる。

特定の好ましい態様において、予後診断しようとする癌は、白血病、より好ましくは急性骨髄性白血病である。
癌または白血病は、ＰＲＬ３発現癌または白血病である。すなわちＰＲＬ３陽性癌または白血病である。

白血病
白血病は、芽細胞と呼ばれる未成熟白血球の異常な増加によって特徴付けられる血液または骨髄の癌のタイプである。白血病の治療は、化学療法、医学的放射線療法、またはホルモン治療を伴う。

臨床的および病理的に、白血病は多様な大きな群に細分割される。急性白血病は、多くの未成熟血球数の迅速な増加によって特徴付けられる。慢性白血病は、相対的に成熟しているが、なお異常な白血球の、過剰な構築によって特徴付けられる。

リンパ芽球性白血病またはリンパ球性白血病において、癌性変化は、通常発生し、そしてリンパ球、通常はＢ細胞を形成するタイプの骨髄細胞において、起こる。骨髄または骨髄性白血病において、癌性変化は、通常発生し、赤血球、白血球のいくつかの他のタイプおよび血小板を形成するタイプの骨髄細胞において、起こる。

本明細書において、用語「白血病」には、骨髄腫およびリンパ球性白血病が含まれる。したがって、白血病には、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ球性白血病、毛様細胞白血病、Ｔ細胞前リンパ球性白血病、巨大顆粒リンパ球性白血病、および成人Ｔ細胞白血病が含まれる。

急性骨髄性白血病
急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）はまた、急性骨髄性白血病または急性非リンパ球性白血病（ＡＮＬＬ）としても知られる。骨髄中に集積し、そして正常血球の産生に干渉する、異常な白血球の迅速な増殖によって特徴付けられる、血球の骨髄性株の癌である。ＡＭＬは、成人が罹患する最も一般的な急性白血病であり、そしてその発症率は年齢と共に増加する。ＡＭＬは比較的稀な疾患であり、米国では癌の死亡のおよそ１．２％を占めるが、その発症率は、集団の年齢とともに増加すると予測される。

ＡＭＬの症状は、白血病細胞で正常骨髄を置換することによって引き起こされ、これによって、赤血球、血小板、および正常白血球の減少が引き起こされる。これらの症状には、疲労、息切れ、あざおよび出血の起こりやすさ、ならびに感染リスクの増加が含まれる。

ＡＭＬ診断の最初の手がかりは、典型的には、全血球数の異常な結果であり、一方、過剰な異常白血球（白血球増加症）は、一般的な知見である。ＡＭＬの推定診断は、末梢血スメアの検査を通じて行われる可能性があり、この際、循環白血病芽細胞がある場合、確定診断は、通常、適切な骨髄吸引物および生検を必要とする。例えば光学顕微鏡またはフローサイトメトリーによって、骨髄または血液を調べて、白血病の存在を診断し、他のタイプの白血病からＡＭＬを区別し、そして疾患のサブタイプを分類する。試料は、典型的にはまた、染色体異常に関して試験される。

慢性骨髄性白血病
慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）はまた、慢性顆粒球性白血病（ＣＧＬ）としても知られる。これは、骨髄における主に骨髄細胞の増加したそして制御されない増殖、ならびに血中のこれらの細胞の集積によって特徴付けられる白血病の型である。ＣＭＬは、成熟顆粒球（好中球、好酸球および好塩基球）およびその前駆体の増殖が見られる、クローン性骨髄幹細胞障害である。これは、フィラデルフィア染色体と呼ばれる特徴的な染色体転位置と関連する骨髄増殖性疾患のタイプである。ＣＭＬは、現在、チロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）と呼ばれるターゲティング薬剤、例えばグリーベック／グリベック（イマチニブ）、スプリセル（ダサチニブ）、タシグナ（ニロチニブ）、またはボスリフ（ボスチニブ）で大部分が治療されており、２００１年のグリーベックの導入以来、長期生存率（９５．２％）の劇的な改善が導かれてきている。これらの薬剤は、この疾患の治療を改革し、そして以前の化学療法薬剤と比較して、大部分の患者が優れた生活の質を有することを可能にしている。

本発明者らは、遺伝子発現アトラス（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｇｘａ／ｇｅｎｅ／ＥＮＳＧ０００００１８４４８９）の分析を通じて、ＰＲＬ−３の発現レベルが、３２の異なるタイプの癌を含む９５０のヒト癌細胞株の中で、慢性骨髄性白血病２（ＣＭＬ）で最高であると決定し、これによって、ＣＭＬ病因におけるＰＲＬ−３の潜在的な役割もまた示唆された。

ＦＬＴ３
Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ−３）はまた、分化抗原クラスター１３５（ＣＤ１３５）としても知られる。ＦＬＴ３は、受容体チロシンキナーゼクラスＩＩＩに属するサイトカイン受容体である。該分子は、多くの造血前駆細胞の表面上に発現される。Ｆｌｔ３のシグナル伝達は、造血幹細胞および前駆細胞の正常発生に重要である。ＦＬＴ３は、以下のＵｎｉｇｅｎｅ参照にしたがった配列を有する：

ＦＬＴ３の活性化突然変異は、ＡＭＬにおけるより頻繁な遺伝子改変の１つであり、ＦＬＴ３の膜近傍（ＪＭ）ドメインにおける内部タンデム複製（ＩＴＤ）を伴う（Ｎａｋａｏら、１９９６）。ＦＬＴ３−ＩＴＤの恒常的活性化は、多数の下流シグナル伝達経路の上昇し、そして維持される活性化を導き、最終的に、造血細胞の増殖因子非依存性増殖への形質転換を生じる（Ｍｉｚｕｋｉら、２０００）。高レベルの野生型ＦＬＴ３もまた、ＦＬＴ３突然変異を持たない何人かのＡＭＬ患者の芽細胞に関して報告されてきている。ＡＭＬ細胞における本質的な増殖促進性および抗アポトーシス性の役割のため、ＦＬＴ３における活性化突然変異は、ＡＭＬ治療の有望な分子ターゲットとして提唱されてきている。

本明細書に開示するように、ＰＲＬ３は、ＦＬＴ３−ＩＴＤ突然変異を有する患者において、劣った予後の指標である。したがって、本明細書に記載するいくつかの例において、ＦＬＴ３−ＩＴＤ陽性ＡＭＬを有する患者から得た試料に対して、該方法を実行する。方法は、試料がＦＬＴ３−ＩＴＤ陽性試料であるかどうかを決定する工程を含んでもよい。患者は以前、ＦＬＴ３−ＩＴＤ陽性であると決定されていてもよい。

リニファニブ（ＡＢＴ−８６９）は、アミノベンゾピラゾールに基づくＡＴＰ競合性受容体チロシンキナーゼ阻害剤である。リニファニブは、ＦＬＴ３阻害剤と同定されてきている。リニファニブは、ある範囲の癌、例えばＡＭＬ、結腸直腸癌および小細胞肺癌の治療に提唱されている。ＦＬＴ３阻害に基づく他の療法剤には、スニチニブ（ＳＵ１１２４８、スーテント^ＴＭ）、レスタウルチニブ（ｒＩＮＮ、ＣＥＰ−７０１）およびキザルチニブ（ＡＣ２２０）が含まれる。

本明細書に記載するいくつかの場合、患者は、ＦＬＴ３阻害療法を受けたことがある。患者は、他の療法もまた受けたことがあってもよく、例えばＳＡＨＡ（スベロイルアニリドヒドロキサム酸）、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤での治療を受けたことがあってもよい。いくつかの場合、患者は療法に反応していないか、または部分的にしか反応していない。したがって、療法は、癌またはその症状の減少または除去を生じていない可能性もある。

療法
本明細書に記載するのは、白血病の治療法および抗ＰＲＬ３抗体を用いた治療法を含む治療法である。抗ＰＲＬ３剤および抗ＰＲＬ３抗体を含む、こうした方法で使用するための剤もまた、癌のための薬剤製造におけるこうした剤の使用とともに開示する。

本明細書に記載する方法および組成物は、治療を受けたことがない個体に比較して、治療を適用された個体において、測定可能な基準での改善を適切に可能にする。用語「治療」によって、本発明者らはまた、癌の予防または軽減も含むことを意味する。

本明細書に開示する治療法は、癌の治療、例えば白血病の治療のためであってもよい。治療は、癌の症状の軽減を生じることも可能であるし、または癌の完全な治療を生じることも可能である。治療は癌の進行を遅延させることも可能であるし、または癌の症状の悪化を防止することも可能である。

やはり開示するのは、本明細書に開示する治療の方法において有用な剤を含む薬剤である。薬剤は、抗ＰＲＬ３剤、例えば抗ＰＲＬ３抗体を含むことも可能である。
本発明の側面にしたがった薬剤および薬学的組成物を、限定されるわけではないが、非経口、静脈内、動脈内、筋内、腫瘍内、口腔および鼻を含むいくつかの経路による投与のために配合することも可能である。薬剤および組成物を液体または固体型で配合してもよい。液体配合物を、ヒトまたは動物の身体の選択した領域への注射による投与のために配合してもよい。

投与は、好ましくは、個体への利益を示すために十分な「療法的有効量」である。投与する実際の量、ならびに投与速度および時間的経過は、治療中の疾患の性質および重症度に応じるであろう。治療の処方、例えば投薬量等に関する決定は、開業医および他の医師の責任の範囲内であり、そして典型的には、治療される障害、個々の患者の状態、送達部位、投与法および医師に知られる他の要因を考慮する。上述の技術およびプロトコルの例は、Remington’s Pharmaceutical Sciences, 第２０版， 2000, Lippincott, Williams & Wilkins刊行に見出されうる。

治療は、１より多い療法剤の投与を伴ってもよい。治療しようとする状態に応じて、剤を単独で、または他の治療と組み合わせて、同時にまたは連続してのいずれかで投与してもよい。例えば、治療は、１またはそれより多くが癌を治療することを意図しうる、２つの剤の投与を伴う共療法であってもよい。したがって、抗ＰＲＬ３抗体を、別の薬剤、例えば化学療法剤、プロドラッグ、抗体またはホルモン治療とともに投与してもよい。治療はさらに、放射療法を伴ってもよい。

抗ＰＲＬ３抗体
ＰＲＬ３に結合するであろう抗体がすでに知られている。例えば、Ｊｉｅ Ｌｉら、２００５に開示される通りである。

抗原結合部分は、抗体の一部（例えばＦａｂ断片）または合成抗体断片（例えば一本鎖Ｆｖ断片［ＳｃＦｖ］）であってもよい。選択した抗原に対する適切なモノクローナル抗体を、既知の技術、例えば“Monoclonal Antibodies: A manual of techniques”， H Zola(CRC Press, 1988)および“Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications”， J G R Hurrell(CRC Press, 1982)に開示されるものによって調製されることも可能である。キメラ抗体は、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら（1988, 8th International Biotechnology Symposium Part 2, 792-799）によって議論される。

モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、本発明の方法において有用であり、そして抗原上の単一のエピトープを特異的にターゲティングする抗体の均一な集団である。当該技術分野に周知の方法を用いて、適切なモノクローナル抗体を調製することも可能である（例えば、Koehler, G.;Milstein, C.(1975).“あらかじめ定義した特異性の抗体を分泌する、融合細胞の連続培養”． Nature 256(5517): 495；Siegel DL(2002).“組換えモノクローナル抗体技術”．Schmitz U,Versmold A,Kaufmann P,Frank HG(2000)；“ファージディスプレイ：抗体生成のための分子ツール−−概説”． Placenta. 21 Suppl A: S106-12．Helen E.ChaddおよびSteven M.Chamow;“療法抗体発現技術，”Current Opinion in Biotechnology 12,第２号（２００１年４月１日）:188-194;McCafferty, J.; Griffiths, A.; Winter, G.; Chiswell, D. (1990).“ファージ抗体：抗体可変ドメインをディスプレイする糸状ファージ”． Nature 348 (6301): 552-554;“モノクローナル抗体：技術マニュアル”， H Zola(CRC Press, 1988)および“モノクローナルハイブリドーマ抗体：技術および適用”， J G R Hurrell(CRC Press, 1982)を参照されたい。キメラ抗体は、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら（1988, 8th International Biotechnology Symposium Part 2, 792-799）に記載される）。

ポリクローナル抗体は、本発明の方法に有用である。単一特異性ポリクローナル抗体が好ましい。当該技術分野に周知の方法を用いて、適切なポリクローナル抗体を調製することも可能である。

抗体断片、例えばＦａｂおよびＦａｂ_２断片もまた使用可能であり、遺伝子操作抗体および抗体断片も使用可能である。抗体の可変重鎖（Ｖ_Ｈ）および可変軽鎖（Ｖ_Ｌ）ドメインが抗原認識に関与し、この事実は、先のプロテアーゼ消化実験によって最初に認識された。さらなる確証は、齧歯類抗体の「ヒト化」によって見出された。生じる抗体が、齧歯類親抗体の抗原特異性を保持するように、齧歯類起源の可変ドメインをヒト起源の定常ドメインに融合させてもよい（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら（１９８４） Proc. Natl. Acad. Sd. USA 81, 6851-6855）。

抗原特異性は、可変ドメインによって与えられ、そして定常ドメインに独立であることは、すべて１またはそれより多い可変ドメインを含有する抗体断片の細菌発現を伴う実験から知られる。これらの分子には、Ｆａｂ様分子（Ｂｅｔｔｅｒら（１９８８） Science 240, 1041）； Ｆｖ分子（Ｓｋｅｒｒａら（１９８８）Science 240, 1038）；Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌパートナードメインが、柔軟なオリゴペプチドを通じて連結されている一本鎖Ｆｖ（ＳｃＦｖ）分子（Ｂｉｒｄら（１９８８） Science 242, 423；Ｈｕｓｔｏｎら（１９８８） Proc. Natl. Acad. Sd. USA 85, 5879）ならびに単離されたＶドメインを含む単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）（Ｗａｒｄら（１９８９） Nature 341, 544が含まれる）。特異的結合部位を保持する抗体断片の合成に関与する技術の一般的な概説は、ＷｉｎｔｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９９１） Nature 349, 293-299に見出される。

「ＳｃＦｖ分子」によって、本発明者らは、Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌパートナードメインが、例えば直接、ペプチドによってまたは柔軟なオリゴペプチドによって共有結合される分子を意味する。Ｆａｂ、Ｆｖ、ＳｃＦｖおよびｄＡｂ抗体断片は、すべて、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）において発現され、そしてそこから分泌されることが可能であり、したがって、前記断片を多量に容易に産生することが可能である。

全抗体、およびＦ（ａｂ’）_２断片は、「二価」である。「二価」によって、本発明者らは、前記抗体およびＦ（ａｂ’）_２断片が２つの抗原結合部位を有することを意味する。対照的に、Ｆａｂ、Ｆｖ、ＳｃＦｖおよびｄＡｂ断片は、１つの抗原結合部位しか持たない、一価である。ＰＲＬ３に結合する合成抗体もまた、当該技術分野に周知であるようなファージディスプレイ技術を用いて作製可能である（例えば、“ファージディスプレイ：抗体生成のための分子ツール−−概説”． Placenta. 21 Suppl A: S106-12. Helen E. ChaddおよびSteven M. Chamow；“ファージ抗体：抗体可変ドメインをディスプレイする糸状ファージ”． Nature 348 (6301): 552-554を参照されたい）。

いくつかの好ましい態様において、抗体は、検出可能に標識されるか、または少なくとも検出可能である。例えば、抗体を放射性原子または着色分子または蛍光分子または任意の他の方式で容易に検出可能な分子で標識してもよい。適切な検出可能分子には、蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ、酵素基質、および放射標識が含まれる。抗体は、検出可能標識で直接標識されてもよいし、または間接的に標識されてもよい。例えば、抗体を標識しなくてもよく、そしてそれ自体が標識されている別の抗体によって検出してもよい。あるいは、第二の抗体がビオチンに結合していてもよく、そして標識ストレプトアビジンのビオチンへの結合を用いて、第一の抗体を間接的に標識する。

本明細書に開示する抗体は、ＰＲＬ−３に結合する。ＰＲＬ３は細胞内腫瘍性タンパク質である。したがって、本発明記載の抗ＰＲＬ３抗体は、細胞に進入することが可能でありうる。例えば、抗体は、形質膜を横断して、細胞内環境において、細胞内のＰＲＬ３に結合することが可能でありうる。抗体は、ＰＲＬ３の生物学的活性、例えばプロテインチロシンホスファターゼ（ＰＴＰ）活性を阻害可能である。

抗体は、エピトープＫＡＫＦＹＮおよび／またはＨＴＨＫＴＲに結合可能な抗体であってもよい。抗体は、Ｌｉら、２００５に報告されるようなハイブリドーマ・クローン２２３またはハイブリドーマ・クローン３１８由来のマウス抗ＰＲＬ３抗体と同一の配列を有する抗体であってもよい。抗体は、Ｌｉら、２００５に記載されるハイブリドーマ・クローン２２３またはハイブリドーマ・クローン３１８由来の抗体とのターゲット結合に関して競合することも可能である。抗体は、図１６に示すような重鎖および／または軽鎖可変ドメイン配列を有する抗体であってもよい。抗体はヒト化抗体、キメラ抗体または完全ヒト抗体であってもよい。抗体は、本明細書記載の抗体に相同であってもよい。

上に示すように、配列同一性に関して、「相同体」は、適切な配列に対して、例えば少なくとも５％同一性、少なくとも１０％同一性、少なくとも１５％同一性、少なくとも２０％同一性、少なくとも２５％同一性、少なくとも３０％同一性、少なくとも３５％同一性、少なくとも４０％同一性、少なくとも４５％同一性、少なくとも５０％同一性、少なくとも５５％同一性、少なくとも６０％同一性、少なくとも６５％同一性、少なくとも７０％同一性、少なくとも７５％同一性、少なくとも８０％同一性、少なくとも８２％同一性、少なくとも８４％同一性、少なくとも８６％同一性、少なくとも８８％同一性、少なくとも９０％同一性、少なくとも９２％同一性、少なくとも９４％同一性、少なくとも９６％同一性、または少なくとも９８％同一性を有する。適切な配列は、ＣＤＲ配列、あるいは重鎖および／または軽鎖可変鎖の配列に渡ってもよい。

本発明の側面および態様を、ここで、実施例によって、不随する図を参照しながら例示する。さらなる側面および態様は、当業者に明らかであろう。

材料および方法
細胞株および初代患者試料
ＴＦ−１およびＭＶ４−１１細胞をＡＴＣＣ（アメリカンタイプカルチャーコレクション、ヴァージニア州マナサス）から購入した。ＭＯＬＭ−１４細胞株を自社で得た。熱不活化１０％ウシ胎児血清（Hyclone Laboratories, Inc.、ユタ州ローガン）を補充し、そして２ｎｇ／ｍｌヒトＩＬ−３（Ｒ＆Ｄ System Inc.、ミネソタ州ミネアポリス）を補充したＲＰＭＩ １６４０（Invitrogen、カリフォルニア州カールスバッド）中で、ＴＦ−１細胞を培養した。ＴＦ１−ＩＴＤおよびＴＦ１−ＰＲＬ−３細胞を先に記載されるように調製した（Ｋｉｍら、２００５；Ｚｈｏｕら、２０１１）。シンガポール国立大学病院の新規に診断されたＡＭＬ患者から、書面のインフォームドコンセントとともに、骨髄（ＢＭ）芽細胞を得た。この研究は、シンガポール国立大学施設内倫理委員会（ＩＲＢ）によって認可された。

化学薬品および試薬
ＦＬＴ３阻害剤（ＰＫＣ４１２）、ＭＥＫ阻害剤（Ｕ０１２６）、ｐ３８ ＭＡＰＫ阻害剤（ＳＢ２０３５８０）、およびＪＮＫ阻害剤（ＳＰ６００１２５）をＬＣ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（マサチューセッツ州ウォバーン）から購入した。ＦＬＴ３阻害剤（ＣＥＰ−７０１）およびＳｒｃキナーゼ阻害剤（ＳＵ６６５６およびＰＰ２）を、Ｓｉｇｍａ（ミズーリ州セントルイス）より購入した。ＦＬＴ３、ＳＴＡＴ５、ＪＡＫ２、Ｓｒｃ、ＥＲＫ、ｃ−Ｊｕｎ、ｐＦＬＴ３、ｐＪＡＫ２、ｐＳＴＡＴ５、ｐＳｒｃおよびｐ−ｃ−Ｊｕｎを、Cell Signalling Technologies（マサチューセッツ州ビバリー）より購入した。ＧＡＰＤＨ抗体をMillipore（マサチューセッツ州ビレリカ）より得た。抗ＣＤ４５−ＡＰＣおよびＬｉｇｈｔＳｈｉｆｔ化学発光ＥＭＳＡキットを、Pierce Biotechnology, Inc.（イリノイ州ロックフォード）より得た。マウス抗ＰＲＬ３抗体は、以前報告されたようにハイブリドーマクローン３１８より得た（Ｌｉら、２００５）。分泌アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）レポーターアッセイキットをClontech（カリフォルニア州パロアルト）より、そしてＰｈｏｓｐｈａ−Ｌｉｇｈｔ^ＴＭをApplied Biosystems（マサチューセッツ州ベッドフォード）より購入した。

ＲＴ−ＰＣＲによるＦＬＴ３−ＩＴＤ突然変異およびＰＲＬ−３の発現の検出
製造者の指示にしたがって、ＲＮｅａｓｙミニキット（Qiagen、カリフォルニア州チャツワース）を用いて、ＡＭＬ患者の骨髄細胞から総ＲＮＡを抽出した。逆転写酵素ＩＩＩ（Invitrogen、カリフォルニア州カールスバッド）によって総ＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、そして以前記載されるように、ＰＣＲによって増幅した（Ｑｕｅｎｔｍｅｉｅｒら、２００３）。ＲＴ−ＰＣＲのプライマーセットを要約した；ＦＬＴ３−ＩＴＤ、５’−ＧＣＡＡＴＴＴＡＧＧＴＡＴＧＡＡＡＧＣＣＡＧＣ−３’および５’−ＣＴＴＴＣＡＧＣＡＴＴＴＴＧＡＣＧＧＣＡＡＣＣ−３’、ＰＲＬ−３、５’−ＧＧＧＡＣＴＴＣＴＣＡＧＧＴＣＧＴＧＴＣ−３’および５’−ＡＧＣＣＣＣＧＴＡＣＴＴＣＴＴＣＡＧＧＴ−３’、そしてβ−アクチン遺伝子は５’−ＧＴＧＧＧＧＣＧＣＣＣＣＡＧＧＣＡＣＣＡ−３’および５’−ＣＴＣＣＴＴＡＡＴＧＴＣＡＣＧＣＡＣＧＡＴＴＴＣ−３’であった。ＰＣＲ産物を５％ポリアクリルアミドゲル上で分析し、エチジウムブロミドで染色し、そして次いで、ＧｅｌＤｏｃ画像化装置（BioRad Inc.、カリフォルニア州ハーキュルス）で視覚化した。

定量的リアルタイムＰＣＲ
定量的リアルタイムＰＣＲ（Ｑ−ＲＴ−ＰＣＲ）を用いて、ヒトＢＭ試料およびＡＭＬ細胞株でのＰＲＬ−３のｍＲＮＡ発現レベルを測定した（ＡＢＩ ７５００迅速リアルタイムＰＣＲ系）。ｃＤＮＡは、ＴａｑＭａｎ（登録商標）Universal PCR Master Mixキット（Applied Biosystems、カリフォルニア州フォスターシティー）を用いることによるＱ−ＲＴ−ＰＣＲのテンプレートとして働いた。定量的ＰＣＲ反応混合物各１０μｌは、５μｌの２× ＴａｑＭａｎ（登録商標）Universal Master Mixture（Applied Biosystems）、４．５μｌの希釈ｃＤＮＡ混合物、および０．５μｌの遺伝子特異的プローブを含有した。選択したターゲット遺伝子の定量化を標準化するため、ＧＡＰＤＨが内部対照として働き、そしてターゲット遺伝子と同じプレート上で定量化した。

ウェスタンブロット分析
修飾ＲＩＰＡ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ ＮＰ−４０、ｐＨ ８．０、１ｘプロテアーゼ阻害剤カクテル）を用いて細胞を溶解し、そして溶解物を、示す一次抗体とともに、ウェスタンブロッティングに供した。化学発光検出キット（Pierce、Thermo Scientific、イリノイ州ロックフォード）を用いて、抗体によって認識されるタンパク質を検出した。

ｓｉＲＮＡまたはレポーターベクターの一過性トランスフェクション
ＴＦ−１、ＴＦ１−ＩＴＤ、ＭＯＬＭ−１４、またはＭＶ４−１１細胞を、１００μＬの適切なＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒキット溶液（Amaxa Biosystems、ドイツ・ケルン）あたり、２ｘ１０^６細胞で再懸濁し、そして２μｇのＦＬＴ３ ＳＭＡＲＴｐｏｏｌ ｓｉＲＮＡ二重鎖（Dharmacon Research、Milipore）、ＰＲＬ−３ ｓｉＲＮＡ、シグナルサイレンスＳＴＡＴ５ ｓｉＲＮＡ Ｉ／ＩＩ（Cell Signalling Technologies）、ＡＰ−１ ＳＥＡＰレポーターベクター、ＥＲＫ ｓｉＲＮＡ、ＪＮＫ ｓｉＲＮＡまたは非サイレンシングｓｉＲＮＡ（Santa Cruz Biotechnology、カリフォルニア州）を用いてヌクレオフェクション処理した。ヌクレオフェクション後、細胞を直ちに５００μｌのあらかじめ温めた培地と混合し、そしてインキュベーションのため、培養プレートに移した。上述のように、タンパク質抽出のため、試料を収集した。

電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）
転写因子データベース（ＴＲＡＮＳＦＡＣ）（Ｗｉｎｇｅｎｄｅｒら、１９９６）を用いて、ヒトＰＲＬ−３プロモーター領域上のありうる転写因子結合部位を予測した。ＮＥ−ＰＥＲ核タンパク質抽出キット（Pierce、Thermo Scientific）を用いて、核抽出物を調製した。ＥＭＳＡプローブに関しては、長さ３０ｂｐのＤＮＡオリゴヌクレオチドの相補的センスおよびアンチセンス鎖をアニーリングさせて、そして５０ｆｍｏｌ／μｌに希釈した。ＤＮＡプローブ（５０ｆｍｏｌ／μｌ）および核抽出物をＥＭＳＡ緩衝液［５０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１％グリセロール、０．０１％ ＮＰ−４０、１ｍＭ ＤＴＴ、および０．１ｍｇ／ｍｌポリ（ｄＩ−ｄＣ）］と混合し、そして室温で３０分間インキュベーションした。競合反応において、非標識競合剤を、ビオチン化プローブの少なくとも１０：１モル過剰で添加した。反応混合物を非変性ゲル上で泳動し、そしてＬｉｇｈｔＳｈｉｆｔ化学発光ＥＭＳＡ検出キットによって視覚化した。本研究で用いたプローブ配列（センス鎖）には以下が含まれた； Ｓ１、５’−ＧＧＴＧＡＴＧＴＴＴＴＣＴＧＧＡＡＧＴＧＴＧＧＧＴ−３’、Ｓ２、５’− ＣＣＡＴＡＡＧＴＴＣＴＴＧＧＡＡＧＣＴＧＣＧＧＣＴＴ−３’およびＳＴＡＴ５競合剤配列、５’−ＡＧＡＴＴＴＣＴＡＧＧＡＡＴＴＣＡＡＴＣＣ−３’。

ルシフェラーゼレポーターアッセイ
ＰＲＬ−３の−５．４ｋｂ上流領域（−５５５６〜−５３３１、Ｓ１ａ、転写開始部位から番号付け）およびその５’連続欠失断片（−５４７２〜−５３３１、−５４４０〜−５３３１、および−５３９９〜−５３３１；それぞれ、Ｓ１ｂ、Ｓ１ｃ、およびＳ１ｄ）をｐＧＬ−Ｌｕｃ基本ベクター内にサブクローニングした。ＳＴＡＴ５ＡおよびＳＴＡＴ５Ｂ発現ベクターを、OriGene Technologies, Inc（メリーランド州ロックビル）より購入した。ＴＦ−１細胞を、６ウェルプレートに植え付け、そしてヌクレオフェクション法によって、１．５μｇの適切なルシフェラーゼレポーター構築物とともに、ＳＴＡＴ５ＡまたはＳＴＡＴ５Ｂの発現ベクターでトランスフェクションした（Ｌｏｎｚａ Ｃｏｌｏｇｎｅ ＡＧ、スイス）。レニラ（renilla）ルシフェラーゼ活性にしたがって、トランスフェクション効率を規準化することによって、相対ホタル（firefly）ルシフェラーゼ活性を計算する、二重ルシフェラーゼレポーター系（Promega、ウィスコンシン州マディソン）を用いて、ルシフェラーゼアッセイを行った。ＳＴＡＴ５ＡまたはＳＴＡＴ５Ｂの発現レベルを決定した。

分泌アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）アッセイ
ＡＰ−１レポーターベクター（ＡＰ１−ＳＥＡＰ）をClontechから購入した。ＴＦ１−ＧＦＰ細胞およびＴＦ１−ＰＲＬ−３細胞を２００ｎｇのＡＰ１−ＳＥＡＰベクターでトランスフェクションし、そして２４時間インキュベーションした。培養上清を収集し、６５℃で３０分間加熱し、そして以下のようにアルカリホスファターゼ活性に関してアッセイした； ３０μｌの上清を１２０μｌのアッセイ緩衝液と５分間インキュベーションし、その時点で、１：２０希釈したＣＳＰＤ基質を添加し、そしてＴＥＣＡＮマイクロプレート読み取り装置（Maennedorf、スイス）上で試料を読み取った。

細胞生存アッセイ
ＡＭＬ細胞（１ｘ１０^４）を、１００μｌ増殖培地中、９６ウェル組織培養プレートの各ウェル内に植え付け、そしてＣｅｌｌＴｉｔｅｒ^９６水性細胞増殖アッセイキット（Promega）を用いて、７２時間、異なる阻害剤とともに植え付けた後、生存細胞を測定した。簡潔には、２０μｌ ＭＴＳ混合物のアリコットを、アッセイの示す時間で添加し、そして３７℃で２時間反応を行った。そしてＴＥＣＡＮマイクロプレート読み取り装置を用いて、４９０ｎｍの波長で、吸光度を読み取った。細胞数および各細胞株由来の吸光度の間の直線関係を確立した後、獲得された吸光度を細胞数に変換した。

細胞周期分析
ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で染色し、そしてフローサイトメトリー（BDLSR11、Becton Dickinson、カリフォルニア州サンノゼ）によって分析することによって、培養細胞のＤＮＡ含量を定量化した。簡潔には、細胞をＰＢＳで採取し、そして７０％冷エタノールを用いて４℃で３０分間固定した。細胞をＰＢＳで洗浄し、そして次いで、５００μのＰＩ染色溶液中に再懸濁し、そして室温で３０分間インキュベーションした。次いで、細胞周期に関して試料を調べ、そして分析した（Modfit LT2.0、Becton Dickinson）。

アネキシン−Ｖおよび７−アミノアクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ）染色
サイトカイン補充なしに４８時間培養した後、ＴＦ１−ＧＦＰおよびＴＦ１−ＰＲＬ−３細胞を、ＰＢＳで採取した。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、そしてアネキシン−Ｖおよび７−ＡＡＤ染色溶液と室温で３０分間インキュベーションした。染色後、細胞をＦＡＣＳ分析に供した。

細胞株生成
ＰＲＬ−３ノックダウン細胞株を生成するため、ｐＲＳ−ＰＲＬ−３−ｓｈＲＮＡ（OriGene Technologies、メリーランド州ロックビル）をＴＦ１−ＩＴＤ細胞内にトランスフェクションした。生じたＰＲＬ−３−ＫＤ細胞株を、ピューロマイシンで選択し、そしてウェスタンブロット分析によって確認した。ＴＦ１−ＩＴＤ ＰＲＬ−３−ＫＤ細胞を、マウス注射のために用いた。

マウスモデルにおける抗白血病効果
先に記載されるような（Ｇｕｏら、２００８）すべての動物研究は、施設動物飼育使用委員会（ＩＡＣＵＣ）によって認可されてきている。本発明者らは、シンガポール科学技術研究所動物施設センター（Ａ^＊ ＳＴＡＲ）のポリシーにしたがった。生物資源センター（Ａ^＊ ＳＴＡＲ、シンガポール）からＢａｌｂ／ｃヌードマウスを得た。ヌードマウスに、１ｘ１０^６ ＴＦ１−ＩＴＤ細胞を静脈内注射した。３日後、マウスをランダムに３つの処置群に分け；ＩｇＧ（偽処置、ｎ＝１１）、ＰＲＬ−３ ｍＡｂ（ＰＲＬ−３処置、ｎ＝１１）、およびＦＬＴ３ ｍＡｂ（ＦＬＴ３処置、ｎ＝１１）を週２回注射した。生存研究のため、ＩｇＧ処置（ｎ＝７）、またはＰＲＬ−３ ｍＡｂ処置（ｎ＝７）したマウスを用い、そして毎日観察した。ＴＦ−１細胞を注射したマウスを、ＴＦ１−ＩＴＤ細胞を注射したマウスの対照として用いた。臓器を単離し、そして実験の最後に、巨視的転移に関して調べた。（Ｇｕｏら、２００８）。

ヒト白血病細胞生着分析
ヌードマウスに、１ｘ１０^６ ＴＦ−１、ＴＦ１−ＩＴＤ、またはＴＦ１−ＩＴＤ ＰＲＬ−３ ＫＤ細胞を静脈内注射した。ＴＦ１−ＩＴＤ細胞を注射したマウスを２群に分け、そして対照ＩｇＧまたはＰＲＬ−３ ｍＡｂで週２回処置した。実験終了時、骨髄細胞を単離し、そしてヒト特異的造血細胞表面マーカー、ＣＤ４５−ＡＰＣ抗体（Pierce、Thermo Scientific）で染色し、そしてフローサイトメトリーによって分析した。

ＡＭＬ癌患者マイクロアレイデータの分析
本研究に用いたすべてのヒトＡＭＬ患者のデータセットの詳細を以下に要約した。総数５つの独立のＡＭＬ患者データセットを分析した：１）英国ベルファストのＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｕ１３３Ｐｌｕｓ２アレイ上で分析した本発明者らの未公表データセット（コホート１）； ２） ＧＥＯアクセス可能ＧＳＥ１１５９データセット（Ｖａｌｋら、２００４）； ３） ＧＥＯアクセス可能ＧＳＥ６８９１データセット（Ｖｅｒｈａａｋら、２００９）； ４） ＧＥＯアクセス可能ＧＳＥ１５４３４データセット（Ｋｏｈｌｍａｎｎら、２０１０）；および５） ＧＥＯアクセス可能ＧＳＥ１２４１７データセット（Ｍｅｔｚｅｌｅｒら、２００８）。図１０は、各データセットにおいて利用可能な情報、および生データを用いたこの報告中の図の番号を示す。規準化のため、ＲおよびＢｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒを用いて、データセットを前プロセシングした。ＰＲＬ−３高レベルおよび低レベルを区別するため、カットオフポイントとして中央値を用いた（２つのＰＲＬ−３プローブ； ２０６５７４および２０９６９５の平均）。ＳＰＳＳ１９．０（ＩＢＭ、シンガポール）を用いて、統計分析を行った。Ｆｉｓｈｅｒの直接検定、または適用可能な場合、カイ二乗検定によって、ＰＲＬ−３発現およびＦＬＴ３−ＩＴＤ突然変異状態の間の相関を分析した。ＰＲＬ−３発現および生存時間の間の関連を、ログランク検定によって比較されるカプラン−メイヤー分析によって分析した。ｐ＜０．０５を有意と見なした。ｐ＞０．０５の除去限界を伴う後ろ向き条件付段階的選択を含むコックス回帰分析を行って、ＡＭＬ患者生存に関する独立の予測因子を同定した。

ＰＲＬ−３は、ＦＬＴ３−ＩＴＤ突然変異を有するＡＭＬ患者において、しばしば上方制御される
ＰＲＬ−３過剰発現およびＦＬＴ３−ＩＴＤ突然変異の間の相関を調べるため、ＦＬＴ３−ＩＴＤ突然変異を持つまたは持たないＡＭＬ患者由来の１９の骨髄試料を分析した。ＡＭＬにおけるＰＲＬ−３上方制御の発生率は、ＦＬＴ３−ＩＴＤ突然変異を持たない場合の１２症例のうち３例（２５％）に比較して、ＦＬＴ３−ＩＴＤ突然変異と有意に関連する（７つの症例のうち５つ、７１．４％）ことが見出された（Ｆｉｓｈｅｒの直接検定、ｐ＜０．０５；図１Ａ）。同様に、２つのＦＬＴ３−ＩＴＤ陽性細胞株（ＭＯＬＭ−１４およびＭＶ４−１１）において、高いＰＲＬ−３発現が観察された（図１Ａ）。同じ患者由来のＰＲＬ−３ ｍＲＮＡの定量的リアルタイムＰＣＲ分析によって、より高いＰＲＬ−３ ｍＲＮＡ発現は、ＦＬＴ３−ＩＴＤ突然変異を有するＡＭＬ患者と関連することを裏付けた（図１１）。この知見を拡張して、本発明者らは、総数２２１人のＡＭＬ患者からなる、本発明者らの未公開ベルファスト／ＭＩＬＥデータセット（コホート１）を分析した。このうち、正常核型を持つ１０１人の患者を用いて、ＰＲＬ−３発現レベルおよびＦＬＴ３−ＩＴＤ突然変異状態の間の関係を分析した。ＦＬＴ３−ＩＴＤ陰性ＡＭＬ患者のわずか１０％が、「非常に高い」ＰＲＬ−３を発現し（カイ二乗検定、ｐ＜０．００１）、一方、４０％のＦＬＴ３−ＩＴＤ陽性患者は、「非常に高い」ＰＲＬ−３（黒いブロック、図１Ｂ、ａ）を発現した。本発明者らの観察は、ＰＲＬ−３発現が、３つの独立のデータセットにおいて、ＦＬＴ３−ＩＴＤ突然変異に関して陰性である患者に比較して、ＦＬＴ３−ＩＴＤ突然変異に関して陽性であるＡＭＬ患者において、有意により高いことが観察される、３つの独立の公的に入手可能なＡＭＬ患者データベース（ＧＳＥ１１５９ ｎ ＝ ２８５、ＧＳＥ６８９１ ｎ＝５２１、およびＧＳＥ１５４３４ ｎ＝２５１）においてさらに実証された（図１Ｂ、ｂ〜ｄ； ｐ＜０．００１）。要約すると、４つの別個のＡＭＬ患者のコホートの本発明者らの分析は、総数１１５８人のＡＭＬ患者において、ＦＬＴ３−ＩＴＤ突然変異および高いＰＲＬ−３発現の間の強い関連を示す。

これらの結果は、ＦＬＴ３シグナル伝達が、ＡＭＬ患者において、ＰＲＬ−３過剰発現を導きうることを示す。臨床データを検証するため、本発明者らは、ヒト骨髄性白血病細胞株において、ＦＬＴ３−ＩＴＤを過剰発現させるかまたは枯渇させるかいずれかを行った。ＴＦ−１対照細胞と比較して（図１Ｃ、レーン１）、内因性ＦＬＴ３−ＩＴＤ突然変異を宿するＭＶ４−１１およびＭＯＬＭ−１４細胞株ならびに外因性ＦＬＴ３−ＩＴＤを過剰発現するＴＦ−１細胞株（ＴＦ１−ＩＴＤ）は、より高いレベルのＰＲＬ−３を有した（図１Ｃ、レーン２〜４）。対照的に、ＭＯＬＭ−１４およびＭＶ４−１１細胞におけるｓｉＲＮＡ仲介性ＦＬＴ３発現枯渇は、ＰＲＬ−３発現を有効に抑制した（図１Ｄ）。集合的に、本発明者らの結果は、ＡＭＬ細胞におけるＦＬＴ３−ＩＴＤ突然変異およびＰＲＬ−３発現上昇の緊密な関係を暗示する。

ＦＬＴ３の恒常的活性化は、Ｓｒｃ−ＳＴＡＴ５シグナル伝達経路を通じて、ＰＲＬ−３発現を増進する
恒常的に活性であるＦＬＴ３シグナル伝達が、ＰＲＬ−３発現の上方制御に関与しているかどうかを調べるため、本発明者らは、ＦＬＴ３阻害剤を用いて、ＦＬＴ３受容体活性を遮断し、そしてＦＬＴ３−ＩＴＤ突然変異の下流シグナル伝達分子を調べた。ＳＴＡＴ５は、ＦＬＴ３−ＩＴＤの非常に重要な下流ターゲットであることが知られているため（Ｍｉｚｕｋｉら、２０００）、本発明者らは、ＦＬＴ３特異的阻害剤； ＰＫＣ４１２またはＣＥＰ−７０１（Ｏｄｇｅｒｅｌら、２００７； Ｓｍｉｔｈら、２００４）での処理後、ＳＴＡＴ５発現レベルを試験した。それぞれの阻害剤は、ＴＦ１−ＩＴＤおよびＭＯＬＭ−１４細胞株において、用量依存方式で、ＦＬＴ３およびＳＴＡＴ５のリン酸化を減少させ、そしてＰＲＬ−３タンパク質レベルの対応する減少を生じた（図２Ａ）。本発明者らは、次に、ＦＬＴ３−ＩＴＤ誘導性ＰＲＬ−３発現が、ＳＴＡＴ５の２つの別個の上流活性化因子であるＪＡＫまたはＳｒｃ（Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、２００５； Ｓｐｉｅｋｅｒｍａｎｎら、２００３）によって仲介されうるかどうかを調べた。ＦＬＴ３阻害剤での処理後、ホスホおよび総ＪＡＫ２レベルは影響を受けておらず（図２Ｂ）、一方、Ｓｒｃの活性化型（ｐＳｒｃ Ｙ４１６）は、処理後、強力に下方制御された。重要なことに、Ｓｒｃ不活性化は、用量依存方式で、ＳＴＡＴ５リン酸化の減少に緊密に対応した（図２Ｂ）。ＦＬＴ３−ＩＴＤ陽性 ＡＭＬ細胞における、Ｓｒｃ仲介性ＳＴＡＴ５リン酸化の役割を調べるため、ＡＭＬ細胞を２つの別個のＳｒｃキナーゼ阻害剤、ＳＵ６６５６およびＰＰ２（Ｂｌａｋｅら、２０００； Ｎａｍら、２００２）で処理した。Ｓｒｃ阻害は、ＳＴＡＴ５リン酸化およびＰＲＬ−３発現レベルの両方を減少させ（図２Ｃ）、Ｓｒｃ仲介性ＳＴＡＴ５リン酸化およびＰＲＬ−３発現の間の相関を明らかにした。

ＳＴＡＴ５は、ＰＲＬ−３発現の強力な転写制御因子である
ＰＲＬ−３がどのように上方制御されうるかを理解するため、ヒトＰＲＬ−３プロモーター領域を転写因子データベース（ＴＲＡＮＳＦＡＣ）によって分析して、ありうる転写因子結合部位を予測した（Ｗｉｎｇｅｎｄｅｒら、１９９６）。ＴＲＡＮＳＦＡＣ プログラムは、ＰＲＬ−３の上流プロモーター領域にいくつかの推定上の転写因子を同定し、これには、２つのＳＴＡＴ５コンセンサス結合配列、ＴＴＣＮ（３）ＧＡＡ（Ｓｅｉｄｅｌら、１９９５）が含まれた（図３Ａ）。ＰＲＬ−３の転写制御因子としてのＳＴＡＴ５の役割を評価するため、本発明者らは、これらのＳＴＡＴ５結合配列に対応する２つのビオチン化プローブ、Ｓ１およびＳ２を設計し、そしてＴＦ−１（ＰＲＬ−３非発現）またはＴＦ１−ＩＴＤ（ＰＲＬ−３発現）細胞のいずれかに由来する核抽出物を用いて、ゲル移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）を行った（図１Ｃ、レーン１、４）。ＴＦ１−ＩＴＤ細胞由来の核抽出物は、プローブＳ１（−５．４ｋｂ）に対するロバストなレベルの特異的なＤＮＡ結合活性を示したが、プローブＳ２（−１８．４ｋｂ）に対しては示さず、一方、親ＴＦ−１細胞由来の核抽出物は、プローブＳ１またはＳ２との観察可能なＤＮＡ結合活性を持たなかった（図３Ｂ）。ＳＴＡＴ５結合配列を含有する非標識競合オリゴヌクレオチドは、結合シフトアッセイ中、標識プローブを効率的に置換可能であった（図３Ｃ）。このタンパク質／ＤＮＡ複合体におけるＳＴＡＴ５の関与をさらに確証するために、ビオチン化プローブＳ１を用いて、ストレプトアビジン−アガロース・プルダウンアッセイを行った。ＥＭＳＡ結果と一致して、ＳＴＡＴ５抗体を用いたウェスタンブロット分析は、ＳＴＡＴ５が、複合体において、プローブＳ１に結合する転写因子であることを確認した（図３Ｄ）。

ＰＲＬ−３プロモーターの上流領域へのＳＴＡＴ５の結合特性をさらに明らかにするため、ＳＴＡＴ５ＡまたはＳＴＡＴ５Ｂ発現ベクターのいずれかを、ＰＲＬ−３プロモーター領域の−５．４ｋｂ上流配列またはその連続５’欠失構築物（Ｓ１ａ、Ｓ１ｂ、Ｓ１ｃ、およびＳ１ｄ）のいずれかを含有するｐＧＬ３ルシフェラーゼベクターと一緒の同時トランスフェクションに用いて、レポーターアッセイを行った（図３Ｅ、左のパネル）。トランスフェクションＳＴＡＴ５ＡまたはＳＴＡＴ５Ｂの類似のタンパク質発現レベルが同定された。ＴＦ−１細胞において、ＳＴＡＴ５Ａ発現ベクターをレポーター構築物Ｓ１ａ〜ｃと同時発現した際、ルシフェラーゼ活性は、ＳＴＡＴ５結合部位を欠くＳ１ｄ欠失構築物に比較して、３〜４倍増加した（図３Ｅ、黒いカラム）。興味深いことに、ＳＴＡＴ５Ｂとレポーター構築物の同時発現は、レポーター活性に有意な増加を示さず（図３Ｅ、白抜きのカラム）、この活性化がＳＴＡＴ５Ａに特異的であり、ＳＴＡＴ５Ｂでは特異的でないことが示唆された。ＰＲＬ−３の重要な転写制御因子としてのＳＴＡＴ５の役割を裏付けるため、３つのＡＭＬ細胞株；ＴＦ１−ＩＴＤ、ＭＯＬＭ−１４、およびＭＶ４−１１において、ｓｉＲＮＡノックダウンアプローチによって、ＳＴＡＴ５を枯渇させた。ＳＴＡＴ５のサイレンシングは、ＰＲＬ−３ ｍＲＮＡを減弱させ（図３Ｆ、ａ）、その結果、ＰＲＬ−３タンパク質発現レベルを減少させた（図３Ｆ、ｂ）。これらの結果はさらに、ＰＲＬ−３発現に対するＳＴＡＴ５の正の制御を実証した。

ＰＲＬ−３の上方制御は、ＥＲＫおよびＪＮＫカスケードを通じて、ＡＰ−１発癌性転写因子を活性化する
ＰＲＬ−３は、腫瘍発生において、重要な役割を果たすことが報告されてきている（Ｇｕｏら、２００６； Ｍａｔｓｕｋａｗａら、２０１０）。したがって、本発明者らは、多様な発癌性転写因子、例えば腫瘍発生を駆動する周知の転写因子であるＡＰ−１に対するＰＲＬ−３過剰発現の分子的結果を調べた（Ｅｆｅｒｌ ＆ Ｗａｇｎｅｒ、２００３）。このため、本発明者らは、ＴＦ１−ＰＲＬ−３（ＧＦＰ−ＰＲＬ−３を過剰発現するＴＦ−１細胞）およびＴＦ１−ＧＦＰ対照細胞を用いて、ＡＰ−１プロモーターの制御下でＳＥＡＰレポーター遺伝子を含有するｐＡＰ１−ＳＥＡＰベクターを用いた、ＳＥＡＰ（分泌アルカリホスファターゼ）アッセイを行った。図４Ａに示すように、ＴＦ１−ＰＲＬ−３細胞は、ＴＦ１−ＧＦＰ対照細胞に比較した際、ＳＥＡＰ活性に＞２．５倍の増加を示し、ＰＲＬ−３がＡＰ−１発現を誘導可能であることを示した。ＴＦ−１白血病細胞株からのこの観察が、他の固形腫瘍細胞株に適用可能であるかどうかを調べるため、２つの結腸直腸癌細胞株、ＤＬＤ−１およびＨＣＴ１１６を調べた。一貫して、ＰＲＬ−３の過剰発現は、それぞれ、ＤＬＤ−１細胞およびＨＣＴ１１６細胞において、それぞれ、ＡＰ−１活性の＞６．５倍および＞２．５倍の増加を導いた（図１３）。

活性化ＡＰ−１複合体をさらに同定するため、本発明者らは、ＡＰ−１複合体の２つの重要なメンバーである、ｃ−Ｊｕｎおよびｃ−Ｆｏｓタンパク質に対するウェスタンブロット分析を行った。ＴＦ１−ＧＦＰ対照細胞に比較して、ｃ−ＪｕｎはＴＦ１−ＰＲＬ−３およびＴＦ１−ＩＴＤ細胞の両方で上方制御されたが、ｃ−ＦｏｓはＴＦ１−ＩＴＤのみで検出され、ＴＦ１−ＰＲＬ−３細胞では検出されず（図４Ｂ、ａ）、ＰＲＬ−３がｃ−Ｊｕｎを優先的に刺激するが、ｃ−Ｆｏｓを刺激しないことを示す。この結果をＴＦ１−ＩＴＤ細胞におけるＰＲＬ−３のノックダウンによって検証し、これは、ＰＲＬ−３の喪失がｃ−Ｊｕｎ発現を減少させる（が、ｃ−Ｆｏｓ発現は減少させない）ことを示した（図４Ｂ、ｂ）。ＭＡＰキナーゼは、ＡＰ−１転写因子の制御に活発に関与する（Ｚｈａｎｇ ＆ Ｌｉｕ、２００２）ため、本発明者らは、ｃ−Ｊｕｎの誘導が、ＭＡＰキナーゼ（ＭＥＫ／ＥＲＫまたはＪＮＫ）の活性化の結果でありうるかどうかを調べた。ＴＦ１−ＩＴＤおよびＭＯＬＭ−１４細胞において、ＰＲＬ−３の枯渇は、ＪＮＫおよびＥＲＫのリン酸化を減少させ、続くｃ−Ｊｕｎリン酸化の喪失を導いた（図４Ｃ、ａ）。さらに、ＰＲＬ−３の過剰発現は、ＴＦ１−ＧＦＰ細胞に比較して、ＴＦ１−ＰＲＬ−３細胞において、ＥＲＫおよびＪＮＫリン酸化を誘導した（図４Ｃ、ｂ）。これらの結果は、ＰＲＬ−３が、ＥＲＫおよび／またはＪＮＫカスケードを通じて、発癌性ｃ−Ｊｕｎを活性化することを示唆する。これをさらに確証するため、本発明者らは、ＴＦ１−ＰＲＬ−３細胞において、それぞれのｓｉＲＮＡで、ＥＲＫまたはＪＮＫいずれかをノックダウンし、そして結果は、ＥＲＫ（図４Ｃ、ｃ）またはＪＮＫ（図４Ｃ、ｄ）のいずれかの枯渇が、ｃ−Ｊｕｎのリン酸化を抑制することを示した。

ｃ−Ｊｕｎは、多様な癌において、細胞増殖を促進することが知られているため（Ｈｕｉら、２００７； Ｚｈａｎｇら、２００７）、本発明者らは次いで、ＰＲＬ−３−ＥＲＫ／ＪＮＫ−ｃ−Ｊｕｎ経路の活性化が、ＡＭＬ細胞増殖に影響を及ぼすかどうかを調べた。ＭＥＫ特異的阻害剤（Ｕ０１２６、５μＭ）またはＪＮＫ特異的阻害剤（ＳＰ６００１２５、５μＭ）で処理したＴＦ１−ＰＲＬ−３細胞は、ＤＭＳＯ処理対照細胞に比較して、７２時間で、細胞数のほぼ５０％の減少を示した（図４Ｄ、ａ〜ｂ）。さらに、ＡＰ１ファミリーの一般的な阻害剤である１５μＭのクルクミンでの処理（Ｂａｌａｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ ＆ Ｅｃｋｅｒｔ、２００７； Ｗａｎｇら、２００９）は、７２時間で、ＤＭＳＯ処理細胞の〜５０％の細胞数の減少を示した（図４Ｄ、ｃ）。

ＰＲＬ−３過剰発現は、細胞増殖を促進し、そしてアポトーシスを阻害する
ＰＲＬ−３過剰発現の生物学的転帰を調べるため、ＴＦ−１細胞におけるＰＲＬ−３機能の獲得を調べた。ＴＦ−１は、細胞増殖および生存を維持するために、培地においてＩＬ−３またはＧＭ−ＣＳＦなどのサイトカインの補充を必要とする、サイトカイン依存性細胞株である（Ｌｉｎら、２００７）。サイトカインなしでは、ＴＦ−１−ＧＦＰベクター対照細胞は、劣ってしか増殖せず（図５Ａ）、そして４８時間の時点で、２２．８％のサブＧ１アポトーシス集団を示した（図５Ｂ、左パネル）。しかし、ＰＲＬ−３を過剰発現しているＴＦ−１細胞（ＴＦ１−ＰＲＬ−３細胞）は、細胞増殖に関してサイトカイン非依存性となり、そして細胞数は、同じ時点で、ＴＦ１−ＧＦＰ対照細胞のほぼ２倍に増加した（図５Ａ）。さらに、図５Ｂに提示するように、ＴＦ１−ＰＲＬ−３細胞は、サイトカイン補充が欠如しているにもかかわらず、はるかにより少ないサブＧ１アポトーシス集団を有した（１．７％、図５Ｂ、右パネル）。サイトカイン補充の非存在下でのＰＲＬ−３の抗アポトーシス活性を研究するため、本発明者らは、ＴＦ１−ＧＦＰ対ＴＦ１−ＰＲＬ−３細胞株に対して、アネキシン−Ｖおよび７−アミノアクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ）染色後、蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）分析を行った。サイトカイン補充を伴わず４８時間培養した後、ＴＦ１−ＰＲＬ−３細胞（６．８％）におけるより、ＴＦ１−ＧＦＰ細胞において、より多くのアポトーシス集団（３１％）が観察され（図５Ｃ）、ＰＲＬ−３が、抗アポトーシス性の役割を果たし、そしてＴＦ１−ＰＲＬ−３ ＡＭＬ細胞において細胞増殖を維持しうることが示唆された。

ＰＲＬ−３枯渇は細胞増殖を減少させる
ＡＭＬ細胞株におけるＰＲＬ−３機能の喪失を調べるため、本発明者らは、内因性ＦＬＴ３−ＩＴＤおよびＰＲＬ−３の両方を高発現する２つのサイトカイン非依存性細胞株（ＭＯＬＭ−１４およびＭＶ４−１１）において、ＰＲＬ−３をノックダウンした（図１Ｃ）。ＰＲＬ−３の枯渇後、多様な時点で細胞生存度を評価した（図６Ａ ａ、Ｂ ａ）。興味深いことに、ｓｉＲＮＡによってＰＲＬ−３をサイレンシングすると、４８時間で、偽ノックダウン細胞に比較して、ＭＯＬＭ−１４細胞において〜６４．５％、そしてＭＶ４−１１細胞において〜６６．７％の細胞数減少を生じた。さらに、細胞周期分析によって、ＰＲＬ−３除去細胞における細胞数減少は、ＭＯＬＭ−１４およびＭＶ４−１１細胞株において、Ｇ１増加およびＳ期集団減少（↑Ｇ１／Ｓ↓）と相関することが示された。Ｇ１／Ｓ集団の比は、ＭＯＬＭ−１４偽ノックダウン細胞において４６．６％／４１．１％であり、そしてＭＯＬＭ−１４ ＰＲＬ−３ ＫＤ細胞において６９．７％／２１．６％になった（図６Ａ、ｂ）。同様に、ＭＶ４−１１偽ノックダウン細胞におけるＧ１／Ｓ集団の比は、ＭＶ４−１１ ＰＲＬ−３ ＫＤ細胞では、５１．４％／３６．８％から８０．５％／１４．６％にシフトした（図６Ｂ、ｂ）。したがって、ＰＲＬ−３の枯渇は、細胞がＧ１からＳ期に進入するのを遅延させ、ＰＲＬ−３が、ＭＯＬＭおよびＭＶ４−１１細胞株の両方において、Ｇ１からＳ期の遷移を促進する際に役割を果たし、細胞増殖を促進する可能性を暗示する。しかし、ＰＲＬ−３の枯渇は、細胞周期分析において提示されるように、アポトーシスに影響を及ぼさなかった（図６Ａ ｂ、Ｂ ｂ）。結果は、ＰＲＬ−３ノックダウン後、サブＧ１細胞集団の観察可能な増分がないことを示した。これはさらに、アネキシン−Ｖおよび７−ＡＡＤ染色を用いたアポトーシス分析によって確認された。ＦＡＣＳ分析は、ｓｉＲＮＡによるＰＲＬ−３のサイレンシングが、両細胞株において、アポトーシス集団の実質的な増分を示さないことを示した。これらの結果は、ＭＯＬＭ−１４およびＭＶ４−１１サイトカイン非依存性細胞において、ＰＲＬ−３の役割が、主に、Ｇ１−Ｓ遷移を促進する際のものであることを示す。

ＰＲＬ−３抗体は、マウス白血病モデルにおいて、抗腫瘍効果を示す
本発明者らの結果は、これまでのところ、ＦＬＴ３およびＰＲＬ−３が、相乗的にＡＭＬ細胞増殖を駆動可能であることを示した。ＦＬＴ３阻害剤を用いた臨床試験が、一次または二次薬剤耐性（Ｗｉｅｒｎｉｋ、２０１０）およびＡＭＬ薬剤耐性におけるＰＲＬ−３の関与（Ｚｈｏｕら、２０１１）を示してきていることを考慮すると、本発明者らは、本明細書において、ＰＲＬ−３（細胞内ホスファターゼ）発現ＡＭＬ細胞を、ＰＲＬ−３抗体を用いてターゲティングすることによる、代替戦略の開発を試みた。本発明者らおよび他の研究者らは、抗癌免疫療法のための細胞内腫瘍性タンパク質に対する抗体療法の実現可能性を立証してきている（Ｄａｏら、２０１３； Ｇｕｏら、２０１１； Ｇｕｏら、２０１２）。ＰＲＬ−３のｉｎ ｖｉｔｒｏの役割が、ｉｎ ｖｉｖｏでのＦＬＴ３−ＩＴＤ駆動ＡＭＬ腫瘍負荷と相関するかどうかを確かめるため、本発明者らは、ＡＭＬ細胞の側方尾静脈注射を用いた白血病マウスモデルを開発した。ＰＲＬ−３モノクローナル抗体（ｍＡｂ）（Ｌｉ Ｊｉｅら、２００５）を続いて用いて、ＰＲＬ−３発現が上昇したＴＦ１−ＩＴＤ ＡＭＬ細胞をターゲティングした（図１Ｃ、レーン４）。ＴＦ１−ＩＴＤ細胞を注射したＢａｌｂ／ｃヌードマウスを３つの処置群に分けた： １． ＩｇＧ抗体偽処置（ＩｇＧ処置、ｎ＝１１）； ２． ＰＲＬ−３ ｍＡｂ（ＰＲＬ−３ ｍＡｂ処置、ｎ＝１１）；または３． ＦＬＴ３ ｍＡｂ（ＦＬＴ３ ｍＡｂ処置、ｎ＝１１）。１２〜１４日に渡って、ＩｇＧ、ＰＲＬ−３またはＦＬＴ３ ｍＡｂを週２回投与した後、ＰＲＬ−３ ｍＡｂ処置マウスは、肝臓および脾臓サイズの有意な減少を示し（図７Ａ、ａ）、これは腫瘍負荷の減少の指標である。肝臓および脾臓重量が、未処置（ＩｇＧ対照）群の、それぞれ、７２．８％および５９．３％に減少した（ｐ＜０．００１、図７Ａ、ｂ）。注目すべきことに、ＰＲＬ−３ ｍＡｂ処置は、ＦＬＴ３ ｍＡｂ処置と類似の結果を生じた（図７Ａ ａ、ｂ）。以前、ＦＬＴ３ ｍＡｂ処置は、ＦＬＴ３白血病マウスモデルにおいて、有効性を持つことが立証されている（Ｌｉら、２００４）。本明細書の結果は、ＦＬＴ３−ＩＴＤ駆動性ＡＭＬ進行において、ＰＲＬ−３の役割を実証し、そして以前調べた他のＰＲＬ−３陽性癌タイプに加えて、ＰＲＬ−３陽性ＡＭＬ患者を治療して、ＰＲＬ−３抗体療法の新規使用を示す（Ｇｕｏら、２０１２）。

白血病負荷を減少させる際のＰＲＬ−３ ｍＡｂの効果を理解するため、本発明者らは、マウス骨髄におけるこれらのヒト白血病細胞の生着を評価した。２０匹のｂａｌｂ／ｃヌードマウスを４群に分けた（図７Ｂ、Ｉ〜ＩＶ、ｎ＝５／群）：マウスに、Ｉ． ＴＦ−１細胞； ＩＩ． ＴＦ１−ＩＴＤ細胞＋ＩｇＧ（ＩｇＧ処置）； ＩＩＩ． ＴＦ１−ＩＴＤ＋ＰＲＬ−３ ｍＡｂ（ＰＲＬ−３ ｍＡｂ処置）； ＩＶ． ＴＦ１−ＩＴＤ ＰＲＬ−３ ＫＤ（処置なし）を注射した。ＣＤ４５ヒト特異的造血細胞表面マーカー（ｈＣＤ４５）に対する抗体を用いて、ＦＡＣＳ分析により、マウス宿主骨髄細胞から生着ヒト白血病細胞を区別し、そして同定した。第Ｉ群のマウスは、骨髄中に生着したＣＤ４５陽性（ｈＣＤ４５＋）細胞を０．３％示した（図７Ｂ、ａ、パネルＩ）。対照的に、第ＩＩ群のマウスは、骨髄中にｈＣＤ４５＋である細胞を９％示した（図７Ｂ、ａ、パネルＩＩ）。第ＩＩＩ群のマウスは、ｈＣＤ４５＋である細胞を３．５％しか示さず（図７Ｂ、ａ、パネルＩＩＩ）、ＰＲＬ−３ ｍＡｂ処置は、ＴＦ１−ＩＴＤ細胞浸潤を減少させうることが示された。第ＩＶ群のマウスは、白血病発展に対するＰＲＬ−３サイレンシングの影響を示した。本発明者らは、第ＩＶ群のマウス由来のマウス骨髄において、こうしたｈＣＤ４５＋細胞をわずか０．７％しか検出できず（図７Ｂ、ａ、パネルＩＶ）、ＰＲＬ−３のノックダウンが、マウス骨髄における癌細胞移植に関して、ＰＲＬ−３ ｍＡｂ処置よりも有効であることが示唆された。マウスの異なる群における白血病浸潤の統計的有意性を図７Ｂ（ｂ）に要約する（ｐ＜０．００１）。重要なことに、ＰＲＬ−３ ｍＡｂ療法は、ＴＦ１−ＩＴＤ細胞を注射されたヌードマウスの生存率を延長させた。ＰＲＬ−３ ｍＡｂ処置マウスに関しては、生存中央値は１９日であったが、対照ＩｇＧ処置マウスに関しては、１６日であった（図７Ｃ； ｐ＜０．００１）。総合すると、本発明者らの結果は、本明細書において、骨髄におけるＦＬＴ３−ＩＴＤ ＡＭＬ細胞生着および腫瘍負荷を減少させる際の、それとともに生存を延長させる際の、ＰＲＬ−３免疫療法の有意な利点を立証する。

ＡＭＬ患者におけるＰＲＬ−３発現は、より短い生存と有意に関連する
コホート１（ｎ＝２２１）および公的に入手可能なデータセットＧＳＥ１２４１７（ｎ＝１６３）（Ｍｅｔｚｅｌｅｒら、２００８）を用いて、ＡＭＬ患者におけるＰＲＬ−３遺伝子発現および全生存の間の相関を分析した。単変数コックス回帰分析によって、高レベルのＰＲＬ−３発現は、コホート１（ＨＲ＝１．３２７、９５％ ＣＩ＝１．０５７〜１．６６４、ｐ＝０．０１５）およびＧＳＥ１２４１７コホート（ＨＲ＝１．８１、９５％ ＣＩ＝１．２０〜２．７４、ｐ＝０．００５）の両方において、より短い生存と関連した。本発明者らは、ＰＲＬ−３の予後値が、コホート１中、正常核型を有するＡＭＬ患者（ｎ＝１０１）（ＨＲ＝１．５７６、９５％ ＣＩ＝１．１５１〜２．１５６、ｐ＝０．００５）において、細胞遺伝合併症を有するＡＭＬ患者（ｎ＝１２０）（ＨＲ＝１．２９８、９５％ ＣＩ＝０．９２７〜１．８１８、ｐ＝０．１２９）におけるよりも、高いことに注目した。本発明者らはしたがって、以下の３つのコホートを用いたカプラン−メイヤー生存分析によって、正常核型を持つこうした患者におけるＰＲＬ−３および生存の間の関係に焦点をあてた： １． コホート１（ｎ＝１０１）、２． ＧＳＥ ６８９１（ｎ＝２２７）、および３． ＧＳＥ１２４１７（ｎ＝１６３）。コホート１においては、高レベルのＰＲＬ−３発現は、正常核型を持つ患者（ログランク検定、ｎ＝１０１、ｐ＝０．０２８；図８Ａ）における低いＰＲＬ−３発現レベルを持つ患者（平均生存時間＝６０ヶ月、９５％ ＣＩ＝３９〜８１ヶ月）に比較して、より短い生存と有意に関連した（平均生存期間＝２６ヶ月、９５％ ＣＩ＝１３〜４０ヶ月）。したがって、他の２つの独立のコホート、ＧＳＥ６８９１およびＧＳＥ１２４１７において、正常核型を持つＡＭＬ患者のカプラン−メイヤー生存分析もまた、高レベルのＰＲＬ−３ ｍＲＮＡ発現がより短い生存時間と有意に関連することを明らかにした（それぞれ、ｐ＜０．００１およびｐ＝０．０２５；図８Ｂ〜Ｃ）。総合すると、これらの結果は、ＰＲＬ−３発現が正常核型を有するＡＭＬ患者において、より劣った全生存と関連することを示唆する。

多変数コックス回帰分析は、ＰＲＬ−３が独立の予後マーカーであることを明らかにする
ＰＲＬ−３がＡＭＬ患者における生存に関する独立の予後マーカーであるかどうかを評価するため、性別、年齢、細胞遺伝リスク群、核型、ＦＡＢ群、ＦＬＴ３突然変異状態、ＮＰＭ突然変異状態、およびＰＲＬ−３ ｍＲＮＡ発現を含むパラメータを用いて、コホート１（ｎ＝２２１）において、多変数コックス回帰を行った（図９）。重要なことに、高ＰＲＬ−３ ｍＲＮＡ発現（ｐ＝０．００１、ＨＲ＝１．５７７、９５％ ＣＩ＝１．１９９〜２．０７３）を、年齢（ｐ＜０．００１）、細胞遺伝リスク群（中程度、ｐ＝０．００１；有害、ｐ＜０．００１）およびＦＬＴ３−ＩＴＤ突然変異（ｐ＝０．００１、赤）に加えて、患者生存に関する独立予測因子として同定した。一貫して、同様の多変数分析を用いたＧＳＥ６８９１データセット（ｎ＝５２１）（Ｖｅｒｈａａｋら、２００９）の検査は、ＰＲＬ−３高発現またはＦＬＴ３−ＩＴＤ突然変異が、患者生存に関する独立の予測因子であることを立証した。このデータセットにおいて、本発明者らは、高レベルのＰＲＬ−３発現（ＨＲ＝１．４８８、９５％ ＣＩ＝１．１９４〜１．８５５、ｐ＜０．００１）またはＦＬＴ３−ＩＴＤ突然変異（ＨＲ＝１．３８９、９５％ ＣＩ＝１．０９４〜１．７６４、ｐ＝０．００７）のみが、患者生存に関する独立の予測因子であることを示すことを見出した。別個のデータセットに由来するこれらの一貫した結果は、総合的に、ＰＲＬ−３の高レベル発現が劣った生存と関連することを示し、そしてＡＬＭ患者に関する他の既知の臨床的に適切な予後マーカーとは独立に、重要でそして新規の予後マーカーとしてのＰＲＬ−３発現レベルを強調する。

考察
本研究において、本発明者らは３つの主な知見を提示する：１）ＡＭＬ細胞増殖をｉｎ ｖｉｔｒｏで促進する際のＰＲＬ−３過剰発現の分子機構、２）動物モデルにおける腫瘍負荷を減少させるための、ＰＲＬ−３発現ＡＭＬ細胞をターゲティングする非慣用的な療法として、ＰＲＬ−３抗体を用いる新規アプローチ、ならびに３）ＡＭＬ患者における高ＰＲＬ−３発現および劣った生存の間の臨床的関連。総合すると、本発明者らの知見は、ＰＲＬ−３が、ＦＬＴ３−ＩＴＤ突然変異を有するＡＭＬ患者に関して、劣った生存を予測する、推定上の新規療法ターゲットおよび予後マーカーでありうることを示唆する。

ＦＬＴ３およびその突然変異体は、骨芽細胞の細胞増殖および分化において突出した役割を果たすため、療法薬剤ターゲットとして多くの関心を集めてきた（Ｌｅｖｉｓ ＆ Ｓｍａｌｌ、２００３）。これまでのところ、いくつかのＦＬＴ３選択的阻害剤が開発され、そして単一剤として、または化学療法と組み合わせて、ＡＭＬ患者において調べられてきている（Ｗｉｅｒｎｉｋ、２０１０）。しかし、ＦＬＴ３阻害剤を用いた最近の臨床試験は、一次または二次薬剤耐性および示差的臨床転帰（Ｗｅｉｓｂｅｒｇら、２００９）を示した。したがって、療法を改善するには、ＦＬＴ３突然変異の決定的な下流ターゲット遺伝子の発見が重要であろう。本明細書において、ＡＭＬ療法の推定上の新規ターゲットとしてのＰＲＬ−３の証明は、タイムリーであり、そして重要な試みである。現在、ＰＲＬ−３発現および白血病の間のありうる関連には、少数の研究しか取り組んできていない（Ｆａｇｅｒｌｉら、２００８； Ｚｈｏｕら、２０１１）。本明細書において、本発明者らは、ＡＭＬ細胞およびＦＬＴ３−ＩＴＤ突然変異を有する患者試料が、ＰＲＬ−３過剰発現を高い発生率で有することを報告し、この観察は、総数１１５８人の患者の４つの別個のＡＭＬ患者コホートの分析によって裏付けられた。ＰＲＬ−３は、ＦＬＴ３−ＩＴＤ突然変異の下流ターゲットであることが示され、ＦＬＴ３−Ｓｒｃ−ＳＴＡＴ５経路がＰＲＬ−３ ｍＲＮＡ発現を制御する。重要なことに、ＦＬＴ３−ＩＴＤ突然変異によるＰＲＬ−３上方制御は、癌進行と関連づけられ、この現象は、潜在的に、発癌性転写因子ｃ−Ｊｕｎ／ＡＰ−１のＰＲＬ−３誘導性活性化によって説明される。ｃ−Ｊｕｎは、ＡＭＬ患者において過剰発現され、そして顆粒球分化およびＡＭＬ発展におけるブロックに寄与し（Ｐｕｌｉｋｋａｎら、２０１０； Ｒａｎｇａｔｉａら、２００３）、したがって、腫瘍発展における、ＰＲＬ−３によるＡＰ−１活性化の重要な役割が示される。さらに、ＭＥＫ／ＪＮＫ阻害剤（Ｕ０１２６、ＳＰ６００１２５）またはＡＰ−１阻害剤（クルクミン）での処理は、ＰＲＬ−３駆動細胞増殖の減少を生じ、ＰＲＬ−３機能がＭＥＫ／ＥＲＫおよび／またはＪＮＫシグナル伝達に依存することが示唆される。いくつかの報告によって、多様な固形癌細胞において、ＰＲＬ−３が、ＲｈｏファミリーＧＴＰアーゼ（Ｆｉｏｒｄａｌｉｓｉ ＪＪら、２００６、Ｍｉｎｇ Ｊら、２００９）またはインテグリンβ（Ｐｅｎｇら、２００９）の制御を通じて、ＥＲＫを活性化可能であることが示されてきているが、詳細な分子機構は、いまだ、完全には解明されていない。さらに、ＰＲＬ（ＰＲＬ−１、ＰＲＬ−２、およびＰＲＬ−３）が、非小細胞肺癌細胞において、ＡＰ−１活性を促進し、そして細胞増殖を増加させうることが最近報告されてきている（Ｈｗａｎｇら、２０１１）。一貫して、本発明者らは、細胞周期におけるＧ１からＳ期遷移の促進ならびに抗アポトーシスによって、ＰＲＬ−３がＡＭＬ細胞増殖における発癌性の役割を果たすことを立証した。より重要なことに、本発明者らは、ＰＲＬ−３上方制御が、特に正常核型を有する患者において、ＡＭＬ進行に寄与しうることを示し、ＰＲＬ−３が、慣用的な療法に対する臨床転帰が非常に不均一である、この群の患者に関する実行可能な療法ターゲットであることが示唆された（Ｂａｌｄｕｓ ＆ Ｂｕｌｌｉｎｇｅｒ、２００８； Ｇａｉｄｚｉｋ ＆ Ｄｏｈｎｅｒ、２００８； Ｓｍａｌｌ、２００６）。さらに、多変数分析は、ＰＲＬ−３発現を２つの別個のデータセット（コホート１、ＧＳＥ６８９１； 図９）における独立の予後マーカーとして確証した。これらの結果は、ＰＲＬ−３が、ＡＭＬ患者における有用な予後マーカーおよび療法ターゲットであることを示唆する。

最後に、本発明者らは、マウスにおける抗ＡＭＬ療法のための細胞内ＰＲＬ−３腫瘍性タンパク質をターゲティングする、非慣用的な抗体療法アプローチを示した（図７）。抗体は、伝統的には、細胞外（表面）タンパク質に対して用いられ、そして抗体は細胞に進入するには大きすぎる（〜１５０ｋＤａ）と一般的に考えられるため、細胞内タンパク質をターゲティングするためには用いられてこず、抗体療法またはワクチン接種に関して、大量の細胞内の貴重な潜在的癌特異的療法ターゲットは放置されてきた。抗体が、抗癌のため、細胞内腫瘍性タンパク質をターゲティングすることがどのように可能であるか、ありうる機構が、最近の概説論文に提示された（Ｆｅｒｒｏｎｅ、２０１１； Ｇｕｏら、２０１１； Ｇｕｏら、２００８； Ｈｏｎｇ ＆ Ｚｅｎｇ、２０１２）。本明細書において、この非伝統的なアプローチは、ＦＬＴ３−ＩＴＤおよびＰＲＬ−３タンパク質を両方発現するＴＦ１−ＩＴＤ細胞によって形成される腫瘍を所持するマウスにおいて、ＰＲＬ−３ ｍＡｂ療法を実行することによって、さらに評価された。対照ＩｇＧ処置マウスに比較して、ＦＬＴ３ ｍＡｂ（細胞外ＦＬＴ３受容体をターゲティングする）で処置されたマウス、またはＰＲＬ−３ ｍＡｂ（細胞内ＰＲＬ−３をターゲティングする）で処置されたマウスは、脾臓および肝臓のサイズの減少を示し、これら２つの肥大した臓器は一般的に白血病負荷の指標として用いられる。この結果は、ＰＲＬ−３過剰発現に関連するＡＭＬ患者に関するＰＲＬ−３抗体療法の潜在的な価値を示唆する。単独のそして標準的化学療法と組み合わせたＦＬＴ３阻害は、臨床的限界を有することが示されているため、ＰＲＬ−３抗体療法は、ＰＲＬ−３過剰発現と関連するＦＬＴ３−ＩＴＤ突然変異を有するＡＭＬ患者の実行可能な代替治療を提供しうる。白血病細胞は、循環系において、容易にアクセス可能であり、そして抗体と直接接触するため、こうした抗体処置は、ＡＭＬ患者に特に有用であり、そして特異的でありうる。ＡＭＬ患者においてＰＲＬ−３をターゲティングすることによる新規療法手段の可能性を、さらに追求すべきである。

参考文献

Claims (31)

1. 癌を有する個体の予後を決定するための方法であって、個体から得た試料におけるＰＲＬ３の発現、量または活性の調節を検出する工程を含む、前記方法。
2. 個体の生存率を予測するための方法である、請求項１記載の方法。
3. ａ）個体から得た試料におけるＰＲＬ３タンパク質またはＰＲＬ３核酸の量をアッセイし；そして
   ｂ）試料におけるＰＲＬ３の量に基づいて、患者の予後を決定する；
   工程を含む、請求項１または請求項２記載の方法。
4. 対照に、試料中のＰＲＬ３の量を比較する工程をさらに含む、請求項３記載の方法。
5. 個体から得た試料における上昇したＰＲＬ３が劣った予後の指標である、先行する請求項のいずれか一項の方法。
6. 癌が白血病である、先行する請求項のいずれか一項の方法。
7. 白血病が急性または慢性骨髄性白血病である、請求項６の方法。
8. 試料が体液試料である、先行する請求項のいずれか一項の方法。
9. 試料が骨髄試料である、先行する請求項のいずれか一項の方法。
10. 試料が正常核型を有する、先行する請求項のいずれか一項の方法。
11. 個体から得た試料が正常核型を有することを決定する工程をさらに含む、先行する請求項のいずれか一項の方法。
12. 個体がＦＬＴ３−ＩＴＤ陽性癌を有する、先行する請求項のいずれか一項の方法。
13. 試料がＦＬＴ３−ＩＴＤ陽性であることを決定する工程をさらに含む、先行する請求項のいずれか一項の方法。
14. 個体がＦＬＴ３阻害療法で以前治療されているか、または該療法を経験中である、先行する請求項のいずれか一項の方法。
15. 個体から得た試料中のＰＲＬ３タンパク質の量をイムノアッセイによって決定する、先行する請求項のいずれか一項の方法。
16. ＰＲＬ３の量が決定する分子の唯一の量である、先行する請求項のいずれか一項記載の方法。
17. 白血病患者の生存率を予測するための方法であって：
    患者から得た試料におけるＰＲＬ３タンパク質の量を測定し；そして
    測定したＰＲＬ３の量に基づいて、患者の生存率を予測する；
    工程を含む、前記方法。
18. 試料がＦＬＴ３−ＩＴＤ陽性であることを決定する工程をさらに含む、請求項１７の方法。
19. 白血病治療法において使用するための抗ＰＲＬ３抗体。
20. 白血病が急性または慢性骨髄性白血病である、請求項１９記載の白血病の治療法において使用するための抗ＰＲＬ３抗体。
21. 個体が以前ＦＬＴ３阻害療法を経験している、請求項１９または２０のいずれか一項記載の白血病の治療法において使用するための抗ＰＲＬ３抗体。
22. 方法が、癌がＦＬＴ３−ＩＴＤ陽性であることを決定する工程を含む、請求項１９〜２２のいずれか一項記載の白血病の治療法において使用するための抗ＰＲＬ３抗体。
23. 抗ＰＲＬ３抗体の療法的有効量を投与する工程を含む、個体における白血病の治療法。
24. 白血病が急性または慢性骨髄性白血病である、請求項２３記載の治療法。
25. 患者が以前ＦＬＴ３阻害療法を経験している、請求項２３記載の治療法。
26. ＦＬＴ３を阻害する化合物の投与をさらに含む、請求項２３記載の治療法。
27. 白血病治療のための薬剤製造における抗ＰＲＬ３抗体の使用。
28. 白血病が急性または慢性骨髄性白血病である、請求項２７記載の白血病治療のための薬剤製造における抗ＰＲＬ３抗体の使用。
29. 方法が、癌がＦＬＴ３−ＩＴＤ陽性であることを決定する工程を含む、請求項２７または２８のいずれか一項記載の白血病治療のための薬剤製造における抗ＰＲＬ３抗体の使用。
30. 個体が以前ＦＬＴ３阻害療法を経験している、請求項２７〜２９のいずれか一項記載の白血病治療のための薬剤製造における抗ＰＲＬ３抗体の使用。
31. ＦＬＴ３を阻害する化合物とともに、抗ＰＲＬ３抗体を投与する、請求項２７〜３０のいずれか一項記載の白血病治療のための薬剤製造における抗ＰＲＬ３抗体の使用。