JP4794213B2 - Tリンパ性白血病の検出方法及び検出用キット - Google Patents
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(1)生体から単離された検体中のAREB6遺伝子の発現レベルを測定し、前記発現レベルの低下を指標としてTリンパ性白血病を検出することを特徴とするTリンパ性白血病の検出方法。
(2)前記Tリンパ性白血病が成人T細胞白血病である(1)記載の方法。
(3)前記検体が白血球細胞である(1)又は(2)記載の方法。
(4)AREB6遺伝子の発現レベルを測定するための試薬を含むTリンパ性白血病を検出するためのキット。
ATL細胞に対するSKY−FISH法を用いた染色体分析を行った。方法は次の通りである。ATL細胞あるいは細胞株から型のごとく染色体標本を作製し、SKYプローブカクテル(Applied Spectral Imaging Inc)を37℃で2日間分子雑種させ、洗浄後に蛍光顕微鏡に装着したSD200 Spectracubeで画像を記録し、附属のソフトウエアを用いて核型を作成した。次に、10p11−13にマップされたBACクローンをビオチンあるいは蛍光色素で標識しプローブにしてFISH解析を行い、10p11−13領域の切断点と欠失を同定した。1例のATL細胞で1.2Mbのホモ欠失を見出した。
以上の通り、ATL細胞において10番染色体短腕の染色体異常集中部位p11−13を同定した。この領域は1.2Mbのホモ欠失領域を含む約2Mbの領域であり、その中に38遺伝子がマップされた。そこで、その遺伝子群の発現解析を行ったところ、AREB6遺伝子が原因遺伝子候補であることがわかった。図2は10番染色体のマップであり、各細胞株、患者検体における欠失領域のマップを示す。最下部にはマップされた遺伝子候補のうち、確実に遺伝子であることが確認されている遺伝子を示す。
10pの共通欠失領域にマップされた遺伝子に対してDNAマイクロアレイ法を用いた遺伝子発現解析を行った。Affymetrix社マイクロアレイHU95Aを用い、目的細胞より取り出したRNA 5μgを逆転写酵素(Superscript II、Life Technologies社)によりT7−dT24プライマーを用いてcDNAに変換、さらに、MEGAscript High Yield Transciption kit(Ambion社)を用いてビオチン付加cRNAに転写した。転写したcRNAをT7 RNA polymeraseにより増幅し、これをプローブとしてAffymetrix社プロトコールに従い、DNAマイクロアレイを処理した。染色したアレイはGeneArray Scannerにより取り込み、Affymetrix社解析ソフトによりデータ解析を行った。
図2中マップされた遺伝子群のうち、確実に発現が確認された遺伝子の発現を、インフォームドコンセント後同意を得られた、4例の健常人コントロールCD4陽性T細胞と8例のATL細胞においてRT−PCR法を用いて測定した。AREB6遺伝子を増幅するために5’末端側プライマーcgtcacatgacatcacataaatca及び3’末端側プライマーaagcaaccactatgggtttgaattを用いた。totalRNA 1μgよりtakara T4 reverse transcriptaseを用いた逆転写反応によりcDNAに変換後、このDNAを鋳型としてPCRを行った。PCRは94度5分加熱後、94度30秒、58度30秒、72度1分を25サイクルで行った。
Real−time PCR法を用いて、ATL患者白血病細胞のAREB6発現レベルを測定した。インフォームドコンセント後同意を得られた、健常人末梢血リンパ球(CD4陽性)4例、ATL患者末梢血白血病細胞6例につき、AREB6遺伝子発現を検討した。上記サンプルRNAよりRT−PCRによりcDNAを合成、このDNAを鋳型としてABI PRISM 7000を用い、ABIリアルタイムPCRプロトコールに準じてPCRを行った。プライマーとしてABI 4323969 AREB6−308T (FAMラベル)を用い、コントロールとしてヒトb−actinプローブ(4326315E)(VICラベル)を用いた。
RT−PCRを用いてATL細胞株(6),HTLV1感染細胞株(3),T−ALL細胞株(2)についてAREB6遺伝子発現を検討した。AREB6遺伝子を増幅するために5’末端側プライマーcgtcacatgacatcacataaatca及び3’末端側プライマーaagcaaccactatgggtttgaattを用いた。totalRNA 1μgよりtakara T4 reverse transcriptaseを用いた逆転写反応によりcDNAに変換後、このDNAを鋳型としてPCRを行った。PCRは94度5分加熱後、94度30秒、58度30秒、72度1分を25サイクルで行った。KOB,SO4,KK1,OMT細胞株は長崎大学医学部山田先生より、Su9T,S1Tは鹿児島大学医学部有馬先生より、ED細胞株は京都大学医学部前田先生より、Jurkat,MOLT4,HUT102,MT2は理研細胞センターより分与していただいた。
AREB6プロモーター領域のDNAメチル化が転写低下に関係するかどうかを検討するために、ATL細胞株を5−azacytidine添加培養液にて5日培養しその転写の変化をRT−PCR法にて検討した。AREB6遺伝子を増幅するために5’末端側プライマーcgtcacatgacatcacataaatca及び3’末端側プライマーaagcaaccactatgggtttgaattを用いた。totalRNA 1μgよりtakara T4 reverse transcriptaseを用いた逆転写反応によりcDNAに変換後、このDNAを鋳型としてPCRを行った。PCRは94度5分加熱後、94度30秒、58度30秒、72度1分を25サイクルで行った。KK1,KOB細胞株は長崎大学医学部山田先生より、ED細胞株は京都大学医学部前田先生より分与していただいた。それぞれの細胞株に培養液中に5−Azacytidine 1mMを添加、もしくは無添加し4日間培養し、total RNAを抽出、1μgをcDNAに変換し、これを鋳型としてRT−PCRを行った。
ヒストンタンパク質のアセチル化の影響がAREB6の転写に関連するかどうか検討するため、抗ガン剤として用いられている脱アセチル化阻害剤Trichostatin A(TSA)処理による転写の変化をRT−PCR法により検討した。AREB6遺伝子を増幅するために5’末端側プライマーcgtcacatgacatcacataaatca及び3’末端側プライマーaagcaaccactatgggtttgaattを用いた。totalRNA 1μgよりtakara T4 reverse transcriptaseを用いた逆転写反応によりcDNAに変換後、このDNAを鋳型としてPCRを行った。PCRは94度5分加熱後、94度30秒、58度30秒、72度1分を25サイクルで行った。SO4細胞株は長崎大学医学部山田先生より、ED細胞株は京都大学医学部前田先生より分与していただいた。それぞれの細胞株に培養液中にTSA 1mMを添加、もしくは無添加し、培養前(Pre)、培養後24時間後(24)、48時間後(48)に細胞より、total RNAを抽出、1μgをcDNAに変換し、これを鋳型としてRT−PCRを行った。
マウスCTLL細胞株にアンチセンスdeltaEF1(マウスにおけるAREB6)を導入し、deltaEF1抗体を用いてWestern法によりタンパク質発現を検討した。pcDNA3ベクターにdeltaEF1遺伝子を逆向きに挿入し、マウスCTLL2細胞株にelectroporation法により導入した。導入後G418 800μg/mlを添加約3週間培養した。生き残った細胞株をそれぞれ分画し、細胞株を6株得た。それぞれのクローン(clone 1,clone2など)について、deltaEF1のたんぱく質発現をWestern法により同定した。コントロール細胞(CTLl/neo,CTLL/GFP)および、得られたクローン細胞株(CTLL/3及びCTLL/4)について5x106細胞よりより得られた蛋白質をSDS−PAGEで分離後、ナイロン膜(Amersham)に転写し、一次抗体である3000倍希釈抗deltaEF1抗体(大阪大学医学部東先生より供与)で処理し、二次抗体である4000倍希釈ビオチン標識抗ラビットIgG抗体で処理し、さらに4000倍希釈HRP標識ストレプトアビジンで処理後、ECLキット(Amersham社)により発色させLAS3000(富士フィルム)を用いてdeltaEF1蛋白質を同定した。
ATL細胞株EDにdeltaEF1(マウスにおけるAREB6)を導入し、deltaEF1抗体を用いてWestern法にて発現レベルを検討した。pcDNA3ベクターにdeltaEF1遺伝子を組み込み、electroporation法(Biolad社)にてヒトATL細胞株EDに遺伝子導入を行った。導入後G418 800μg/mlの条件で3週間培養し、3種類の細胞株(dEF1−1, dEF1−2, dEF1−3)を作成した。それぞれの細胞株5x106細胞より蛋白質を抽出し、SDS−GAGEゲル電気泳動により蛋白質を分離し、ナイロン膜に転写した。この膜に対して、一次抗体である3000倍希釈抗deltaEF1抗体(大阪大学医学部東先生より供与)で処理し、二次抗体である4000倍希釈ビオチン標識抗ラビットIgG抗体で処理し、さらに4000倍希釈HRP標識ストレプトアビジンで処理後、ECLキット(Amersham社)により発色させLAS3000(富士フィルム)を用いてdeltaEF1蛋白質を同定した。
Claims (5)
- 生体から単離された検体中のAREB6遺伝子の発現レベルを測定し、前記発現レベルが正常検体中のAREB6遺伝子の発現レベルと比較して低下していることを指標として、前記生体を成人T細胞白血病発症の可能性が高いと判定することを特徴とする、成人T細胞白血病発症の可能性を判定する方法。
- 生体から単離された検体中のAREB6遺伝子の発現レベルを測定し、前記発現レベルが正常検体中のAREB6遺伝子の発現レベルと比較して低下していることを指標として、前記生体をヒトT細胞白血病ウイルス感染の可能性が高いと判定することを特徴とする、ヒトT細胞白血病ウイルス感染の可能性を判定する方法。
- 前記検体が白血球細胞である請求項1又は2記載の方法。
- AREB6を特異的に検出するためのオリゴヌクレオチドプローブ若しくはAREB6を特異的に増幅するためのプライマーセット、又はAREB6に反応し得る抗体若しくはその抗原結合断片を含む、請求項1に記載の方法により成人T細胞白血病発症の可能性を判定するためのキット。
- AREB6を特異的に検出するためのオリゴヌクレオチドプローブ若しくはAREB6を特異的に増幅するためのプライマーセット、又はAREB6に反応し得る抗体若しくはその抗原結合断片を含む、請求項2に記載の方法によりヒトT細胞白血病ウイルス感染の可能性を判定するためのキット。
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