CN108779454A - 肥胖风险的诊断试剂盒和肥胖发病风险的分析方法 - Google Patents

肥胖风险的诊断试剂盒和肥胖发病风险的分析方法 Download PDF

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CN108779454A CN201780017278.1A CN201780017278A CN108779454A CN 108779454 A CN108779454 A CN 108779454A CN 201780017278 A CN201780017278 A CN 201780017278A CN 108779454 A CN108779454 A CN 108779454A
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荒谷聪子
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Abstract

本发明提供一种肥胖风险的诊断试剂盒和肥胖发病风险的分析方法。肥胖风险的诊断试剂盒包括探针，该探针用于分析肥胖者和非肥胖者的遗传信息，利用在肥胖者中滑膜素基因大量表达的状况，来鉴定作为肥胖指标的滑膜素基因。肥胖发病风险的分析方法包括：对从成为对象的生物体中采取的样本中的滑膜素基因的表达量进行测定的步骤；以及使用滑膜素基因的表达量，求出肥胖发病风险的步骤。

Description

肥胖风险的诊断试剂盒和肥胖发病风险的分析方法
技术领域
本发明涉及一种肥胖风险的诊断试剂盒(diagnosis kit)和肥胖发病风险的分析方法。
背景技术
在日本发明专利授权公报特许第5279492号中公开有一种用于在肥胖遗传基因的多态性(polymorphism)分析中使用的探针(probe)。如此，开发出一种通过分析肥胖遗传基因，来分析对象发生肥胖遗传风险的技术。
另一方面，在国际公开2014-103863号单行本中记载有一种能够通过抑制滑膜素(Synoviolin)的表达来防止肥胖的技术。
【现有技术文献】
【专利文献】
专利文献1：日本发明专利授权公报特许第5279492号
专利文献2：国际公开2014-103863号单行本
发明内容
【发明要解决的课题】
本发明提供一种肥胖风险的诊断试剂盒和肥胖发病风险的分析方法。
【用于解决课题的方式】
基本上，本发明是对肥胖者和非肥胖者的遗传信息进行分析，并基于在肥胖者中滑膜素基因大量表达的这样的实施例的认知所实施的技术。即，肥胖者的滑膜素基因的表达量多于非肥胖者的滑膜素基因的表达量，在统计上存在明显差异。因此，考虑滑膜素基因能够作为用于判断是否有较高倾向发展成遗传性肥胖的风险(患病可能性)的肥胖指标。另外，通过求出对象的该滑膜素基因的表达量并与规定的值(预先测定，并预先求得的与滑膜素基因的表达量相关的阈值)进行比较，能够分析对象是否有发生遗传性肥胖的风险。
本发明的第1技术方案涉及一种肥胖风险的诊断试剂盒。该肥胖风险的诊断试剂盒包括用于鉴定作为肥胖指标的滑膜素基因的探针。
本发明的第2技术方案涉及一种肥胖发病风险的分析方法。该方法包括：对从成为对象的生物体中所采取的样本中的滑膜素基因的表达量进行测定的步骤；以及使用滑膜素基因的表达量，求出肥胖发病风险的步骤。
【发明效果】
本发明能够提供一种肥胖风险的诊断试剂盒和肥胖发病风险的分析方法。
附图说明
图1是表示滑膜素基因和ATF6基因的表达量的箱形图。
图2是表示XBP1基因和elF2基因的表达量的箱形图。
图3是表示GRP78基因和IREI1基因的表达量的箱形图。
具体实施方式
以下，使用附图对本发明的实施方式进行说明。本发明并不限定于以下说明的实施方式，还包括本领域的技术人员根据以下的实施方式在周知的范围内适宜地进行修正得到的实施方式。
本发明的第1技术方案涉及一种肥胖风险的诊断试剂盒。该诊断试涉及如下方式，即，从成为对象的生物体(例如人)采取样本(例如，血液、唾液、指甲、毛发)，通过测定所采取的样本中含有的滑膜素基因的表达量，来分析对象是否有发展成遗传性肥胖的可能性(肥胖风险)，并进行评价。因此，该肥胖风险的诊断试剂盒包括用于鉴定作为肥胖指标的滑膜素基因的探针。通过使用该探针，能够求出滑膜素基因的表达量。该诊断试剂盒例如能够在判断该生物体是否具有容易发展成肥胖的基因这样的基因诊断中使用。该诊断试剂盒除了探针外，也可以包含用于测定对象的滑膜素基因表达量的周知的结构要素。这样的结构要素，例如为在PCR中使用的引物(primer)，也包含PCR测定装置。
求出滑膜素基因表达量的方法可以适当采用周知的方法。求出滑膜素基因的表达量的方法，例如为PCR方法。例如可以测定mRNA水平(mRNA level)的滑膜素基因的表达量，也可以测定蛋白质水平的滑膜素基因的表达量。求出滑膜素基因的表达量的方法，例如为诺瑟杂交(Northern blot)法、定量RT-PCR法、蛋白质印迹(Western Blot)法、ELISA法和免疫染色法。这些方法为周知的方法，用于实现这些方法的试剂盒为售卖品，因此，参阅该试剂盒的操作说明书，能够求出滑膜素基因的表达量。
用于鉴定滑膜素基因的探针为周知的探针。用于鉴定滑膜素基因的探针，例如为罗氏的通用探针库(Universal ProbeLibrary)的第16号探针。通过该探针扩增的区域是序列SEQ ID NO:1的区域。
序列SEQ ID NO:1：
ccagtacctcaccgtgctggcctccttggggcccccccggcctgccacttcagtcaactccactgaggagactgccactacagttgttgctgctgcctcctccaccagcatccctagctcaga
除上述探针以外，本发明的肥胖风险的诊断试剂盒还可以适当包含用于进行遗传基因诊断的周知的结构要素。
本发明的第2技术方案涉及一种肥胖发病风险的分析方法。该方法包括：对从成为对象的生物体中所采取的样本中的滑膜素基因的表达量进行测定的步骤；以及使用滑膜素基因的表达量，求出肥胖发病风险的步骤。对滑膜素基因的表达量进行测定的步骤如上已作了说明。为了使用滑膜素基因的表达量求出肥胖发病风险，也可以与从健康人中所采取的样本中的滑膜素基因的表达量相比较。另外，也可以预先使用多个肥胖者或非肥胖者的样本，来预先求出有关滑膜素基因的表达量的阈值，与该阈值进行比较。
该肥胖发病风险的分析方法也可以是采用计算机来自动求出的方法。计算机具有输入输出部、运算部、控制部和存储部，这些使用总线(bus)等，能够进行信息的发送和接收。并且，存储部存储有关样本(例如，血液、唾液、指甲、毛发)对应的滑膜素基因的表达量的阈值。有关对象的信息(ID等)、有关样本的信息、有关滑膜素基因的表达量的信息从输入输出部输入计算机内。于是，控制部读取存储于存储部的运算程序，并读取与来自存储部的样本对应的阈值，在运算部中将滑膜素基因的表达量与阈值比较。然后，运算部根据比较的结果，求出有关肥胖发病风险的分析结果。求出的分析结果由控制部发送到适当的存储部存储，并且从输入输出部输出。这样一来，能够求出对象的肥胖发病风险。
【实施例】
下面使用实施例对本发明进行具体说明。本发明不局限于下面的实施例。
RNA的采集和实时(RT)-PCR
从33个健康人采血，并使用聚蔗糖分离方法(Ficoll separation method)采集淋巴细胞。使用采集的淋巴细胞，并使用ISOGEN(日本基因株式会社(NIPPON GENE CO.,LTD.)制造)，生成了总RNA。在表1中表示实施例中的有关健康人(健康的捐助者)的年龄、性别、身高、BMI值的信息。
【表1】
使用随机引物，采用ReverTra(东洋纺株式会社制)对1μg的总RNA进行逆转录后，使用Light480 Probes Master(罗氏制造)，采用实时PCR，检测滑膜素基因和内质网应激相关基因的表达量。使用了酸性核糖体磷蛋白大亚基(RPLPO)作为内部对照。
在实施例中使用的引物和探针如下。
SYVN1:(滑膜素基因)
正向引物：5′-ccagtacctcaccgtgctg-3(序列SEQ ID NO:2)
反向引物：5′-tctgagctagggatgctggt-3′(序列SEQ ID NO:3)
使用了罗氏(Roche)的通用探针库的第16号探针作为探针。
ATF6:
正向引物：5′-gcagaaggggagacacattt-3′(序列SEQ ID NO:4)
反向引物：5′-tgtggtcttgttatgggtggt-3′,(序列SEQ ID NO:5)
使用了罗氏的通用探针库的第62号探针作为探针。
XBP1:
正向引物：5′-ggagttaagacagcgcttgg-3′(序列SEQ ID NO:6)
反向引物：5′-cactggcctcacttcattcc-3′,(序列SEQ ID NO:7)
使用了罗氏的通用探针库的第37号探针作为探针。
lRE1:
正向引物：5′-gaagcatgtgctcaaacacc-3′(序列SEQ ID NO:8)
反向引物：5′-tctgtcgctcacgtcctg-3′,(序列SEQ ID NO:9)
使用了罗氏社的通用探针库的第50号探针作为探针。
eIF2a:
正向引物：5′-gaagctaagaaagctgcaaagc-3′(序列SEQ ID NO:10)
反向引物：5′-cagtgtttcgtggtgtgctc-3′,(序列SEQ ID NO:11)
使用了罗氏的通用探针库的第43号探针作为探针。
GRP78:
正向引物：5′-catcaagttcttgccgttca-3′(序列SEQ ID NO:12)
反向引物：5′-ttcaggagcaaatgtctttgttt-3′,(序列SEQ ID NO:13)
使用了罗氏的通用探针库的第10号探针作为探针。
RPLPO:
正向引物：5′-gcagaaggggagacacattt-3′(序列SEQ ID NO:14)
反向引物：5′-tgtggtcttgttatgggtggt-3′,(序列SEQ ID NO:15)
使用了罗氏的通用探针库的第62号探针作为探针。
在RT-PCR中，使用了东洋纺株式会社制造的高效率逆转录酶(ReverTra Ace(注册商标))。
RT-PCR的条件如下。RT-PCR根据使用的试剂盒的使用说明书来确定温度设定等条件。
将1μg总RNA与去RNA酶水混合为10μL的混合物，并在65℃下培养5分钟后，在冰上冷却5分钟。
之后添加以下的原料。
将混合物在30℃下培养10分钟后，在42℃下培养30分钟，之后，在99℃下培养5分钟。
使用SSRI日本株式会社制造的表格统计软件2012(Excel Statistical software2012)对得到的表达量进行统计分析。将各基因的RNA表达量分为对象的BMI(身体质量指数)25kg/m2以上和对象的BMI(身体质量指数)25kg/m2以下，通过未配对学生t检验(Student's t检验)，来验证表达量之间的统计学上的明显差异。此时，若P值为0.05以下，则判断为在统计学上存在明显差异。
图1～图3是表示各RNA表达量的箱形图。图1是表示滑膜素基因和ATF6基因的表达量的箱形图。图2是表示XBP1基因和elF2基因的表达量的箱形图。图3是表示GRP78基因和lREI1基因的表达量的箱形图。
如图1所示，在BMI(身体质量指数)在25kg/m2以上的对象和BMI(身体质量指数)在25kg/m2以下的对象之间，能够观察到在滑膜素基因和ATF6基因的表达量中统计学上的明显差异。即，可知BMI为25kg/m2以上的对象的滑膜素基因的表达量多于25kg/m2以下的对象的滑膜素基因的表达量，且具有统计学上的明显差异。即，因此可知，通过求出滑膜素基因的表达量，能够评价发展成遗传性肥胖的风险。
【产业上应用的可能性】
本发明能够在基因诊断器械领域、诊断行业中应用。
【序列表独立文本】
序列SEQ ID NO:2：引物
序列SEQ ID NO:3：引物
序列SEQ ID NO:4：引物
序列SEQ ID NO:5：引物
序列SEQ ID NO:6：引物
序列SEQ ID NO:7：引物
序列SEQ ID NO:8：引物
序列SEQ ID NO:9：引物
配置序列SEQ ID NO:10：引物
序列SEQ ID NO:11：引物
序列SEQ ID NO:12：引物
序列SEQ ID NO:13：引物
序列SEQ ID NO:14：引物
序列SEQ ID NO:15：引物
【序列表】
15-283P._ST25.txt
序列表
<110> 绵引一
中岛利博
<120> 肥胖风险的诊断试剂盒和肥胖发病风险的分析方法
<130> 15-283P
<160> 15
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 123
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
ccagtacctc accgtgctgg cctccttggg gcccccccgg cctgccactt cagtcaactc 60
cactgaggag actgccacta cagttgttgc tgctgcctcc tccaccagca tccctagctc 120
aga 123
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
ccagtacctc accgtgctg 19
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
tctgagctag ggatgctggt 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
gcagaagggg agacacattt 20
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
tgtggtcttg ttatgggtgg t 21
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
ggagttaaga cagcgcttgg 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 7
cactggcctc acttcattcc 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 8
gaagcatgtg ctcaaacacc 20
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 9
tctgtcgctc acgtcctg 18
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 10
gaagctaaga aagctgcaaa gc 22
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 11
cagtgtttcg tggtgtgctc 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 12
catcaagttc ttgccgttca 20
<210> 13
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 13
ttcaggagca aatgtctttg ttt 23
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 14
gcagaagggg agacacattt 20
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 15
tgtggtcttg ttatgggtgg t 21

Claims (2)

1.一种肥胖风险的诊断试剂盒，其特征在于，
包括探针，所述探针用于鉴定作为肥胖指标的滑膜素基因。
2.一种肥胖发病风险的分析方法，其特征在于，
包括：对从成为对象的生物体中所采取的样本中的滑膜素基因的表达量进行测定的步骤；以及
使用所述滑膜素基因的表达量，求出肥胖发病风险的步骤。
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