JPWO2005012570A1 - Ｓｌｃ２５ａ１０による肥満治療に有効な化合物の評価方法 - Google Patents

Ｓｌｃ２５ａ１０による肥満治療に有効な化合物の評価方法 Download PDF

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Abstract

肥満の治療薬のスクリーニング等をはじめとする化合物の評価において、Ｓｌｃ２５ａ１０遺伝子又はタンパク質の被検組織又は被検細胞における発現レベルや、当該遺伝子又はタンパク質の性質を利用して当該評価をする。肥満の検査において、Ｓｌｃ２５ａ１０遺伝子の発現量や当該遺伝子における多型等に基づいた検査をする。

Description

本発明は、Ｓｌｃ２５ａ１０遺伝子又はタンパク質を用いた肥満の治療又は予防に有効な化合物の評価方法に関する。また、本発明は、Ｓｌｃ２５ａ１０遺伝子又はタンパク質を用いた肥満の検査方法に関する。
肥満は、高血圧症、糖尿病、高脂血症、虚血性心疾患等に代表される種々の成人病の危険因子である。また、これらの多くは慢性疾患であることから、将来的には医療費の高騰の原因になると考えられ、社会的にも大きな問題となっている。
このような肥満を防止するために抗肥満薬の開発が進められており、現在では、食欲抑制剤や脂質吸収阻害剤が臨床的に利用されている。ここで、抗肥満薬研究の標的分子としては、これまでにレプチン、ＰＰＡＲγ、ニューロペプチドＹ等が知られているが、肥満の原因は非常に多様であるため、創薬標的として作用機序の異なった標的分子が待望されている。
また、このような肥満状態あるいはその原因を適切に診断することは、その後の適切な治療にとって不可欠であるため、簡便で精度の高い肥満マーカーの出現が望まれている。また、近年、投与した薬剤の効果が被投与者の遺伝子多型等の遺伝子型に影響を受ける現象が見出されており、薬剤の開発段階における臨床試験やいわゆるオーダーメイド医療において、分子レベルでの検査や診断のマーカーが待望されている。
一方、Ｓｌｃ２５ａ１０は、ミトコンドリアの内膜に存在する輸送タンパク質のグループに属する６回膜貫通型のタンパク質であることが知られており、これまでに、ラット及びマウスの遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿０１３７７０：配列番号１）のクローニングに関する報告（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３（３８），２４７５４−２４７５９（１９９８）：非特許文献１）及びヒト遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿０１２１４０：配列番号２）のクローニングに関する報告がある（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３４４，９５３−９６０（１９９９）：非特許文献２）。
非特許文献２において、マウスを寒冷下に晒した場合に肥満細胞中のＳｌｃ２５ａ１０の発現量が低下すること、マウス３Ｔ３−Ｌ１細胞をインシュリン処理した場合にＳｌｃ２５ａ１０の発現量が低下すること、同細胞を遊離脂肪酸中で培養した場合にＳｌｃ２５ａ１０の発現量が上昇することが明らかにされている。
Ｇｉｕｓｅｐｐｅ Ｆｉｅｒｍｏｎｔｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３（３８），２４７５４−２４７５９（１９９８） Ｋａｌｌｏｌ Ｄａｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３４４，９５３−９６０（１９９９）
しかしながら、Ｓｌｃ２５ａ１０と肥満あるいは体重との相関についてはこれまでに何ら知見がなく、体重をコントロールする化合物等についての知見も全くないのが現状であった。
本発明は、上記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、肥満の治療薬のスクリーニング等、化合物の評価方法を提供することを目的とする。また、分子レベルで判断可能な肥満の検査方法を提供することを目的とする。
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、Ｓｌｃ２５ａ１０遺伝子の発現量と体重との間には一定の相関関係があることを見出すとともに、Ｓｌｃ２５ａ１０遺伝子の発現量の変化と脂肪酸合成に関与する分子の発現量の変化との間に相関関係があることを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、以下の肥満の治療又は予防に有効な化合物の評価方法（１）及び（２）を提供する。
（１）被検化合物を、被検動物又は被検細胞に、投与又は接触させる工程と、該被検動物又は該被検細胞中でＳｌｃ２５ａ１０遺伝子あるいは該遺伝子と機能的に等価な遺伝子の発現レベルの変化を検出する工程と、を含むことを特徴とする肥満の治療又は予防に有効な化合物の評価方法。
（２）被検化合物を、Ｓｌｃ２５ａ１０遺伝子の発現調節領域とレポーター遺伝子との融合遺伝子を有する被検動物又は被検細胞に投与又は接触させる工程と、該レポーター遺伝子の被検動物又は被検細胞中での発現レベルの変化を検出する工程と、を含むことを特徴とする肥満の治療又は予防に有効な化合物の評価方法。
上記評価方法（１）及び（２）において、前記発現レベルの変化は、発現レベルの低下であることが好ましい。また、ＡＣＣ１（アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ１）発現量、マロニルＣｏＡ存在量及び脂肪酸存在量のうち少なくとも一つの変化を検出する工程をさらに含んでいてもよい。かかる工程を含むことにより、被検対象となった肥満がＳｌｃ２５ａ１０を介した脂肪酸合成に起因して生じていると判断できる。
本発明は、また、以下の肥満の治療又は予防に有効な化合物の評価方法（３）及び（４）を提供する。
（３）被検化合物を、被検動物又は被検細胞に、投与又は接触させる工程と、該被検化合物が、Ｓｌｃ２５ａ１０タンパク質の活性に影響を与えるか否かを確認する工程と、を含むことを特徴とする肥満の治療又は予防に有効な化合物の評価方法。
（４）被検化合物を、Ｓｌｃ２５ａ１０タンパク質に接触させる工程と、該被検化合物が、該タンパク質の活性に影響を与えるか否かを確認する工程と、を含むことを特徴とする肥満の治療又は予防に有効な化合物の評価方法。
本発明は、また、前述したいずれかの評価方法によって得られた化合物を有効成分として含有することを特徴とする肥満の治療又は予防剤を提供する。
本発明は、また、Ｓｌｃ２５ａ１０遺伝子の発現量を低下させることを特徴とする脂肪酸合成阻害方法を提供する。ここで、Ｓｌｃ２５ａ１０遺伝子の発現量を低下させる手段は特に制限されないが、ＲＮＡｉ（ＲＮＡ干渉）を利用することが好ましい。Ｓｌｃ２５ａ１０のＲＮＡｉは、例えば、以下のｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）を使用することにより達成される。配列番号３及び４に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡ、配列番号５及び６に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡ、配列番号７及び８に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡ、配列番号９及び１０に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡ、配列番号１１及び１２に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡ、配列番号１７及び１８に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡ、配列番号２１及び２２に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡ、配列番号２３及び２４に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡ、配列番号２５及び２６に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡ、配列番号２７及び２８に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡ、配列番号２９及び３０に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡ、配列番号３１及び３２に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡ、配列番号３５及び３６に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡ、配列番号３７及び３８に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡ、配列番号３９及び４０に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡ、配列番号４１及び４２に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡ、配列番号４３及び４４に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡ、配列番号４５及び４６に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡ、配列番号４７及び４８に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡ及び配列番号４９及び５０に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡ。特に、配列番号９及び１０に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡ並びに配列番号４１及び４２に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡは、Ｓｌｃ２５ａ１０遺伝子の発現を強く低下させるため、これらのｓｉＲＮＡを使用することが好ましい。
本発明は、また、Ｓｌｃ２５ａ１０遺伝子の発現量を低下させる工程を含むことを特徴とする肥満の治療又は予防方法を提供する。ここで、Ｓｌｃ２５ａ１０遺伝子の発現量を低下させる手段は特に制限されないが、ＲＮＡｉにより抑制することが好ましい。ＲＮＡｉは、上述のｓｉＲＮＡを使用することにより達成されるが、特に配列番号９及び１０に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡ並びに配列番号４１及び４２に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡを使用することが好ましい。
本発明は、また、以下の肥満の検査方法（１）〜（５）を提供する。
（１）被検組織又は被検細胞におけるＳｌｃ２５ａ１０遺伝子の発現レベル又は発現レベルの変化を測定することを特徴とする肥満の検査方法。
（２）被検組織又は被検細胞におけるＳｌｃ２５ａ１０タンパク質の発現レベル又は発現レベルの変化を測定することを特徴とする肥満の検査方法。
（３）被検組織又は被検細胞において、Ｓｌｃ２５ａ１０遺伝子の発現レベル又はＳｌｃ２５ａ１０タンパク質の活性を変化させた際に、該変化によって生じる脂肪酸合成に関与する物質の変化量を測定することを特徴とする肥満の検査方法。
（４）被検組織又は被検細胞におけるＳｌｃ２５ａ１０遺伝子に存在する多型を検出することを特徴とする肥満の検査方法。
（５）Ｓｌｃ２５ａ１０タンパク質と相互作用することにより、Ｓｌｃ２５ａ１０遺伝子の発現量に影響を及ぼすタンパク質の発現量又は該タンパク質の活性を検出することを特徴とする肥満の検査方法。
本発明は、さらに、配列番号９及び１０に記載の核酸からなることを特徴とするｓｉＲＮＡを提供し、当該ｓｉＲＮＡを含むことを特徴とするＳｌｃ２５ａ１０発現抑制剤、脂肪合成抑制剤及び肥満の治療又は予防剤を提供する。
本発明は、さらに、配列番号４１及び４２に記載の核酸からなることを特徴とするｓｉＲＮＡを提供し、当該ｓｉＲＮＡを含むことを特徴とするＳｌｃ２５ａ１０発現抑制剤、脂肪合成抑制剤及び肥満の治療又は予防剤を提供する。
本発明の化合物の評価方法又は検査方法によれば、肥満の治療薬のスクリーニング等、化合物の評価方法を提供することが可能となる。また、分子レベルで判断可能な肥満の検査方法を提供することが可能となる。
図１は、ＨＥＫ２９３細胞の顕微鏡写真である。（ａ）は、ＣＣＣＰで処理したＨＥＫ２９３細胞を表し、（ｂ）は、ＣＣＣＰ非処理のＨＥＫ２９３細胞を表す。 図２は、Ｓｌｃ２５ａ１０とミトコンドリアプロトン勾配との関係についてフローサイトメーターにより解析した結果を示す図である。（ａ）はＣＣＣＰで処理したＨＥＫ２９３細胞を、（ｂ）は非処理のＨＥＫ２９３細胞を、（ｃ）はＳｌｃ２５ａ１０を導入したＨＥＫ２９３細胞を表す。 図３は、Ｓｌｃ２５ａ１０とミトコンドリアプロトン勾配との関係についてフルオロメーターにより解析した結果を示すグラフである。 図４は、各組織におけるＳｌｃ２５ａ１０遺伝子の発現量を示す図である。 図５は、脂肪細胞への分化の前後における（ａ）マウスＳｌｃ２５ａ１０遺伝子及び（ｂ）ＡＣＣ１遺伝子の発現量の変化を示すグラフである。 図６は、様々なｓｉＲＮＡをトランスフェクトした細胞におけるＳｌｃ２５ａ１０遺伝子の相対発現量を表すグラフである。（ａ）はマウスの細胞での結果を、（ｂ）はヒトの細胞での結果を表す。ＳＣＲは哺乳類ではＲＮＡｉが生じないスクランブルｓｉＲＮＡをトランスフェクトさせた細胞を表す。 図７は、ｓｉＲＮＡ（Ｈ４又はＨ１０）をトランスフェクトさせた細胞における（ａ）Ｓｌｃ２５ａ１０遺伝子及び（ｂ）ＡＣＣ１遺伝子の発現量を表すグラフである。 図８は、Ｓｌｃ２５ａ１０遺伝子を過剰発現させた細胞におけるＡＣＣ１遺伝子の発現量を表すグラフである。 図９は、ｓｉＲＮＡ（Ｍ８）をトランスフェクトさせた細胞におけるマロニルＣｏＡのレベルを表すグラフである。 図１０は、脂肪細胞に分化した３Ｔ３−Ｌ１細胞の顕微鏡写真である。（ａ）は分化前の細胞を、（ｂ）は分化後の細胞を、（ｃ）は分化後の細胞をｓｃｒ−ｓｉＲＮＡで処理した細胞を、（ｄ）は分化後の細胞をｓｉＲＮＡ（Ｍ８）で処理した細胞を表す。 図１１は、各細胞における脂肪の蓄積量を表すグラフである。
以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。
先ず、本発明にかかる用語について説明する。
本発明における「発現レベル」とは、Ｓｌｃ２５ａ１０遺伝子の転写産物の絶対量又は相対量をいう。この場合、当該遺伝子は、ＤＮＡ又はｍＲＮＡのいずれをも含む。また、発現の検出対象がタンパク質の場合、その「発現レベル」とは、Ｓｌｃ２５ａ１０遺伝子の翻訳産物の絶対量又は相対量をいう。
また、本発明における「被検動物」としては、その種は特に限定されず、例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、サルが挙げられる。
また、本発明における「被検組織」とは、肥満検査を行う際に生体から抽出可能な組織であればその種類は特に限定されないが、肥満の影響が反映されやすいとの観点から、例えば、肝臓組織、脂肪組織、筋肉組織、血液組織であることが好ましい。また、組織の単離が容易であるとの観点から、前記組織の中でも血液組織であることが好ましい。ここで、これらの組織の由来となる動物種については特に制限されないが、本発明の主たる用途がヒトの臨床的使用であることから、ヒトであることが好ましい。
また、本発明における「被検細胞」についても、肥満の検査を行う際に生体から抽出可能な細胞であれば、その種類は特に限定されないが、肥満の影響が反映されやすいとの観点から、例えば、肝細胞、脂肪細胞（白色脂肪細胞、褐色脂肪細胞等）、筋肉細胞（筋芽細胞、骨格筋細胞平滑筋細胞等）、膵細胞（膵島細胞等）、血球細胞であることが好ましい。ここで、かかる組織の由来となる動物種については特に限定されないが、本発明の主たる用途がヒトの臨床的使用であることから、ヒトであることが好ましい。
さらに、本発明における「肥満」とは、脂肪組織が過剰に蓄積した状態と定義される一般的な肥満に加え、これに糖尿病や高血圧等の合併症又は内臓脂肪が伴う、いわゆる「肥満症」も含む。また、本発明における「肥満」は、薬物投与等による体重のコントロールを受けた場合に、もとの体重と比較して相対的に体重が増加した状態をも意味する。
また、本発明における「検査」とは、肥満であることを単に判断するのみならず、将来的な肥満を予測する場合をも含む。
次に、本発明にかかるＳｌｃ２５ａ１０について説明する。Ｓｌｃ２５ａ１０は褐色脂肪細胞のミトコンドリアに存在し、熱産生に関与するＵＣＰファミリーと３６〜３８％程度の相同性を有する。ＵＣＰは、ミトコンドリアにおいて熱の産生を引き起こすタンパク質である。具体的には、グルコースや脂肪酸が酸化されることによって生じたプロトンが、呼吸鎖酵素群によってミトコンドリア内膜から膜外に放出され、その結果、プロトン勾配が生じる。ＵＣＰは、プロトンを内膜内に運ぶチャネルとして機能し、かかるプロトン勾配を解消する。その結果、内膜内のプロトンによって脂肪酸等の酸化が亢進し、熱産生を促す。すなわち、ＵＣＰは、生体内のエネルギーの消費を促進する機能を有している。
本発明者らは、上述のＳｌｃ２５ａ１０とＵＣＰとの相同性の高さに反して、Ｓｌｃ２５ａ１０がミトコンドリアにおける熱産生においてＵＣＰとは逆の活性を有することを見出した。すなわち、Ｓｌｃ２５ａ１０は、ミトコンドリア内膜に存在し、内膜の内外間のプロトン勾配を上昇せしめる活性を有し、その結果、熱産生をせずにエネルギーを蓄積する機能を有する。従って、Ｓｌｃ２５ａ１０の機能を阻害することによりエネルギー消費が亢進され、肥満の解消に寄与するものと、本発明者らは考えている。
一方、本発明者らは、Ｓｌｃ２５ａ１０遺伝子の発現量の変化と脂肪酸合成に関与する分子の発現量の変化との間に相関関係があることをも見出した。すなわち、Ｓｌｃ２５ａ１０遺伝子の発現量を抑制した場合に脂肪酸合成に関与する遺伝子であるＡＣＣ１（アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ１）の発現量や、脂肪酸の前駆物質であるマロニルＣｏＡの量が減少し、一方、Ｓｌｃ２５ａ１０遺伝子の発現量を増加させた場合に増加する。これは、Ｓｌｃ２５ａ１０が脂肪酸の合成経路上に存在する、あるいは、当該合成経路に深く関与する分子であることを証明するものである。また、脂肪酸は脂質の構成成分であり、体内では、脂肪組織に入った遊離脂肪酸がトリアシルグリセロールに変化し、脂肪細胞に貯蔵される。すなわち、脂肪酸の合成を阻害することができればトリアシルグリセロールの脂肪細胞への貯蔵を阻害できる。Ｓｌｃ２５ａ１０や当該合成経路に関与する遺伝子又は分子は、その発現量を低下させることにより脂肪酸の合成能を低下させることができるため、当該遺伝子又は分子の挙動（発現量や活性など）を指標に、肥満に有効な化合物の評価や選択が可能となる。
（１）肥満の治療又は予防に有効な化合物の評価方法
本発明の肥満の治療又は予防に有効な化合物の評価方法について説明する。被検化合物を被検動物や被検細胞に投与、接触させることにより変動するＳｌｃ２５ａ１０遺伝子の発現量を測定したり、被検化合物をＳｌｃ２５ａ１０タンパク質に接触させて当該タンパク質の活性に及ぼす影響を検討したりすることにより、当該被検化合物の評価を行うことが可能となる。
すなわち、このような被検化合物の中には、細胞や組織に作用することにより、Ｓｌｃ２５ａ１０遺伝子の発現レベルやＳｌｃ２５ａ１０タンパク質の活性を正常化あるいはコントロールし、脂肪の蓄積や食欲のコントロール等、肥満の原因となるメカニズムの正常化を図ることができるものがあると考えられる。従って、以下に説明するような評価方法により、肥満の治療薬又は予防に有効な化合物を評価することが可能となる。
（Ａ）Ｓｌｃ２５ａ１０遺伝子の発現レベル調節能を指標とする評価方法
Ｓｌｃ２５ａ１０遺伝子の発現レベル調節能を指標とする第１の評価方法として、被検化合物を被検動物又は被検細胞に投与又は接触させ、当該被検化合物が被検動物又は被検細胞中でＳｌｃ２５ａ１０遺伝子あるいは当該遺伝子と機能的に等価な遺伝子の発現レベルを調節するか否かを確認する方法が挙げられる。本方法により、肥満の治療又は予防に有効な化合物を評価することが可能となる。
具体的には、以下の手順で被検化合物の評価を行う。先ず、被検化合物を被検動物又は被検細胞に投与又は接触させる。ここで、被検化合物としては、肥満の治療又は予防薬の候補化合物であれば、その構造や性質は問わず、化合物種も限定されない。被検化合物を被検動物に投与する方法としては特に制限はなく、具体的には、例えば、経口投与、非経口投与（例えば、経皮投与、筋肉内注射、静脈内注射、皮下注射）が挙げられる。また、被検化合物を被検細胞に接触させる方法としても特に制限はなく、具体的には、例えば、培養液や緩衝液（リン酸緩衝液等）等の溶液中で混合し両者を接触させる方法が挙げられる。
次に、被検化合物が被検動物又は被検細胞中でＳｌｃ２５ａ１０遺伝子あるいは当該遺伝子と機能的に等価な遺伝子の発現レベルを調節するか否かを確認する。
前記遺伝子の発現レベルの調節の有無の確認法としては、特に制限はなく、前述の投与又は接触の前を対照とし、当該遺伝子の発現量の変化をＲＴ−ＰＣＲのような遺伝子増幅法、ＤＮＡマイクロアレイを用いる方法又はノーザンハイブリダイゼーション法等によって検出・比較することにより実施することができる。また、前記遺伝子の発現調節領域とレポーター遺伝子との融合遺伝子を人為的に導入した動物又は細胞を用いてもよい。この場合、レポーター遺伝子としては、具体的には、例えば、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子又はグリーンフルオレッセンスプロテイン遺伝子が挙げられる。
ここで、「Ｓｌｃ２５ａ１０遺伝子と機能的に等価な遺伝子」とは、Ｓｌｃ２５ａ１０遺伝子と塩基配列は異なるものの、比較的高い相同性を示し、Ｓｌｃ２５ａ１０と同じ又は類似の活性を有する遺伝子を示す。ここで、前記相同性は、機能的に等価であれば特に制限はないが、塩基配列の相同性が７０〜１００％であることが好ましく、８０〜１００％であることがより好ましく、９０〜１００％であることが特に好ましい。相同性が前記下限より低い場合には、Ｓｌｃ２５ａ１０と同じ又は類似の機能を示さない可能性が高い傾向にある。しかしながら、塩基配列の相同性が前記下限未満であっても、Ｓｌｃ２５ａ１０に特有の機能を有するドメインと、当該ドメインに対応する塩基配列との相同性が高い場合にはＳｌｃ２５ａ１０遺伝子と同様又は類似の機能を有する場合がある。このような遺伝子は、塩基配列の相同性が前記範囲外であっても好適に使用可能である。また、比較的相同性の高い遺伝子とは、Ｓｌｃ２５ａ１０遺伝子における１又は２以上の塩基が自然若しくは人工的に置換、欠失、不可及び／又は挿入した遺伝子であってもよい。
被検化合物を投与又は接触させない場合に比べて、被検化合物を投与又は接触させた場合のＳｌｃ２５ａ１０遺伝子又はＳｌｃ２５ａ１０遺伝子と機能的に等価な遺伝子の発現レベルが３０％以上、好ましくは５０％以上低下した場合、当該被検化合物は肥満の治療又は予防に有効な化合物と評価できる。
また、Ｓｌｃ２５ａ１０遺伝子の発現レベル調節能を指標とする第２の評価方法として、被検化合物を、被検動物又は被検細胞に、投与又は接触させ、当該被検動物又は被検細胞中でＳｌｃ２５ａ１０遺伝子あるいは当該遺伝子と機能的に等価な遺伝子の発現レベルの変化を検出する方法が挙げられる。発現レベルの調節の有無のみならず、発現レベルの変化の程度を検出することにより、被検化合物の活性の強弱をも考慮した評価が可能となる。また、上述のように、Ｓｌｃ２５ａ１０遺伝子の発現レベルが低下すると、例えばＡＣＣ１やマロニルＣｏＡといった脂肪酸合成経路上の分子の発現量や存在量が低下し、結果的に脂肪酸の合成量が減少する。従って、脂肪酸合成能を低下せしめる化合物のスクリーニング等を行う場合には、前記第２の評価方法によって、Ｓｌｃ２５ａ１０遺伝子あるいは当該遺伝子と機能的に等価な遺伝子の発現レベルの低下を指標に評価を行うことが好ましい。
前記遺伝子の発現レベルの変化を検出する方法としては、特に制限はなく、前述の投与又は接触の前を対照とし、当該遺伝子の発現量の変化をＲＴ−ＰＣＲのような遺伝子増幅法、ＤＮＡマイクロアレイを用いる方法又はノーザンハイブリダイゼーション法等によって検出・定量することにより実施することができる。また、前記遺伝子の発現調節領域とレポーター遺伝子との融合遺伝子を人為的に導入した動物又は細胞を用いてもよい。この場合、レポーター遺伝子としては、具体的には、例えば、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子又はグリーンフルオレッセンスプロテイン遺伝子が挙げられる。
被検化合物を投与又は接触させない場合に比べて、被検化合物を投与又は接触させた場合のＳｌｃ２５ａ１０遺伝子又はＳｌｃ２５ａ１０遺伝子と機能的に等価な遺伝子の発現レベルが３０％以上、好ましくは５０％以上低下した場合、当該被検化合物は肥満の治療又は予防に有効な化合物と評価できる。
また、前記第２の方法に加えて、Ｓｌｃ２５ａ１０遺伝子の発現レベルの変化に伴って生じる、ＡＣＣ１の発現量、マロニルＣｏＡ存在量及び脂肪酸存在量のうち少なくとも一つの変化を検出する工程を含んでいてもよい。ここで、前記ＡＣＣ１は、ＡＣＣ１タンパク質及び遺伝子のいずれであってもよい。
ＡＣＣ１タンパク質や遺伝子の発現量の変化を検出する方法としては、特に制限はないが、例えば、ウエスタンブロッティング、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法、ＤＮＡチップ、ＲＴ−ＰＣＲが挙げられる。また、マロニルＣｏＡの存在量の変化を検出する方法としては、特に制限はないが、例えば、逆相クロマトグラフィー等で部分精製した細胞由来のマロニルＣｏＡを脂肪酸合成酵素（ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｓｙｎｔｈａｓｅ）及び放射線標識したアセチルＣｏＡと反応させ、生成された標識脂肪酸量を測定する方法が挙げられる。
被検化合物を投与又は接触させない場合に比べて、被検化合物を投与又は接触させた場合のＡＣＣ１遺伝子若しくはＡＣＣ１タンパク質の発現量又はマロニルＣｏＡ若しくは脂肪酸の存在量が５％以上、好ましくは１０％以上低下した場合、当該被検化合物は肥満の治療又は予防に有効な化合物と評価できる。
このように、Ｓｌｃ２５ａ１０遺伝子の発現量及びＡＣＣ１、マロニルＣｏＡ、脂肪酸の発現量や存在量を指標として化合物の評価を行うことにより、脂肪酸合成経路に直接作用する被検化合物の評価が可能となる。
（Ｂ）Ｓｌｃ２５ａ１０タンパク質の活性を指標とする評価方法
被検化合物を被検動物、被検細胞又はＳｌｃ２５ａ１０タンパク質に接触させ、被検化合物が当該タンパク質の活性に影響を与えるか否かを確認することにより、肥満の治療又は予防に有効な化合物を評価することが可能となる。
具体的には、以下の手順で被検化合物の評価を行う。先ず、被検動物、被検細胞又は被検化合物をＳｌｃ２５ａ１０タンパク質に接触させる。ここで、被検化合物としては、肥満の治療又は予防薬の候補化合物であれば、その構造や性質は問わず、化合物種も限定されない。被検化合物を被検動物に投与する方法としては特に制限はなく、具体的には、例えば、経口投与、非経口投与（例えば、経皮投与、筋肉内注射、静脈内注射、皮下注射）が挙げられる。また、被検化合物を被検細胞に接触させる方法としても特に制限はなく、具体的には、例えば、培養液や緩衝液（リン酸緩衝液等）等の溶液中で混合し両者を接触させる方法が挙げられる。また、タンパク質と被検化合物を接触させる方法としては、特に制限はなく、具体的には、例えば、緩衝液（リン酸緩衝液等）等の溶液中で混合し接触させる方法が挙げられる。
次に、被検化合物が当該タンパク質の活性に影響を与えるか否かを確認する。タンパク質の活性測定における条件は、使用するタンパク質の性質により適宜設定すればよい。このような条件としては、具体的には、例えば、Ｓｌｃ２５ａ１０タンパク質の場合には、ミトコンドリア内膜の内外間のプロトン勾配の変化等を指標とすることができる（例えば、Ｙｕ ＸＸ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ（２００１）３５３，３６９−３７５参照）。
被検化合物を投与又は接触させない場合に比べて、被検化合物を投与又は接触させた場合のＳｌｃ２５ａ１０タンパク質の活性が３０％以上、好ましくは５０％以上低下した場合、当該被検化合物は肥満の治療又は予防に有効な化合物と評価できる。
以上説明したような本発明の肥満の治療又は予防に有効な化合物の評価方法により、肥満の治療薬や診断薬のスクリーニングや、これらの薬剤の有効性又は安全性の評価、さらには、オーダーメイド治療における適切な薬剤の選択が可能となる。
（２）肥満の検査方法
次に本発明の肥満の検査方法について説明する。
（Ａ）Ｓｌｃ２５ａ１０遺伝子の発現レベルを測定することによる肥満の検査方法
被検組織又は被検細胞におけるＳｌｃ２５ａ１０遺伝子の発現レベルの変化を検出することにより、又は、発現レベルを測定することにより、当該被検組織又は被検細胞を抽出した生体（例えばヒト）が肥満であるか否かを検査・診断することが可能である。また、単に検査時の肥満の状態を検査するのみならず、将来的に肥満になるか否かを予測することも可能である。
以下に、本発明の検査の具体的な方法について説明する。先ず、検査対象となる生体より被検組織又は被検細胞を抽出する。このような抽出の方法としては特に制限はなく、公知の方法により抽出することができる。
次に、抽出された被検組織又は被検細胞から発現レベルの測定の対象となる遺伝子を調製する。Ｓｌｃ２５ａ１０遺伝子の発現レベルを測定するには、先ず、被検組織又は被検細胞からＳｌｃ２５ａ１０のＲＮＡ（ｔｏｔａｌ ＲＮＡ又はｍＲＮＡ）を調製する必要がある。このようなＲＮＡの調製は、公知の方法によって行うことができるが、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ ２ｎｄ ＥＤＩＴＩＯＮ（１９８９）（Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ著：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）７．３−７．３６を参照して行うことができる。こうして調製したＲＮＡを用いて、例えば、ＲＴ−ＰＣＲのような遺伝子増幅法、ＤＮＡマイクロアレイ（例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製ＤＮＡチップ）を用いる方法、ノーザンハイブリダイゼーション法により、その発現量を測定することができる。また、被検組織又は被検細胞を用いたイン サイチュ ハイブリダイゼーション（ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）等により、その発現量を測定することもできる。
また、Ｓｌｃ２５ａ１０遺伝子の発現レベルの変化を検出するには、前記の発現量の測定を当該発現量が変化すると予測される期間の前後（例えば、肥満治療薬の投与の前後）について行い、発現量の差を測定すればよい。具体的には、被検組織又は被検細胞において、前述したＳｌｃ２５ａ１０遺伝子の発現量が変化すると予測される期間の前後で、その発現レベルが有意に上昇した場合に、体重の増加があった又は将来的に増加する可能性があると診断できる。一方、前記発現レベルが減少した場合に体重の減少があった又は将来的に減少する可能性があると診断できる。
（Ｂ）Ｓｌｃ２５ａ１０タンパク質の発現レベルを測定することによる肥満の検査方法
被検組織又は被検細胞におけるＳｌｃ２５ａ１０タンパク質の発現レベルの変化を検出することにより、又は、発現レベルを測定することにより、当該被検組織又は被検細胞を抽出した生体（例えばヒト）が肥満であるか否かを検査・診断することが可能である。また、単に検査時の肥満状態を検査するのみならず、将来的に肥満又は痩せになりうるかを予測することも可能である。
以下、このような検査の具体的な方法について説明する。タンパク質の発現レベルを測定する方法としては、生体から単離したタンパク質を定量する方法やタンパク質の血中濃度を測定する方法があり、具体的な方法としては特に限定されない。生体から単離したタンパク質を定量する方法の具体例としては、以下のとおりである。先ず、被検組織又は被検細胞からＳｌｃ２５ａ１０タンパク質を調製する。このようなタンパク質の調製は、公知の方法によって行うことができる。こうして調製したタンパク質から、例えば、プロテインチップ（例えば、ＣＩＰＨＥＲＧＥＮ社製プロテインチップシステム）を用いる方法、免疫学的方法（例えば、ＥＬＩＳＡ、ＥＩＡ法、ウエスタンブロッティング法）により、その発現量を測定することができる。また、被検組織又は被検細胞を用いた免疫染色等によって、その発現量を測定することもできる。一方、タンパク質の血中濃度を測定する方法の具体例としては、生体から採取した血液を用いて、上記免疫学的方法等により、Ｓｌｃ２５ａ１０タンパク質を定量する方法が挙げられる。
以上のようにして、Ｓｌｃ２５ａ１０の遺伝子又はタンパク質の発現レベルを測定した後、その結果を解析することにより、被検体が肥満か又は痩せであるかを検査できる。すなわち、本発明より、Ｓｌｃ２５ａ１０タンパク質の発現レベルと体重は一定の相関関係を有することが明らかにしたため、上記検査結果と対照群（健常人等）におけるＳｌｃ２５ａ１０タンパク質の発現量とを比較することにより、肥満の程度を判断することが可能となる。また、本発明の検査方法によれば、単に検査時の肥満の状態を検査するのみならず、将来的な肥満又は痩せの可能性の予測も可能となる。
また、Ｓｌｃ２５ａ１０タンパク質の発現レベルの変化を検出するには、前記の発現量の測定を当該発現量が変化すると予測される期間の前後（例えば、肥満治療薬の投与の前後）について行い、発現量の差を測定すればよい。具体的には、被検組織又は被検細胞において、前述したＳｌｃ２５ａ１０タンパク質の発現量が変化すると予測される期間の前後で、その発現レベルが有意に上昇した場合に体重の増加があった又は将来的に増加する可能性があると診断できる。
（Ｃ）Ｓｌｃ２５ａ１０及び脂肪酸合成経路に関与する分子の相互作用に基づく肥満の検査方法
生体内において、Ｓｌｃ２５ａ１０遺伝子・タンパク質は、他の多くの分子と直接的又は間接的に相互作用して固有の機能を発揮している。例えば、本発明者らは、Ｓｌｃ２５ａ１０遺伝子の発現量と脂肪酸合成経路上の種々の分子（例えば、ＡＣＣ１やマロニルＣｏＡ）の変化量との間に相関があり、Ｓｌｃ２５ａ１０遺伝子の発現が増加することにより、脂肪酸合成経路上の分子の発現が増加すること、及び、Ｓｌｃ２５ａ１０遺伝子の発現が低下することにより、脂肪酸合成経路上の分子の発現が低下することを見出している。これは、Ｓｌｃ２５ａ１０遺伝子・タンパク質の発現量を測定することにより、脂肪酸合成経路の活性化状態を検出することができることを意味する。その結果、脂肪酸合成の促進に起因する脂肪の蓄積を予測・検査することが可能となる。
ここで、脂肪酸合成経路上の種々の分子の発現を検出する方法としては、特に制限はなく、遺伝子（例えば、ＡＣＣ１）であれば、ノーザンハイブリダイゼーションやＲＴ−ＰＣＲにより検出すればよく、マロニルＣｏＡであれば、マロニルＣｏＡを基質として脂肪酸合成反応をさせ、放射性同位体の取り込み量等を指標にマロニルＣｏＡの量を算出することができる。
このようにして検出された脂肪酸合成経路上の分子の変化量より、標準体重又は健常人における当該分子の発現量又は量と比較して、変化量が有意に上昇した場合に体重の増加があった又は将来的に増加する可能性があると診断できる。一方、前記変化量が減少した場合に体重の減少があった又は将来的に減少する可能性があると診断できる。
またＳｌｃ２５ａ１０の発現のみならず、Ｓｌｃ２５ａ１０タンパク質の活性を変化させた際に、これによって生じる脂肪酸合成経路上の分子の変化量を検出することにより、肥満の検査をすることもできる。
（Ｄ）Ｓｌｃ２５ａ１０遺伝子の遺伝的多型を検出する肥満の検査方法
Ｓｌｃ２５ａ１０遺伝子に遺伝的多型が存在する場合、その多型の有無や種類によりＳｌｃ２５ａ１０遺伝子又はタンパク質の発現レベルが変化したり、当該タンパク質の活性に異常が生じたりする場合がある。従って、このような遺伝的多型を検出することによりＳｌｃ２５ａ１０の発現や活性に関する知見を得、さらに、被検組織や被検細胞の由来となった被検体の肥満の検査を行うことができる。このような遺伝的多型としては、具体的には、例えば、ミニサテライト、マイクロサテライト、ＳＮＰ（ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ：一塩基多型）が挙げられる。
Ｓｌｃ２５ａ１０遺伝子における多型の検出は以下のようにして行うことができる。すなわち、Ｓｌｃ２５ａ１０遺伝子において、その発現量を制御する領域を検査対象となる肥満の被検体を対象として塩基配列を決定し、多型部位を検出する。検出された多型部位の対立遺伝子頻度を算出し、被検体集団において有意に増加又は減少している対立遺伝子を見出すことにより肥満と相関する多型を同定する。このようにして検出された遺伝的多型は、例えば、被検体由来のゲノムＤＮＡについて、多型部位の塩基配列の解析、多型部位に存在する塩基の種類に依存して変化するＤＮＡの物理化学的性質の差や制限酵素部位の相違を利用する方法、当該多型部位の検出に適当な検出用プローブを利用する方法及び質量分析法を利用した方法等によって臨床的に検出可能である。
（Ｅ）Ｓｌｃ２５ａ１０タンパク質と相互作用することによりＳｌｃ２５ａ１０遺伝子の発現量に影響を及ぼすタンパク質の発現量又は活性を検出することによる肥満の検査方法
生体内において、多くのタンパク質は他のタンパク質と相互作用することにより、所定の生理機能を発揮する。Ｓｌｃ２５ａ１０についても同様に、例えば、その発現を制御する転写因子等の作用を受けることにより発現量が制御され、所定の機能を発揮している。Ｓｌｃ２５ａ１０タンパク質と、当該Ｓｌｃ２５ａ１０タンパク質と相互作用することによりＳｌｃ２５ａ１０遺伝子の発現量に影響を及ぼすタンパク質の発現量やその活性とは一定の相関関係を有し、いずれか一方の挙動を検出することにより、他方の挙動を推測できる関係にある。
ここで、「相互作用」とは、Ｓｌｃ２５ａ１０タンパク質と別のタンパク質が直接的又は間接的に作用することをいい、例えば、Ｓｌｃ２５ａ１０タンパク質が別のタンパク質と物理的に接触することによりアミノ酸の修飾等を生じるような作用や、第３のタンパク質を介して相互作用し、間接的にＳｌｃ２５ａ１０タンパク質の発現に影響を及ぼすような作用が挙げられる。このようなタンパク質としては、例えば、Ｓｌｃ２５ａ１０タンパク質を介するシグナル伝達において、Ｓｌｃ２５ａ１０タンパク質の上流又は下流で生理的機能を発揮するタンパク質が挙げられる。また、このようなタンパク質の発現量又は活性を検出する方法としては、対象となるタンパク質の種類に応じて好適な手段を適宜選択すればよく、具体的な手段としては特に限定されない。
以上の（Ａ）〜（Ｅ）で説明したような本発明の肥満の検査方法によって、分子レベルで肥満又は痩せの診断が可能となるばかりか、将来的に肥満又は痩せになる可能性についても予測できることとなり、従来の診断方法と比較して、より的確な診断が可能となる。
（３）肥満又は痩せの治療、予防剤
Ｓｌｃ２５ａ１０遺伝子は、その発現量と体重とが相関関係を示す。また、上述したように、当該遺伝子は、脂肪酸の合成に関与し、当該遺伝子の発現が増加すると脂肪酸の合成は促進される関係にある。従って、当該遺伝子の発現レベルを正常レベルへと調節する化合物は肥満の治療又は予防に有用であるのみならず、例えば、痩せ、糖尿病、高血圧症、高脂血症、虚血性心疾患にも応用可能である。また、Ｓｌｃ２５ａ１０遺伝子の発現を阻害することにより脂肪酸の合成は阻害されることから、Ｓｌｃ２５ａ１０遺伝子の発現を阻害するか又はＳｌｃ２５ａ１０タンパク質の活性を低下させる化合物は、脂肪酸合成阻害剤として機能する。このような化合物としては、上述したような本発明の化合物の評価方法によって選択された化合物が挙げられる。これらの化合物を薬剤として使用するには、当該化合物を直接患者へ投与する以外に、公知の製剤学的方法により製剤化した医薬組成物として投与することもできる。製剤化するに際し、薬理学上許容される担体若しくは媒体としては、具体的には、例えば、滅菌水、生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定化剤、結合剤、滑沢剤、甘味料、香料又は着色剤が挙げられる。また、このような医薬組成物を患者に投与する方法としては、例えば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射等の他、鼻腔内的、経気管支的、筋肉的又は経口的な投与が挙げられる。医薬組成物の投与量は、患者の体重、年齢又は投与方法等により変動するが、当業者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。
（４）肥満又は痩せの検査薬、検査キット
Ｓｌｃ２５ａ１０タンパク質の発現量は、肥満又は痩せに基づく体重変化と相関関係を有する。従って、当該タンパク質に対する抗体を使用して被検細胞や被検組織中のタンパク質量を検出、測定することにより、肥満又は痩せの検査を簡便に行うことができる。ここで、「抗体」とは、抗原であるＳｌｃ２５ａ１０遺伝子産物に結合しうる抗体分子全体又はその断片をいう。このような抗体は、公知の方法によって製造することができ、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体のいずれであってもよい。また、当該抗体を用いた免疫学的測定法としては、公知の方法を使用すればよく、具体的には、例えば、蛍光抗体法、酵素抗体法が挙げられる。
また、このような抗体を含んだキットを製造し、本発明を実施することも可能である。キットの構成としては、当該抗体に加え、例えば、抗体を検出するために蛍光標識やラジオアイソトープで標識された２次抗体や抗原抗体反応を行う際に使用する緩衝液を備えていてもよい。
このような肥満又は痩せの検査薬を使用することにより、分子レベルでの診断が可能となるばかりか、将来的に肥満又は痩せになる可能性についても予測できることとなり、従来の診断方法と比較して、より的確な診断が可能となる。また、本発明の肥満又は痩せの検査キットを使用することにより、前述したような的確な診断を非常に簡便に実施することが可能となる。
（５）脂肪酸合成阻害方法及び肥満の治療又は予防方法
次に、本発明の脂肪酸合成阻害方法及び肥満の治療又は予防方法について説明する。既に述べたように、本発明者らは、Ｓｌｃ２５ａ１０遺伝子の発現を抑制した場合に脂肪酸合成に関与する遺伝子であるＡＣＣ１の発現量や、脂肪酸の前駆物質であるマロニルＣｏＡの量が減少することを見出した。したがって、Ｓｌｃ２５ａ１０遺伝子の発現量を低下させることにより、脂肪酸合成を阻害することか可能となり、ひいては、脂肪の合成を阻害することも可能である。
具体的には、以下の手順で脂肪酸合成阻害を行う。先ず、Ｓｌｃ２５ａ１０の発現量を低下させる物質を選択する。かかる物質としては、例えば、Ｓｌｃ２５ａ１０阻害剤として機能する化合物、Ｓｌｃ２５ａ１０の抗体、アンチセンスヌクレオチド及びＲＮＡｉに使用するｓｉＲＮＡが挙げられる。
次に、Ｓｌｃ２５ａ１０が存在する個体、組織、細胞に対して前記の物質を導入する。具体的には、対象が個体であれば、導入方法としては特に制限はないが、前記化合物等を、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射等の他、鼻腔内的、経気管支的、筋肉的又は経口的に導入する方法が挙げられる。また、対象が組織であれば、導入方法としては特に制限はないが、組織中への注入、緩衝液中での混合により導入する方法が挙げられる。さらに、対象が細胞であれば、導入方法としては特に制限はないが、緩衝液中での混合、エレクトロポレーション等が挙げられる。
より具体的には、ＲＮＡｉの場合、例えば、リポソームに封入したｓｉＲＮＡを細胞培養液に添加し細胞に接触させることで細胞内にｓｉＲＮＡを導入でき、ＲＮＡｉを起こすことができる（Ｎａｔｕｒｅ，４１１，４９４−４９８（２００１）、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．，１１４（Ｐｔ ２４），４５５７−４５６５（２００１）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，３０１（３），８０４−８０９，２００３）。Ｓｌｃ２５ａ１０のＲＮＡｉには、以下のｓｉＲＮＡを用いることができる：Ｈ１（配列番号３及び４）、Ｈ２（配列番号５及び６）、Ｈ３（配列番号７及び８）、Ｈ４（配列番号９及び１０）、Ｈ５（配列番号１１及び１２）、Ｈ８（配列番号１７及び１８）、Ｈ１０（配列番号２１及び２２）、Ｈ１１（配列番号２３及び２４）、Ｈ１２（配列番号２５及び２６）、Ｍ１（配列番号２７及び２８）、Ｍ２（配列番号２９及び３０）、Ｍ３（配列番号３１及び３２）、Ｍ５（配列番号３５及び３６）、Ｍ６（配列番号３７及び３８）、Ｍ７（配列番号３９及び４０）、Ｍ８（配列番号４１及び４２）、Ｍ９（配列番号４３及び４４）、Ｍ１０（配列番号４５及び４６）、Ｍ１１（配列番号４７及び４８）及びＭ１２（配列番号４９及び５０）。これらのｓｉＲＮＡを複数組み合わせて使用することによりＲＮＡｉを生じさせてもよい。これらの中でも、Ｈ４及びＭ８はＳｌｃ２５ａ１０の発現抑制作用が特に強いため、Ｓｌｃ２５ａ１０のＲＮＡｉに適している。
このようにＳｌｃ２５ａ１０の発現量を低下させることにより、脂肪酸の合成が阻害される。
また、かかる脂肪酸合成阻害方法を肥満の治療又は予防に応用することができる。すなわち、生体内でＳｌｃ２５ａ１０の発現量を低下させることにより脂肪酸の合成を阻害し、結果的に脂質の合成を抑制することにより肥満の治療又は予防が可能となる。
具体的には、以下の手順で肥満の治療又は予防を行う。先ず、Ｓｌｃ２５ａ１０の発現量を低下させる物質を選択する。かかる物質としては、例えば、Ｓｌｃ２５ａ１０阻害剤として機能する化合物、Ｓｌｃ２５ａ１０の抗体、アンチセンスヌクレオチド及びＲＮＡｉに使用するｓｉＲＮＡが挙げられる。
次に、このような物質を生体内に投与する。投与方法としては、特に制限はないが、例えば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射等の他、鼻腔内的、経気管支的、筋肉的又は経口的な投与方法が挙げられる。ＲＮＡｉを用いた具体的な方法については、脂肪酸合成阻害方法で説明した通りである。
（６）配列番号９及び１０の核酸からなるｓｉＲＮＡ及びそれを含むＳｌｃ２５ａ１０発現抑制剤、脂肪酸合成抑制剤、肥満の治療又は予防剤
既に述べたように、配列番号９及び１０の核酸からなるｓｉＲＮＡは、Ｓｌｃ２５ａ１０の発現を強く抑制する。したがって、このｓｉＲＮＡはＳｌｃ２５ａ１０発現抑制剤として用いることができ、また、脂肪酸合成抑制剤として用いることもでき、さらに、肥満の治療又は予防剤として用いることも可能である。
（７）配列番号４１及び４２の核酸からなるｓｉＲＮＡ及びそれを含むＳｌｃ２５ａ１０発現抑制剤、脂肪酸合成抑制剤、肥満の治療又は予防剤
既に述べたように、配列番号４１及び４２の核酸からなるｓｉＲＮＡは、Ｓｌｃ２５ａ１０の発現を強く抑制する。したがって、このｓｉＲＮＡはＳｌｃ２５ａ１０発現抑制剤として用いることができ、また、脂肪酸合成抑制剤として用いることもでき、さらに、肥満の治療又は予防剤として用いることも可能である。
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
（肥満モデル動物の作製）
製造例１：ニューロペプチドＹ（Ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅ Ｙ：ＮＰＹ）Ｙ５アゴニストｉ．ｃ．ｖ．投与マウス）
ＮＰＹ Ｙ５アゴニストを投与することにより肥満を呈するモデルマウスを以下の要領で作製した。９〜１２週齢の雄マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ：クレア社製）を、室温２３±２℃、湿度５５±１５％の条件下、１プラスチックゲージに１匹ずつ飼育した。また、飼育時の明暗のサイクルは１２時間とし、午前７時に点灯し、午後７時に消灯した。また、マウスには、飼料（ＣＥ−２（タンパク質：２５．４重量％、炭水化物：５０．３重量％、脂質：４．４重量％）：クレア社製）と水を自由に摂取させた。
マウスを８０ｍｇ／ｋｇペントバルビタールナトリウム（ダイナボット社製）で麻酔し、滅菌された２８ゲージの脳注入カニューレ（アルゼ（Ａｌｚｅｔ）社製）を右側脳質へ定位的に移植した。カニューレを、ブレグマより後方へ０．４ｍｍ、側方へ０．８ｍｍ、深さ２ｍｍの位置に、頭蓋骨に対し垂直に歯科用セメントで固定した。カニューレを、０．０５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む１０ｍＭのリン酸緩衝液で満たした浸透圧ポンプ（モデルナンバー２００２：アルゼ社製）にポリビニルクロライドチューブで接続した。１０ｍＭ ＰＢＳ（０．０５％ ＢＳＡ含む）にＤ−Ｔｒｙ３４ＮＰＹ（５マイクログラム／日になるように調製）を溶解した溶液をポンプに満たした後、マウスの背中の皮下に埋め込み連続注入した。また、抗生物質（５０ｍｇ／ｋｇのセファメジン（Ｃｅｆａｍｅｄｉｎｅ）：藤沢薬品製）を皮下注射した。
これらのマウスを、溶媒のみを注入し通常に摂食させたグループ（ｖｅｈｉｃｌｅ ｇｒｏｕｐ）、Ｄ−Ｔｒｙ３４ＮＰＹ（ＮＰＹ Ｙ５アゴニスト）を注入することによって摂食量を増加させ肥満にさせたグループ（ａｄ ｌｉｂ ｆｅｄ ｇｒｏｕｐ）、Ｄ−Ｔｒｙ３４ＮＰＹを注入したが摂食量はｖｅｈｉｃｌｅ ｇｒｏｕｐと同量に摂食制限をかけたグループ（ｐａｉｒ−ｆｅｄ ｇｒｏｕｐ）に分けた。
製造例２：ＭＣＨ投与マウス
ＭＣＨ（ｍｅｌａｎｉｎ−ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ）を投与することにより肥満を呈するモデルマウスを以下の要領で作製した。１３週齢の雄マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ：クレア社製）を、室温２３±２℃、湿度５５±１５％の条件下、１プラスチックゲージに１匹ずつ飼育した。また、飼育時の明暗のサイクルは１２時間とし、午前７時に点灯し、午後７時に消灯した。また、マウスには、飼料（ＣＥ−２（タンパク質：２５．４重量％、炭水化物：５０．３重量％、脂質：４．４重量％）：クレア社製）と水は自由に摂取させた。マウスが環境に適応した頃、飼料としてＭＨＦ（タンパク質：１５．０重量％、炭水化物：５２．４重量％、脂質：３２．６重量％、オリエンタルバイオサービス社製）を与えた。
マウスを８０ｍｇ／ｋｇペントバルビタールナトリウム（ダイナボット社製）で麻酔し、滅菌された２８ゲージの脳注入カニューレ（アルゼ（Ａｌｚｅｔ）社製）を右側脳質へ定位的に移植した。カニューレはブレグマより後方へ０．４ｍｍ、側方へ０．８ｍｍ、深さ２ｍｍの位置に、頭蓋骨に対し垂直に歯科用セメントで固定した。カニューレを、３０％プロピレングリコールで満たした浸透圧ポンプ（モデルナンバー２００２：アルゼ社製）にポリビニルクロライドチューブで接続した。ポンプはマウスの背中の皮下に埋め込み、抗生物質を皮下注射した。
これらのマウスを、平均体重を一致させた３つのグループ（溶媒のみを注入したグループ（ｖｅｈｉｃｌｅ ｇｒｏｕｐ）、ＭＣＨを注入したグループ（ａｄ ｌｉｂ ｆｅｄ ｇｒｏｕｐ）、ＭＣＨを注入しペアフィードとしたグループ（ｐａｉｒ−ｆｅｄ ｇｒｏｕｐ））に分けた。続いて、エーテル麻酔下で、ポンプをＭＣＨ（３マイクログラム／日）又は溶媒（３０％プロピレングリコール）に置き換えた。
製造例３：ＤＩＯ（Ｄｉｅｔ ｉｎｄｕｃｅｄ ｏｂｅｓｉｔｙ）マウス
１８週齢のマウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ：クレア社製）を、室温２３±２℃、湿度５５±１５％の条件下、１プラスチックゲージに１匹ずつ飼育した。このマウスに高カロリー食であるＭＨＦ（タンパク質：１８．２重量％、炭水化物：５５．６重量％、脂質：１５．５重量％）を６ヶ月間に渡って与え、肥満を呈するモデルマウス（ＤＩＯマウス）を作製した。なお、実施例中、「ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ＭＦＤ」は、これ以上体重が増えないようになるまでＭＨＦを与えて飼育したマウスを指す。
また、前記のマウスにＭＨＦよりさらに高い脂肪を含有する高カロリー食であるＨＦＤ（タンパク質：２０．８重量％、炭水化物：３８．５９重量％、脂質：３２．８８重量％）を与えたＤＩＯマウス（ＨＦＤ）も作製した。
製造例４：食事制限をしたマウス
マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ、１７週齢）を１ケージに１匹ずつ個別に飼育した。また、エサは普通食（ＣＡ−１、ＣＬＥＡ）を与えた。摂食制限は、以下のようなスケジュールで行った。すなわち、エサ（ＣＡ−１）を１日につき３時間（１０：００〜１３：００）だけ与え、水は自由に摂取できるようにした。摂食時間の前後で餌の重量を測定し、その差を摂食量とした。また、摂食制限をしている期間は、体重、外見の観察等をモニターした。なお、条件付けに失敗したと思われるマウス（短期間に極度な体重減少（例えば２０％程度の減少）が見られるマウス）は実験には使用しなかった。かかる条件下でマウスを７日間飼育した後、白色脂肪細胞を摘出した。
実施例１〜５及び比較例１〜２：白色脂肪細胞におけるＳｌｃ２５ａ１０の発現
製造例１〜４において製造したモデルマウスを用いて、白色脂肪細胞（ＷＡＴ）中のＳｌｃ２５ａ１０遺伝子の発現量を測定した。発現量の測定は、各モデルマウスの白色脂肪細胞から抽出したＲＮＡを、ｍｏｕｓｅ Ｕ７４Ａチップ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）及びｍｏｕｓｅ２５Ｋ１．８チップ（Ｒｏｓｓｅｔｔａ社製）を用いて処理することにより行った。
非処理のＣ５７ＢＬ／６Ｎの白色脂肪細胞におけるＳｌｃ２５ａ１０の発現量を１とした場合の、ＤＩＯマウス（ＤＩＯ）、Ｄ−Ｔｒｙ３４ＮＰＹ投与マウス（ＮＰＹ（ＦＦ））、Ｄ−Ｔｒｙ３４ＮＰＹｐａｉｒ ｆｅｅｄｉｎｇ投与群マウス（ＮＰＹ（ＰＦ））、ＭＣＨ投与マウス（ＭＣＨ（ＦＦ））、ＭＣＨ ｐａｉｒ ｆｅｅｄｉｎｇ投与群マウス（ＭＣＨ（ＰＦ））、食事制限をしたマウス（Ｆａｓｔｉｎｇ）及びＮＰＹ Ｙ５アンタゴニスト投与マウス（Ｙ５ａｎｔ）におけるＳｌｃ２５ａ１０遺伝子の発現量を表１に示す。
表１より明らかなように、肥満モデルマウスではＳｌｃ２５ａ１０の発現量が増加し、食事制限をしたマウス及びＮＰＹ Ｙ５アンタゴニストを投与したマウスでは、その発現量が低下していた。従って、ＮＰＹ Ｙ５アンタゴニストの発現量と体重とが相関関係を有していることが明らかとなった。
Figure 2005012570
実施例６：Ｓｌｃ２５ａ１０とミトコンドリアプロトン勾配との関連
Ｓｌｃ２５ａ１０と高い相同性を有するＵＣＰは、ミトコンドリアの膜電位を変化させることにより熱産生を行う。そこで、Ｓｌｃ２５ａ１０についてもミトコンドリアのプロトン勾配について検討した。
先ず、ＨＥＫ２９３細胞を６ｗｅｌｌプレートに２×１０６／ｗｅｌｌの密度で播種した。２４時間後、ｐｃＤＮＡ３．１ベクターにクローニングしたＳｌｃ２５ａ１０遺伝子を、リポフェクトアミン２０００を用いて、前記の細胞に導入した。また、ネガティブコントロールとしてベクターのみを導入した細胞、並びに、ポジティブコントロールとしてマウスＵＣＰ１を導入した細胞及びヒトＵＣＰ３を導入した細胞を準備した。
遺伝子を導入して４８時間後にミトコンドリア勾配に感受性を示す試薬であるＤｉＯＣ６（３−３’−Ｄｉｈｅｘｙｌｏｘａｃａｒｂｏｃｙａｎｉｎｅ ｉｏｄｉｄｅ）を用いて染色を行った。当該染色は、細胞を０．３μＭ ＤｉＯＣ６で２０分間染色した後、ＰＢＳで２回洗浄することにより行った。なお、ＤｉＯＣ６は、プロトン勾配が高い場合にはミトコンドリアに結合する量が多くなり、強い蛍光を発する。一方、プロトン勾配が低い場合にはミトコンドリアに結合する量は減少し、蛍光強度は弱くなる。
図１（ａ）は、細胞内ミトコンドリアプロトン勾配をｕｎｃｏｕｐｌｉｎｇさせるＣＣＣＰ（ｃａｒｂｏｎｙｌ ｃｙａｎｉｄｅ ｍ−ｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ−ｈｙｄｒａｚｏｎｅ）で処理したＨＥＫ２９３細胞をＤｉＯＣ６で染色した後の共焦点顕微鏡写真であり、図１（ｂ）は、ＣＣＣＰ非処理のＨＥＫ２９３細胞の写真である。非処理のＨＥＫ２９３細胞では、細胞内ミトコンドリアが緑状のドットに染色されていることがわかる。一方、ＣＣＣＰ処理細胞では、蛍光強度が大きく低下していることがわかる。従って、ミトコンドリアがプロトン勾配特異的に染色されていることが確認できた。
ＤｉＯＣ６の蛍光強度、すなわち、ミトコンドリアプロトン勾配の定量化は、以下の２つの方法により行った。
（１）フローサイトメーターによる解析
ＤｉＯＣ６で染色した細胞をリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で洗浄した後、フローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社製：Ｅｐｉｃｓ Ｅｌｉｔｅ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）（アルゴンレーザー：４８８ｎｍ、バンドパスフィルター：５２２ｎｍ）を用いてその蛍光強度を測定した。
フローサイトメーターの解析結果を図２に表す。（ａ）はＣＣＣＰで処理したＨＥＫ２９３細胞を、（ｂ）は非処理のＨＥＫ２９３細胞を、（ｃ）はＳｌｃ２５ａ１０を導入したＨＥＫ２９３細胞を表す。図２（ａ）〜（ｃ）に示すとおり、Ｓｌｃ２５ａ１０遺伝子を導入したＨＥＫ２９３細胞の蛍光強度を示すヒストグラムは、コントロールと比較してシフト（蛍光強度が増加）しており、プロトン勾配が上昇したことが確認できた。表２に、それぞれの試料の蛍光強度の平均値を示す。
Figure 2005012570
（２）フルオロメーターによる解析
ＤｉＯＣ６で染色した細胞をＰＢＳで洗浄した後、溶解し、遠心分離することによって細胞抽出液を準備した。この細胞抽出液をフルオロメーター（Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製：Ｃｙｔｏｆｌｕｏｒ Ｓｅｒｉｅｓ ４０００ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｍｕｌｔｉ Ｗｅｌｌ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ）（Ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ：４８５ｎｍ、Ｅｍｉｓｓｉｏｎ：５２０ｎｍ）を用いて解析した。
ベクターのみを導入したコントロール細胞の蛍光強度を１００として、各試料の相対値を求めたところ、図３に示すとおり、マウスＵＣＰ１又はヒトＵＣＰ３を導入した細胞では２０％程度のプロトン勾配の低下が観察されたのに対し、マウス又はヒトＳｌｃ２５ａ１０遺伝子を導入した細胞では２０％程度のプロトン勾配の上昇が観察された。この結果より、Ｓｌｃ２５ａ１０のプロトン勾配に対する活性はＵＣＰとは逆の作用を有するものであり、その活性はＵＣＰと同程度の強度であることが確認できた。
実施例７：Ｓｌｃ２５ａ１０遺伝子の発現
脂肪組織、骨格筋、脾臓、肺、腎臓、脳、心臓、精巣、肝臓のｍＲＮＡがトランスファーされたノーザン解析用のメンブレン（バイオチェーン社製、クロンテック社製）を用いて、Ｓｌｃ２５ａ１０遺伝子の発現部位の解析を行った。ここで、プローブとして３２Ｐで標識されたマウスＳｌｃ２５ａ１０の全長ｃＤＮＡを使用し、ＱｕｉｃｋＨＹＢ（ストラタジーン社製）を緩衝液としてハイブリダイゼーションを行った。
図４に示すとおり、Ｓｌｃ２５ａ１０遺伝子は脂肪組織に非常に強く発現し、腎臓及び肝臓にも若干発現していることが確認された。
実施例８：Ｓｌｃ２５ａ１０の発現抑制によるＡＣＣ１の挙動
（１）脂肪酸合成におけるＳｌｃ２５ａ１０の役割
脂肪細胞への分化能を有する３Ｔ３−Ｌ１細胞を用いて、分化の前後でＳｌｃ２５ａ１０遺伝子とＡＣＣ１遺伝子の発現の間に相関があるかどうかを確認した。６ウェルプレートに３Ｔ３−Ｌ１細胞を播種し、２日後にコンフルエントになったところで、インスリン、デキサメタゾン及びＩＢＭＸ（３−イソブチル−１−メチルキサンチン）を含む分化誘導培地にて脂肪細胞へと分化させた。分化から２日後及び４日後に、それぞれｓｉＲＮＡ（Ｍ８）で３時間、Ｓｌｃ２５ａ１０の発現抑制を行った。分化８日後に相関を調べた。図５（ａ）及び（ｂ）に示すように、３Ｔ３−Ｌ１を脂肪に分化させた場合に、Ｓｌｃ２５ａ１０遺伝子及びＡＣＣ１遺伝子のいずれについても、その発現量が増加することが確認できた。ＡＣＣ１の発現の増加は脂肪酸合成が亢進していることの指標となることから、脂肪酸合成の亢進とＳｌｃ２５ａ１０の発現との間に密接な関係があることが確認できた。
（２）ｓｉＲＮＡのトランスフェクション及び定量的ＲＴ−ＰＣＲ
先ず、サイレンサーｓｉＲＮＡコンストラクションキット（アンビオン社製）を用いてｓｉＲＮＡを合成した。次に、ヒト又はマウスのＳｌｃ２５ａ１０に最適な配列を決定するため、それぞれ１２種の配列をＳｌｃ２５ａ１０の発現抑制を指標に検討した。各ｓｉＲＮＡをトランスフェクトした細胞における、Ｓｌｃ２５ａ１０遺伝子の相対発現量を図６（ａ）及び（ｂ）に示す。この結果から、以後の実験にはｓｉＲＮＡとしてＨ４、Ｈ１０及びＭ８を用いることとした。
各ｓｉＲＮＡの配列は以下のとおりである。「ポジション」は、ヒトＳｌｃ２５ａ１０遺伝子（ＮＭ＿０１２１４０）においてそのｓｉＲＮＡがどの核酸番号の位置に該当するかを示す。
Ｈ１（ポジション １８６）
センス：ＡＡＣＴＧＣＧＴＣＴＧＣＡＧＡＴＧＣＡＣＣＣＣＴＧＴＣＴＣ（配列番号３）
アンチセンス：ＡＡＧＧＴＧＣＡＴＣＴＧＣＡＧＡＣＧＣＡＧＣＣＴＧＴＣＴＣ（配列番号４）
Ｈ２（ポジション ４６５）
センス：ＡＡＧＴＣＧＴＴＣＴＧＣＡＴＣＣＴＧＡＣＧＣＣＴＧＴＣＴＣ（配列番号５）
アンチセンス：ＡＡＣＧＴＣＡＧＧＡＴＧＣＡＧＡＡＣＧＡＣＣＣＴＧＴＣＴＣ（配列番号６）
Ｈ３（ポジション ５１３）
センス：ＡＡＡＴＣＣＡＧＣＧＣＡＴＧＧＧＣＧＴＡＧＣＣＴＧＴＣＴＣ（配列番号７）
アンチセンス：ＡＡＣＴＡＣＧＣＣＣＡＴＧＣＧＣＴＧＧＡＴＣＣＴＧＴＣＴＣ（配列番号８）
Ｈ４（ポジション ５５６）
センス：ＡＡＡＣＡＧＴＣＴＣＣＴＧＡＧＡＣＣＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣ（配列番号９）
アンチセンス：ＡＡＧＡＧＧＧＴＣＴＣＡＧＧＡＧＡＣＴＧＴＣＣＴＧＴＣＴＣ（配列番号１０）
Ｈ５（ポジション ６５１）
センス：ＡＡＧＧＴＧＣＴＡＡＧＧＡＣＣＡＧＣＴＧＣＣＣＴＧＴＣＴＣ（配列番号１１）
アンチセンス：ＡＧＣＡＧＣＴＧＧＴＣＣＴＴＡＧＣＡＣＣＣＣＴＧＴＣＴＣ（配列番号１２）
Ｈ６（ポジション ７８０）
センス：ＡＡＣＴＧＡＴＡＣＴＣＣＣＣＣＴＴＧＧＡＧＣＣＴＧＴＣＴＣ（配列番号１３）
アンチセンス：ＡＡＣＴＣＣＡＡＧＧＧＧＧＡＧＴＡＴＣＡＧＣＣＴＧＴＣＴＣ（配列番号１４）
Ｈ７（ポジション ９４５）
センス：ＡＡＧＧＣＴＧＧＴＣＡＧＧＡＴＧＧＣＡＣＴＣＣＴＧＴＣＴＣ（配列番号１５）
アンチセンス：ＡＡＡＧＴＧＣＣＡＴＣＣＴＧＡＣＣＡＧＣＣＣＣＴＧＴＣＴＣ（配列番号１６）
Ｈ８（ポジション １０１０）
センス：ＡＡＧＴＧＣＴＧＧＧＣＴＴＧＧＧＡＣＴＣＴＣＣＴＧＴＣＴＣ（配列番号１７）
アンチセンス：ＡＡＡＧＡＧＴＣＣＣＡＡＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＣＴＧＴＣＴＣ（配列番号１８）
Ｈ９（ポジション １３１５）
センス：ＡＡＧＴＧＣＴＧＧＡＡＧＡＴＧＣＴＧＣＴＣＣＴＧＴＣＴＣ（配列番号１９）
アンチセンス：ＡＡＡＧＴＧＣＴＧＧＡＡＧＡＴＧＣＴＧＣＴＣＣＴＧＴＣＴＣ（配列番号２０）
Ｈ１０（ポジション １４２６）
センス：ＡＡＧＡＧＧＡＣＡＴＧＧＡＡＧＧＴＣＴＧＧＣＣＴＧＴＣＴＣ（配列番号２１）
アンチセンス：ＡＡＣＣＡＧＡＣＣＴＴＣＣＡＴＧＴＣＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣ（配列番号２２）
Ｈ１１（ポジション １６３４）
センス：ＡＡＧＣＴＧＧＴＧＡＧＴＧＧＡＧＡＧＧＣＴＣＣＴＧＴＣＴＣ（配列番号２３）
アンチセンス：ＡＡＡＧＣＣＴＣＴＣＣＡＣＴＣＡＣＣＡＧＣＣＣＴＧＴＣＴＣ（配列番号２４）
Ｈ１２（ポジション １８７０）
センス：ＡＡＡＧＣＴＣＣＣＧＧＣＡＴＴＴＡＴＴＧＡＣＣＴＧＴＣＴＣ（配列番号２５）
アンチセンス：ＡＡＴＣＡＡＴＡＡＡＴＧＣＣＧＧＧＡＧＣＴＣＣＴＧＴＣＴＣ（配列番号２６）。
同様に、マウスＳｌｃ２５ａ１０遺伝子（ＮＭ＿０１３７７０）に対するｓｉＲＮＡの塩基配列を以下に示す。
Ｍ１（ポジション ２０９）
センス：ＡＡＴＴＧＧＧＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＣＡＣＣＣＣＴＧＴＣＴＣ（配列番号２７）
アンチセンス：ＡＡＧＧＴＧＣＡＴＴＴＧＣＡＧＡＣＣＣＡＡＣＣＴＧＴＣＴＣ（配列番号２８）
Ｍ２（ポジション ３５８）
センス：ＡＡＴＣＣＣＧＣＡＴＧＧＴＣＴＣＧＴＡＧＡＣＣＴＧＴＣＴＣ（配列番号２９）
アンチセンス：ＡＡＴＣＴＡＣＧＡＧＡＣＣＡＴＧＣＧＧＧＡＣＣＴＧＴＣＴＣ（配列番号３０）
Ｍ３（ポジション ４８８）
センス：ＡＡＧＴＣＧＴＴＣＴＧＣＡＴＣＣＴＧＡＣＡＣＣＴＧＴＣＴＣ（配列番号３１）
アンチセンス：ＡＡＴＧＴＣＡＧＧＡＴＧＣＡＧＡＡＣＧＡＣＣＣＴＧＴＣＴＣ（配列番号３２）
Ｍ４（ポジション ５３６）
センス：ＡＡＡＴＣＣＡＧＧＧＣＡＴＧＡＧＡＧＴＡＧＣＣＴＧＴＣＴＣ（配列番号３３）
アンチセンス：ＡＡＣＴＡＣＴＣＴＣＡＴＧＣＣＣＴＧＧＡＴＣＣＴＧＴＣＴＣ（配列番号３４）
Ｍ５（ポジション ６７４）
センス：ＡＡＡＧＴＧＣＴＧＡＧＧＡＣＣＡＧＴＴＧＣＣＣＴＧＴＣＴＣ（配列番号３５）
アンチセンス：ＡＡＧＣＡＡＣＴＧＧＴＣＣＴＣＡＧＣＡＣＴＣＣＴＧＴＣＴＣ（配列番号３６）
Ｍ６（ポジション ７８８）
センス：ＡＡＧＧＡＧＴＴＣＡＴＣＡＧＧＣＧＡＧＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣ（配列番号３７）
アンチセンス：ＡＡＧＡＣＴＣＧＣＣＴＧＡＴＧＡＡＣＴＣＣＣＣＴＧＴＣＴＣ（配列番号３８）
Ｍ７（ポジション ９６８）
センス：ＡＡＡＴＧＴＣＡＧＧＴＧＧＴＴＧＧＣＡＣＴＣＣＴＧＴＣＴＣ（配列番号３９）
アンチセンス：ＡＡＡＧＴＧＣＣＡＡＣＣＡＣＣＴＧＡＣＡＴＣＣＴＧＴＣＴＣ（配列番号４０）
Ｍ８（ポジション １１５９）
センス：ＡＡＧＴＧＧＣＡＣＣＴＣＴＧＣＣＣＴＡＣＴＣＣＴＧＴＣＴＣ（配列番号４１）
アンチセンス：ＡＡＡＧＴＡＧＧＧＣＡＧＡＧＧＴＧＣＣＡＣＣＣＴＧＴＣＴＣ（配列番号４２）
Ｍ９（ポジション １３１２）
センス：ＡＡＡＧＣＡＧＧＡＡＡＣＧＡＡＣＴＣＧＧＣＣＣＴＧＴＣＴＣ（配列番号４３）
アンチセンス：ＡＡＧＣＣＧＡＧＴＴＣＧＴＴＴＣＣＴＧＣＴＣＣＴＧＴＣＴＣ（配列番号４４）
Ｍ１０（ポジション １４８１）
センス：ＡＡＣＴＣＴＣＣＴＧＡＡＧＧＣＡＣＴＡＣＣＣＣＴＧＴＣＴＣ（配列番号４５）
アンチセンス：ＡＡＧＧＴＡＧＴＧＣＣＴＴＣＡＧＧＡＧＡＧＣＣＴＧＴＣＴＣ（配列番号４６）
Ｍ１１（ポジション １６６１）
センス：ＡＡＧＴＧＴＧＡＧＧＧＡＣＡＣＡＧＡＣＡＧＣＣＴＧＴＣＴＣ（配列番号４７）
アンチセンス：ＡＡＣＴＧＴＣＴＧＴＧＴＣＣＣＴＣＡＣＡＣＣＣＴＧＴＣＴＣ（配列番号４８）
Ｍ１２（ポジション １８２７）
センス：ＡＡＴＴＧＡＧＧＧＡＡＡＡＣＡＧＧＣＴＧＣＣＣＴＧＴＣＴＣ（配列番号４９）
アンチセンス：ＡＡＧＣＡＧＣＣＴＧＴＴＴＴＣＣＣＴＣＡＡＣＣＴＧＴＣＴＣ（配列番号５０）。
次に、ｓｉＲＮＡを導入した細胞を準備した。ｓｉＲＮＡのトランスフェクションに際して、６穴プレートに２×１０４細胞／ｗｅｌｌの濃度で播種した。２４時間後、ｓｉＲＮＡ（Ｈ４又はＨ１０）をオリゴフェクタミン（Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ：インビトロジェン社製）を用いて細胞にトランスフェクションした。トランスフェクションの２日後、細胞を回収し、ＲＮｅａｓｙ（キアゲン社製）を用いてＲＮＡを調製した。調製したＲＮＡから定量的ＲＴ−ＰＣＲ（アプライドバイオシステム社製）によりｃＤＮＡを調製し、Ｓｌｃ２５ａ１０及びＡＣＣ１の発現量を定量した。
図７（ａ）及び（ｂ）に示すように、ＲＮＡｉによりＳｌｃ２５ａ１０遺伝子の発現を抑制した場合に、ＡＣＣ１遺伝子の発現もそれに比例して抑制されることが確認できた。
実施例９：Ｓｌｃ２５ａ１０の強制発現によるＡＣＣ１の挙動
次に、Ｓｌｃ２５ａ１０遺伝子を強制発現させ、ＨＥＫ２９３細胞における発現を増加させた場合にＡＣＣ１の発現がどのような挙動を示すかを検討した。
先ず、Ｓｌｃ２５ａ１０の発現ベクターを、ヒトＳｌｃ２５ａ１０遺伝子をｐｃＤＮＡ３．１（インビトロジェン社製）にクローニングすることにより調製した。この発現ベクターをＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクションし、安定的にＳｌｃ２５ａ１０を発現する細胞株（Ｈ１９クローン及びＨ４１クローン）を樹立した。当該細胞株（１０６細胞）からＲＮＡを調製し、調製したＲＮＡから定量的ＲＴ−ＰＣＲによりＳｌｃ２５ａ１０及びＡＣＣ１の発現レベルを測定した。図８に示すように、Ｓｌｃ２５ａ１０遺伝子を強制発現させた場合、対照と比較してＡＣＣ１遺伝子の発現も増加していることが確認できた。
実施例１０：Ｓｌｃ２５ａ１０の発現によるマロニルＣｏＡ量の挙動
１０７細胞／ｄｉｓｈの濃度で培養したＨｅｐＧ２細胞をトリプシン処理し、遠心分離することにより細胞を回収した。得られた細胞のペレットにトリクロロ酢酸（１０％：８００μＬ）を加え、３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離することにより可溶化画分を抽出した。マロニルＣｏＡの部分精製のために、抽出物を逆相クロマトグラフィー（Ｓｅｐ−Ｐａｋ Ｃ１８）で精製した。得られた溶出液を乾燥させた後、１００μＬの水に溶解した。マロニルＣｏＡ（５０μＬ）を含む試料を脂肪酸シンセース（ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｓｙｎｔｈａｓｅ）及び放射線標識したアセチルＣｏＡと反応させ、脂肪酸を合成した。脂肪酸を石油エーテルで抽出し、放射線標識された脂肪酸の放射活性をシンチレーションカウンターにより測定した。
図９に示すように、Ｓｌｃ２５ａ１０遺伝子の発現を抑制した場合に、マロニルＣｏＡの生成量は低下することが確認できた。また、脂肪酸の生成は、通常、マロニルＣｏＡと比例的な挙動を示すことから、Ｓｌｃ２５ａ１０遺伝子の発現と脂肪酸の生成量との間にも同様の関係があるものと考えられた。
実施例１１：脂肪蓄積の同定
３Ｔ３−Ｌ１細胞を用いて、脂肪の蓄積を解析した。
６ウェルプレートに３Ｔ３−Ｌ１細胞を播種し、２日後にコンフルエントになったところで、インスリン、デキサメタゾン及びＩＢＭＸ（３−イソブチル−１−メチルキサンチン）を含む分化誘導培地にて脂肪細胞へと分化させた。分化から２日後及び４日後に、それぞれｓｉＲＮＡ（Ｍ８）で３時間、Ｓｌｃ２５ａ１０の発現抑制を行った。分化から８日後に、蓄積した脂肪を０．１７５％のオイルレッドＯで染色し、ＰＢＳで洗浄した。図１０は、脂肪細胞に分化した３Ｔ３−Ｌ１細胞の顕微鏡である。
また、脂肪の蓄積量を定量するため、染色した脂肪細胞を１ｍＬのプロパノールで処理し、蓄積した脂肪を溶出させた。各細胞における脂肪の蓄積量の定量結果を図１１に示す。図１０及び１１に示した結果から明らかなように、ＲＮＡｉでＳｌｃ２５ａ１０の発現抑制を行ったところ、脂肪の蓄積量が減少した。
以上説明したように、本発明の化合物の評価方法又は検査方法によれば、肥満の治療薬のスクリーニング等、化合物の評価方法を提供することが可能となる。また、分子レベルで判断可能な肥満の検査方法を提供することが可能となる。従って、抗肥満薬の開発や臨床における肥満の診断など、生活習慣病を一例とする医療の分野において、新たな医薬や診療形態を提供することが可能となる。
また、本発明によれば、長鎖脂肪鎖伸長酵素活性を抑制する活性を有する物質（例えば、ｓｉＲＮＡ、低分子化合物、タンパク質、抗体など）を用いた代謝系疾患、循環器系疾患、中枢神経系疾患などの治療・予防方法を提供することが可能となり、また、かかる物質を含有する治療・予防剤を提供することが可能となる。代謝系疾患としては、例えば、肥満症、糖尿病、ホルモン分泌異常、高脂血症、通風、脂肪肝などが挙げられる。循環器疾患としては、例えば、狭心症、急性・うっ血性心不全、心筋梗塞、冠状動脈硬化症、高血圧、腎臓病、電解質異常などが挙げられる。中枢神経系疾患としては、過食症などが挙げられる。

Claims (30)

  1. 被検化合物を、被検動物又は被検細胞に、投与又は接触させる工程と、
    該被検動物又は該被検細胞中でＳｌｃ２５ａ１０遺伝子あるいは該遺伝子と機能的に等価な遺伝子の発現レベルの変化を検出する工程と、
    を含むことを特徴とする肥満の治療又は予防に有効な化合物の評価方法。
  2. 被検化合物を、Ｓｌｃ２５ａ１０遺伝子の発現調節領域とレポーター遺伝子との融合遺伝子を有する被検動物又は被検細胞に投与又は接触させる工程と、
    該レポーター遺伝子の被検動物又は被検細胞中での発現レベルの変化を検出する工程と、
    を含むことを特徴とする肥満の治療又は予防に有効な化合物の評価方法。
  3. 前記発現レベルの変化が発現レベルの低下であることを特徴とする請求項１又は２に記載の化合物の評価方法。
  4. ＡＣＣ１の発現量、マロニルＣｏＡ存在量及び脂肪酸存在量のうち少なくとも一つの変化を検出する工程をさらに含むことを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物の評価方法。
  5. 被検化合物を、被検動物又は被検細胞に、投与又は接触させる工程と、
    該被検化合物が、Ｓｌｃ２５ａ１０タンパク質の活性に影響を与えるか否かを確認する工程と、
    を含むことを特徴とする肥満の治療又は予防に有効な化合物の評価方法。
  6. 被検化合物を、Ｓｌｃ２５ａ１０タンパク質に接触させる工程と、
    該被検化合物が、該タンパク質の活性に影響を与えるか否かを確認する工程と、
    を含むことを特徴とする肥満の治療又は予防に有効な化合物の評価方法。
  7. 請求項１〜６のいずれか一項に記載の評価方法によって得られた化合物を有効成分として含有することを特徴とする肥満の治療又は予防剤。
  8. Ｓｌｃ２５ａ１０遺伝子の発現量を低下させることを特徴とする脂肪酸合成阻害方法。
  9. Ｓｌｃ２５ａ１０遺伝子の発現量をＲＮＡｉにより低下させることを特徴とする脂肪酸合成阻害方法。
  10. 前記ＲＮＡｉが、配列番号３及び４に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡ、配列番号５及び６に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡ、配列番号７及び８に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡ、配列番号９及び１０に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡ、配列番号１１及び１２に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡ、配列番号１７及び１８に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡ、配列番号２１及び２２に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡ、配列番号２３及び２４に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡ、配列番号２５及び２６に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡ、配列番号２７及び２８に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡ、配列番号２９及び３０に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡ、配列番号３１及び３２に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡ、配列番号３５及び３６に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡ、配列番号３７及び３８に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡ、配列番号３９及び４０に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡ、配列番号４１及び４２に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡ、配列番号４３及び４４に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡ、配列番号４５及び４６に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡ、配列番号４７及び４８に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡ及び配列番号４９及び５０に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡからなる群から選択される一以上のｓｉＲＮＡを使用したものであることを特徴とする請求項９に記載の脂肪酸合成阻害方法。
  11. 前記ＲＮＡｉが配列番号９及び１０に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡを使用したものであることを特徴とする請求項９に記載の脂肪酸合成阻害方法。
  12. 前記ＲＮＡｉが配列番号４１及び４２に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡを使用したものであることを特徴とする請求項９に記載の脂肪酸合成阻害方法。
  13. Ｓｌｃ２５ａ１０遺伝子の発現量を低下させる工程を含むことを特徴とする肥満の治療又は予防方法。
  14. Ｓｌｃ２５ａ１０遺伝子の発現量をＲＮＡｉにより低下させることを特徴とする肥満の治療又は予防方法。
  15. 前記ＲＮＡｉが、配列番号３及び４に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡ、配列番号５及び６に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡ、配列番号７及び８に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡ、配列番号９及び１０に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡ、配列番号１１及び１２に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡ、配列番号１７及び１８に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡ、配列番号２１及び２２に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡ、配列番号２３及び２４に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡ、配列番号２５及び２６に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡ、配列番号２７及び２８に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡ、配列番号２９及び３０に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡ、配列番号３１及び３２に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡ、配列番号３５及び３６に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡ、配列番号３７及び３８に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡ、配列番号３９及び４０に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡ、配列番号４１及び４２に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡ、配列番号４３及び４４に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡ、配列番号４５及び４６に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡ、配列番号４７及び４８に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡ及び配列番号４９及び５０に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡからなる群から選択される一以上のｓｉＲＮＡを使用したものであることを特徴とする請求項１４に記載の肥満の治療又は予防方法。
  16. 前記ＲＮＡｉが配列番号９及び１０に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡを使用したものであることを特徴とする請求項１４に記載の肥満の治療又は予防方法。
  17. 前記ＲＮＡｉが配列番号４１及び４２に記載の核酸からなるｓｉＲＮＡを使用したものであることを特徴とする請求項１４に記載の肥満の治療又は予防方法。
  18. 被検組織又は被検細胞におけるＳｌｃ２５ａ１０遺伝子の発現レベル又は発現レベルの変化を測定することを特徴とする肥満の検査方法。
  19. 被検組織又は被検細胞におけるＳｌｃ２５ａ１０タンパク質の発現レベル又は発現レベルの変化を測定することを特徴とする肥満の検査方法。
  20. 被検組織又は被検細胞において、Ｓｌｃ２５ａ１０遺伝子の発現レベル又はＳｌｃ２５ａ１０タンパク質の活性を変化させた際に、該変化によって生じる脂肪酸合成に関与する物質の変化量を測定することを特徴とする肥満の検査方法。
  21. 被検組織又は被検細胞におけるＳｌｃ２５ａ１０遺伝子に存在する多型を検出することを特徴とする肥満の検査方法。
  22. Ｓｌｃ２５ａ１０タンパク質と相互作用することにより、Ｓｌｃ２５ａ１０遺伝子の発現量に影響を及ぼすタンパク質の発現量又は該タンパク質の活性を検出することを特徴とする肥満の検査方法。
  23. 配列番号９及び１０に記載の核酸からなることを特徴とするｓｉＲＮＡ。
  24. 請求項２３に記載のｓｉＲＮＡを含むことを特徴とするＳｌｃ２５ａ１０発現抑制剤。
  25. 請求項２３に記載のｓｉＲＮＡを含むことを特徴とする脂肪酸合成抑制剤。
  26. 請求項２３に記載のｓｉＲＮＡを含むことを特徴とする肥満の治療又は予防剤。
  27. 配列番号４１及び４２に記載の核酸からなることを特徴とするｓｉＲＮＡ。
  28. 請求項２７に記載のｓｉＲＮＡを含むことを特徴とするＳｌｃ２５ａ１０発現抑制剤。
  29. 請求項２７に記載のｓｉＲＮＡを含むことを特徴とする脂肪酸合成抑制剤。
  30. 請求項２７に記載のｓｉＲＮＡを含むことを特徴とする肥満の治療又は予防剤。
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