CN109295220A

CN109295220A - miR-495-5p在制备诊断、预后、预防或治疗胰腺癌的产品中的应用

Info

Publication number: CN109295220A
Application number: CN201811138902.6A
Authority: CN
Inventors: 杨跃梅; 赵小灵; 贾冰寒
Original assignee: Beijing Zhicheng Biomedical Technology Co Ltd
Current assignee: Beijing Zhicheng Biomedical Technology Co Ltd
Priority date: 2018-09-28
Filing date: 2018-09-28
Publication date: 2019-02-01
Anticipated expiration: 2038-09-28
Also published as: CN109295220B

Abstract

本发明公开了miR‑495‑5p在制备诊断、预后、预防或治疗胰腺癌的产品中的应用。本发明还提供了用于检测胰腺癌的诊断试剂盒。本发明还提供了用于预后、预防或治疗胰腺癌的药物组合物，所述药物组合物包含miR‑495‑5p的抑制剂或者模拟物/类似物作为活性成分。本发明发现miR‑495‑5p特异性强，灵敏度高，能够有效地用于早期检测胰腺癌，并且可用于基因治疗、药物治疗等临床应用。

Description

miR-495-5p在制备诊断、预后、预防或治疗胰腺癌的产品中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及miR-495-5p在制备诊断、预后、预防或治疗胰腺癌的产品中的应用。

背景技术

胰腺癌占胰腺恶性肿瘤的95％以上,其世界各地发病率呈上升趋势,85％～95％的转移率导致其5年生存率仅为1.2％～6％,全球每年因此病死亡约33万人。外科手术切除是胰腺癌最有效的治疗手段,但因术后远处转移和局部复发,其5年生存率仍低于20％，给家庭和社会带来沉重负担。因此，探寻可作为胰腺癌治疗靶点的驱动基因是目前国际相关领域研究的重点和难点。

miRNA(microRNA)是一类长度为20～25个核苷酸的非编码小分子RNA，由高等真核生物基因组编码，miRNA通过自身的种子序列(seed sequence)和靶基因mRNA碱基配对引导沉默复合体降解mRNA或阻碍其翻译。研究表明miRNA通过调控靶基因的表达，影响肿瘤的发生和发展，参与肿瘤调控的信号网络。

众多证据表明，miR-495参与了多种肿瘤的形成。例如，在黑色素瘤组织和细胞中miR-495的表达下调，过表达miR-495后，显著抑制黑色素瘤细胞的增殖、迁移和侵袭。miR-495通过调节其靶基因Twist1，抑制胃癌细胞的增殖和转移，促进其凋亡。miR-495在结直肠癌中表达下调，过表达miR-495后，显著抑制结直肠癌细胞的侵袭和上皮细胞间质转化过程；而敲低miR-495后，显著促进结直肠癌细胞的侵袭和上皮细胞间质转化过程。在食管癌中过表达miR-495后，在体内外显著抑制食管癌细胞的增殖、周期、迁移和侵袭。这些研究表明，在肿瘤的发生和进程中，miR-495可能发挥抑癌基因的作用。然而，在胰腺癌中miR-495的表达情况，作用模式及相关机制尚不清楚，也未见报道。

为此，本发明的发明人探索了miR-495-5p在胰腺癌发生、发展中的作用及其机制，旨在为临床上诊断、预后、预防或治疗胰腺癌提供有效的手段。

发明内容

为了解决以上提到的技术问题，本发明一个目的在于提供胰腺癌标记物miR-495-5p在制备诊断、预后、预防或治疗胰腺癌的产品中的应用，所述应用包括制备用于预防或治疗胰腺癌的生物制剂如药物，以及制备用于诊断或预后胰腺癌的装置如试剂盒。

本发明还一个目的是提供诊断、预后、预防或治疗胰腺癌的产品，所述产品包括用于预防或治疗胰腺癌的生物制剂如药物，以及用于诊断或预后胰腺癌的装置如试剂盒。

S100蛋白位于多种细胞的细胞质和/或细胞核中，并参与许多细胞过程的调节，如细胞周期进展和细胞分化。S100P蛋白是含有两个EF手型钙结合基序的S100蛋白家族成员。新近研究发现S100P蛋白在多种肿瘤组织中表达升高，促进了肿瘤的生长、转移和侵袭，与肿瘤的发生发展关系密切,并与部分肿瘤的分期预后存在一定相关性。因此其在多种肿瘤的发生发展过程中扮演了一定的作用，对临床有积极的指导意义。临床及基础实验研究表明，S100P基因在大多数胰腺癌组织中的表达高于正常对照正常胰腺细胞H6C7和胰腺炎组织。体内外研究均证实，S100P基因的表达水平与胰腺癌细胞的增殖、存活、迁移和侵袭相关。

本发明的发明人在对胰腺癌的相关研究中发现，体外细胞水平实验结果表明，miR-495-5p在恶性程度较低的胰腺癌细胞PANC-1中的表达显著高于正常细胞(图1)，在恶性程度较高的胰腺癌细胞BxPC-3中的表达显著低于正常细胞(图2)；而S100P的表达趋势则相反，在PANC-1中显著低于正常细胞(图1)，在BxPC-3中显著高于正常细胞(图2)；并且，在PANC-1中敲低miR-495-5p后，S100P的表达水平显著升高(图3)。

这表明miR-495-5p表达异常与胰腺癌发生发展相关，并且miR-495-5p抑制其靶基因S100P的表达。miR-495-5p在胰腺癌的发病及进程中发挥重要作用，并可作为胰腺癌良性恶性辨别的标志物。因此，胰腺癌患者血液中miR-495-5p的含量高低可作为诊断胰腺癌的依据，即miR-495-5p可作为诊断胰腺癌的一个分子标记物。进一步研究发现，miR-495-5p的抑制剂能够敲低miR-495-5p的表达，从而显著增加S100P的表达。这说明在miR-495-5p抑制其靶基因S100P表达的情况下，加入miR-495-5p抑制剂则上调其靶基因S100P的表达。体外功能实验结果表明，在PANC-1中加入miR-495-5p抑制剂，上调了其靶基因S100P的表达后，细胞增殖能力显著增强，细胞周期进程加快，细胞侵袭、迁移能力增强。这意味着miR-495-5p很可能是胰腺癌的新型抑癌基因，并可作为区分胰腺癌良性与恶性的标志物。

在本发明中，术语“miR-495-5p”是指包含SEQ ID No:1(GAAGUUGCCCAUGUUAUUUUCG)所示序列或其同源序列的miRNA，例如本领域中已知各种来源如人、鼠、兔等的miR-495-5p。

本发明的“miR-495-5p”还包含上述天然存在的miR-495-5p序列经取代、缺失或添加一个或几个核苷酸，或经过生物学化学修饰后仍具有miR-495-5p生物活性的miR-495-5p衍生物。

本发明的“miR-495-5p”还包含人工合成的以及可以通过购买市售商品方式获得的具有miR-495-5p生物学活性的miR-495-5p模拟物或类似物，本文中所称的miR-495-5p模拟物或类似物是具有miR-495-5p生物学活性的其变体形式。

此外，本发明所述的miR-495-5p也可以为前体形式，miR-495-5p前体是指在被施用对象的细胞内或体内可以被加工成为miR-495-5p的前体。获得天然存在的miR-495-5p前体的方法为本领域技术人员所公知。

本领域技术人员公知，miR-495-5p的初始转录产物经过一系列的加工后，形成成熟的miR-495-5p。miR-495-5p前体只有在加工为成熟的miR-495-5p后才具有相应的生物学功能。

在本发明的一些实施方案中，相对于健康人，胰腺癌患者样本中miR-495-5p的表达异常，具体地，在恶性程度低的胰腺癌细胞中其表达上调，在恶性程度高的胰腺癌细胞中其表达下调；其中所述样本选自组织、血液、血浆、血清、胰腺分泌物和胰腺细胞。

本发明的一个方面提供了用于检测胰腺癌的诊断试剂盒，所述试剂盒包括特异性扩增胰腺癌相关的miR-495-5p的引物和说明书，所述引物包括序列分别为SEQ ID NO:7(正向引物：CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC)和SEQ ID NO:8(反向引物：CGCGAGGAGAGAATTAATACGACTC)的cDNA扩增引物对。所述试剂盒还包括10×Buffer、dNTP、MgCl₂、Taq酶和SYBR Green荧光染料。根据以上所述的发现，即miR-495-5p在恶性程度较低的胰腺癌细胞中的表达显著高于正常细胞，在恶性程度较高的胰腺癌细胞中的表达显著低于正常细胞，通过检测受试者样本中miR-495-5p的表达相对于正常健康人是上调还是下调，可对胰腺癌患者作出初步诊断，以及时采取治疗措施。

本发明的另一个方面提供了miR-495-5p抑制剂(miR-495-5p-inhibitor)或者模拟物/类似物在制备预后、预防或治疗胰腺癌的生物制剂中的应用。在本发明的一些实施方案中，所述应用包括将miR-495-5p抑制剂或者模拟物/类似物与载体结合后与抗炎症药物和/或药物可接受的辅料复配制成药物组合物。

进一步地，所述miRNA-495-5p抑制剂选自：能降低miRNA-495-5p表达量的siRNA、dsRNA、shRNA、miRNA、反义核苷酸；或者能表达或形成所述siRNA、dsRNA、shRNA、miRNA、反义核苷酸的构建物。在本发明的一些实施方案中，所述miRNA-495-5p抑制剂为具有与SEQ IDNo:1序列互补的序列的反义寡核苷酸，即如SEQ ID No:2(CGAAAAUAACAUGGGCAACUUC)所示的anti-miRNA-495-5p。

所述miR-495-5p模拟物/类似物为能够促进其表达并具有其生物活性的变体形式。

进一步地，所述miRNA-495-5p抑制剂为广州锐博生物科技有限公司合成的产品(反义寡核苷酸anti-miR-495-5p)或具有其抑制剂活性的化学修饰物。

本发明还提供了用于预后、预防或治疗胰腺癌的药物组合物，所述药物组合物含有有效量的miR-495-5p抑制剂或者模拟物/类似物以及药物可接受的辅料。具体地，针对miR-495-5p在体内表达上调的恶性程度低的胰腺癌的患者，可使用有效量miR-495-5p抑制剂以敲低miR-495-5p的表达水平；针对miR-495-5p在体内表达下调的恶性程度高的胰腺癌的患者，可使用适量miR-495-5p模拟物/类似物以提高miR-495-5p的表达水平。

本发明的miR-495-5p抑制剂或者模拟物/类似物的有效剂量可以随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等进行相应的调整。优选的有效量的可以由本领域普通技术人员综合各因素来确定。所述因素包括但不限于：miR-495-5p抑制剂的药代动力学参数、受治疗的患者的健康状况、体重、给药途径等。

进一步地，所述miRNA-495-5p抑制剂选自：能降低miRNA-495-5p表达量的siRNA、dsRNA、shRNA、miRNA、反义核苷酸；或者能表达或形成所述siRNA、dsRNA、shRNA、miRNA、反义核苷酸的构建物。

进一步地，所述miR-495-5p抑制剂为广州锐博生物科技有限公司合成的产品(反义寡核苷酸anti-miR-495-5p)或具有其抑制剂活性的化学修饰物。

在本发明的一些实施方案中，所述药物组合物含有与载体结合的miR-495-5p抑制剂或者模拟物/类似物以及药物可接受的辅料，所述载体可以为本领域常用的适于miRNA在宿主细胞中表达的载体种类如脂质体、壳聚糖或慢病毒表达载体，所述辅料包括在药物使用中但不引起明显副作用的各种赋形剂、稀释剂和佐剂，包括但不限于：生理盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇等。所述药物组合物的形式适合于：直接裸miRNA注射法、脂质体包裹RNA直接注射法、繁殖缺陷细菌携带质粒DNA法或复制缺陷腺病毒携带目的DNA法等。

在本发明的一些实施方案中，所述表达载体为慢病毒表达载体，优选地，所述慢病毒表达载体可以为pWPXL、pMD2.G或psPAX2慢病毒表达载体。

在本发明的一些实施方案中，所述药物组合物还任选地包含一种或多种其他对治疗胰腺癌有效的药物，这些药物是本领域技术人员所熟知的。

本发明中，所述药物组合物的给药途径为静脉内、动脉内灌注或局部注射等，也可以采用本领域技术人员所熟知的其他给药途径进行给药。本发明的药物组合物可以与其他治疗手段联合施用，用于胰腺癌的预后、预防或治疗。

有益效果：

本发明提供的用于检测胰腺癌的诊断试剂盒，可用于诊断miR-495-5p相关的胰腺癌，从而为有针对性地治疗该疾病提供依据。本发明还提供一种预后、预防或治疗胰腺癌的药物组合物，所述药物组合物含有有效量miR-495-5p抑制剂或者模拟物/类似物作为活性剂，由于miR-495-5p可抑制S100P基因表达，因此可对体内miR-495-5p表达上调或下调的胰腺癌患者分别施用有效量所述miR-495-5p抑制剂或者模拟物/类似物，从而实现预后、预防或治疗胰腺癌的作用。本发明发现miR-495-5p特异性强，灵敏度高，不仅能够快速有效的做到早期检测，而且为基因治疗、药物治疗等临床应用提供了治疗靶点和重要依据。

附图说明

图1所示为miR-495-5p在PANC-1胰腺癌细胞中的表达水平明显高于对照组H6C7，而S100P在PANC-1胰腺癌细胞中的表达水平明显低于对照组H6C7。

图2所示为miR-495-5p在BxPC-3胰腺癌细胞中的表达水平明显低于对照组H6C7，而S100P在BxPC-3胰腺癌细胞中的表达水平明显高于对照组H6C7。

图3所示为，相对于空白对照(Blank)和阴性对照(NC)，转染的anti-miR-495-5p(miR-495-5p-inhibitor)组对胰腺癌细胞PANC-1中miR-495-5p表达起到一定抑制作用，同时S100P蛋白表达明显上调。

图4-5所示为，相对于空白对照(Blank)组和NC对照组，通过在PANC-1中加入miR-495-5p-inhibitor(anti-miR-495-5p)敲低miR-495-5p上调其靶基因S100P后，细胞增殖能力增强(图4)、细胞周期进程加快(图5)。

图6所示为，相对于空白对照(Blank)组和NC对照组，转染miR-495-5p-inhibitor(anti-miR-495-5p)对细胞凋亡率没有明显影响。

图7-8所示为，相对于空白对照(Blank)组和NC对照组，通过在PANC-1中加入miR-495-5p-inhibitor(anti-miR-495-5p)敲低miR-495-5p上调其靶基因S100P后，明显促进了细胞的迁移。

图9-10所示为，相对于空白对照(Blank)组和NC对照组，通过在PANC-1中加入miR-495-5p-inhibitor(anti-miR-495-5p)敲低miR-495-5p上调其靶基因S100P后，穿透基质膜进入下室的细胞明显更多，PANC-1细胞侵袭力显著增强。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1：miR-495-5p在胰腺癌细胞中明显异常表达

本实施例证明，相对于正常胰腺细胞H6C7，miR-495-5p在胰腺癌细胞PANC-1和BxPC-3中表达异常

1.样本总RNA提取

采用 Reagent(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)对正常胰腺细胞H6C7、胰腺癌细胞PANC-1和BxPC-3样本进行RNA提取，实验操作按产品说明书进行，具体操作如下：

收集样本后冻存于液氮，分别取出大约30mg细胞样本置于已预冷的研钵中进行研磨，待细胞样本研磨至不见颗粒状后，按以下步骤操作：

①加入Trizol，室温静置10分钟；

②加氯仿0.2mL，用力振荡离心管，充分混匀，室温静置3分钟；

③4℃、12000rpm离心15分钟后，吸取上层水相到另一新的离心管中，注意不要吸到两层水相之间的蛋白物质。移入新管，加入等体积的异丙醇，充分颠倒混匀，室温静置10分钟；

④4℃、12000rpm离心15分钟后小心弃掉上清液，加入1ml 75％乙醇洗涤沉淀，振荡混合后于4℃下7500g离心5分钟；

⑤弃去乙醇液体，室温下放置10分钟以充分晾干沉淀，加入DEPC水溶解沉淀；

⑥用NanoDrop One分光光度计测量RNA浓度及纯度，冻存于-80℃。RNA-seq测序的样品要求：OD260/OD280为1.8-2.2。

2.逆转录

2.1mRNA逆转录

采用 III Reverse Transcriptase(invitrogen，货号18080-044)进行cDNA反转录，实验操作按产品说明书进行，具体操作如下：

使用逆转录试剂盒，用逆转录缓冲液对lμg总RNA进行逆反录合成cDNA。采用25μL反应体系，每个样品取1μg总RNA作为模板RNA。获得的cDNA保存放-20℃冰箱备用。

2.2miRNA逆转录

使用One Step PrimeScript miRNA cDNA Synthesis Kit(Takara，CodeNo.D350A)进行逆转录，实验操作按产品说明书进行，具体操作如下：

采用20μL反应体系，每个样品取1μg总RNA作为模板。获得的cDNA保存放-20℃冰箱备用。

2.3Real-Time PCR

用ABI7500型荧光定量PCR仪，采用2^-ΔΔCt法进行数据的相对定量分析。

(1)mRNA的RT-PCR

使用Power Green PCR Master Mix(invitrogen，货号4367659)进行扩增，实验操作按产品说明书进行。反应体系如表1所示。

表1 mRNA的RT-PCR反应体系

组分	加入量
		2×mix	10μL
正向引物(10uM)	0.5μL
		反向引物(10uM)	0.5μL
模板	2μL
		加入灭菌蒸馏水	至25μL

mRNAs的表达检测每次设置3个平行管反应。扩增S100P的正向引物序列如SEQ IDNO:3所示，反向引物序列如SEQ ID NO:4所示。以GAPDH作为内参基因，其正向引物如SEQ IDNO:5所示，反向引物如SEQ ID NO:6所示。扩增程序为：95℃10min，45x(95℃15s，60℃60s)。

表2引物序列

(2)miRNA的RT-PCR

使用SYBR PrimeScipt miRNA RT-PCR Kit(Takara，Code No.RR716)进行扩增，实验操作按产品说明书进行。

表3 miRNA的RT-PCR反应体系

组分	加入量
		SYBR Premix Ex TaqII(2×)	10μL
PCR Forward Primer(10μM)	0.5μL
		PCR Reverse Primer(10μM)	0.5μL
ROX Reference Dye II(50×)	2μL
		模板(cDNA溶液)	2μL
dH<sub>2</sub>O	至20μL

miRNAs的表达检测每次设置3个平行管反应。扩增miR-495-5p的cDNA的正向引物序列如SEQ ID NO:7(CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC)所示，反向引物序列如SEQ ID NO:8(CGCGAGGAGAGAATTAATACGACTC)所示，以snRNA U6作为内参，用于其cDNA扩增的正向引物如SEQ ID NO:9(GTGCTCGCTTCGGCAGCACA TAT)所示，反向引物如SEQ ID NO:10(AAAATATGGAACGCTTCACGAA)所示。扩增程序：95℃30s；40x(95℃5s，60℃34s)。

3统计学分析

实时定量PCR扩增曲线拐点清楚，扩增曲线整体平行性好，表明各反应管的扩增效率相近，极限平而无上扬现在，曲线指数期斜率较大，说明扩增效率较高；样本扩增产物溶解曲线都是单峰，说明扩增产物只有一条，为特异性扩增；根据qRT-PCR的相对定量公式：2^-ΔΔCt×100％，分别比较miR-495-5p和S100P基因在PANC-1或BxPC-3胰腺癌细胞和对照正常胰腺细胞H6C7中的表达水平。

结果显示：qRT-PCR扩增结果稳定，其中miR-495-5p在PANC-1胰腺癌细胞表达水平明显高于对照组，约是对照的10倍，而S100P在胰腺癌细胞中的表达水平明显低于正常对照，约为对照的30％，具体见图1；此外，miR-495-5p在BxPC-3胰腺癌细胞表达水平明显低于对照组，约是对照的70％，而S100P在BxPC-3胰腺癌细胞中的表达水平明显高于正常对照，约为对照的35倍，具体见图2。

以上结果表明，相对于正常胰腺细胞，miR-495-5p在恶性程度较低的胰腺癌细胞PANC-1中表达明显上调(图1)，在恶性程度较高的胰腺癌细胞BxPC-3中表达下调(图2)；S100P的表达趋势则相反，在PANC-1中显著低于正常细胞(图1)，在BxPC-3中显著高于正常细胞(图2)。

实施例2：miR-495-5p与S100P靶基因关系验证

本实施例证明，miR-495-5p能够抑制S100P的表达。

1、设计合成针对miR-495-5p的反义寡核苷酸(anti-miR-495-5p)

根据miR-495-5p的序列信息由广州锐博生物科技有限公司设计合成miR-495-5p的反义寡核苷酸序列和随机对照序列，miR-495-5p的反义寡核苷酸(miR-495-5p-inhibitor)序列如SEQ ID NO:2(CUUCAACGGGUACAAUAAAAGC)所示。

2、转染

采用阳离子脂质体法进行瞬时转染，操作按照Lipofectamine^TM2000TransfectionReagent试剂说明书进行。转染前24h将生长状态良好的胰腺癌细胞PANC-1接种到6孔板中，细胞计数约5×10⁴，常规培养至转染当天，细胞融合度为50-60％时进行试验。将80nManti-miR-495-5p加入到100uL DMEM培养基中，混匀轻柔；另用100uL DMEM培养基稀释2uLLipofectamin^TM2000脂质体，轻柔混匀，室温孵育5min；混合DMEM-脂质体与DMEM-miRNAs，室温孵育20min，以形成转染复合物；然后将上述混合物加到细胞培养基中，轻轻混匀，使他们充分混合。其中，非特异性序列作为阴性对照(NC)，同期设有空白对照(Blank)组。培养48h后提取细胞总RNA进行下一步实验。

3、miR-495-5p抑制剂对胰腺癌细胞PANC-1中miR-495-5p表达的作用

细胞总RNA提取和PCR步骤同实施例1。

Real-time PCR结果显示，阴性对照(NC)组对胰腺癌细胞PANC-1中miR-495-5p表达无明显抑制作用，和空白对照(Blank)组无统计学差异，转染的anti-miR-495-5p(miR-495-5p-inhibitor)组对胰腺癌细胞PANC-1中miR-495-5p表达起到一定抑制作用，使得其中的miR-495-5p表达为空白对照组的25％(如图3所示)。

4、miR-495-5p抑制剂对胰腺癌细胞PANC-1中S100P基因表达的影响

取对数期生长细胞，以4×10⁵/孔的密度接种于6孔培养板中，按照所述各组进行转染。并重复3次。48h后收集细胞，裂解细胞并提取细胞总蛋白质，将蛋白加入到10％SDS-PAGE进行电泳，再将蛋白转至PVDF膜上，经5％脱脂奶粉封闭后，加入相应的一抗于4℃孵育过夜，抗-S100P抗体(1∶1000稀释，Abcam，ab167046)。二抗(Goat Anti-Rabbit IgG,HRPConjugated(CW0103))室温孵育1h后，利用ECL液显影，扫描仪中成像。以β-Actin作为内参进行数据标准化，与对照组相比，观察anti-miR-495-5p组中S100P蛋白的相对表达水平情况，采用ImageJ分析软件对蛋白电泳条带灰度值进行定量,最后得到的数据进行配对样本t检验统计分析。

结果如图3显示，将anti-miR-495-5p转染至胰腺癌细胞PANC-1中，48h后提取细胞蛋白质，空白对照为未转染miRNA的胰腺癌细胞PANC-1，转染非特异性序列作为阴性对照。用WB方法检测靶基因S100P的蛋白表达水平变化，结果显示，与空白对照组相比，转染非特异性序列没有明显变化，转染anti-miR-495-5p(miR-495-5p-inhibitor)组中S100P蛋白表达明显上调(p<0.01)，S100P蛋白的表达约为空白对照组的3倍。加入miR-495-5p-inhibitor促进S100P蛋白表达，这表明S100P是miR-495-5p的靶基因。

实施例3：miR-495-5p的抑制剂对胰腺癌细胞PANC-1增殖能力、细胞周期的影响

实验分组：空白对照组，阴性对照组，转染anti-miR-495-5p实验组。

取对数增殖期细胞配置成1×10⁴/mL单细胞悬液接种于96孔板，每孔100μL，每组设6个复孔。待细胞贴壁后，加入CCK-8试剂，2h后用酶标仪测定其450nm波长吸光度值作为零点。以后连续5d每过24h，每孔加入CCK-8试剂10μL温育2h后，酶标仪测定细胞吸光度值，并绘制细胞增殖曲线。结果如图4显示，与对照组相比较，阴性对照组细胞增殖无显著差异，而经anti-miR-495-5p转染后胰腺癌细胞PANC-1，其细胞增殖能力显著上升(P<0.05)。

另外，利用细胞周期检测试剂盒，并使用流式细胞仪进行检测，结果如图5所示，相对于空白对照组和NC对照组，在胰腺癌细胞PANC-1中加入anti-miR-495-5p(miR-495-5p-inhibitor)后缩短了G1期时间，促进了S期的分裂，促进了细胞周期的进程。

以上实验表明，在PANC-1中通过加入抑制剂(miR-495-5p-inhibitor)敲低miR-495-5p上调其靶基因S100P后，细胞增殖能力增强、细胞周期进程加快。

实施例4：miR-495-5p抑制剂对胰腺癌细胞PANC-1凋亡、迁移和侵袭的影响

按照实施例3的方法对胰腺癌细胞PANC-1进行anti-miR-495-5p和anti-NC的转染。细胞转染48h后，将细胞用不含EDTA的胰酶消化收集(注：胰酶消化时间不易过长，否则容易引起假阳性)；用PBS洗涤细胞二次(2000rpm离心5min)收集1～5×10⁵细胞；按照Annexin V-FITC/PI双染试剂盒(购自Invitrogen公司)的操作说明进行细胞处理。加入500μL的BindingBuffer(凯基，南京)悬浮细胞；加入5μL Annexin V-FITC(凯基，南京)混匀后，加入5μL Propidium Iodide(凯基，南京)，混匀；室温、避光、反应5-15min后进行流式细胞仪的检测。统计细胞凋亡率，实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS19.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。结果如图6所示，相对于空白对照组和NC对照组，转染anti-miR-495-5p的细胞凋亡率没有明显变化。

通过细胞划痕法实验，如图7和8所示，相对于空白对照组和NC对照组，加入miR-495-5p抑制剂后划痕区修复显著增强，明显促进了细胞的迁移。

利用Transwell 24孔-细胞培养板进行细胞迁移和侵袭检测，保证每孔细胞数量1×10⁵加于上室中，下室中加入2ml培养基。细胞处理后计数侵袭到下室的细胞个数。如图9和10所示，相对于空白对照组和NC对照组，加入miR-495-5p抑制剂后，穿透基质膜进入下室的细胞明显更多，PANC-1细胞侵袭力显著增强。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 北京致成生物医学科技有限公司

<120> miR-495-5p在制备诊断、预后、预防或治疗胰腺癌的产品中的应用

<130> P18065

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> RNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 1

gaaguugccc auguuauuuu cg 22

<210> 2

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 2

cgaaaauaac augggcaacu uc 22

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 3

gagacagcca tgggcatgat 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 4

agccacgaac acgatgaact 20

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 5

aacgtgtcag tggtggacct g 21

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 6

gagaccacct ggtgctcagt g 21

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 7

cgccagggtt ttcccagtca cgac 24

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 8

cgcgaggaga gaattaatac gactc 25

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 9

gtgctcgctt cggcagcaca tat 23

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 10

aaaatatgga acgcttcacg aa 22

Claims

1.胰腺癌标记物miR-495-5p在制备诊断、预后、预防或治疗胰腺癌的产品中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，相对于健康人，胰腺癌患者样本中miR-495-5p的表达异常，具体地在恶性程度低的胰腺癌细胞中其表达上调，在恶性程度高的胰腺癌细胞中其表达下调。

3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述miR-495-5p能够抑制S100P基因的表达。

4.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述样本选自组织、血液、血浆、血清、胰腺分泌物和胰腺细胞。

5.用于检测胰腺癌的诊断试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括特异性扩增胰腺癌相关的miR-495-5p的引物和说明书。

6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述引物包括序列分别为SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8的cDNA扩增引物对。

7.miR-495-5p的抑制剂或者模拟物/类似物在制备预后、预防或治疗胰腺癌的生物制剂中的应用。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述miRNA-495-5p的抑制剂选自：能降低miRNA-495-5p表达量的siRNA、dsRNA、shRNA、miRNA、反义核苷酸；或者能表达或形成所述siRNA、dsRNA、shRNA、miRNA、反义核苷酸的构建物。

9.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述miRNA-495-5p的模拟物/类似物为具有其生物活性的变体形式。

10.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含miR-495-5p的抑制剂或者模拟物/类似物以及药物可接受的辅料。