JP5748736B2 - 筋原性疾患検出用マーカー及びそれを用いた検出方法 - Google Patents

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Description

本発明は、筋原性疾患検出用マーカー及びそれを用いた筋原性疾患、特に筋ジストロフィーの罹患の有無を検出する方法に関する。
筋原性疾患の一種である筋ジストロフィーは、骨格筋の筋線維が変性又は壊死することにより筋肉の萎縮や筋力低下を生じる進行性の遺伝性疾患である。遺伝形式や臨床症状により、デュシャン型、ベッカー型、肢帯型、顔面肩甲上腕型等の様々な病型が知られている（非特許文献１）。
筋ジストロフィーの診断は、臨床症状、血液検査、診察所見、筋電図検査、筋生検、遺伝子検査等を総合して行なわれる。このうち血液検査は、クレアチンキナーゼ、乳酸脱水素酵素、グルタミン酸オキザロ酢酸トランスアミナーゼ（GOT）、グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ（GPT）又はアルドラーゼ等の酵素量の測定によって行なわれる。
血液検査方法は、筋細胞に多く含まれるこれらの酵素が、筋ジストロフィー患者では筋細胞の壊死により血液中に漏出して、正常状態よりも高値となるという現象に基づくものである。末梢血での検出が可能であるため被験者に対する侵襲性が低く、測定方法も比較的簡便であることから、筋ジストロフィーの診断では広く用いられている。中でも血清中のクレアチンキナーゼ値を測定する方法が一般的である（非特許文献２）。ところが、クレアチンキナーゼをはじめとする前記酵素は、運動負荷による筋細胞の壊死によっても血中に多く漏出することから、被験者の運動負荷の有無で血清中の濃度が大きく変動してしまう。そのため健常者であってもクレアチンキナーゼ値等が高い値を示し、誤判定されてしまう問題や正確な判定のために採血前の被験者を安静状態に置かなければならないという煩わしさがあった。
杉田秀夫, 小澤えい二郎, 埜中征哉 編集, 1995, 新筋肉病学.南江堂,東京: pp469-550 Sugita H., et al, 1959, J. Biochem., 46: 103-104
本発明の課題は、被験体に与える侵襲性が低く、かつ運動負荷に対して安定性の高い筋原性疾患検出用マーカーとそれを用いた筋原性疾患、特に筋ジストロフィー検出方法を提供することである。
上記課題を解決するために、本発明者らが鋭意研究を重ねた結果、変異体を含む３種のマイクロRNA（miRNA）、すなわちmiR-1、miR-133（２つの変異体miR-133a及びmiR-133bを含む）及びmiR-206の血中量が筋原性疾患、特に筋ジストロフィーの罹患と密接に関係し、かつ運動負荷による影響をほとんど受けないことを見出した。これまでに、miR-1及びmiR-133が心筋、心房及び骨格筋で特異的に発現し、またmiR-206が骨格筋で特異的に発現することについては知られていた（Kim et al., 2006, J. Cell Biochem, 174,677-687）が、これらのmiRNAの血中量が筋原性疾患罹患個体において運動負荷による影響をほとんど受けず、クレアチンキナーゼに代わる有用な検出用マーカーとなり得ることについては全く知られていなかった。本発明は、当該知見に基づいて完成されたものであって、すなわち以下を提供する。
（１）被験体から採取された血液中に存在する配列番号１〜４で示される塩基配列を含むmiRNAのいずれか一以上の量を測定する工程、被験体の前記miRNAの血中量が健常個体の対応するmiRNAの血中量と比較して統計学的に有意に高いこととその被験体が筋原性疾患に罹患していることを関連づける工程を含む被験体における筋原性疾患の罹患の有無を検出する方法。
（２）miRNAが配列番号１〜４で示される塩基配列からなる、（１）に記載の方法。
（３）被験体の前記miRNAの血中量が健常個体における該miRNAの血中量の５倍以上である、（１）又は（２）に記載の方法。
（４）miRNAの血中量を核酸増幅法又はハイブリダイゼーション法によって定量する、（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（５）核酸増幅法がリアルタイムPCR法である、（４）に記載の方法。
（６）前記血液が運動負荷後の被験体から採取されたものである、（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。
（７）筋原性疾患が筋ジストロフィーである、（１）〜（６）のいずれかに記載の方法。
（８）配列番号１〜４で示される塩基配列を含むmiRNAからなる筋原性疾患検出用マーカー。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2010-041845号の明細書及び／又は図面に記載される内容を包含する。
本発明の筋原性疾患検出用マーカーによれば、被験体の運動負荷による影響を受けることのない筋原性疾患の罹患検出マーカーを提供することができる。
本発明の筋原性疾患の検出方法によれば、被験体に与える侵襲性が低く、かつ被験体の運動負荷による影響を受けることなしに、その被験体における筋原性疾患の罹患の有無を検出することができる方法を提供することができる。
B10マウスに対するmdxマウスの各miRNAの血清中量の相対値を示す。 B10マウス及びmdxマウスの運動負荷後の経過時間における血清中のmiR-1、miR-133a及びmiR-206量の変化を示した図である。各マウスの運動前及び運動負荷後の各経過時間における血清中のmiR-1、miR-133a及びmiR-206量をmiR-16量で補正後、B10マウスの運動前の補正値に対する相対値で表した。図中、ａはmiR-1を、ｂはmiR-133aを、ｃはmiR-206を及びｄはクレアチンキナーゼ（CK）を、また、白丸/破線は、B10マウスを、黒丸/実線はmdxマウスをそれぞれ示している。 B10マウス及びmdxマウスの運動負荷後の経過時間における血清中のmiR-1、miR-133a及びmiR-206量の変化を示した図である。血清中のクレアチンキナーゼ（CK）、miR-1、miR-133a及びmiR-206をmiR-16量で補正後、それぞれの運動負荷前の血清中の量に対する運動負荷後の血清中量の相対値を示す。図中、ａはmiR-1を、ｂはmiR-133aを、ｃはmiR-206を及びｄはクレアチンキナーゼ（CK）を、また、白丸/破線は、B10マウスを、黒丸/実線はmdxマウスをそれぞれ示している。 筋ジストロフィーモデル犬CXMDj又はその保因犬におけるmiRNA等の生後の血清中変化量を示す。miRNA等の量は、miRNA16の血清中の量で補正後、健常犬でのそれぞれ対応するmiRNA等の対応する時期における補正値の相対値で示している。
１．筋原性疾患検出用マーカー
１−１．概要
本発明の第１の態様は、筋原性疾患検出用マーカーである。本態様の筋原性疾患検出用マーカーである特定のmiRNAの血液中の量を測定することによって、筋原性疾患罹患、特に筋ジストロフィー罹患の有無を検出することができる。
１−２．構成
本発明の筋原性疾患検出用マーカーは、配列番号１〜４で示される塩基配列を含むmiRNAによって構成される。
本発明において「筋原性疾患検出用マーカー」とは、被験個体において筋原性疾患の罹患の有無を検出する際の指標となるものであって、本発明では骨格筋、心筋で特異的に発現する特定のmiRNA、すなわち、以下で具体的に説明をするmiR-1、miR-133（miR-133a及びmiR-133b）及びmiR-206が該当する。筋原性疾患検出用マーカーは、前記miRNAの単独又は二以上の組み合わせのいずれも含む。
本発明において「筋原性疾患」とは、筋肉が萎縮し、筋力低下を生じる疾患をいう。例えば、筋ジストロフィー（デュシャン型、ベッカー型、エメリ・ドレフュス型、肢帯型、顔面肩甲上腕型、眼咽頭型、先天性の各種筋ジストロフィーを含む）、ミオパチー（先天性、遠位型、甲状腺機能低下性、ステロイドミオパチー等を含む）、炎症性筋疾患（多発性節炎、皮膚節炎を含む）、ダノン病、筋無力症候群、ミトコンドリア病、ミオグロビン尿症、糖原病、周期性四肢麻痺等が含まれる。本発明において、好ましい筋原性疾患は、筋ジストロフィーである。
「miRNA」とは、細胞内に存在する長さ21〜23塩基長の一本鎖ノンコーディングRNAである。この小分子RNAは、標的遺伝子のmRNA、及びタンパク質因子と結合して複合体を形成し、RISC（RNA-induced silencing complex）／miRNPの作用によって標的遺伝子の翻訳を阻害することにより、標的遺伝子の発現を調節することが知られている。miRNAは、pri-miRNAと呼ばれる前駆体（前々駆体）状態でゲノムから転写された後、核内でDroshaと呼ばれるエンドヌクレアーゼによりpre-miRNAと呼ばれる前駆体にプロセシングされ、さらに核外でDicerと呼ばれるエンドヌクレアーゼの働きによって成熟体のmiRNAとなる（Bartel DP, 2004, Cell, 116:281-297）。したがって、細胞内には、通常、前駆体としてのpri-miRNA及びpre-miRNA、並びに成熟miRNAが存在し得る。本発明のmiRNAは、miRNA前駆体及び成熟miRNAのいずれをも包含する。好ましくは、成熟miRNAである。成熟miRNAが標的遺伝子の発現制御に直接寄与し得るからである。
上記配列番号１で示される塩基配列は、ヒト成熟miR-1に、配列番号２で示される塩基配列は、ヒト成熟miR-133aに、配列番号３で示される塩基配列は、ヒト成熟miR-133bに、そして配列番号４で示される塩基配列は、ヒト成熟miR-206に、それぞれ該当する。ただし、これらのmiRNAは、マウス、ラット、犬等の多くの哺乳類においてその塩基配列が完全に保存されていることから、ヒトのみならず、同一塩基配列を有する他の生物種の各成熟miRNAにも該当し得る。前述のように、miR-1及びmiR-133は、心筋、心房及び骨格筋で、またmiR-206は、骨格筋で、特異的に発現することが知られている（Kim et al., 2006, J. Cell Biochem, 174,677-687）。
前述のように、本発明のmiRNAは、前駆体（pri-miRNA、pre-miRNA）及び成熟体のいずれも包含する。したがって、本発明の筋原性疾患検出用マーカーは、配列番号１〜４で示される塩基配列をその一部に含む各miRNAの前駆体も包含する。本発明の筋原性疾患検出用マーカーとして、より好ましくは配列番号１〜４で示される塩基配列からなる各種成熟miRNAである。
１−３．効果
本発明の筋原性疾患検出用マーカーによれば、後述する本発明の第２の態様において筋原性疾患検出方法の検出用マーカーとして使用することができる。
２．筋原性疾患検出方法
２−１．概要
本発明の第２の態様は、被験体における筋原性疾患、特に筋ジストロフィーの罹患の有無を検出する方法である。本方法は、被験体の血液中に存在する一以上の特定のmiRNA量、すなわち第１態様の筋原性疾患検出用マーカーの量を測定することによって、その被験体が筋原性疾患に罹患しているか否かを検出することを特徴とする。
２−２．構成
本発明の検出方法は、測定工程及び比較工程を含む。以下、各工程について具体的に説明をする。
２−２−１．測定工程
「測定工程」とは、被験体から採取された血液中に存在する前記第１の態様の筋原性疾患検出用マーカー、すなわち、配列番号１〜４で示される塩基配列を含むmiRNAのいずれか一以上の量を測定する工程である。
本発明において「被験体」とは、筋原性疾患罹患の有無の検査に供される個体をいう。被験体となる生物は、哺乳動物、好ましくはヒトである。
本発明において「血液」とは、全血、血漿及び血清を含む。静脈血、動脈血、骨髄液又は臍帯血のいずれであってもよい。また、「被験体から採取された血液」とは、被験体から直接採取された血液、又は間接的に採取された血液をいう。このような血液は、採取前に安静状態に置いた被験体から採取されたもの及び運動負荷後の被験体から採取されたものを含む。ここでいう「安静状態」とは、ヒトであれば、被験体を横臥又は座位の状態に置き、骨格筋の運動を可能な限り停止させた状態をいう。また、ヒト以外の動物であれば、過度の運動やストレスを与えない平穏な生活状態をいう。さらに、本発明において、「運動負荷」とは、被験体の姿勢を問わず、骨格筋に積極的な負荷を与えることをいう。例えば、歩行、走行、階段等の昇降又はスポーツが該当する。
直接採取された血液には、例えば、末梢血や骨髄液のように被験体に注射針等を直接刺して採取したものや、臍帯血のように分娩後の臍帯から直接採取したもの等が含まれる。被験体から直接採取する場合、公知の方法に従って採血されたものであればよい。例えば、末梢血であれば、末梢部の静脈等に注射をして採取されたもの、臍帯血であれば分娩後胎盤の娩出前の臍帯に針を刺して採取されたもの、また骨髄液であれば骨髄穿刺（マルク）によって採取されたもののいずれであってもよい。被験体に対する侵襲性が低く、採取の時期を選ばずに容易に入手可能な点で、注射によって採取された末梢血がより好ましい。
間接的に採取された血液には、前記直接採取された全血にヘパリン等を添加して抗凝固処理を施した後、又は血漿若しくは血清として分離した後、一旦冷蔵若しくは冷凍で保存したものから再採取したもの等が含まれる。
本発明における特徴として、前記「被験体から採取された血液」は、血液採取前の被験体の運動負荷の有無を問わないことが挙げられる。筋原性疾患の代表的疾患である筋ジストロフィーの検査で従来使用されていたクレアチンキナーゼは、運動負荷前後で血中濃度が大きく変動することから、血液採取に当たって被験体を安静状態下におく必要があった。しかし、本発明では、後述する実施例１で示すように、第１の態様の筋原性疾患検出用マーカーの血中濃度が運動負荷前後で安定であることから、運動負荷後（例えば、負荷直後〜２４時間）の被験体から採取された血液であっても使用することができる。
本発明の方法で使用する血液の容量は、通常50μL以上、好ましくは100μL以上、及び500μL以下、好ましくは1mL以下で足りる。被験体から採取された全血は、血液が凝固しない処理を施しておく。例えば、血液採取に用いるシリンジ内部等をヘパリン等の血液凝固阻止剤、又は血液凝固阻害剤で予めコーティングしておく方法、又は採取後の全血に血液凝固阻止剤を添加する処理方法（この場合、例えば、ヘパリン添加であれば終濃度を10〜100units／mLにすればよい。）、前記血液凝固阻止剤等で処理した全血を適当な速度で遠心し、その上清を血漿として調製しておく方法、又は全血を室温に放置した後、適当な速度で遠心して、その上清を血清として調製しておく方法が挙げられる。
本発明の「量」は、血液中における筋原性疾患検出用マーカーの分量を表す用語である。例えば、濃度のような相対量、又は所定の容量の血液中に含有されるmiRNAの絶対量が挙げられる。本発明においては、相対量又は絶対量のいずれであってもよい。好ましくは、相対量である。
本工程において、血液中に存在する前記第１の態様の筋原性疾患検出用マーカーの量を測定する方法は、該マーカー量を検出し、定量できる方法であれば特に限定はしない。例えば、核酸増幅法、ハイブリダイゼーション法、又はRNaseプロテクション法が挙げられる。
「核酸増幅法」とは、フォワード／リバースプライマーセット用いて、標的核酸の特定の領域を核酸ポリメラーゼによって増幅させる方法をいう。例えば、PCR法（RT-PCR法を含む）、NASBA法、ICAN法、LAMP（登録商標）法（RT-LAMP法を含む）が挙げられる。好ましくはPCR法である。これは、PCR法が当該分野で最も広く利用されている方法であり、試薬、キット、及び反応機器等が充実している他、様々な応用技術が開発されているためである。本発明では、標的核酸がmiRNAであることから、通常は、逆転写反応（RT反応）を介した核酸増幅法、例えば、RT-PCR法又はRT-LAMP法が採用される。また、本発明では、血液中に存在する筋原性疾患検出用マーカーの量を測定する必要性があることから、核酸増幅法の中でも、特に、例えば、リアルタイムPCR法のような定量的PCR法を用いることが好ましい。リアルタイムPCRは、遺伝子増幅反応過程でPCR産物が特異的に蛍光標識される反応系で、蛍光強度を検出する装置の備わった温度サイクラー装置を用いてPCRを行うことによって解析する。本方法は、反応中の産物の量をサンプリングの必要なくリアルタイムでモニターでき、その結果をコンピュータで回帰分析することができる点で優れている。PCR産物を標識する方法としては、例えば、TaqMan（登録商標）PCR法のような蛍光標識したプローブを用いる方法、又は二本鎖DNAに特異的に結合する試薬を用いる方法とがある。TaqMan PCR法は、5’末端部がクエンチャー物質で、また3’末端部が蛍光色素で、それぞれ修飾されたプローブを用いる。通常は、5’末端部のクエンチャー物質が3’末端部の蛍光色素を抑制しているが、PCRが行われるとTaqポリメラーゼのもつ5’→3’エキソヌクレアーゼ活性により当該プローブが分解され、それによってクエンチャー物質の抑制が解除されるため蛍光を発するようになる。その蛍光量は、PCR生成物の量を反映する。PCR産物が検出限界に到達するときのサイクル数（CT）と初期鋳型量とは逆相関の関係にあることから、リアルタイム測定法ではCTを測定することによって初期鋳型量を定量している。数段階の既知量の鋳型を用いてCTを測定し検量線を作製すれば、未知試料の初期鋳型量の絶対値を算出することができる。その他、増幅産物を次で説明するハイブリダイゼーション法と組み合わせて、検出、定量することもできる。
なお、核酸増幅法を用いたmiRNAの具体的な測定方法については、後述する「２−３．方法」の項で詳述する。
「ハイブリダイゼーション法」とは、検出すべき標的核酸の塩基配列の全部又は一部に相補的な塩基配列を有する核酸断片をプローブとして用い、その核酸と該プローブ間の塩基対合を利用して、標的核酸若しくはその断片を検出、定量する方法である。ハイブリダイゼーション法には、検出手段の異なるいくつかの方法が知られているが、本発明では、標的核酸がmiRNAであることから、例えば、ノザンハイブリダイゼーション法（ノザンブロットハイブリダイゼーション法）、RNAマイクロアレイ法、表面プラズモン共鳴法又は水晶振動子マイクロバランス法が好ましい。
「ノザンハイブリダイゼーション法」は、遺伝子の発現を解析する最も一般的な方法で、試料より調製したRNAを変性条件下でアガロースゲル若しくはポリアクリルアミドゲル等による電気泳動によって分離し、フィルターに転写（ブロッティング）した後に、標的RNAに特異的な塩基配列を有するプローブを用いて、そのRNAを検出する方法である。プローブを蛍光色素や放射性同位元素のような適当なマーカーで標識することで、例えば、ケミルミ（化学発光）撮影解析装置（例えば、ライトチャプチャー；アトー社）、シンチレーションカウンタ、イメージングアナライザ（例えば、FUJIFILM社：BASシリーズ）等の測定装置を用いて標的RNAを定量することも可能である。ノザンハイブリダイゼーション法は、当該分野において周知著名な技術であり、例えば、Sambrook, J. et. al., (1989) Molecular Cloning: a Laboratory Manual Second Ed., Cold SpringHarbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York、分子生物学実験プロトコルＩ（1997年），西野・佐野共訳，丸善株式会社を参照すればよい。
「RNAマイクロアレイ法」は、DNAマイクロアレイ法をRNAに応用した方法である。基板上に標的とする核酸の塩基配列の全部若しくは一部に相補的な核酸断片をプローブとして小スポット状に高密度で配置、固相化し、これに標的核酸を含む試料を反応させて、基盤スポットにハイブリダイズした核酸を蛍光等によって検出、定量する方法である。検出、定量には、標的核酸等のハイブリダイゼーションに基づく蛍光等をマイクロプレートリーダーやスキャナーにより検出、測定することによって達成できる。RNAマイクロアレイ法も当該分野において周知の技術である。例えば、DNAマイクロアレイ法（DNAマイクロアレイと最新PCR法（2000年）村松正明、那波宏之監修、秀潤社）等を参照されたい。
「表面プラズモン共鳴（SPR：Surface Plasmon Resonance）法」とは、金属薄膜へ照射したレーザー光の入射角度を変化させると特定の入射角度（共鳴角）において反射光強度が著しく減衰するという表面プラズモン共鳴現象を利用して、金属薄膜表面上の吸着物を高感度に検出、定量する方法である。本発明においては、例えば、金属薄膜表面に標的miRNAの塩基配列に相補的な配列を有する核酸プローブを固定化し、その他の金属薄膜表面部分をブロッキング処理した後、サンプルである被験体から採取された血液を金属薄膜表面に流通させることによって標的miRNAと核酸プローブの塩基対合を形成させて、サンプル流通前後の測定値の差異から標的miRNAを検出、定量することができる。表面プラズモン共鳴法による検出、定量は、例えば、Biacore社で市販されるSPRセンサを利用して行なうことができる。本技術は、当該分野において周知である。例えば、永田和弘、及び半田宏, 生体物質相互作用のリアルタイム解析実験法, シュプリンガー・フェアラーク東京, 東京, 2000を参照されたい。
「水晶振動子マイクロバランス（QCM: Quarts Crystal Microbalance）法」とは、水晶振動子に取り付けた電極表面に物質が吸着すると、その質量に応じて水晶振動子の共振周波数が減少する現象を利用して、共振周波数の変化量によって極微量な吸着物を定量的に捕らえる質量測定法である。本方法による検出、定量も、SPR法と同様に市販のQCMセンサを利用して、例えば、電極表面に固定した標的miRNAの塩基配列に相補的な配列を有する核酸プローブと被験体から採取された血液中の標的miRNAとの塩基対合によって標的miRNAを検出、定量することができる。本技術は、当該分野において周知であり、例えば、J.Christopher Love,L.A.Estroff，J.K.Kriebel,R.G.Nuzzo,G.M.Whitesides(2005) Self-Assembled Monolayers of a Form of Nanotechnology, Chemical Review,105:1103-1169；森泉豊榮，中本高道，(1997) センサ工学，昭晃堂を参照されたい。
前記ハイブリダイゼーション法で用いるプローブは、配列番号１〜４で示される塩基配列の全部又は一部に相補的な塩基配列を有する核酸断片を用いればよい。プローブの塩基長は、８塩基以上、好ましくは１０塩基以上、より好ましくは１２塩基以上、さらに好ましくは１５塩基以上、又は全長以下である。プローブを構成する核酸は、通常DNA、RNA又はその組み合わせであればよいが、必要に応じて全部又は一部にPNA(Peptide Nucleic Acid)、LNA(Locked Nucleic Acid;登録商標)、メチルホスホネート型DNA、ホスホロチオエート型DNA、2'-O-メチル型RNA等の化学修飾核酸や擬似核酸又はそれらの組み合わせを含むこともできる。また、ハイブリダイゼーション法で用いるプローブは、蛍光色素（例えば、フルオレサミン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、FITC、cy3、cy5、FAM、HEX、VIC）、クエンチャー物質（TAMRA、DABCYL、BHQ-1、BHQ-2、又はBHQ-3）、ビオチン若しくは（ストレプト）アビジン、又は磁気ビーズ等の修飾物質、あるいは放射性同位元素（例えば、32P、33P、35S）等を用いて修飾又は標識することができる。ハイブリダイゼーションは、ストリンジェントな条件で行うことが好ましい。非特異的にハイブリダイズする目的外の核酸を排除するためである。
「RNAプロテクション法」とは、標的RNAに相補的な塩基配列を有するプローブを用いて、標的RNAとプローブとのハイブリダイゼーションを行い、その後のRNase処理による分解を免れたハイブリダイズしたRNAを電気泳動によって分離、検出することで、標的RNAを検出、定量する方法である。電気泳動による分離及び検出の方法については基本的に前記ハイブリダイゼーション法と同様である。
２−２−２．比較工程
「比較工程」とは、被験体における前記miRNAの血中量が健常個体の対応するmiRNAの血中量と比較して統計学的に有意に高いこととその被験体が筋原性疾患に罹患していることを関連づける工程である。この関連付けによって、被験体が筋原性疾患に罹患しているか否かが判断される。すなわち、被験体における特定のmiRNAにいずれか一以上の血中量が健常個体における対応するmiRNAの血中量と比較して統計学的に有意に高いときには、その被験体は、筋原性疾患に罹患している又は近い将来に発症する可能性が高いと判定される。
「前記miRNAの血中量」とは、筋原性疾患検出用マーカー、すなわち配列番号１〜４で示される塩基配列を含むmiRNAいずれか一以上の血液中の分量をいう。
本発明において「健常個体」とは、被験体と同種で、かつ少なくとも筋原性疾患に罹患していないことが明らかである個体、好ましくはあらゆる疾患に罹患していない健康な個体をいう。
「健常個体の対応するmiRNA」とは、前記測定工程で測定された被験体のmiRNAと同一のmiRNAをいう。例えば、測定工程で被験体のmiR-1を測定対象とした場合、対応するmiRNAは健常個体のmiR-1となる。
本工程で使用する健常個体のmiRNAの血中量は、本発明の前記測定工程で、被験体におけるmiRNAの血中量の測定と共に測定されたそれに対応するmiRNAの血中量を利用できる他、被験体のmiRNAの血中量測定と同一条件下で予め測定された対応するmiRNAの血中量を用いることもできる。このように、健常個体の筋原性疾患検出用マーカーである各miRNAの血中量を基準値としてデータベース化しておけば、被験体における筋原性疾患検出用マーカーの血中量の測定を測定する度に並行して測定する必要がなくなるため便利である。
「統計学的に有意」とは、血中における前記対応する２つのmiRNAの量的差異を統計学的に処理したときに、両者間に有意差があることをいう。具体的には、例えば、危険率（有意水準）が5％、1％又は0.1％より小さい場合が挙げられる。統計学的処理の検定方法は、有意性の有無を判断可能な公知の検定方法を適宜使用すればよく、特に限定しない。例えば、スチューデントｔ検定法、多重比較検定法を用いることができる。
「統計学的に有意に高い」とは、具体的には、例えば、被験体の筋原性疾患検出用マーカーの血中量が健常個体の対応する筋原性疾患検出用マーカーの血中量の5倍以上、好ましくは10倍以上あることをいう。例えば、健常個体のmiR-1の血中濃度に対して、被験体のmiR-1の血中濃度が相対値で5以上あればよい。
本発明で「関連付ける」とは、筋原性疾患検出用マーカーであるmiRNAの血中量の比較結果と筋原性疾患の罹患又は発症潜在性とを結びつけることをいう。本発明者らの研究により、筋原性疾患に罹患している又は近い将来に発症する可能性のある個体と健常個体の間では、筋原性疾患検出用マーカーの血中量に統計学的に有意な量的差異が見られることが判明した。この知見に基づき、本発明では、被験体における筋原性疾患検出用マーカーの血中量が健常個体の対応するmiRNAの血中量と比較して統計学的に有意に高い場合には、その被験体が筋原性疾患に罹患しているか又は将来的に発症する可能性が高いと判断する。筋原性疾患に罹患しているか又は将来的に発症する可能性が高い被験体では、筋原性疾患検出用マーカーである全てのmiRNA、特に全ての成熟miRNAが健常個体と比較して有意に高い。したがって、筋原性疾患検出用マーカーを構成する少なくとも１以上のmiRNAに関して上記関連付けができれば、その被験体は筋原性疾患に罹患しているか又は将来的に発症する可能性が高いと判断できる。誤検出の可能性を排除するためには、二以上の筋原性疾患検出用マーカーに関して上記関連付けが成立することが好ましい。
２−３．方法
＜リアルタイムPCR法を用いたmiRNAの血中量の測定＞
（１）血液からのRNA抽出
採取された血液が全血の場合は、血清又は血漿に調製することができる。血清を調製する場合には、全血を室温で20分間〜１時間程度放置した後、氷冷し、4℃にて2500rpm〜4000rpmで10分〜20分間遠心して、その上清を得ればよい。また、血漿を調製する場合には、全血を、例えば、4℃にて5000×gで15分間遠心すればよい。
血液（全血、血漿、血清及びその組み合わせ）から、RNAを抽出するには、当該分野で公知のRNA抽出方法を用いればよい。例えば、Sambrook, J. et. al., (1989) Molecular Cloning: a Laboratory Manual Second Ed., Cold SpringHarbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New Yorkに記載のRNA抽出法に従って抽出することができる。RNAは総RNA（Total RNA）として調製すればよい。また、各メーカーから市販されているRNA抽出キットを利用することもできる。このような市販のRNA抽出キットの中には、例えば、小分子RNAのみを選択的に抽出できるような、試料中に存在するmicroRNAの効率的な回収を目的として開発されたものもあり、本発明においても好適に利用することができる。具体的には、例えば、mirVana microRNA isolation kit（Ambion社）が挙げられる。キットを利用する場合には、具体的な方法については、キット添付のプロトコルに従って又は準じて行なえばよい。
（２）リアルタイムPCR法
前述のように、本発明で検出すべき核酸は、成熟体が約20塩基長しかないmiRNAである。したがって、一般的なRT反応を介した定量的核酸増幅法、例えば、リアルタイムRT-PCR法では標的核酸が短すぎて適当に増幅することができない。そこで、核酸増幅法を用いて血液中の筋原性疾患検出用マーカーを検出する場合には、例えば、メーカーから市販されているキットや特殊なプライマーを利用して増幅すればよい。一例として、Life Technologies社から市販されているApplied Biosystems TaqMan MicroRNA Assays Kitが挙げられる。このキットに付属の各miRNA特異的なLooped RTプライマーを使用すれば、目的の成熟miRNAを効率的に逆転写させた後に増幅が可能となるため有用である。Looped RTプライマーは、3’末部分が標的成熟miRNAの3’末領域に相補的な配列を有する数塩基突出したヘアピン構造を自己形成する。その突出した3’末部分が標的miRNAの3’末領域とアニーリングした後、RTaseで標的miRNAを鋳型に伸長される。その後、伸長産物を鋳型に通常のリアルタイムPCRを行うことで、標的miRNAを特異的に増幅することが可能となる。
リアルタイムPCRの反応条件は、一般に、公知のPCR法を基礎として、増幅する核酸断片の塩基長及び鋳型用核酸の量、並びに使用するプライマーの塩基長及びTm値、使用する核酸ポリメラーゼの至適反応温度及び至適pH等により変動するため、これらの条件に応じて適宜定めればよい。一例として、通常、変性反応を94〜95℃で5秒〜5分間、アニーリング反応を50〜70℃で10秒〜1分間、伸長反応を68〜72℃で30秒〜3分間行い、これを１サイクルとして15〜40サイクルほど繰り返し、最後に68〜72℃で30秒〜10分間の伸長反応を行うことができる。前記メーカー市販のキットを使用する場合には、原則としてキットに添付のプロトコルに従って行えばよい。
リアルタイムPCRで用いられる核酸ポリメラーゼは、DNAポリメラーゼ、特に熱耐性DNAポリメラーゼである。このような核酸ポリメラーゼは、様々な種類のものが市販されており、それらを利用することもできる。例えば、前記Applied Biosystems TaqMan MicroRNA Assays Kit（Life Technologies社）に添付のTaq DNAポリメラーゼが挙げられる。特にこのような市販のキットには、添付のDNAポリメラーゼの活性に最適化されたバッファ等が添付されているので有用である。
２−４．効果
本態様の筋原性疾患の罹患の有無を検出する方法によれば、被験体の運動負荷による影響を受けることなく、被験体における筋原性疾患の罹患の有無を高感度に検出することができる。従来の血中クレアチンキナーゼ値による筋原性疾患罹患の検出方法では、運動負荷による変動が大きかったことから、正確な診断を行なうためには、血液等の検出用試料を採取する前に被験体を安静状態に保つ必要があった。しかし、これは被験体に過度の運動制限を強いることになり、被験体におけるその負担は少なくなかった。それゆえ、本態様の検出方法であれば、採血前の被験体の負担を大きく軽減することができる。
本態様の筋原性疾患の罹患の有無を検出する方法によれば、末梢血で検出可能であることから試料採取において被験体に与える侵襲性が低い。
[実施例１]
＜筋ジストロフィーモデルマウスを用いた筋ジストロフィー検出用マーカーの検証＞
本発明の筋ジストロフィー検出用マーカーとそれを用いた筋ジストロフィー検出方法の効果を、筋ジストロフィーモデルマウスを用いて検証した。
（材料）
筋ジストロフィーのモデルマウスには、デュシャン型筋ジストロフィーの疾患モデルであるmdxマウス（mdx/B10）（雄個体；8週齢）を使用した。デュシャン型筋ジストロフィーは、X染色体連鎖の劣性遺伝によるジストロフィン遺伝子の欠損により発症する。また、コントロール（健常個体）群としてB10マウス（雄個体；8週齢）を使用した。なお、mdxマウスは、ジストロフィン遺伝子の欠損を除けば、B10マウスと遺伝的バックグラウンドが同一である。
（方法）
採血及び血清の調製
上記各マウスを動物実験施設内に搬入後、移送や環境変化によるストレスを軽減させるため、1週間以上、1匹ずつケージに分けて予備飼育した。各マウスに運動負荷を与える1週間前に29G注射針と0.5mLシリンジを用い、尾動脈から100μL以上採血した。その後、運動負荷を与えるため、トレッドミル（ランニングマシーン）を用いて5m/分を5分、その後1分ごとに1m/分ずつ加速して15分間、各マウスを走らせた。運動負荷終了直後（30分以内；グラフでは0hで示す）、6時間後、48時間後に、上記と同様の方法で採血を行なった。
採取した全血を室温で30分以上放置した後、遠心機（KUBOTA 2410）を用いて3000rpmで10分間遠心し、血清として上清を得た。
クレアチンキナーゼ活性の測定
それぞれの血清から50μLを分注し、生化学分析装置（富士ドライケムシステム）を用いてクレアチンキナーゼ活性を測定した。
各種miRNAの血中量の測定
・RNA抽出
それぞれのサンプルの残った50μL血清からAmbion mirVana microRNA isolation kitを用いて全RNAを抽出し、最後に50μLの溶出液を用いてカラムからRNAを溶出し、これを全RNA溶液とした。RNAの抽出手順については、添付のプロトコルに従った。
・リアルタイムPCRによる各種miRNAの定量
前記全RNA溶液のうち5μLを用いて、当該溶出液中に含まれる各成熟miRNA（mi-R1：配列番号１、mi-R16、mi-R132、mi-R133a：配列番号２、mi-R133b：配列番号３、mi-R206：配列番号４）及び核内低分子RNA（snoRNA）の一つである成熟sno202（配列番号５）をリアルタイムPCRで定量した。増幅反応には、Applied Biosystems TaqMan microRNA assay kit（Life Technologies社）を使用した。
なお、miR-16は、B10及びmbxのいずれにもユビキタスに、かつ十分に発現し、両者の発現量に差がないことから、本実施例の各サンプル中における全RNA量を補正するための内在性コントロールとして用いた。また、miR-132は、神経細胞特異的に発現をすることが知られていることから、本実施例におけるネガティブコントロールとして用いた。さらに、sno202は、マウスのmiRNA定量の際の内在性コントロールとして一般的に用いられるRNAである。基本的手順については、キット添付のプロトコルに従った。具体的には、以下の通りである。
まず、逆転写反応における各種miRNA及びsnoRNAに特異的なプライマーには、キットに付属の各成熟miRNA及び成熟snoRNA特異的Looped RTプライマーを用いた。なお、ヒトとマウスにおける前記成熟miRNA等の塩基配列は、完全同一である（miRBase；http://www.mirbase.org/cgi-bin/browse.plを参照）。また、反応試薬には、100mM dNTPs；0.15μL／RTase(Superscript)；1.0μL／10×RT buffer；1.5μL／RNasin；0.188μL／5×前記プライマー；3.0μL／全RNA(2μg/μL)；5.0μLからなる総量15.0μLの反応溶液を用いた。逆転写反応の反応条件は、アニーリング反応を16℃にて30分間、逆転写反応を42℃で30分間、そしてRTaseの失活を85℃で5分間行ない、得られたRT産物を、その後、4℃に置いた。
次に、核酸増幅反応では、TaqMan universal PCR master mix；10.0μl（Life Technologies社）／蒸留水 7.5μl／20×プライマーセット；1.0μl／前記RT産物；1.5μlからなる反応組成液を、94℃で2分を1サイクル、及び68℃で15秒と94℃で1分を40サイクルの条件で反応させ、その後、増幅産物を4℃に置いた。 増幅産物の検出及び定量には、Applied Biosystems 7900HTリアルタイムPCRシステム（Life Technologies社）を使用した。
（１）マウス血清中のmiRNA量
リアルタイムPCRによる定量結果に基づき、運動負荷を与えない、すなわち運動前のmdxマウスの血清中における各種miRNA等の平均量（n=5）について検証した。B10マウスの血清中における各miRNA量又はsnoRNA量を１としたときのmdxマウスの血清中における対応するmiRNA量又はsnoRNA量の相対値で表した。
結果を図１に示す。miR-16、miR-132及びsno202の血清中の量の相対値は、いずれも約１であり、健常個体のそれと比べてほとんど量的差異がないことがわかった。一方、骨格筋等で特異的に発現するmiR-1、miR-133a、miR-133b及びmiR-206の血清中の量は、B10のそれと比較して有意に高かった。したがって、miR-1、miR-133a、miR-133b及びmiR-206は、筋ジストロフィー検出用マーカーとなり得ることが明らかとなった。
なお、miR-133aの変異体であるmiR-133bについては、その挙動や機能がほとんど同じであることから、以降の実施例では、miR-133aについて示す。
（２）運動負荷後における筋ジストロフィー検出用マーカーの変動（I）
図１の結果から選択されたmiR-1、miR-133a及びmiR-206の運動負荷による血清中の量の変化について検証した。リアルタイムPCRにより測定した運動前及び運動負荷後の各経過時間における血清中のmiR-1、miR-133a及びmiR-206の量をmiR-16の量にて補正（各miRNAのCt/miR-16 Ctを算出）後、得られた各サンプルの補正値を、それぞれのマーカー候補の運動前のB10マウスにおける補正値（１とする）に対する相対値で表した。
結果を図２に示す。この図は、血清中のmiR-1（ａ）、miR-133a（ｂ）、miR-206（ｃ）及びクレアチンキナーゼ（CK）（ｄ）のB10マウス(白丸；破線)及びmdxマウス（黒丸；実線）における相対値について示している。この図より、血清中のmiR-1、miR-133a及びmiR-206の量は、いずれもmdxマウスの方がB10マウスと比較して高いことがわかった。また、運動直後に変動する傾向は、miR-1、miR-133a及びmiR-206もクレアチンキナーゼと同じであったが、その変化量、すなわち変動幅は、クレアチンキナーゼと比べると非常に小さかった。例えば、運動前に対する運動負荷後の最大値が、クレアチンキナーゼでは70倍以上あるのに対して、miR-1、miR-133a及びmiR-206では10倍以下しかない。したがって、運動負荷後においても、これらのmiRNAは、筋ジストロフィー検出用マーカーとなり得ることが確認された。
（３）運動負荷後における筋ジストロフィー検出用マーカーの変動（II）
さらに、運動負荷による血清中の量の変化を、miRNA又はクレアチンキナーゼのそれぞれの運動前との相対値で検証した。前記（２）と同様にリアルタイムPCRにより測定したB10及びmdxマウスの運動前における及び運動負荷後の各経過時間における血清中のmiR-1、miR-133a及びmiR-206の量をmiR-16の量にて補正（各miRNAのCt/miR-16 Ctを算出）した後、得られた各サンプルの運動負荷後の補正値をそれぞれの運動前の補正値、すなわち、B10についてはB10の運動前の補正値に、mdxについてはmdxの運動前の測定値に、対する相対値でその変化を検証した。
結果を図３に示す。mdxではクレアチンキナーゼが運動前に比べて約70倍の増加を示すのに対して、各miRNAの増加はクレアチンキナーゼに比べて極めて小さいことが明らかとなった。したがって、血清中のmiRNA量は、クレアチンキナーゼと比較して運動負荷による影響を受けにくいことが明らかとなった。
[実施例２]
＜筋ジストロフィーモデル犬を用いた筋ジストロフィー検出用マーカーの検証＞
本発明の筋ジストロフィー検出用マーカー及びそれを用いた検出方法の効果を、筋ジストロフィーモデル犬を用いて検証した。mdxマウスは、ヒト筋ジストロフィー患者と異なり、歩行困難等の症状を示さないが、mdxマウスと同様にX染色体連鎖の劣性遺伝によりジストロフィン遺伝子を欠損する筋ジストロフィー犬は、歩行困難等のヒトと類似した症状を示す。したがって、よりヒトに近い効果を検証することができる。
（材料）
筋ジストロフィーモデル犬としてX染色体上のジストロフィー遺伝子に異常を有するCXMDJ系統のビーグル犬、その保因犬（X染色体対の一方のジストロフィー遺伝子に異常を持つ雌ビーグル犬）及び健常犬（ジストロフィー遺伝子に異常のないビーグル犬）を用いた。
（方法）
各犬の生後直後（0日）、1日後、2日後、2〜4週後、2〜3月後、6〜7月後、12月後、24月後のそれぞれにおいて、29G注射針と0.5mLシリンジを用い、前肢又は後肢の皮静脈から100μL以上採血した。その後、実施例１と同様の方法により血清を調製し、一旦-80℃で冷凍保存した。実験には、各群から3〜5標本ずつ、無作為に抽出して用いた。
クレアチンキナーゼ活性、血清からのRNA抽出とそれを用いたリアルタイムPCRによる血清中のmiRNA（miR-1、miR-16、miR-133a及びmiR-206）の定量は、実施例１に準じた。
（結果）
結果を図４に示す。この図は、実施例１と同様に、リアルタイムPCRによるCXMDJ系統個体及び保因犬の血清中のmiR-1、miR-133a、miR-206及びクレアチンキナーゼのそれぞれの定量値をmiR-16の定量値によって補正し、その補正値を健常個体における対応する月齢の補正値に対する相対値として示したものである。
本発明の筋ジストロフィー検出用マーカーであるmiR-1、miR-133a及びmiR-206の血清中の量は、いずれもクレアチンキナーゼの挙動とほとんど同一の変化を示した。したがって、筋ジストロフィーモデル犬においても、これらのマーカーは有効であることが明らかとなった。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。

Claims (7)

  1. 運動負荷後の被験体から採取された血液中に存在する配列番号２で示される塩基配列を含むmiRNAの量を測定する工程、
    被験体の前記miRNAの血中量が健常個体の対応するmiRNAの血中量と比較して統計学的に有意に高いこととその被験体が筋ジストロフィーに罹患していることを関連づける工程
    を含む被験体における筋ジストロフィーの検出方法。
  2. miRNAが配列番号２で示される塩基配列からなる、請求項１に記載の方法。
  3. 運動負荷後の被験体から採取された血液中に存在する配列番号１、３または４で示される塩基配列を含むmiRNAのいずれか一以上の量を測定する工程、
    被験体の前記miRNAの血中量が健常個体の対応するmiRNAの血中量と比較して統計学的に有意に高いこととその被験体が筋ジストロフィーに罹患していることを関連づける工程
    をさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
  4. miRNAが配列番号１、３または４で示される塩基配列からなる、請求項３に記載の方法。
  5. 被験体の前記miRNAの血中量が健常個体における該miRNAの血中量の５倍以上である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
  6. miRNAの血中量を核酸増幅法又はハイブリダイゼーション法によって定量する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 核酸増幅法がリアルタイムPCR法である、請求項６に記載の方法。
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