CN107760787B

CN107760787B - 一种乳腺癌分子分型实时荧光多重pcr引物及试剂盒与应用

Info

Publication number: CN107760787B
Application number: CN201711249133.2A
Authority: CN
Inventors: 万东山; 郭樱
Original assignee: Luoyang Koch Medical Devices Co ltd
Current assignee: Luoyang Koch Medical Devices Co ltd
Priority date: 2017-12-01
Filing date: 2017-12-01
Publication date: 2020-05-19
Anticipated expiration: 2037-12-01
Also published as: CN107760787A

Abstract

本发明属于核酸检测技术领域，具体涉及一种乳腺癌分子分型实时荧光多重PCR引物及试剂盒与应用。所述的乳腺癌分子分型实时荧光多重PCR引物包含雌激素受体α66基因引物、孕激素受体基因引物、人类表皮生长因子受体2基因引物，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1～6所示。本发明还提供了一种乳腺癌分子分型实时荧光多重PCR快速检测试剂盒，该试剂盒包含上述引物、2×RT‑PCR Buffer、25×RT‑PCR Enzyme、阳性对照和阴性对照等。该试剂盒具有特异性强，灵敏度高、准确性高等特点。

Description

一种乳腺癌分子分型实时荧光多重PCR引物及试剂盒与应用

技术领域

本发明属于核酸检测技术领域，具体涉及一种乳腺癌分子分型实时荧光多重PCR引物及试剂盒与应用。

背景技术

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，据资料统计，发病率占全身各种恶性肿瘤的7～10％，在妇女仅次于子宫癌，它的发病常与遗传有关，以及40～60 岁之间，绝经期前后的妇女发病率较高，是一种严重影响妇女身心健康甚至危及生命的最常见的恶性肿瘤之一。

乳腺癌是一种高度异质性的肿瘤，传统的病理形态学分型在目前的临床实践中已逐渐显示出其不完善性。随着人类分子生物学技术的应用，以肿瘤形态学结合基因表达特征的分子分型概念已被学者们所认同。乳腺癌各分子亚型基因表型及临床病理学特点如下：

(1)Luminal A型：是乳腺癌最常见的分子亚型，发病率为44.5～69.0％。雌激素受体(ER或ERR或者ESR)和/或孕激素受体(PR或者PGR)阳性，原癌基因人类表皮生长因子受体2(Her2或者Erb-B2Receptor Tyrosine Kinase 2) 阴性，预后最好。内分泌治疗效果最佳。常采用内分泌治疗。绝经前常选择三苯氧胺，绝经后常选择芳香化酶抑制剂如阿那曲唑、来曲唑等。

(2)Luminal B型：luminal B型为7.8％，雌激素受体(ER)和/或孕激素受体(PR)阳性，原癌基因人类表皮生长因子受体2(Her2)阳性，内分泌治疗仍有效，预后较好。LuminalB型乳腺癌由于HER2表达阳性，对他莫昔芬的反应性低于luminal A型，但改用其他作用机制的内分泌治疗仍有效。治疗常采用化疗+内分泌治疗+靶向治疗。

(3)Her2过表达型：发病率为14.7％，雌激素受体(ER)和/或孕激素受体(PR)阴性，原癌基因人类表皮生长因子受体2(Her2)阳性，化疗效果较好，并且是HER2靶向治疗药赫塞汀治疗的适应病例，HER2(+)型乳腺癌对于环磷酰胺联合蒽环类(AC)化疗方案的疗效明显优于luminal型，前者的临床缓解率可达70％，而后者为47％。

(4)Basal-like型：发病率为17.1％，雌激素受体(ER)和/或孕激素受体 (PR)阴性，原癌基因人类表皮生长因子受体2(Her2)阴性，内分泌无效，化疗效果好，预后最差。其转移多发生于内脏及中枢神经系统。治疗选择化疗。在接受术前新辅助化疗(AC)的乳腺癌患者中，具有较高的总反应率及病理缓解率，85％的患者出现临床缓解，其中27％达到病理完全缓解，明显高于luminal 型乳腺癌。

病理形态相同的乳腺癌，由于分子遗传学改变，在分子水平上呈现高度异质，从而导致肿瘤的预后及对治疗的反应差别很大。而以基因表达谱为基础提出的乳腺癌基因分型，能更精确的反应肿瘤的生物学行为，判断预后，并有利于选择和研究更具针对性的个性化治疗方法。应根据每一位患者的分子分型及其他相关因素，制定个体化、系统性的治疗方案。目前临床上乳腺癌分子分型主要是雌激素受体α66(ER-α66)、孕激素受体(PR)、人类表皮生长因子受体2(Her2)，检测主要三种方法：免疫组织化学法、逆转录-聚合酶链反应

(RT-PCR)、蛋白免疫印迹法。免疫组织化学法(IHC)目前是判定乳腺癌分型的重要手段，但是其耗时长、对实验操作要求高，而且结果的判定人为主观性比较强。蛋白免疫印迹法则敏感度偏低。

近年来，乳腺癌的诊断、分期、治疗选择和预后判断等已由组织病理学、细胞病理学进人分子病理学阶段，将乳腺癌组织中提取mRNA，采用逆转录酶反转录成cDNA，再以cDNA为模板，进行PCR扩增，得到目的基因的表达。

荧光核酸PCR技术具有敏感性高，检测快速等优点，然而，传统的荧光实时PCR每次只能扩增一种基因分子，检测多种基因要多次尝试，耗费大量的时间和精力。新型的多重实时荧光PCR可以有效弥补单重PCR的这些缺陷，是一种非常有应用前景的诊断方法。

要成功实施多重PCR，需要解决几个技术问题：①由于每一种扩增子的最佳扩增条件都不一样，需要协调每个单独反应的条件以保证在单一扩增条件下各扩增子都能进行成功扩增。②由于需要使用多组引物/探针组合，不同引物/探针之间互相产生交联的可能性很大，因此在设计时需要考虑消除这一可能性。③每组引物/探针不能对其他目标和非目标核酸序列有交叉同源性，以防止产生假阳性的结果，影响对疾病的诊断。

发明内容

为了克服现有技术的不足和缺点，本发明的首要目的在于提供一种乳腺癌分子分型实时荧光多重PCR引物。

本发明的另一目的在于提供一种乳腺癌分子分型实时荧光多重PCR快速检测试剂盒，该试剂盒包含上述引物。

本发明的再一目的在于提供上述引物和试剂盒的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种乳腺癌分子分型实时荧光多重PCR引物，包含雌激素受体α66(ER-α66) 基因引物、孕激素受体(PR)基因引物、人类表皮生长因子受体2(Her2)基因引物，其核苷酸序列分别如下所示：

ER-α66-F：CATGGTGGAGATCTTCGA；

ER-α66-R：GTGCTGGACAGAAATGTG；

PR-F：ACCACGGTGATGGATTTC；

PR-R：CGTCGTAACTTTCGTCTTC；

Her2-F：CTTCCACAAGAACAACCA；

Her2-R：CTGACAATCCTCAGAACTC；

一种乳腺癌分子分型实时荧光多重PCR快速检测试剂盒，该试剂盒包含上述引物；

所述的乳腺癌分子分型实时荧光多重PCR快速检测试剂盒，还包含雌激素受体α66(ER-α66)基因探针、孕激素受体(PR)基因探针和类表皮生长因子受体2(Her2)基因探针，其核苷酸序列分别如下所示：

ER-α66-probe：CTGCTGGCTACATCATCTCGGT；

PR-probe：CGTGCCTATCCTGCCTCTCA；

Her2-probe：ACACTGATAGACACCAACCGCT；

所述的乳腺癌分子分型实时荧光多重PCR快速检测试剂盒，还包含β-actin 基因引物和探针，其核苷酸序列分别如下所示：

β-actin-F：TGCAGAAGGAGATCACTG；

β-actin-R：CTTGCTGATCCACATCTG；

β-actin-probe：AAGATCAAGATCATTGCTCCTCCTGA；

所述的雌激素受体α66(ER-α66)基因探针、孕激素受体(PR)基因探针、类表皮生长因子受体2(Her2)基因探针和β-actin基因探针的荧光标记分别为： FAM、VIC、Cy5和YAK；

所述的试剂盒还包括2×RT-PCR Buffer和25×RT-PCR Enzyme；

所述的试剂盒还包括阳性对照和阴性对照；

所述的乳腺癌分子分型实时荧光多重PCR引物和试剂盒在制备检测乳腺癌分子分型产品中的应用；

所述的应用不包含疾病的治疗与诊断目的；

一种乳腺癌分子分型方法，包含如下步骤：

(1)提取待测样品RNA；

(2)配制RT-PCR反应体系：步骤(1)制得的RNA10μl，2×RT-PCR Buffer 12.5μl，25×RT-PCR Enzyme Mix 1μl，上述试剂盒中引物/探针组合1.5μl，其中，模板终浓度为5μM，各引物/探针终浓度为0.5μM；

(3)进行RT-PCR反应；

(4)根据扩增曲线Ct值，判断雌激素受体-α66基因、孕激素受体基因、人类表皮生长因子受体2基因表达情况；如某种受体基因相应的荧光信号产生指数Ct值小于33，则为阳性，否则为阴性；

所述的RT-PCR反应的反应程序为：50℃保持15min，95℃保持10min；95℃维持8s，60℃维持34s，40个循环；

所述的方法不包含疾病的治疗与诊断目的；

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明提供的引物和试剂盒，避免了不同引物/探针之间互相产生交联的问题，每组引物/探针不会对其他目标和非目标核酸序列产生交叉同源性，可实现一次反应同时检测乳腺癌三种受体分子基因。

(2)本发明提供的引物、试剂盒和检测方法，灵敏度高、特异性强、准确性高，检测所需时间短，为临床和检测实验室提供了有力的检测工具。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

(1)设计引物/探针组合

根据GenBank发布的乳腺癌各个分子受体的mRNA序列(ER-α66基因：N M_000125.3；PR基因：NM_000926.4；Her2基因：NM_001005862.2)，进行序列比对以寻找保守区域，使用Beacon

软件对这些受体基因转录m RNA进行多重RT-PCR的引物和Taqman探针设计，每个分子设计三对引物(表1)。将所得到的各引物/探针组合在NCBI网站上进行BLAST分析以确保与样本中可能存在的其他基因不发生交叉反应。并对设计的不同引物和探针分别进行交叉试验，共进行81组实验。通过实验验证其性能最佳的引物组合。同时设计单重RT-PCR引物作为对照。

表1多重RT-PCR引物/探针组合

(2)内对照和阴性对照：内参基因β-actin cDNA质粒标准品(Sino Biological 货号HG10962-M)，稀释至2×10⁴copies/ml，作为RT-PCR反应的内对照；灭菌0.1％ (v/v)DEPC纯化水作为阴性对照。

(3)模板：分别将ER-α66、PR、Her2阳性细胞株MFC-7、Bcap-37、SK-BR-3 (购自上海歌凡生物科技有限公司)经过培养、传代、扩增等步骤，收集细胞，得到样本；各样本加入2μl内对照(终浓度为5μM)，分别提取各样本RNA (

mRNA DIRECT^TMPurification(life))，并混合，得到混合RNA；阴性对照加入2μl内对照(5μM)；

(4)RT-PCR：以混合RNA为模板，单重RT-PCR引物或多重RT-PCR引物为扩增引物，采用AgPath-ID^TM One-Step RT-PCR试剂盒进行实时荧光定量PCR，其中，反应体系(25μl)为：模板10μl，2×RT-PCR Buffer 12.5μl，25×RT-PCR Enzyme Mix 1μl，各引物/探针组合1.5μl，其中，各引物/探针终浓度为0.5μM；随后将各反应管按照以下程序在实时荧光PCR仪(ABI7500，Applied Biosystems)上进行RT-PCR反应：50℃保持15min(逆转录)，95℃保持10min (热启动)；95℃维持8s(变性)，60℃维持34s(退火/延伸，采集荧光信号)， 40个循环。

(5)结果判定：所有阴性对照的信号值都应低于阈值。所有阳性样本、内对照信号都应有指数上升且Ct值必须小于33。否则说明扩增不成功。

实验结果分析：

设计引物排列交叉试验，综合考虑检测结果，确认ER-α66、PR、Her2基因最佳多重RT-PCR引物为引物1(ER66)，引物2(PR)，引物2(Her)、引物1 (Actin)，与最佳单重RT-PCR引物并不一致(表2和表3)。

表2ER-α66、PR、Her2基因最佳多重RT-PCR引物及内对照引物和探针

实施例2

(1)制备阳性对照，检测最低检出量

分别将ER-α66、PR、Her2阳性细胞株MFC-7、Bcap-37、SK-BR-3(购自上海歌凡生物科技有限公司)经过培养、传代、扩增等步骤，收集细胞，提取 mRNA，以表2所示引物作为扩增引物，进行RT-PCR，其中，反应体系(25μl) 为：模板10μl，2×RT-PCR Buffer 12.5μl，25×RT-PCR Enzyme Mix 1μl，各引物/ 探针组合1.5μl，其中，模板终浓度为5μM，各引物/探针终浓度为0.5μM；随后将各反应管按照以下程序在实时荧光PCR仪(ABI 7500，AppliedBiosystems) 上进行RT-PCR反应：50℃保持15min(逆转录)，95℃保持10min(热启动)； 95℃维持8s(变性)，60℃维持34s(退火/延伸，采集荧光信号)，40个循环。反应产物用电泳鉴定并进行回收，回收产物与载体pMD^TM19-T(pMD^TM19-T Vector Cloning Kit，Takara)连接，并转入E.coli HST08(Takara)，挑选阳性克隆测序并抽质粒(

96PlasmidPurification System，Invitrogen)，分别得到连接有ER-α66、PR、Her2目的序列的质粒载体，按照1:1:1比例定量混合，各质粒的终浓度分别为1ng/ml，用来作为RT-PCR反应的阳性对照，利用阳性对照检测最佳多重RT-PCR引物的最低检出量。

(2)选取ER-α66阳性组织20例、PR阳性组织20例、Her2阳性组织20 例作为特异性样本(来源：北京中杉金桥生物技术有限公司)，检测最佳多重 RT-PCR引物的特异性。

结果如表3所示，ER-α66、PR、Her2基因最佳多重RT-PCR引物最低检出量分别为98cop/ml、1000cop/ml、95cop/ml，特异性100％，其灵敏度与最佳单重RT-PCR引物灵敏度基本一致(无显著性差异)，特异性100％符合。

表3引物最低检出量及特异性分析

实施例3

从新鲜乳腺癌组织样本或组织切片中提取RNA，在提取之前先向样本中加入2μl内对照(终浓度为5μM)，然后从样本中提取RNA(

mRNA DIRECT^TM Purification(life))。然后以表2所示引物组合作为扩增引物，进行RT-PCR，反应体系(25μl)为：RNA模板10μl，2×RT-PCR Buffer 12.5μl， 25×RT-PCR Enzyme Mix 1μl，各引物/探针组合1.5μl，其中，样本最终浓度为 5μM，各引物/探针浓度为0.5μM；扩增程序为：50℃保持15min(逆转录)，95℃保持10min(热启动)；95℃维持8s(变性)，60℃维持34s(退火/延伸，采集荧光信号)，40个循环。

结果判定：如某种受体基因相应的荧光信号产生指数Ct值小于33，则为阳性，否则为阴性。

检测新鲜乳腺癌组织样本或组织切片，可检测到ER-α66、PR、Her2的PCR 表达产物。

实施例4

利用实施例3反应体系及方法，检测了ER-α66、PR、Her2分别为阳性的样本(ER-α66阳性组织、PR阳性组织、Her2阳性组织，来源：北京中杉金桥生物技术有限公司)，并与免疫组织化学法进行比较，其中ER-α66阳性符合率98.8％，PR阳性符合率100％，Her2的阳性符合率97.8％。本发明提供的引物及方法适合于乳腺癌患者的分子病理分型的检测，对患者的用药和预后有重要的指导意义。

表4RT-PCR准确性分析

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 洛阳科赫医疗器械有限公司

<120> 一种乳腺癌分子分型实时荧光多重PCR引物及试剂盒与应用

<130> 1

<160> 45

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物ER-α66-F

<400> 1

catggtggag atcttcga 18

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ER-α66-R

<400> 2

gtgctggaca gaaatgtg 18

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物PR-F

<400> 3

accacggtga tggatttc 18

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物PR-R

<400> 4

cgtcgtaact ttcgtcttc 19

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物Her2-F

<400> 5

cttccacaag aacaacca 18

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物Her2-R

<400> 6

ctgacaatcc tcagaactc 19

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物β-actin-F

<400> 7

tgcagaagga gatcactg 18

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物β-actin-R

<400> 8

cttgctgatc cacatctg 18

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ER-α66-probe

<400> 9

ctgctggcta catcatctcg gt 22

<210> 10

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> PR-probe

<400> 10

cgtgcctatc ctgcctctca 20

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Her2-probe

<400> 11

acactgatag acaccaaccg ct 22

<210> 12

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物ER-α66-F2

<400> 12

ctgctggaga catgagag 18

<210> 13

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物ER-α66-R2

<400> 13

actcggaata gagtatggg 19

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<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ER-α66-probe2

<400> 14

catccaacaa ggcactgacc atc 23

<210> 15

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物ER-α66-F3

<400> 15

aacgctctaa gaagaaca 18

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物ER-α66-R3

<400> 16

gtaggatcat actcggaata 20

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<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ER-α66-probe3

<400> 17

catccaacaa ggcactgacc atc 23

<210> 18

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物PR-F1

<400> 18

acggtgatgg atttcatc 18

<210> 19

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物PR-R1

<400> 19

gtcgtaactt tcgtcttc 18

<210> 20

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> PR-probe1

<400> 20

tgcctatcct gcctctcaat caca 24

<210> 21

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物PR-F3

<400> 21

ggaagttaat aagtagattc atatc 25

<210> 22

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物PR-R3

<400> 22

taggccataa tcttctga 18

<210> 23

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> PR-probe3

<400> 23

ttcttatgtc cactcgcaat acctca 26

<210> 24

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物Her2-F1

<400> 24

gtggtcatcc agaatgag 18

<210> 25

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物Her2-R1

<400> 25

gtaccagata ctcctcag 18

<210> 26

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Her2-probe1

<400> 26

tgtcatcgtc ctccagcagt g 21

<210> 27

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物Her2-F3

<400> 27

ggtagaacct ttgctgtc 18

<210> 28

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物Her2-R3

<400> 28

tgccaccatt cattaagtg 19

<210> 29

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Her2-probe3

<400> 29

ttcaccactc tacctccagc ac 22

<210> 30

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物β-actin-F2

<400> 30

gatgcagaag gagatcac 18

<210> 31

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物β-actin-R2

<400> 31

cttgctgatc cacatctg 18

<210> 32

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> β-actin-probe2

<400> 32

tgaagatcaa gatcattgct cctcct 26

<210> 33

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物β-actin-F3

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gacgacatgg agaaatc 17

<210> 34

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物β-actin-R3

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gaaggtctca aacatgatc 19

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<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> β-actin-probe3

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caccacacct tctacaatga gc 22

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<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> β-actin-probe

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aagatcaaga tcattgctcc tcctga 26

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 单重引物ER-α66-F

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<210> 38

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 单重引物ER-α66-R

<400> 38

ggatcatact cggaataga 19

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<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 单重ER-α66-probe

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catccaacaa ggcactgacc atc 23

<210> 40

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 单重引物PR-F

<400> 40

ggaagttaat aagattcata tc 22

<210> 41

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 单重引物PR-R

<400> 41

gttggtaagg agtacagtta 20

<210> 42

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 单重PR-probe

<400> 42

ttcttatgtc cactcgcaat acctca 26

<210> 43

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 单重引物Her2-F

<400> 43

cttccacaag aacaacca 18

<210> 44

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 单重引物Her2-R

<400> 44

ctgacaatcc tcagaactc 19

<210> 45

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 单重Her2-probe

<400> 45

tgtcatcgtc ctccagcagt g 21

Claims

1.一种乳腺癌分子分型实时荧光多重PCR引物和探针，其特征在于包含雌激素受体α66基因引物、孕激素受体基因引物、人类表皮生长因子受体2基因引物，其核苷酸序列分别如下所示：

ER-α66-F：CATGGTGGAGATCTTCGA；

ER-α66-R：GTGCTGGACAGAAATGTG；

PR-F：ACCACGGTGATGGATTTC；

PR-R：CGTCGTAACTTTCGTCTTC；

Her2-F：CTTCCACAAGAACAACCA；

Her2-R：CTGACAATCCTCAGAACTC；

还包含雌激素受体α66基因探针、孕激素受体基因探针和类表皮生长因子受体2基因探针，其核苷酸序列分别如下所示：

ER-α66-probe：CTGCTGGCTACATCATCTCGGT；

PR-probe：CGTGCCTATCCTGCCTCTCA；

Her2-probe：ACACTGATAGACACCAACCGCT。

2.一种乳腺癌分子分型实时荧光多重PCR快速检测试剂盒，其特征在于该试剂盒包含权利要求1所述的引物和探针。

3.根据权利要求2所述的乳腺癌分子分型实时荧光多重PCR快速检测试剂盒，其特征在于还包含β-actin基因引物和探针，其核苷酸序列分别如下所示：

β-actin-F：TGCAGAAGGAGATCACTG；

β-actin-R：CTTGCTGATCCACATCTG；

β-actin-probe：AAGATCAAGATCATTGCTCCTCCTGA。

4.根据权利要求3所述的乳腺癌分子分型实时荧光多重PCR快速检测试剂盒，其特征在于：

所述的雌激素受体α66基因探针、孕激素受体基因探针、类表皮生长因子受体2基因探针和β-actin基因探针的荧光标记分别为：FAM、VIC、Cy5和YAK。

5.根据权利要求2所述的乳腺癌分子分型实时荧光多重PCR快速检测试剂盒，其特征在于：

所述的试剂盒还包括2×RT-PCR Buffer和25×RT-PCR Enzyme。

6.根据权利要求2所述的乳腺癌分子分型实时荧光多重PCR快速检测试剂盒，其特征在于：

所述的试剂盒还包括阳性对照和阴性对照。

7.权利要求1所述的乳腺癌分子分型实时荧光多重PCR引物和探针与权利要求2～6任一项所述的试剂盒在制备检测乳腺癌分子分型产品中的应用。

8.一种乳腺癌分子分型方法，其特征在于包含如下步骤：

(1)提取待测样品RNA；

(2)配制RT-PCR反应体系：步骤(1)制得的RNA 10μl，2×RT-PCR Buffer 12.5μl，25×RT-PCR Enzyme Mix 1μl，权利要求2～7任一项所述的试剂盒中引物/探针组合1.5μl，其中，模板终浓度为5μM，各引物/探针终浓度为0.5μM；

(3)进行RT-PCR反应；

所述的方法不包含疾病的治疗与诊断目的。

9.根据权利要求8所述的乳腺癌分子分型方法，其特征在于：

所述的RT-PCR反应的反应程序为：50℃保持15min，95℃保持10min；95℃维持8s，60℃维持34s，40个循环。