JP2006519591A - 乳癌患者の診断および予後 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、乳癌の診断および予後に有用なマーカー遺伝子の同定に関する。より詳細には、本発明は、乳癌に関連する一セットのマーカー遺伝子、エストロゲン受容体(+)腫瘍対エストロゲン受容体(−)腫瘍中で示差的に発現される一セットのマーカー遺伝子、BRCA1対散発性腫瘍中で示差的に発現される一セットのマーカー遺伝子、および臨床的予後が良好な(すなわち診断から少なくとも5年間の経過観察の間、転移または疾患がない)患者対臨床的予後が不良な(すなわち診断から5年以内に転移または疾患が起こった)患者に由来する散発性腫瘍中で示差的に発現される一セットのマーカー遺伝子の同定に関する。上記マーカーのセットのそれぞれについて、本発明はさらに、乳癌に関連する状態を識別する方法に関する。本発明はさらに、乳癌を有する患者の治療過程を決定する方法を提供する。
米国および実際に世界中で報告されている癌の症例数の上昇は重大な懸案事項である。現在では特定の種類の癌に対して利用可能な一握りの治療方法しか存在せず、これらは成功する保証がない。最も有効であるためには、これらの治療には悪性腫瘍の早期検出が必要であるだけでなく、悪性腫瘍の重篤度の信頼性のある評価も必要である。
本発明は、乳癌の様々な種類および亜型を識別する遺伝子マーカーのセット、ならびにその使用方法を提供する。一実施形態では、本発明は、細胞サンプルをER(+)またはER(−)として分類する方法であって、対照と比較した第1の複数の遺伝子の発現の差を検出することを含み、前記第1の複数の遺伝子は表1に記載のマーカーに対応する遺伝子の少なくとも5個からなる方法を提供する。具体的な実施形態では、前記複数の遺伝子は、表1に記載の遺伝子マーカーの少なくとも50、100、200、500、1000、2,460個までからなる。別の具体的な実施形態では、前記複数の遺伝子は、表2に記載の2,460個のマーカーに対応するそれぞれの遺伝子からなる。別の具体的な実施形態では、前記複数の遺伝子は、表2に記載の550個のマーカーからなる。別の具体的な実施形態では、前記対照は、個々の散発性患者の腫瘍のプール由来の核酸を含む。別の具体的な実施形態では、前記検出は、(a)複数の散発性患者内の複数のER(+)患者由来の核酸を個々の散発性患者の腫瘍のプール由来の核酸に対してハイブリダイゼーションさせることによってER(+)テンプレートを作製するステップと;(b)前記複数の散発性患者内の複数のER(−)患者由来の核酸を前記複数の散発性患者内の個々の散発性患者の前記腫瘍のプール由来の核酸に対してハイブリダイゼーションさせることによってER(−)テンプレートを作製するステップと;(c)個々のサンプル由来の核酸を前記プールに対してハイブリダイゼーションさせるステップと;(d)個々のサンプル中のマーカー遺伝子の発現とER(+)テンプレートおよびER(−)テンプレートの発現との類似度を決定するステップであって、前記発現がER(+)テンプレートにより類似している場合はサンプルをER(+)と分類し、前記発現がER(−)テンプレートにより類似している場合はサンプルをER(−)と分類するステップとを含む。
はそれぞれER(−)およびER(+)テンプレートであり、それぞれ、前記第2の蛍光体標識した核酸の第1のプール中の前記マーカーのそれぞれにおける前記第2の蛍光発光シグナルおよび前記第2の蛍光体標識した核酸の第2のプール中の前記マーカーのそれぞれにおける前記第3の蛍光発光シグナルの平均をとることによって計算し、
は、ER(+)またはER(−)として分類するサンプル中の前記マーカーのそれぞれにおける前記第1の蛍光発光シグナルであり、サンプル中のマーカーの発現は、P1<P2である場合はER(+)に類似しており、P1>P2である場合はER(−)に類似している]。
は前記表現型の分類を表わす数であり、
はそれぞれの個々の遺伝子におけるすべてのサンプルにわたる対数的発現率であり、相関係数が閾値以上の絶対値を有する場合は前記遺伝子の前記発現が前記表現型の分類に関連しており、前記複数の遺伝子は、その発現が特定の表現型に関連する一セットのマーカー遺伝子である]
ステップとを含む方法を提供する。閾値は使用するサンプルの数に依存し、閾値は、
[式中、
は分布幅であり、n=サンプル数である]
として計算することができる。n=98である具体的な実施形態では、前記閾値は0.3である。具体的な実施形態では、前記マーカー遺伝子のセットは、以下のように確証する:(a)統計的方法を使用して前記マーカー遺伝子と前記表現型の分類との関連性をランダム化することによって、それぞれのマーカー遺伝子について対照相関係数を作製すること;(b)ステップ(a)を100回以上繰り返してそれぞれのマーカー遺伝子についての前記対照相関係数の頻度分布を得ること;(c)閾値以上の対照相関係数を有するマーカー遺伝子の数を決定することによって、対照マーカー遺伝子のセットを作製すること;および(d)このようにして同定された対照マーカー遺伝子の数を前記マーカー遺伝子の数と比較し、前記マーカー遺伝子の数と対照遺伝子の数とのp値の差が0.01未満の場合は、前記マーカー遺伝子のセットは有効である。別の具体的な実施形態では、前記マーカー遺伝子のセットを、(a)相関の大きさまたは相関係数の有意性によって遺伝子を順位づけすること、および(b)順位リストの上位から任意数のマーカー遺伝子を選択することを含む方法によって最適化する。閾値は試験したサンプルの数に依存する。
5.1 序論
本発明は、発現パターンが、乳癌腫瘍の重要な特徴、すなわち、エストロゲン受容体(ER)の状態、BRCA1の状態、および再発(すなわち、遠隔転移または予後不良)の尤度と相関する遺伝子マーカーのセットに関する。より詳細には、本発明により、次の3つの病態を識別できる遺伝子マーカーのセットが提供される。第1に、本発明は、発現が患者のER状態と相関し、ER(+)患者をER(−)患者から識別するために使用できるマーカーセットに関する。ER状態は、有用な予後因子であり、患者がタモキシフェンなどの特定の治療法に応答する尤度の標識である。また、ER陽性である女性のうち、ホルモン療法に対する応答率(50%を上回る)は、ER状態が陰性の患者における応答率(10%低い)よりもずっと高い。ER陽性の腫瘍をもつ患者では、ホルモン応答を達成する確率は、レベルERに直接に比例する(P. CalabresiおよびP. S. Schein, MEDICAL ONCOLOGY (2ND ED.), McGraw-Hill, Inc., New York (1993))。第2に、本発明は、さらに、発現がBRCA1突然変異の存在と相関し、BRCA1タイプの腫瘍を散発性腫瘍から識別するのに使用できるマーカーセットに関する。第3に、本発明は、発現が臨床予後と相関し、予後良好(すなわち、5年以内の腫瘍の遠隔転移がない)の患者を予後不良(すなわち、5年以内の腫瘍の遠隔転移)から識別するのに使用できる遺伝子マーカーに関する。こうした患者群の間で識別を行い、治療の一般的方針を決めるためにこれらのマーカーを使用する方法が提供される。また、これらのマーカーを含むマイクロアレイ、ならびにそのようなマイクロアレイを構築する方法が提供される。各マーカーは、ヒトゲノム中の1個の遺伝子に対応する。すなわち、そのようなマーカーは、1個の遺伝子の全体または一部分として同定可能である。最後に、上記マーカーのそれぞれは、特定の乳癌に関連する病態と相関するため、マーカー、またはそれらがコードするタンパク質は、乳癌に対する薬物についての標的であることが見込まれる。
本明細書で使用する「BRCA1腫瘍」とは、BRCA1遺伝子座の突然変異を含む細胞を有する腫瘍を意味する。
5.3.1 マーカーセット
本発明では、発現がクラスター化解析によって乳癌の存在と相関させられる4986個の遺伝子マーカーのセットを提供する。これらのマーカーのうちの、診断または予後に有用なものとして同定したサブセットを、配列番号:1−2699として列挙してある。また、本発明では、これらのマーカーを使用して、腫瘍のタイプの識別を診断または予後において行う方法を提供する。
本発明では、乳癌に付随する病態または徴候の同定のためのマーカーのセットを提供する。一般に、マーカーのセットの同定は、約25000個のヒトのマーカーのうちで、どれがその病態または徴候と相関する発現パターンを有したかを決定することによって行った。
は臨床パラメータまたはカテゴリーを表し、
はサンプルと対照の間の発現の比の線形、対数、または任意の変換を表す。相関係数があるカットオフを超えるマーカーを、特定の臨床型に特異的な乳癌関連のマーカーとして同定する。そのようなカットオフまたは閾値は、モンテカルロシミュレーションで得られる、判別遺伝子の特定の有意性に対応している。この閾値は、使用するサンプルの数に依存する。閾値は、
として計算することができ、ここで
は分布幅であり、n=サンプルの数である。具体的な実施形態では、マーカーを、相関係数が約0.3より大きいか、または約−0.3より小さい場合に選ぶ。
は、第1の診断群(たとえば、ER(−))の内部の転写産物の発現測定値のlog比の誤差で重み付けをした平均であり、
は、第2の、関連する診断群(たとえば、ER(+))の内部のlog比の誤差で重み付けをした平均であり、σ1は、ER(−)群の内部のlog比の分散であり、n1は、log比の有効な測定値が利用可能なサンプルの数である。σ2は、第2の診断群(たとえば、ER(+))の内部のlog比の分散であり、n2は、log比の有効な測定値が利用可能なサンプルの数である。このt値は、分散を補償した、2つの平均の間の差となっている。
本発明では、標的ポリヌクレオチド分子を、乳癌にかかっている個人から採取したサンプルから抽出する。サンプルの収集は、臨床的に受け入れられるどのような形でも行うことができるが、マーカー由来のポリヌクレオチド(すなわち、RNA)が保存されるように収集しなければならない。mRNAまたはこれに由来する核酸(すなわち、cDNAまたは増幅したDNA)の標識化を、好ましくは、標準または対照のポリヌクレオチド分子から識別できるように行い、この両方のハイブリダイゼーションを、同時にまたは独立に、上で説明したマーカーまたはマーカーのセットもしくはサブセットの一部または全部を含むマイクロアレイに対して行う。あるいは、mRNAまたはこれに由来する核酸の標識化は、標準または対照のポリヌクレオチド分子と同じ標識で行うことができ、特定のプローブにおいてそれぞれのハイブリダイゼーションの強度を比較する。サンプルは、腫瘍生検や穿刺吸引細胞診(fine needle aspirate)など、任意の臨床的に関連性のある組織サンプル、または、血液、血漿、血清、リンパ液、腹水、嚢胞液、尿、または乳頭滲出液などの体液のサンプルを含むことができる。サンプルの採取は、ヒトから、あるいは、獣医学に関しては、反芻動物、ウマ、ブタ、またはヒツジなどの非ヒト動物から、または、ネコやイヌなどの飼育伴侶動物(domestic companion animal)から行うことができる。
5.4.1 診断方法
本発明では、マーカーのセットを使用して、ある個人からのサンプルの分析を、その個人の腫瘍の分子レベルでのタイプまたはサブタイプ、ある腫瘍がER(+)またはER(−)タイプであるかどうか、その腫瘍がBRCA1関連または散発性であるかどうかを決定するために行う方法を提供する。その個人は、実際に乳癌にかかっていなくてもよい。基本的には、その個人、またはその個人から採取したサンプルの中の特定のマーカー遺伝子の発現を、標準または対照と比較する。たとえば、乳癌関連の2つの病態、XとYがあるとしよう。ある個人における病態Xに対する乳癌予後マーカーの発現のレベルを、対照におけるマーカー由来のポリヌクレオチドのレベルと比較することができ、ここで、そのレベルは、病態Xを有するサンプルの示す発現のレベルである。この例では、その個人のサンプル中のマーカーの発現が実質的に(すなわち、統計的に)対照のそれとは異なる場合、その個人は病態Xをもたない。ここでのように、選択が二方式である場合(すなわち、あるサンプルはXかYかである)には、その個人はさらに病態Yを有するということができる。もちろん、病態Yに相当する対照との比較も行うことができる。好ましくは、そのどちらも同時に行い、対照それぞれが、陽性の対照と陰性の対照のどちらとしても働くようにする。したがって、識別を行う結果は、その対照の表す発現レベル(すなわち、マーカー由来のRNA、またはこれに由来するポリヌクレオチドの量)からの証明可能な差、または有意差のないこととすることができる。
ziは発現テンプレートiであり、yはある患者の発現プロファイルである]。
本発明では、患者を異なる予後カテゴリーに分類するのに有用なマーカーのセットを提供する。たとえば、本発明では、さらに、これらマーカーを使用して、乳癌にかかっている個人の臨床的予後が良好になるか不良になるかを決定する方法を提供する。本発明では、さらに、「予後良好」の患者をさらに、2つの群、すなわち「予後の優良である」患者と、「予後の中等度」である患者に分類する方法を提供する。上記の分類それぞれに対して、本発明では、さらに、推奨する治療法を提供する。
本明細書で開示したマーカーを使用して、また実際に、マーカーの任意のセットを使用して、ある表現型を有する個人を第2の表現型を有する別の個人から識別する際にも、あるサンプル中のマーカーのそれぞれの絶対的発現を、ある対照と比較することができる。たとえば、この対照は、それぞれ、複数の個人のプール中の、マーカーのそれぞれの発現の平均レベルとすることができる。しかし、比較の感度を上げるために、好ましくは、発現レベルの値をいくつもの手法で変換する。
5.5.1 方法
あるサンプル中のマーカー遺伝子の発現レベルの決定は、当技術分野に知られているどのような手段によっても行うことができる。発現レベルの決定は、マーカー遺伝子それぞれから転写した核酸の単離および核酸のレベル(すなわち、量)の決定によって行うことができる。あるいは、または追加として、あるマーカー遺伝子から転写したmRNAから翻訳した特定のタンパク質のレベルを決定することもできる。
好ましい実施形態では、ポリヌクレオチドマイクロアレイを使用して発現を計測し、その結果、上記のマーカーそれぞれの発現の状態は同時に評価される。具体的な一実施形態では、本発明は、上で説明したマーカーセットのそれぞれに対応する遺伝子に対してハイブリダイズ可能なプローブを含むオリゴヌクレオチドまたはcDNAのアレイを提供する(すなわち、ある腫瘍の分子タイプまたはサブタイプを決定するマーカー、ER状態を識別するマーカー、BRCA1を散発性腫瘍から識別するマーカー、良好の患者を予後不良の患者に対して識別するマーカー、ER(+)をER(−)からと、BRCA1腫瘍を散発性腫瘍からの識別をどちらも行うマーカー、ER(+)をER(−)から、および予後良好の患者を予後不良の患者から識別するマーカー、BRCA1腫瘍を散発性腫瘍から、および予後良好の患者を予後不良の患者から識別するマーカー、ER(+)をER(−)から、BRCA1腫瘍を散発性腫瘍から、および予後良好の患者を予後不良の患者から識別することのできるマーカー、および状態それぞれに特有のマーカー)。
マイクロアレイの調製は、ポリヌクレオチド配列を含むプローブを選択し、次いでそのようなプローブを固体支持体または表面へと固定することによって行う。たとえば、プローブは、DNA配列、RNA配列、またはDNAとRNAのコポリマー配列を含むことができる。また、プローブのポリヌクレオチド配列は、DNAおよび/またはRNAのアナログ、またはその組み合わせを含むことができる。たとえば、プローブのポリヌクレオチド配列は、ゲノムDNAの完全または一部の断片を含むことができる。プローブのポリヌクレオチド配列は、合成オリゴヌクレオチド配列などの、合成ヌクレオチド配列とすることもできる。プローブ配列は、in vivoで酵素的に、in vitroで酵素的に(たとえば、PCRによって)、またはin vitroで非酵素的に合成することができる。
上で触れたように、本発明による、特定のポリヌクレオチド分子が特異的にハイブリダイズする「プローブ」は、相補的なゲノムポリヌクレオチド配列を含む。マイクロアレイのプローブは、好ましくは、1000ヌクレオチド以下のヌクレオチド配列からなる。一部の実施形態では、アレイのプローブは、10〜1000ヌクレオチドのヌクレオチド配列からなる。好ましい一実施形態では、プローブのヌクレオチド配列は、長さが10〜200ヌクレオチドの範囲にあり、1つの種の生物のゲノム配列であって、複数の異なるプローブが、そのような1つの種の生物のゲノムと相補的であり、したがってハイブリダイズできる配列を、そのようなゲノムの全体または一部にわたって順次敷き詰めたものとなっている。他の具体的な実施形態では、プローブは、長さ10〜30ヌクレオチドの範囲、長さ10〜40ヌクレオチドの範囲、長さ20〜50ヌクレオチドの範囲、長さ40〜80ヌクレオチドの範囲、長さ50〜150ヌクレオチドの範囲、長さ80〜120ヌクレオチドの範囲にあり、最も好ましくは、長さは60ヌクレオチドである。
プローブは、固体支持体または表面へと結合させるが、これは、たとえば、ガラス、プラスチック(たとえば、ポリプロピレン、ナイロン)、ポリアクリルアミド、ニトロセルロース、ゲル、または他の多孔質または非多孔質の素材から作製することができる。核酸を表面へと結合させる好ましい方法は、ガラスプレート上にプリントすることであり、これはSchena et al.、Science 270:467-470 (1995)で一般的に説明されている通りである。この方法は、cDNAのマイクロアレイを調製するのに特に有用である(DeRisi et al., Nature Genetics 14:457-460 (1996);Sharon et al., Genome Res. 6:639-645 (1996);および、Schena et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93:10539-11286 (1995)も参照されたい)。
本発明によって分析することのできるポリヌクレオチド分子(「標的ポリヌクレオチド分子」)は任意の臨床的採取源からのものとすることができるが、天然に存在する核酸分子並びに合成核酸分子を含めて、発現したRNAまたはこれに由来する核酸(たとえば、cDNA、または、RNAポリメラーゼプロモーターを取り込むcDNAに由来する増幅したRNA)である。一実施形態では、標的ポリヌクレオチド分子は、RNAを含み、これは、全細胞RNA,ポリ(A)+メッセンジャーRNA(mRNA)またはその一部、細胞質mRNA、またはcDNAから転写されたRNA(すなわち、cRNA。たとえば、1999年10月4日出願のLinsley & Schelter,米国特許出願第09/411,074号、または米国特許第5,545,522号、第5,891,636号または第5,716,785号を参照されたい)を含むが、決してこれに限定されるものではない。全RNAおよびポリ(A)+RNAを調製する方法は当技術分野にはよく知られており、その一般的な記述が、たとえば、Sambrookら, MOLECULAR CLONING - A LABORATORY MANUAL (2ND ED), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Sprint Harbor, New York (1989)にある。一実施形態では、RNAの抽出を、本発明で対象となる多種の細胞から、グアニジニウムチオシアネート溶解と、それに続くCsCl遠心分離を用いて行う(Chirgwinら, 1979, Biochemistry 18:5294-5299)。別の実施形態では、全RNAの抽出を、シリカゲルベースのカラムを用いて行うが、その市販例としては、RNeasy(カリフォルニア州Valencia、Qiagen)およびStrataPrep(カリフォルニア州La Jolla、Stratagene)がある。S. cerevisiaeの場合に好ましい一代替実施形態では、RNAの細胞からの抽出をフェノールおよびクロロホルムを用いて行うが、その記述が、Ausubel et.al., eds, 1989, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Vol III, Green Publishing Associates, Inc., John Wiley & Sons, Inc., New York, pp. 13.12.1-13.12.5にある。ポリ(A)+ RNAの選択は、たとえば、オリゴ−dTセルロースによる選択によって、または、代替方法として、全細胞RNAのオリゴ−dTプライミング逆転写によって行うことができる。一実施形態では、RNAの断片化を、当技術分野に知られている方法によって、たとえば、RNAの断片を生成するためのZnCl2によるインキュベーションによって、行うことができる。別の実施形態では、本発明によって分析するポリヌクレオチド分子は、cDNA、増幅したRNAまたはcDNAのPCR産物を含む。
核酸のハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件は、標的ポリヌクレオチド分子が、アレイの相補的ポリヌクレオチド配列に対して、好ましくは、その相補的DNAを配置してある特定のアレイ部位に対して、特異的に結合または特異的にハイブリダイズするように選ぶ。
蛍光標識したプローブの使用時には、マイクロアレイの各部位における蛍光発光を、好ましくは走査共焦点レーザー顕微鏡によって検出することができる。一実施形態では、適切な励起線を用いて、別個の走査を、使用している2種の蛍光体のそれぞれに対して行う。あるいは、2種の蛍光体に特異的な波長で試料の同時照射を可能とするレーザーを使用することができ、2種の蛍光体からの発光を同時に分析することができる(Shalonら, 1996, 「A DNA microarray system for anlyzying complex DNA samples using two-color fluorescent probe hybridization,」Genome Research 6:639-645を参照されたい。この全体を参照によりあらゆる目的に応じて組み込む)。好ましい一実施形態では、アレイの走査を、コンピュータ制御のX−Yステージおよび顕微鏡対物レンズ付きのレーザー蛍光スキャナーで行うことができる。2種の蛍光体の逐次励起が、マルチライン混合ガスレーザーによって達成され、放出された光は波長で分割し、2つの光増幅管で検出する。蛍光レーザー走査装置の記述は、Schenaら, Genome Res. 6:639-645 (1996)、および本明細書で引用する他の参考文献にある。あるいは、Fergusonら, Nature Biotech. 14:1681-1684 (1996)の記述する光ファイバー束を使用すると、mRNA存在量レベルを多数の部位で同時にモニターすることができる。
本発明では、さらに、上記のマーカーセットを含むキットを提供する。好ましい一実施形態では、キットは、標的ポリヌクレオチド分子に対するハイブリダイゼーションができるようになっているマイクロアレイ、および上で説明したデータ解析のためのソフトウェアを含む。
実験材料および方法
乳癌患者からの117個の腫瘍サンプルを収集した。次いで、RNAサンプルを用意し、各RNAサンプルのプロファイリングをインクジェット印刷したマイクロアレイを用いて行った。次いで、マーカー遺伝子の同定を、発現パターンに基づいて行った。次いで、これらの遺伝子を使用して分類器の訓練を行い、分類器で、これらのマーカー遺伝子を使用して腫瘍を診断および予後カテゴリーへと分類した。最後に、これらのマーカー遺伝子を使用して、個人からなるグループに対して診断および予後の結果を予測した。
オランダ アムステルダムのThe Netherlands Cancer Institute/Antoni van Leeuwenhoek Hospitalで治療の行われた117例の乳癌患者を、次の臨床基準に基づいて選択した(NKI/AvL Tumor Register、Biometrics Departmentの医療記録から抽出したデータ)。
末梢血リンパ球から単離したDNA上のBRCA1およびBRCA2の生殖系列突然変異試験は、BRCA1のエキソン11ならびにBRCA2のエキソン10および11のタンパク質末端切断試験(Protein Truncation Test:PTT)と、エキソン13および22のBRCA1ゲノム欠失の欠失PCR(deletion PCR)と、残りのエキソンの変性濃度勾配ゲル電気泳動(Denaturing Gradient Gel Electrophoresis:DGGE)による突然変異スクリーニングを含む。異常バンドはすべて、ABI3700自動シーケンサー上で解析したゲノム配列決定による確認、および独立のDNAサンプル上での確認を行った。
マーカー由来の核酸の産出および核酸のマイクロアレイへのハイブリダイゼーションの概要を、図2に示している。30個の厚さ30μMの冷凍切片を使用して、瞬間冷凍した腫瘍標本それぞれの全RNA単離を行った。全RNAの単離は、RNAzol(商標)B(オランダ Veenendaal、Campro Scientific)により、メーカーのプロトコルに従って、Polytron PT−MR2100(オランダ アムステルダム、Merck)を用いた組織のホモジナイゼーションを含めて行い、最後に、RNAse非含有の水の中で溶解させた。全RNAの品質評価は、A260/A280比が1.7と2.1の間になければならず、またアガロースゲル上のRNAの視認では、28SリボソームRNAバンドが、18SリボソームRNAバンドに比べて、より強く示されているべきであるとした。この後、25μgの全RNAのDNase処理を、Qiagen RNASE−free DNaseキットおよびRNeasyスピンカラム(ドイツ、Qiagen Inc,GmbH)を用いて、メーカーのプロトコルに従って行った。DNase処理した全RNAは、RNase非含有の水の中で溶解させ、最終的な濃度を0.2μg/μlとした。
参照cRNAプールは、別々の散発性患者それぞれ(合計78個の腫瘍)からの等量のcRNAをプールすることによって形成した。
表面結合したオリゴヌクレオチドの合成は、基本的には、Blanchardら, Biosens. Bioelectron. 6(7):687-690 (1996)の提案するように行った。Hughesら, Nature Biotech. 19(4):342-347 (2000)も参照されたい。露出したヒドロキシル基を含む疎水性ガラス面(3インチ×3インチ)をヌクレオチド合成のための基層として使用した。ホスホルアミダイトモノマーを、ガラス面上のコンピュータで決定した位置へ、インクジェットプリンタのヘッドを用いて送達した。次いで、未反応のモノマーを洗浄で除去し、延長されたオリゴヌクレオチド末端の脱保護を行った。このモノマーの結合、洗浄、および脱保護のサイクルを、ヌクレオチド合成の所望の各層に対して繰り返した。プリントすべきオリゴヌクレオチド配列はコンピュータファイルによって指定した。
マイクロアレイ上に代表させた約25000個の配列のうち、サンプルからなる群にわたって有意に制御された約5000個の遺伝子からなる群を選択した。ある遺伝子を、乳房の癌に関する制御が有意に異なると決定したのは、その遺伝子が2倍を超える転写産物の変化を散発性腫瘍プールに比べて示した場合、および異なる制御に対するp値(Hughesら, Cell 102:109-126 (2000))が、98個の腫瘍サンプルのうち少なくとも5個において、上側または下側のどちらかで0.01未満であった場合である。
が付随する。
この実施例で説明する結果により、2つの主要なタイプの腫瘍細胞、すなわち、「ER陰性」群と「ER陽性」群を識別する発現マーカー遺伝子の同定が可能になる。ER(+)の状態によるサンプルの識別は、4つのステップで達成される。すなわち(1)ERレベルと相関する候補マーカー遺伝子のセットの同定、(2)これらの候補遺伝子を相関の強さによって順位付けすること、(3)マーカー遺伝子の個数の最適化、および(4)サンプルをこれらのマーカー遺伝子に基づいて分類すること、である。
第1のステップでは、候補判別遺伝子のセットの同定を、訓練サンプルの遺伝子発現データに基づいて行った。具体的には、本発明者らは、カテゴリー番号またはERレベルと、サンプルすべてにわたる対数発現比
の間の相関係数ρを別々の遺伝子ごとに計算した:
であり、ここでnはサンプルの数である。本発明者らのケースでは、n=98である。したがって、0.3という閾値は、この分布における3−σにほぼ対応する(3×
)。
第2のステップでは、候補リスト上にある遺伝子の順位付けを、各遺伝子の判別遺伝子としての有意性に基づいて行った。マーカーの順位付けは、相関の大きさによって、またはフィッシャー統計量に類似の尺度、すなわち
等式(3)では、
はER(−)内部の誤差加重log比の平均であり、
はER(+)群内の誤差加重log比の平均である。σ1はER(−)群内のlog比の分散であり、n1はlog比の測定値が有効であったサンプルの数である。σ2はER(+)群内のlog比の分散であり、n2はlog比の測定値が有効であったサンプルの数である。等式(3)のt値は、2つの平均値の間の分散を補償した差を表す。候補リスト中の各遺伝子の有意水準の評価を、実際のデータセットから導出した帰無仮説に対して、ブートストラップ法を用いて行った。すなわち、多くの人工的データセットを、臨床データと遺伝子発現データの間の連関をランダム化することによって生成した。
判別遺伝子を最適化するために、一点除外法を使用して相互検証を行った。順位付けした候補リストからのマーカー遺伝子のセットでは、分類器(classifier)を97個のサンプルで訓練し、これを使用して残りのサンプルの状態を予測した。この手順をプール内のサンプルのそれぞれに対して繰り返し、抜き出した1個に対する予測が誤っているまたは正しい場合の数をカウントした。
第3のステップでは、分類器パラメータのセットの計算を、訓練データセットのタイプごとに、上記の順位付け方法のうちのどちらかに基づいて行った。ER(−)群(
)に対するテンプレートの生成を、遺伝子からなる選択した群の誤差加重log比の平均を用いて行った。同様に、ER(+)群(
と呼ぶ)に対するテンプレートの生成は、遺伝子からなる選択した群の誤差加重log比の平均を用いて行った。2つの分類器パラメータ(P1およびP2)は、相関または距離に基づいて定義した。P1は、この遺伝子からなる選択した群全体にわたるあるサンプル
とER(−)テンプレート
の間の類似度の尺度である。P2は、この遺伝子からなる選択した群全体にわたるあるサンプル
とER(+)テンプレート
の間の類似度の尺度である。相関Piは、
BRCA1突然変異は、乳癌腫瘍における主要な臨床カテゴリーの1つである。ER(−)群中の38人の患者の腫瘍のうち、17個がBRCA1突然変異を示し、21個は散発性腫瘍であった。このため、ER(−)群の中で17個のBRCA1突然変異の腫瘍を21個の散発性腫瘍から識別することのできる一方法を作製した。
第1のステップでは、候補遺伝子のセットの同定を、これら38サンプルの遺伝子発現パターンに基づいて行った。本発明者らは、まず、BRCA1突然変異のカテゴリー番号と、発現比の間の相関の計算を、38個のサンプルすべてにわたって、個々の遺伝子ごとに、等式(2)を用いて行った。相関係数の分布を、実線で描いたヒストグラムとして図9Aに示している。本発明者らは、大部分の遺伝子はBRCA1突然変異の状態と相関しないが、遺伝子のある小さな群が有意なレベルで相関したことを認めた。相関係数のより大きな遺伝子は、ER(−)群の内部で、BRCA1突然変異保持者の腫瘍を散発性腫瘍から判別するレポーターとして役立つはずであることが見込まれる。
第2のステップでは、候補リスト上の遺伝子の順位付けを、遺伝子それぞれの判別遺伝子としての有意性に基づいて行った。ここでは、本発明者らは、相関係数の大きさの絶対値を使用して、マーカー遺伝子の順位付けを行った。
第3のステップでは、この順位付けたリストの上位からの遺伝子からなるサブセットを使用して分類を行った。本発明者らは、BRCA1群テンプレート(
と呼ぶ)を、遺伝子からなる選択した群の誤差加重log比の平均を用いて定義した。同様に、本発明者らは、非BRCA1群テンプレート(
と呼ぶ)を、遺伝子からなる選択した群の誤差加重log比の平均を用いて定義した。2つの分類器パラメータ(P1およびP2)は、相関または距離に基づいて定義した。P1は、この遺伝子からなる選択した群全体にわたるあるサンプル
とBRCA1テンプレート
の間の類似度の尺度である。P2は、この遺伝子からなる選択した群全体にわたるあるサンプル
と非BRCA1テンプレート
の間の類似度の尺度である。相関に関しては、P1およびP2を等式(4)と同様に定義した。
散発性乳癌患者からの78個の腫瘍を使用して、遺伝子発現データからの予後予測変数(predictor)の検討を行った。この散発性乳癌群の中の78個のサンプルのうち、44個のサンプルでは、最初の診察から5年以内に遠隔転移がなかった(「非遠隔転移群」)ことが臨床的に知られており、34個のサンプルでは、最初の診察から5年以内に遠隔転移があった(「遠隔転移群」)。この2つの群の間の識別を可能にした231個のマーカーからなる群、および最適には70個のマーカーからなる群を同定した。
第1のステップでは、候補判別遺伝子のセットの同定を、これら78個のサンプルの遺伝子発現データに基づいて行った。予後カテゴリー番号(遠隔転移に対して遠隔転移なし)と対数発現比の間の相関の計算を、サンプル全てにわたって個々の遺伝子ごとに、等式(2)を用いて行った。相関係数の分布を、実線として図12Aに示している。また、図12Aには、1回のモンテカルロ実験の結果を破線として示している。本発明者らは、大部分の遺伝子が予後カテゴリーと相関していないにしても、遺伝子のある小さな群は相関していることを認める。相関係数のより大きな遺伝子は、対象となる予後、すなわち遠隔転移群と無遠隔転移群のレポーターとしてより有用なはずであることが見込まれる。
第2のステップでは、候補リスト上の遺伝子の順位付けを、各遺伝子の判別遺伝子としての有意性に基づいて行った。具体的には、等式(3)で定義する、「フィッシャー(Fisher)」統計量に類似の尺度を、順位付けの目的で使用した。候補リスト中の各遺伝子の有意水準の評価を、実際のデータセットから導出した帰無仮説に対して、ブートストラップ法を用いて行った。また、候補リスト中の遺伝子は、相関係数の大きさによってランク付けすることもできる。
第3のステップとして、この順位付けたリストの上位から5個の遺伝子からなるサブセットを選択して、78個の腫瘍を「遠隔転移群」または「無遠隔転移群」へと分類する判別遺伝子として使用した。一点除外法を使用して相互検証を行った。具体的には、77個のサンプルにより、分類器の定義を、選択した判別遺伝子のセットに基づいて行い、これらを使用して残りのサンプルを予測した。この手順を繰り返しては78個のサンプルのそれぞれを予測した。予測が誤っていたまたは正しかった場合の数をカウントした。分類器の性能は、この選択した遺伝子セットに関する第1種および第2種の過誤率によって測定した。
散発性乳癌腫瘍をもつ78人の患者の、2つのはっきり別のサブグループへの予後分類の予測を、70個の最適なマーカー遺伝子の発現に基づいて行った(図14および15)。
提案した予後分類器を確認し、70個の最適な予後マーカー遺伝子の再現性、頑健性、および予測力を保証するために、本発明者らは、The Netherlands Cancer Institute(NKI)で別個に調製された、散発性乳癌患者からの19例の独立の腫瘍サンプルに同じ分類器を適用した。使用したのは同じ参照プールであった。
前のセクションでは、個々の臨床パラメータそれぞれの予測力を発現データのそれと比較した。しかし、臨床パラメータをすべて組み合わせてひとまとめにした上で、それを発現データと比較することのほうが、より意味がある。これには、多変量モデリングが必要であるが、選んだ方法は、ロジスティック回帰であった。また、そのような手法からは、どれだけの改善がマイクロアレイの手法により臨床データの結果に付け加えられるかが示される。
診断および予後を目的とするマーカー遺伝子リスト上の遺伝子はすべて、小規模なマイクロアレイ上で、インクジェット技術を用いて合成することができる。遺伝子が診断および予後用のマイクロアレイは、それぞれまたはまとめて作製することができる。リスト上の各遺伝子は、ゲノム全体でのその配列の特有性に応じて、単一または複数のオリゴヌクレオチドプローブによって代表されている。この注文設計のミニアレイは、サンプル調製プロトコルと組み合わせて、診療所での診断/予後キットとして使用することができる。
表3のBRCA1診断用の430個のマーカー遺伝子に関する利用可能な機能注解に関して、パブリックドメインの検索を行った。表3の430個の診断遺伝子は、2つの群に分けることができる。すなわち、(1)発現がBRCA1様群で高発現する196個の遺伝子、および、(2)発現が散発性群で高発現する234個の遺伝子である。196個のBRCA1群遺伝子のうちでは、94個が注解付きである。234個の散発性群の遺伝子のうちでは、100個が注解付きである。「T細胞」、「B細胞」、または「免疫グロブリン」という用語が、それぞれ、94個の注解付き遺伝子のうちの13個、および100個の注解付き遺伝子のうちの1個に関係している。マイクロアレイ上で代表された24479個の遺伝子のうち、現在、注解付き遺伝子は7586個ある。「T細胞」、「B細胞」、および「免疫グロブリン」は、これら7586個の遺伝子のうちの207個の中に見出される。これを前提にすると、BRCA1群中の13個の「T細胞」、「B細胞」、または「免疫グロブリン」遺伝子のp値は、非常に有意である(p値=1.1×10−6)。これに比べ、散発性群中に「T細胞」、「B細胞」、または「免疫グロブリン」に関する遺伝子1個の観察は、有意ではない(p値=0.18)。
231個の予後マーカー遺伝子(表5)に関する利用可能な機能注解の検索を行った。マーカーは2つの群に分かれる。すなわち、(1)発現が予後不良群で高発現する156個のマーカー、および(2)発現が予後良好群で高発現する75個の遺伝子である。156個のマーカーのうち、72個の遺伝子が注解付きであり、75個の遺伝子のうち、28個の遺伝子が注解付きである。
上記の諸実施例での発現プロファイリング用の参照プールの作製は、散発性群中の個々の患者それぞれからの等量のcRNAを使用して行った。信頼でき、作製が簡単で、大量の参照プールを得るために、乳癌の診断および予後のための参照プールの構築を、マーカー遺伝子それぞれを代表する、またはそれに由来する合成核酸を用いて行うことができる。個々の患者サンプルに関するマーカー遺伝子の発現をモニターする際、突き合わせを行うのは、この参照プールのみであり、他の患者に由来するプールではない。
1.保存値の参照プールの作製(「数学的サンプルプール」)
上で、実施例1〜7に使用した比ベースのデータの使用には、物質的な参照サンプルが必要である。上記の諸実施例では、散発性腫瘍サンプルのプールを参照として使用した。そのような参照の使用は、頑健な予後および診断の予測を可能にするが、プールは通常限られた資源であるために、問題となる可能性がある。このため、物質的なサンプルプールを必要としない分類器方法を開発し、この予測および診断の技法の臨床上の応用における適用をより簡単なものとした。
数学的サンプルプールにより、サンプル参照プールに等価な機能が果たされることを実証するために、平均対数(強度)差(単チャンネルデータ、数学的プールに対するもの)とlog(比)(ハイブリダイゼーション、サンプルプールに対するもの)を比較して、70個の最適なレポーター遺伝子に関して、78個の散発性サンプルにわたってプロットし、これを図22に示している。比と単チャンネル量は、相関が高く、これは、どちらも遺伝子発現の相対的変化を報告するだけの能力があることを示している。次いで、分類器の構築を、平均対数(強度)差を用いて、実施例4のような、比のデータを用いたときに従ったのとまったく同じ手順に従って行った。
本発明者らは、インクジェット合成したオリゴヌクレオチドマイクロアレイを用いて、乳癌における予後に関連する遺伝子発現プロファイルを定義してきた。この遺伝子発現プロファイルを同定するために、55歳未満のリンパ節陰性患者からの5cm未満の腫瘍を使用した。驚くべきことに、70遺伝子ベースの分類器の能力は、5年以内の遠隔転移の予測において、臨床パラメータすべてよりも優れていた。遺伝子発現パターンに基づく「予後不良」対「予後良好」シグネチャ群の転移に関するオッズ比は、相互検証手順により、約15であると推定された。こうした結果は非常に有望ではあったが、この最初の研究の限界は、こうした結果を引き出し、テストを行ったのが、結果のために選択した患者からなる2群、すなわち、5年以内に遠隔転移を発生させた患者からなる群と、少なくとも5年間無疾患のままであった患者の群であったことである。
腫瘍295例の逐次系列を、Netherlands Cancer Institute(NKI)の新たに凍結された組織バンクから、次の患者選択基準に従って選択した。すなわち、病理所見で5cm未満の原発浸潤性乳癌(pT1またはpT2)、陰性の鎖骨下リンパ節生検によって決定される腫瘍陰性の上腋窩リンパ節、診断時年齢52歳以下、診断の暦年1984〜1995、および、既往の悪性腫瘍なしである。患者すべての治療は、腋窩リンパ節廓清を含む、非定型的乳房切除術(modified radical mastectomy)または乳房温存術(breast conserving surgery)と、必要な場合にはこれに続く放射線療法により行われていた。295個の腫瘍サンプルは、リンパ節陰性(病理所見pN0)の患者から採取した151個、および144人のリンパ節陽性(pN+)患者のものを含んでいた。151人中10人のリンパ節陰性患者および144人中120人のリンパ節陽性患者に、化学療法(n=90)、ホルモン療法(n=20)、またはその両方(n=20)からなる補助全身療法が施されていた。患者すべての追跡が、少なくとも年1回、少なくとも5年間行われた。患者の追跡情報は、NKI Medical Registryから抽出した。転移を第1の事象としない患者270人の追跡期間中央値が、7.8年(範囲は0.05〜18.3)であるのに対して、追跡期間中転移を第1の事象とする患者88人では、2.7年(0.3〜14.0)であった。295人の患者すべてに対する追跡期間中央値は6.7年(0.05〜18.3)である。欠失データはなかった。この研究は、Netherlands Cancer Instituteの医療倫理委員会(Medical Ethical Committee)によって承認された。
RNA単離、cRNA標識化、25Kオリゴヌクレオチドマイクロアレイ、およびハイブリダイゼーション実験は、実験材料および方法で説明した通りであった。発現比にp値を割り当てる統計誤差モデルは、実施例4に説明した通りであった。ハイブリダイゼーション後に、スライドを洗浄し、共焦点レーザースキャナー(Agilent Technologies)を用いて走査した(Hughesら, Nat. Biotechnol. 19(4):342-347 (2001)を参照されたい)。
乳癌患者からなる逐次系列中の遺伝子発現プロファイルの予後上の価値の決定を、実施例4で説明した実験によって同定した70個のマーカー遺伝子を用いて行った。この逐次系列を得るために、70個の遺伝子の予後プロファイルの構築に使用した訓練系列の一部でもあった、pN0患者のうちの61人も含めた。これらの患者を除外することは選択バイアスとなる。その理由は、第1の系列が、5年以内に遠隔転移を発生させた患者を不釣り合いなほど多数含んでいたためである。この295個の腫瘍サンプルのコホート中の234個の新しい腫瘍のそれぞれに対して、本発明者らは、予後良好の患者(C1)の腫瘍中での、70個の遺伝子の発現と、以前に決定したこれら遺伝子の平均プロファイルとの相関係数を計算した(実施例4を参照されたい)。次いで、相関係数>0.4である腫瘍(偽陰性を10%許した78個の腫瘍からなる訓練セットで以前に決定した閾値)を、「予後良好」シグネチャ群に割り当て、他の腫瘍すべては「予後不良」シグネチャ群に割り当てた。61人の以前に使用したpN0患者による過剰適合(overfitting)を避けるために、性能の相互検証を行った相関係数を使用して、予後分類を閾値となる相関係数の値を0.55(この相互検証済みの分類器の10%偽陰性に対する閾値に対応する)として行った。
無遠隔転移確率の分析では、第1の事象が遠隔転移であった患者は失敗としてカウントした。この他の患者は、すべて、最終追跡の日付、非乳癌による死亡、局所局部再発、または、対側乳癌を含む第2の原発性悪性腫瘍の時点で打ち切った。期間の開始は手術の日付からとした。無転移の曲線を、カプラン−マイヤーの方法を用いて描き、ログランク検定を用いて比較した。無転移のパーセンテージの標準誤差(SE)の計算には、Tsiatisの方法(Klein, Scand. J. of Statistics 18:333-340 (1991))を用いた。
295個の腫瘍のそれぞれから、全RNAを単離し、これを使用してcRNAを生成し、これを標識化し、約25000個のヒト遺伝子を含むマイクロアレイへとハイブリダイズした(実験材料および方法を参照されたい)。走査した画像の蛍光強度の定量化および正規化を行って、遺伝子の転写産物の存在量を、組み合わせた腫瘍すべての等量のcRNAから作ったcRNAの参照プールと比べた強度比として出力した。この研究で295個の腫瘍すべてに関して以前に決定した70個の予後マーカー遺伝子の遺伝子発現比を、図25Aに示している。以前に決定した閾値(点線)より上の(すなわち、それより相関係数が大きい)腫瘍を、「予後良好」カテゴリー(n=115)に割り当てた。この線よりも下の腫瘍は、「予後不良」カテゴリー(n=180)に割り当てた。図25Bに示すのは、第1の事象としての遠隔転移までの期間(黒い点)、または他の患者すべてに関する追跡期間である(灰色の点、方法を参照されたい)。図25Cには、295人の患者すべてに関するリンパ節状態、遠隔転移、および生存状況を示している。図25A、25B、および25Cを比較することによって、予後良好シグネチャを有することと(早期)遠隔転移または死亡が見られないことの間に強い相関があることがわかる。リンパ節陰性と陽性の患者は偏りなく分布しており、これは、予後プロファイルがリンパ節状態とは独立であることを示している。
無遠隔転移確率および総合生存率の計算を、腫瘍が「予後良好」または「不良」シグネチャを有する患者すべてに関して行った(図26Aおよび26B、表10)。その結果のカプラン−マイヤー曲線で示されているのは、「予後良好」と「予後不良」シグネチャの患者の間の転移率および総合生存率における大きな差である。第1の事象としての転移では、全追跡期間にわたる「不良」と「良好」シグネチャの対比に関するハザード比(HR)は、5.1と推定される(95%信頼区間(CI):2.9〜9.0、p<0.0001)。予後プロファイルは、最初の5年間(HR 8.8、95%CI:3.8〜20、p<0.0001)では、5年後の1.8というHR(95%CI:0.69〜4.5、p=0.24)に比べ、はるかに有意であった。総合生存率に関するHRは、8.6である(95%CI:4〜19、p<0.0001)。
第1の事象としての遠隔転移の多変量解析の結果を、年齢、直径、陽性リンパ節の数、進行度、脈管侵襲、ER発現、治療、および遺伝子発現プロファイルを含めて、表11に示している。70個の遺伝子の発現プロファイル、腫瘍径、および補助化学療法だけが、独立の予測変数であった。これら患者が治療を受けた期間中、閉経前のリンパ節陽性患者の大部分が補助化学療法を受けた。リンパ節陰性患者は、普通、補助療法を受けていなかった。生存率に改善がみられたのは、この腫瘍の症例中では、補助化学療法を受けた患者であった。70個の遺伝子の発現プロファイルは、全体のハザード比が4.6で(95%CI 2.3〜9.2、p<0.0001)、遠隔転移に対する抜群に強力な予測変数である。これは意外ではない。というのも、予後プロファイルは、5年以内に全員が遠隔転移を発生させた患者からの腫瘍に基づいて確立されたものだからである。
(1)腫瘍が「予後優良」シグネチャを有するリンパ節陰性の患者は、補助全身療法なしで治療することが可能である。
本明細書中に引用した参考文献はすべて、本明細書に参照によりその全体をあらゆる目的に応じて組み込むが、その程度は、個々の刊行物または特許または特許出願それぞれに参照によりその全体をあらゆる目的に応じて組み込むと具体的かつ個別に示してある場合と同様とする。
Claims (28)
- 予後に従って乳癌患者を分類するための方法であって、
a.前記乳癌患者から採取した細胞サンプル中の、そのマーカーが表5に記載されている少なくとも5個の遺伝子のそれぞれの発現レベルと、前記少なくとも5個の遺伝子のそれぞれの対照発現レベルとの類似度を決定することにより、患者の類似度値を得るステップ、
b.前記少なくとも5個の遺伝子のそれぞれの前記発現レベルと前記対照発現レベルとの類似度の選択した第1および第2の閾値を与えることによって、それぞれ第1および第2の類似度の閾値を得るステップであって、前記第2の類似度の閾値が前記対照に対して前記第1の類似度の閾値よりも高い類似度を示すステップ、ならびに
c.前記患者の類似度値が前記第1および前記第2の類似度の閾値を超える場合は、前記乳癌患者を第1の予後を有すると分類し、前記遺伝子の前記発現レベルが前記第1の類似度の閾値を超えるが前記第2の類似度の閾値を超えない場合は、第2の予後を有すると分類し、前記遺伝子の前記発現レベルが前記第1の類似度の閾値も前記第2の類似度の閾値も超えない場合は第3の予後を有すると分類するステップ、
を含む方法。 - ステップ(a)の前に、前記少なくとも5個の遺伝子の前記発現レベルを決定することをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- ステップ(a)における前記決定を、前記乳癌患者から採取したサンプル中の前記少なくとも5個の遺伝子のそれぞれの発現レベルと、初診から5年以内に乳癌が再発しなかった複数の乳癌患者中の前記少なくとも5個の遺伝子のそれぞれの発現レベルとの間の類似度の程度を決定することを含む方法によって実施する、請求項1に記載の方法。
- ステップ(a)における前記決定を、前記少なくとも5個の遺伝子のそれぞれの絶対発現レベルと、初診から5年以内に乳癌が再発しなかった複数の乳癌患者から得た腫瘍サンプルのプール中の前記少なくとも5個の遺伝子のそれぞれの平均発現レベルとの差を決定することを含む方法によって実施する、請求項1に記載の方法。
- 前記第1の閾値および前記第2の閾値が、初診から5年以内に乳癌が再発しなかった複数の乳癌患者から得た腫瘍サンプルのプール中の前記少なくとも5個の遺伝子のそれぞれの平均発現レベルに対する相関係数である、請求項1に記載の方法。
- 前記第1の類似度値の閾値および前記第2の類似度値の閾値が、
a.腫瘍サンプルの前記プールを構成する前記腫瘍サンプルの各々における前記少なくとも5個の遺伝子のそれぞれの発現レベルと、前記プールを構成する残りの腫瘍サンプルの前記少なくとも5個の遺伝子の平均発現レベルとの間の類似度の程度によって、前記腫瘍サンプルを降順に順位づけすることにより、順位リストを得るステップであって、前記類似度の程度が類似度値として表されるステップ、
b.前記分類ステップにおいて偽陰性の許容数を決定するステップであって、偽陰性は、前記細胞サンプル中の前記少なくとも5個の遺伝子の発現レベルから、初診から最初の5年以内に遠隔転移を起こさないと予測されたが、初診から最初の5年以内に遠隔転移を起こした乳癌患者であるステップ、
c.前記順位リストにおいて、腫瘍サンプルの前記許容数よりも少ない腫瘍サンプルが、その値を超えると偽陰性となる類似度値を決定するステップ、
d.ステップ(c)で決定した前記類似度値を前記第1の類似度値の閾値として選択するステップ、および
e.前記第1の類似度値よりも大きい第2の類似度値を前記第2の類似度値の閾値として選択するステップ、
を含む方法によって選択される、請求項5に記載の方法。 - 前記順位リスト中の、初診から最初の5年以内に遠隔転移が起こった前記乳癌患者から採取した前記腫瘍サンプルのいずれが、最大の類似度値を有するかを決定すること、および前記最大の類似度値を前記第2の類似度値の閾値として選択することを含む方法によって、前記第2の類似度値の閾値をステップ(e)で選択する、請求項6に記載の方法。
- 前記第1および第2の類似度値の閾値が相関係数であり、前記第1の類似度値の閾値が0.4であり、前記第2の類似度値の閾値が0.4より大きい、請求項6に記載の方法。
- 前記第1および第2の類似度値の閾値が相関係数であり、前記第2の類似度値の閾値が0.636である、請求項6に記載の方法。
- a.そのマーカーが表5に記載されている少なくとも5個の遺伝子の発現レベルに基づいて、乳癌患者を「予後不良」、「予後中等度」、または「予後優良」であると分類するステップ、および
b.前記患者に治療法を指定するステップであって、前記治療法は(i)前記患者がリンパ節陰性であり、予後良好もしくは予後中等度であると分類された場合は補助化学療法を含まず、または(ii)リンパ節状態および発現プロファイルの任意の他の組合せを有する場合は化学療法を含むステップ、
を含む、乳癌患者に治療法を指定する方法。 - a.乳癌患者のリンパ節状態を決定するステップ、
b.前記患者からの細胞サンプル中の、そのマーカーが表5に記載されている少なくとも5個の遺伝子の発現レベルを決定し、それにより発現プロファイルを作製するステップ、
c.前記発現プロファイルに基づいて前記患者を「予後不良」、「予後中等度」、または「予後優良」であると分類するステップ、および
d.前記患者に治療法を指定するステップであって、前記治療法は、前記患者がリンパ節陰性であり、予後良好もしくは予後中程度であると分類された場合は補助化学療法を含まず、またはリンパ節状態および分類の任意の他の組合せを有する場合は化学療法を含むステップ、
を含む、乳癌患者に治療法を指定する方法。 - 「予後中等度」であると分類されたリンパ節陰性患者に指定する前記治療法が、さらに補助ホルモン療法を含む、請求項11に記載の方法。
- 前記分類ステップ(c)を、
a.乳癌腫瘍サンプルのプールを構成する複数の乳癌腫瘍サンプルの各々における前記少なくとも5個の遺伝子の発現レベルと、前記プールを構成する残りの腫瘍サンプル全体の前記少なくとも5個の遺伝子の発現レベルとの間の類似度の程度によって前記腫瘍サンプルを降順に順位づけするステップであって、前記類似度の程度が類似度値として表されるステップ、
b.前記分類ステップにおいて偽陰性の許容数を決定するステップであって、偽陰性は、前記細胞サンプル中の前記少なくとも5個の遺伝子の発現レベルから、初診から最初の5年以内に遠隔転移を起こさないと予測されたが、初診から最初の5年以内に遠隔転移を起こした乳癌患者であるステップ、
c.前記順位リストにおいて、腫瘍サンプルの前記許容数以下の腫瘍サンプルが、その値を超えると偽陰性となる類似度値を決定するステップ、
d.ステップ(c)で決定された前記類似度値を第1の類似度値の閾値として選択するステップ、
e.前記第1の類似度値よりも大きい第2の類似度値を第2の類似度値の閾値として選択するステップ、および
f.乳癌患者からの乳癌腫瘍サンプル中の前記少なくとも5個の遺伝子のそれぞれの発現レベルと、前記プール中の前記少なくとも5個の遺伝子のそれぞれの発現レベルとの間の類似度を決定することにより、患者の類似度値を得るステップ
を含み、
前記患者の類似度値が前記第2の類似度値の閾値以上の場合は、前記患者を「予後優良」であると分類し、前記患者の類似度値が前記第1の類似度値の閾値以上であるが、前記第2の類似度値の閾値未満の場合は、前記患者を「予後中等度」であると分類し、前記患者の類似度値が前記第1の類似度値の閾値未満の場合は、前記患者を「予後不良」であると分類すること、
を含む方法によって実施する、請求項11に記載の方法。 - 前記患者のエストロゲン受容体(ER)の状態を決定することをさらに含み、前記患者がER陽性かつリンパ節陰性である場合は、前記患者に指定した前記治療法が、さらに補助ホルモン療法を含む、請求項11に記載の方法。
- 前記患者が52歳以下である、請求項11に記載の方法。
- 前記患者がI期またはII期の乳癌を有する、請求項11または15に記載の方法。
- 前記患者が閉経前である、請求項11に記載の方法。
- 予後に従って乳癌患者を分類するためのコンピュータプログラム製品であって、前記コンピュータプログラム製品は、メモリおよびプロセッサを備えたコンピュータ共に使用するためのものであり、その上にコード化されたコンピュータプログラムを有するコンピュータで読取り可能なストレージ媒体を含み、前記コンピュータプログラム製品はコンピュータの1つまたは複数のメモリユニット中にロードでき、コンピュータの1つまたは複数のプロセッサユニットに以下のステップ、
a.前記患者から採取した細胞サンプル中の、そのマーカーが表5に記載されている少なくとも5個の遺伝子のそれぞれの発現レベルを含む第1のデータ構造を受信するステップと、
b.前記少なくとも5個の遺伝子のそれぞれの発現レベルと前記少なくとも5個の遺伝子のそれぞれの対照発現レベルとの類似度を決定して患者の類似度値を得るステップと、
c.前記少なくとも5個の遺伝子のそれぞれの発現レベルの選択した第1および第2の類似度の閾値に対する前記患者の類似度値と、前記少なくとも5個の遺伝子の前記それぞれの対照発現レベルとを比較するステップであって、前記第2の類似度の閾値が、前記少なくとも5個の遺伝子の前記それぞれの対照発現レベルに対して前記第1の類似度の閾値よりも高い類似度を示すステップと、
d.前記患者の類似度値が前記第1および前記第2の類似度値の閾値を超える場合は、前記患者が第1の予後を有すると分類し、前記患者の類似度値が前記第1の類似度値の閾値を超えるが、前記第2の類似度値の閾値を超えない場合は、第2の予後を有すると分類し、前記患者の類似度値が前記第1の類似度値の閾値、前記第2の類似度値の閾値のいずれも超えない場合は、第3の予後を有すると分類するステップと、
を実行させる、コンピュータプログラム製品。 - 前記第1の類似度の閾値および前記第2の類似度の閾値が前記コンピュータに記憶される値である、請求項18に記載のコンピュータプログラム製品。
- 前記少なくとも5個の遺伝子の前記それぞれの対照発現レベルが前記コンピュータに記憶される、請求項18に記載のコンピュータプログラム製品。
- 前記第1の予後が「予後優良」であり、前記第2の予後が「予後中等度」であり、前記第3の予後が「予後不良」であり、前記コンピュータプログラムをメモリ中にロードでき、前記コンピュータの前記1つまたは複数のプロセッサユニットに、乳癌患者がリンパ節陰性であり、予後良好もしくは予後中等度であると分類された場合は、補助化学療法を含まず、または前記患者がリンパ節状態および発現プロファイルの任意の他の組合せを有する場合は、化学療法を含む治療法を前記乳癌患者に指定するステップをさらに実行させる、請求項18に記載のコンピュータプログラム製品。
- 前記コンピュータプログラムをメモリ中にロードでき、コンピュータの前記1つまたは複数のプロセッサユニットに、前記乳癌患者に特異的な臨床データを含むデータ構造を受信するステップをさらに実行させる、請求項18に記載のコンピュータプログラム製品。
- 前記少なくとも5個の遺伝子の前記それぞれの対照発現レベルが、前記コンピュータで読取り可能なストレージ媒体に記憶された、前記少なくとも5個の遺伝子のそれぞれについての一セットの単チャンネルハイブリダイゼーション平均強度値を含む、請求項18に記載のコンピュータプログラム製品。
- 前記単チャンネルハイブリダイゼーション平均強度値が対数変換される、請求項23に記載のコンピュータプログラム製品。
- 前記コンピュータプログラム製品は、前記乳癌患者から採取した前記細胞サンプル中の前記少なくとも5個の遺伝子のそれぞれの発現レベルと前記少なくとも5個の遺伝子の前記それぞれの対照発現レベルとの差を計算することによって、前記比較ステップ(c)を前記処理ユニットに行わせる、請求項18に記載のコンピュータプログラム製品。
- 前記コンピュータプログラム製品は、前記対照中の前記少なくとも5個の遺伝子のそれぞれの発現レベルの平均対数を計算してそれぞれの遺伝子について対照平均対数発現レベルを得ることと、前記患者からの乳癌サンプル中の前記少なくとも5個の遺伝子のそれぞれの対数発現レベルを計算して患者の対数発現レベルを得ることと、前記患者の対数発現レベルと前記少なくとも5個の遺伝子のそれぞれの前記対照平均対数発現レベルとの差を計算することとによって、前記処理ユニットに前記比較ステップ(c)を行わせる、請求項18に記載のコンピュータプログラム製品。
- 前記コンピュータプログラム製品は、前記患者から採取した前記細胞サンプル中の前記少なくとも5個の遺伝子のそれぞれの発現レベルと、前記少なくとも5個の遺伝子の前記それぞれの対照発現レベルとの間の類似度を計算することによって、前記処理ユニットに前記比較ステップ(c)を行わせ、前記類似度を類似度値として表す、請求項18に記載のコンピュータプログラム製品。
- 前記類似度値が相関係数である、請求項27に記載のコンピュータプログラム製品。
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