JP2005512510A - 予後および治療標的として乳癌で発現される遺伝子 - Google Patents

予後および治療標的として乳癌で発現される遺伝子 Download PDF

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Abstract

胸部癌腫の内分泌応答性を測定し、胸部腫瘍で差次的発現される遺伝子に基いて胸部癌腫を処置し、その進行をモニターする方法が開示されている。また、胸部癌腫の処置に有用な薬剤の同定方法、胸部癌腫についての処置効力をモニターする方法、胸部癌腫の増殖阻害方法、および開示されている遺伝子のプロモーターを含む胸部特異的ベクターが開示されている。

Description

発明の詳細な説明
この出願は、２００１年５月１６日付けの米国仮出願第６０／２９１４２８号についての優先権を主張しており、出典明示により援用する。
発明の背景
発明の分野
この発明は、癌のモニタリング、予後および処置方法に関するものである。特に、本発明は、乳癌の内分泌療法応答性を測定し、乳癌についての多様な処置の選択を助けるかまたはその効力をモニターするための遺伝子発現分析の使用に関するものである。
関連技術の記載
乳癌は、アメリカの女性を襲う最も多くみられる癌である。合衆国だけでも、毎年新たにほぼ２０００００件が乳癌として診断され、約４４０００人の女性がこの病気で死亡している。乳癌は、生涯の間に１２.５％(女性８人のうち１人)の割合で発生し、女性の癌症例の３２％を占める。乳癌は、肺癌に次ぐ女性の癌死の第２の主原因である。男性乳癌は全新規症例の約１％を占め、女性の場合と類似した自然な進展を示す。乳癌の発生率は現在緩やかに減少しているが、死亡率は過去数十年間一定のままである。世界中で、毎年新たにほぼ１００万件が乳癌として診断されている。一般に、豊かさの優る西側諸国では発病率が非常に高く、発展途上国は非常に低い。
乳癌の原因はまだ解明されていないが、多数の危険因子は確認されている。例えば、乳癌の発生率は年齢が高くなるに伴い劇的に増加し、合衆国における乳癌の女性の５０％以上が６０歳を越えている。他の危険因子は、月経開始年齢が早く、かつ、閉経が遅い場合である。
さらに最近では、推定されている腫瘍サプレッサー遺伝子、ＢＲＣＡ−１およびＢＲＣＡ−２における突然変異が、高いパーセントを占める乳癌の原因であり得ることが発見された。これらの突然変異を伴う女性は、陽性の家族歴を有することが多く、全乳癌患者の５％において、常染色体優性遺伝の明白なパターンが示されている（Cecil,“Textbook of Medicine”、GoldmanおよびBennett編、サウンダーズ・カンパニー、フィラデルフィア、ペンシルベニア、参照）。
乳癌の処置および最終的な結果は、腫瘍病理および処置時点での癌の病期分類により異なる。最も一般的に使用される病期分類システムはＴＮＭシステムである。このシステムは、腫瘍の大きさに基いた癌の状態または段階、リンパ節が冒されている程度および転移の存在を決定する（American Joint Committee on Cancer：AJCC Cancer Staging Handbook、Lippincott‐Raven、フィラデルフィア、ペンシルベニア(１９９８)参照）。検出時点での癌の病期は、１０年目で再発が無い場合のパーセントとして測定される結果を決定する。これは、乳房切除またはランペクトミーによる原腫瘍除去後１０年の間に原癌の再発を経験していない患者のパーセントである。
乳癌の症状は非常に多様な変化を伴い、原発癌の位置および大きさ、転移の存在、位置および程度により異なる。しかしながら、症状としては以下に挙げるものの一つまたはそれ以上を含み得る：片側または両側の触知可能な乳房のしこり、乳頭分泌、乳房の皮膚変化、乳房疼痛、（自然の周期的なもの、すなわち月経に伴うものであり得る）、血性または水性乳頭分泌物、触知可能な腋窩しこり、またはリンパ節が冒されている他の証拠。
原発腫瘍が転移している場合、症状は体中の臓器系で生じ得る。最も一般的な転移部位は、運動部位的、すなわち胸壁および／または局所リンパ節(２０−４０％)、骨(６０％)、肺、すなわち悪性滲出および／または実質病変(１５−２５％)および肝臓(１０−２０％)である。中枢神経系(ＣＮＳ)、脊髄または他の骨格転移および軟膜転移は、局所または広汎性疼痛、特に背部疼痛、および神経学的症状または機能不全、例えば、パラセシアス(parathesias)、対麻痺、感覚の衰弱または喪失および高カルシウム血症を誘発し得る。痙攣、頭痛、精神状態の変化さらには麻痺または発作は、ＣＮＳが冒されている場合に共通している。肝臓転移は、肝機能試験値の上昇、黄疸および／または肝機能障害の他の証拠を伴う肝不全を誘発し得る。肺が冒されると、呼吸困難、肺炎または他の呼吸器系症状が誘発され得る。腫瘍細胞は体中のいかなる組織でも浸潤および増殖し得るため、上記症状は転移を伴う乳癌または伴わない乳癌に共通しており、ほとんどの症候群が乳癌患者で起こる可能性がある。
局所的腫瘍浸潤の程度、関与する腋窩リンパ節の数および腫瘍の大きさを含む、非常に多くの診断的因子が乳癌患者では確認されており、これらの因子は上記病期分類システムに組込まれている。
しかしながら、乳癌における重要な前兆因子は、エストロゲン受容体アルファ(ＥＳＲ１)の腫瘍細胞表面での発現である。エストロゲン受容体(ＥＲ)は、乳癌の増大にとって重要な成長因子、ホルモンおよび癌遺伝子を含む様々な遺伝子の発現を調節するリガンド始動転写因子である(Gronemeyer, Ann. Rev. Genetics、第２５巻、８９−１２３頁(１９９１)、Dickson & Lippman,“The Molecular Basis of Cancer”、Mendelsohn 編、Howley，Israel & Liotta編、３５８−３８４頁、W.B.サウンダーズ・カンパニー、フィラデルフィア、ペンシルベニア(１９９４)参照)。ＥＲの発現は、乳癌の病因および持続において重要な役割を演じる。乳癌患者において腫瘍の約３分の２はＥＳＲ１陽性である(Lippman et al., Cancer、第４６巻、２８３８−２８４１頁(１９８０)参照)。これらのＥＲ陽性腫瘍の約５０％は、エストロゲン依存的であり、内分泌療法に応答する（Manni et al.,Cancer、第４６巻、２８３８−２８４１頁(１９８０)、Jensen, Cancer、第４７巻、２３１９−２３２６頁参照）。閉経後の女性に発生する乳癌は、ＥＲ陽性であることが多い(Iglehart、“Textbook of Surgery”、第１４版、Sabiston編、５１０−５５０頁、W.B.サウンダーズ、フィラデルフィア、ペンシルベニア(１９９１)参照)。これらの腫瘍の多くは、正常な乳房上皮の場合よりも顕著に多いＥＲを発現する(Ricketts et al., Cancer Res.,第５１巻、１８１７−１８２２頁(１９９１)参照)。
ＥＳＲ１遺伝子は１４０Ｋｂに及び、スプライシングにより６６キロダルトンの分子量を有する５９５アミノ酸タンパク質をコード化するＲＮＡにおいて６.３Ｋｂを生じる８個のエキソンにより構成される(Walter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,第８２巻、７８８９−７８９３頁、およびPonglikitmongkoli et al., EMBO J.,第７巻、３３８５−３３８８頁参照)。
一次病変がＥＳＲ１を発現する患者は、一次病変がＥＲを発現しない患者と比べて少なくとも生存において５〜１０％の改善を呈する。
さらに、そして非常に重要なことに、一次病変におけるＥＳＲ１の存在は、内分泌療法形態のアジュバント療法に対する陽性応答を予測させる傾向がある。内分泌療法の目的は、腫瘍細胞に対するＥＲの活性化を遮断することにより、腫瘍細胞塊の増大および増殖を減少または停止させることである。
乳癌患者においてＥＲの活性化を遮断するために多くの方法が使用されている。最も広く使用されている薬剤は、抗エストロゲン剤、例えばタモキシフェンであり、悪性細胞レベルでエストロゲンの作用を阻止するものである。タモキシフェンは抗エストロゲン薬剤としてはたらくが、それはＥＲにおいてアゴニストおよびアンタゴニストの両作用を有する。この薬剤は、伝統的に進行した乳癌患者にとっては第一線の処置であった。
しかしながら、不幸なことに、進行したＥＲ陽性乳癌の患者の場合、タモキシフェンに対する応答割合は５０％前後に過ぎない(Clark et al, Semin. Oncol.、第１５巻、２号、補遺１、２０−２５頁(１９８８)参照)。タモキシフェンに応答の無い多くの場合、腫瘍の増大は、表面上はエストロゲンによる制御と無関係であると思われ、抗エストロゲン剤の使用は功を為さない。しかしながら、驚くべきことに、タモキシフェン耐性患者の約３分の１は、内在性エストロゲンレベルの低下に応答する(Dombernowsky et al., J. Clin. Oncol.、第１６９２０巻、４５３−４６１頁(１９９８)、および Crump et al., Breast Cancer Res. Treat.，第４４巻、３号、２０１−２１０頁(１９９７)参照)。閉経後患者では、これは選択的非ステロイドアロマターゼ阻害剤レトロゾール(フェマーラ(登録商標))により達成され得る(Dombernowsky et al.，前出参照)。フェマーラは、酵素アロマターゼに結合し、それが副腎アンドロゲンをエストロゲンに変換するのを阻止することにより作用するアロマターゼ阻害剤である。
さらに、標的細胞に対し利用可能なエストロゲンの濃度を低下させることにより臨床効果をあげる他の薬剤も使用されている。これらには、プロゲスチン、例えばメゲストロールおよびメドロキシプロゲステロンアセテート、ＬＨＲＨ、アンドロゲンおよび他のアロマターゼ阻害剤、例えばアナストロゾールがある(Litherland et al, Cancer Treatment Reviews,第１５巻、１８３〜１９４頁(１９８８)参照)。
従って、一般に、腫瘍がＥＲについて陽性である患者は、内分泌療法にとって良い候補である。しかしながら、上記で検討した通り、ＥＳＲ１陽性悪性腫瘍のうち、内分泌療法、すなわち抗エストロゲンまたはエストロゲン除去療法に応答するのは３０〜７０％に過ぎない(Clark et al, Semin. Oncol., 第１５巻、２０−２５頁(１９８８)、およびLutherland et al., Cancer Treatment Reviews, 第１５巻、１８３−１９４頁(１９８８)参照)。内分泌療法に耐性を示すＥＳＲ１陽性悪性腫瘍についての分子基礎理論は、充分には理解されていない。
エストロゲン調節遺伝子プロゲステロン受容体(ＰＧＲ)およびＰＳ２としても知られているトレフォイル因子１(ＴＦＦ１)の発現を測定することにより、乳癌内分泌療法についての生物マーカーの予測力を増やす試みが為されている。これらのタンパク質のいずれか一方の存在は、機能的および活性化ＥＲの存在を示すもので、これら両タンパク質は乳癌内分泌療法についての予測的生物マーカーである。ＰＧＲ発現の使用により、ＥＳＲ１単独の予測値は改善されるが、ＥＲおよびＰＧＲの両方を発現する腫瘍の２０％は、依然として転移環境では内分泌療法に応答し得ない。同様に、ＴＦＦ１は、良好な予後と関連しており、ホルモン療法に対する陽性応答を予言するが、乳癌の常用手順による評価についての生物マーカーとして充分なものであるとはまだ判明していない（Ribieras et al., Biochem. Biophys. Acta., 第Ｆ−６１−Ｆ７７巻、１３７８頁(１９９８)参照）。
例えば細胞質ゾルに基くリガンド結合検定法または免疫組織化学(ＩＨＣ)方法の使用により、乳癌腫瘍細胞におけるＥＲの存在、およびＰＧＲおよびＴＦＦ１状態を評価することは、内分泌療法応答性の予測する上で貴重であるが、これらのタンパク質の存在にもかかわらず、著しい数の患者は内分泌療法に対し一次または獲得耐性を呈し、所定の患者腫瘍が内分泌療法に応答性を示すか否かを予測する能力は依然として乏しいままである。
乳癌生検におけるＥＳＲ１と類似した発現パターンを有する遺伝子の同定により、ＥＳＲ１の予測値を加える方法が提供される。さらに、乳癌に関与する鍵となる分子機構については、大部分未知のままである。乳癌細胞においてＥＲにより調節されるかまたはそれと共に発現される遺伝子の同定は、乳癌の分子機構を解明する、乳癌におけるホルモン応答性についての生物マーカーの開発および乳癌患者または乳癌発病の危険がある患者を処置するための新規治療標的の開発にとって非常な重要性を有する。
さらに、最近では、乳癌の存在を確認する主たる方法は、高密度腫瘍状組織の存在の検出によるものである。これは、成果の度合は様々であるが、乳房外面の直接検査により、または他のＸ線造影方法のマンモグラフィーを通して達成される(Jatoi，Am. J. Surg., 第１７７巻、５１８−５２４頁(１９９９)参照)。特定腫瘍がＥＳＲ１陽性であるか否かを測定するためには、ＩＨＣ分析用の腫瘍の生検検体を入手することが必要であった。この方法は費用が高く、かつ侵襲性であり、患者を合併症、例えば感染症の危険に曝すことになる。腫瘍組織はプロファイリング用に常に入手できるわけではないため、血液で遂行され得る侵襲性の低い診断検定法は非常に望ましい。
従って、患者の腫瘍がＥＳＲ−１陽性であるか否かを決定するための特異性が高く侵襲性の低い方法が要望されている。さらに、ＥＲの存在または不存在とは関係無く特定患者の腫瘍が内分泌療法にいかなる応答性を示すかを測定する方法の提供が大きく要望されている。これにより、医師は処置の選択に関してさらに多くの情報を得た上での決定を下すことができ、より正確な予後を患者に提供することができる。さらに、内分泌療法に対する乳癌腫瘍の応答割合を改善する化合物を同定する方法が要望されている。
発明の要約
本発明は、下記に記載している通り、ヒト乳癌細胞でＥＲにより調節／それと共に発現される複数の遺伝子を同定することにより、ＥＲ陽性乳癌のホルモン応答性を測定する現行の利用可能な方法における欠点を克服するものである。これらの遺伝子に対応するｍＲＮＡ転写物およびタンパク質は、例えばホルモン応答性の代理的マーカーとしておよび乳癌に特異的である潜在的治療標的としての有用性を有する。
さらに、本発明は、アロマターゼ阻害剤、レトロゾール(フェマーラ(登録商標))による処置を含め、内分泌療法に応答性を示す乳癌腫瘍および応答性を示さない同腫瘍において差次的発現される遺伝子を同定する。
本発明は、分泌タンパク質をコード化するＥＳＲ１発現に伴う幾つかの遺伝子を同定するもので、これらには、ＴＦＦ１、トレフォイル因子３(ＴＦＦ３)、セリンまたはシステインプロテイナーゼ阻害剤、クレードＡメンバー３(ＳＥＲＰＩＮＡ３)、プロラクチン誘導タンパク質(ＰＩＰ)、マトリックスＧｌａタンパク質(ＭＧＰ)、トランスフォーミング成長因子−ベータIII型受容体(ＴＧＦＲＢ３)、およびアルファ−２−糖蛋白質１、亜鉛(ＡＺＧＰ１)がある。これらのタンパク質は、血清に基く予測的生物マーカーについての基礎を形成し得る。この発明の様々な実施態様で同定される遺伝子を全て、表６において、それらのユニジーンクラスター番号、遺伝子記号および発現されたタンパク質についてのタンパク質受託番号と共に列挙する。
発明の詳細な記載
本発明は、乳癌細胞においてＥＲにより調節されるかまたはそれと共に発現される遺伝子の同定に関するものである。原発性乳癌におけるＥＳＲ１の発現により、内分泌応答性、長い無病生存期間および長い全生存期間と関連する腫瘍表現型が同定される。乳癌の大きな試料においてＥＳＲ１についての遺伝子発現および他の１８遺伝子の発現間には非常に統計的に有意な相関関係が見出された。乳癌細胞におけるＥＲ遺伝子とこれらの遺伝子の共発現により、これらの遺伝子およびそれらの発現産物は、乳癌の危険があるか、罹患しているか、または再発の危険がある患者の管理、予後および処置で使用され得る。これらの遺伝子は表１で同定されている。これら１８遺伝子およびこの出願で開示された他の全遺伝子の完全配列は、表６に示されたユニジーンクラスター(Unigene Cluster)受託番号を用いることにより入手可能である。
ｍＲＮＡの発現レベルの検出方法は当業界ではよく知られており、ノーザンブロッティング、逆転写ＰＣＲ、リアルタイム定量的ＰＣＲおよび他のハイブリダイゼーション方法があるが、これらに限定はされない。
複数の開示された遺伝子から得られるｍＲＮＡ転写物レベルの特に有用な検出方法は、オリゴヌクレオチドの順序づけられたアレイとの標識ｍＲＮＡのハイブリダイゼーションを含む。かかる方法により、複数のこれら遺伝子の転写レベルが同時に測定され得、遺伝子発現プロフィールまたはパターンが作成され得る。対象から得られた試料から誘導される遺伝子発現プロフィールを、別の実施態様において、無病対象から得られた試料から誘導された遺伝子発現プロフィールと比較することにより、対象が乳癌に罹患またはその発病の危険があるか否かが決定され得る。
ＥＲ遺伝子の調節およびこれら１８遺伝子間の強い関連性は、これらの遺伝子がＥＲ遺伝子と共に調節されるため、機能的ＥＲトランスクリプトゾームについての生物マーカーであるという仮説を裏付けている。表１で列挙されているこれらの遺伝子のうち１０(遺伝子番号８〜１７)は、ＥＲ遺伝子と関連しているかまたはエストロゲンにより直接調節されることが既に示されている。表１に示されている初めの７遺伝子(遺伝子番号１〜７、すなわちナトリウムチャンネル・非電位依存性１アルファ(ＳＣＮＮ１Ａ)、ＳＥＲＰＩＮＡ３、Ｎ−アシルスフィンゴシンアミドヒドロラーゼ(ＡＳＡＨ)、リポカリン１(ＬＣＮ１)、ＴＧＦＢＲ３、グルタミン酸レセプター前駆体２(ＧＲＩＡ２)およびシトクロムＰ４５０、サブファミリーIIＢ(フェノバルビタール誘導性)ＣＹＰ２Ｂ)は、これまでに乳癌におけるＥＲの発現と関連していることが示されたことは無い。
従って、この発明は、乳癌の大きな試料においてＥＲで調節される複数の遺伝子を提供する。これらの遺伝子の少なくとも一つを選択することにより、代理的ＥＲマーカーとして利用し得る。特に有用な実施態様では、複数のこれら遺伝子を選択し、それらのｍＲＮＡ発現を同時にモニターすることにより、様々な局面で使用される発現プロフィールが提供され得る。
さらに別の態様において、遺伝子発現産物(タンパク質)のレベルが、様々な体液、例えば、限定するわけではないが、血液、血漿、血清、リンパ液、ＣＳＦ、嚢胞液、腹水、尿、糞および胆汁でモニターされ得る。この発現産物レベルは、腫瘍細胞におけるＥＲの存在の代理的マーカーとして使用され得、対象腫瘍の内分泌療法応答性の指数を提供し得る。
さらに、一つまたは複数のこれら遺伝子の発現プロフィールは、乳癌における内分泌応答性の分子基礎理論を調べ、乳癌処置用薬剤の効力を評価するための貴重な分子ツールを提供し得る。細胞が様々な修飾条件、例えば薬剤または他の活性分子との接触に曝されている間におけるベースラインプロフィールからの発現プロフィールにおける変化は、上記効果の指標として使用され得る。
本発明は、別の態様において、内分泌療法に応答しない乳癌腫の場合と比較した内分泌療法に応答する乳癌腫において異なるレベルで発現される遺伝子の同定を提供する。これらの遺伝子の差次的発現によって、これらの遺伝子および／またはそれらの発現産物を利用することにより患者における特定乳癌が内分泌療法に有利に応答するか否かの予測の確実性を高めることが可能である。これらの遺伝子は、神経腫瘍腹側抗原１(ＮＯＶＡ１)、および免疫グロブリン重定常ガンマ鎖３(ＩＧＨＧ３)であり、表２に列挙されている。開示された遺伝子の発現レベルは、遺伝子発現または遺伝子によりコード化されるタンパク質に対応するｍＲＮＡを測定することにより検出され得る。タンパク質は、限定されるわけではないが、血液、血漿、血清、リンパ液、ＣＳＦ、嚢胞液、腹水、尿、糞および胆汁を含む好都合な体液で測定され得る。
従って、この発明は、特定乳癌試料中の細胞が内分泌応答性表現型を有するか否かの測定方法を提供する。本明細書で使用されている「内分泌応答性」の語は、胸部腫瘍または癌について、その増大または増殖が、腫瘍細胞におけるＥＲの活性化の改変、すなわち増加または減少をもたらす治療により減速または阻止され得る場合を意味する。
本明細書で使用されている「内分泌療法」の語は、その臨床効果の主たる一局面として、直接的または間接的に、腫瘍細胞でのＥＲの活性化において増加または減少をもたらすタイプの治療を包含する。すなわち、内分泌療法の語は、限定されるわけではないが、ＥＲ遮断性薬剤およびＥＲでの混合アゴニスト−アンタゴニストである薬剤および限定されるわけではないが、例えばアロマターゼ阻害剤、プロゲスチン類およびＬＨＲＨを含む内在性エストロゲンの濃度を低下させる処置を包含する。
従って、この発明は、乳癌対象をスクリーニングにかけることにより、対象の胸部腫瘍が内分泌療法に応答する見込みを測定する方法、乳癌罹患対象の処置に有用な薬剤の同定方法、乳癌についてのある種の薬剤処置の効力をモニターする方法および乳癌腫瘍細胞での特異的複製用ベクターを提供する。
レトロゾール(フェマーラ(登録商標))対タモキシフェン比較試験で使用される目的応答の定義
測定可能な病気
１．完全応答(ＣＲ)：４週間以上間をおいた２つの観察結果により測定される、全既知疾患の消失。
２．部分応答(ＰＲ)：４週間以上間をおいた２つの観察結果により治療効果を測定するために測定された病変の全腫瘍サイズにおける５０％またはそれ以上の減少。さらに、新規病変の出現または何らかの病変の進行は全くあり得ない。
３．変化無し(ＮＣ)：全腫瘍サイズにおける５０％減少が確立され得ず、また一つまたはそれ以上の測定可能な病変の大きさにおける２５％増加も立証されていない。
４．進行性疾患(ＰＤ)：一つまたはそれ以上の測定可能な病変の大きさにおける２５％またはそれ以上の増加、または新規病変の出現。
臨床応答評価
一次効力変数は、世界保健機構(ＷＨＯ)基準(ＷＨＯ Handbook for Reporting Results of Cancer Treatment参照)を用いた臨床試験により評価される、腫瘍応答であった。それは、４ヶ月目での乳房触診により臨床的に測定したところＣＲまたはＰＲを呈した各処置群における患者のパーセントとして定義された。可能な応答は、ＣＲ、ＰＲ、ＮＣ、ＰＤまたは評価(アセスメント)不可能／評価不可能(ＮＡ／ＮＥ)であった。触知可能な同側腋窩リンパ節併発により、腫瘍における臨床ＣＲが格下げされた。また、他の因子、例えば乳房切除術ではなく乳房温存術(扇状部分切除／ランペクトミー)を受けた患者のパーセントについても考慮した。手術不能になったか、または４ヶ月目で依然として手術不能なままの患者を、処置失敗として数えた。
乳癌においてＥＳＲ１により共調節される遺伝子の決定に使用される方法。
材料および方法
細胞培養
Ｕ３７３細胞(ＡＴＣＣ、ロックビル、メリーランド)を、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２＋０.０３ｍｇ／ｍＬの内皮細胞成長補給物(ＥＣＧＳ)、０.１ｍｇ／ｍＬのヘパリンおよび１×Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ中で増殖させた。細胞を飽和密度の約４０％まで増殖させ、次いで培地で１回洗浄した。次いで細胞を培地または培地＋ＰＤＧＦ２０ｎｇ／ｍＬにより４８時間増殖させた。ヒト静脈内皮細胞、ＨＵＶＥＣ(ＡＴＣＣ、ロックビル、メリーランド)を、５％ＦＢＳ、０.０３ｍｇ／ｍＬのＥＣＧＳ、０.１ｍｇ／ｍＬのヘパリンおよび１×Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐを含むＦ−１２培地中で飽和密度の約４０％まで増殖させ、次いで培地で１回洗浄した。細胞を培地または培地＋ＶＥＧＦ５０ｎｇ／ｍＬ中で４８時間増殖させた。乳癌セルラインＭＣＦ７(ＡＴＣＣ、ロックビル、メリーランド)を、ＭＥＭ＋２ｍＭのＬ−グルタミン、０.１ｍＭのＮＥＡＡ、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、０.１ｍＭの牛インシュリン、１０％ＢＳＡ中で飽和密度の８０％まで成長させた。全細胞培養物を氷冷ＰＢＳで２回洗浄し、次いで皿から剥し取り、冷ＰＢＳ中で沈澱させ、液体窒素中で急速冷凍した。
試料調製
２１個のＲＮＡ試料を、乳房温存手術に関し不適格な一次浸潤性乳癌を患う閉経後女性についてのレトロゾール(フェマーラ(登録商標)、ノヴァリティス・ファルマ、バーゼル、スイス)対タモキシフェンの無作為化III期試験で登録された患者から術前内分泌療法開始前に集めた１４ゲージ針コア生検から抽出した。スウェーデンで集められた追加の３０の一次乳腺癌、１つの追加ＥＳＲ１＋胸部腫瘍外科生検、２つのＨＵＶＥＣ試料、神経膠芽細胞腫セルラインＵ３７３−ＭＧからの２試料および１つのＭＣＦ７試料からトリゾル(ライフ・テクノロジーズ、ガイザーズバーグ、メリーランド)を用いてＲＮＡを抽出した。地方倫理委員会により認められたプロトコールにしたがってインフォームドコンセントが得られた後に臨床試料を集めた。２試料、すなわち浸潤性III期腺管癌(アンビオン、オースティン、テキサス)および２正常乳腺組織のプール(クロンテック、パロアルト、カリフォルニア)についてＲＮＡを購入した。調製試料の総数は、５３の乳癌生検および１つのプールされた正常乳腺試料を含め５９であった。Lockhart et al., Nat. Biotechnol.、第１４巻、１６７５−１６８０頁(１９９６)により記載された通り、キアゲンＲＮＥＡＳＹ(登録商標)カラム(キアゲン、バレンシア、カリフォルニア)を用いて全ＲＮＡを精製し、プロセッシングし、ＨＵＧＥＮＥ(登録商標)ＦＬ６８００アレイ(アフィメトリックス、サンタクララ、カリフォルニア)にハイブリダイズした。
階層的クラスタリング
ＨｕＧｅｎｅＦＬ６８００アレイの１１５６遺伝子サブセットを、コンピューター限界故にクラスタリング用インプットとして使用した。このサブセットは、５９試料の少なくとも一つにおいてジーンチップ(登録商標)ソフトウェア(アフィメトリックス、サンタクララ、カリフォルニア)により提示コールされた遺伝子により構成され、２０倍の発現差異、すなわち正常プール乳腺組織試料および５９試料の少なくとも一つの間における平均差異(ＡｖＤｉｆ)を有していた。この遺伝子のサブセットは、理想的には正常および腫瘍間におけるある程度のレベルの変動を有する遺伝子を代表した。それは、どの試料からも発現されないかまたは少なくとも一試料においてあまり変化しない遺伝子を排除した。遺伝子発現値を用いることにより、ジーンスプリング(登録商標)３.２.８(シリコン・ジェネティクス、レッドウッドシティー、カリフォルニア)を用いて遺伝子および試料をクラスタリングし、各遺伝子についての平均差異測定値を試料全体で１つの中央値に正規化した。０.００１の最小距離および０.５の分離比による標準相関関係により遺伝子発現類似性を測定した。ＥＳＲ１と共クラスタリングしている遺伝子のリストを、得られたＥＳＲ１遺伝子を含むデンドグラムの分岐から編集した。
結果
実験サンプルツリー
２種の試料を線引きする明白な分岐が無いにもかかわらず(図２)、ＥＳＲ１発現が皆無または非常に低い試料は、主としてデンドグラムの一端付近に集中(クラスタリング)し、ＥＳＲ１発現が高い試料は他端に集中した。ＥＳＲ１についてのＡｖＤｉｆ値は、−２４.０８〜３５０１.６の範囲であり、正常乳腺は１２４の値を呈した。正常乳腺試料は、ここで報告されている１８遺伝子について全般的に発現性が低い試料および発現性が高い試料の境界に集中した。図２において正常乳腺上部に集中した全試料についてのＥＳＲ１ ＡｖＤｉｆの平均は、６６.３７であり、標準偏差は１６３.５４であった。正常乳腺試料より下に集中した全試料についてのＥＳＲ１ ＡｖＤｉｆの平均は、１４４０であり、標準偏差は９３６であった。
内皮および神経膠芽細胞腫細胞培養試料は、腫瘍生検とは別個の分岐におけるそれらの各細胞型とクラスタリングした。内皮および神経膠芽細胞腫分岐は、低ＥＳＲ１発現を伴うデンドグラムの端に位置していた。セルラインをクラスタリング分析に含ませると、例えば内皮および表皮といった、胸部腫瘍に存在し得る細胞型、並びに明白に異なる細胞型、例えば神経膠芽細胞腫を提供することにより遺伝子のクラスタリングが改善された。
ＥＳＲ１と共クラスタリングする遺伝子
１８の遺伝子がＥＳＲ１と共クラスタリングした(表１)。これらの遺伝子は、ＥＳＲ１陽性試料における高発現性およびＥＳＲ１陰性試料における低発現性の独特なパターンを有していた(図２)。ＥＳＲ１と共クラスタリングする遺伝子のうち７種、すなわちＳＣＮＮ１Ａ、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＡＳＡＨ、ＬＣＮ１、ＴＧＦＢＲ３、ＧＲＩＡ２およびＣＹＰ２Ｂ(表１)は、以前にはエストロゲン刺激または乳癌とは関連していなかった。
ＥＳＲ１と共クラスタリングしている遺伝子のうち６種、すなわち癌胎児性抗原関連細胞接着分子５(ＣＥＡＣＡＭ５)、ＬＩＶ−１タンパク質(ＬＩＶ−１)、ＰＩＰ、ＭＧＰ、ＴＦＦ３およびＴＦＦ１(ＰＳ２としても知られている)(表１参照)は、以前からエストロゲン調節タンパク質、乳癌についての予測的または予後生物マーカーであると見なされていた。
ＣＥＡＣＡＭ５は、乳癌の１０〜９５％で発現されることが報告されている免疫反応性糖タンパク質である。ＣＥＡＣＡＭ５タンパク質レベルは、２９８の乳房組織試料試験でＥＳＲ１陽性／ＰＧＲ陽性腫瘍において最高であることが見出された(Molina et al., Anticancer Res., 第１９巻、２５５７−２５６２頁(１９９９)参照)。ＥＳＲ１発現と相関していることに加えて、ＣＥＡＣＡＭ５は、Zachetal., J. Clin Oncol., 第１７巻、２０１５−２０１９頁(１９９９)による報告においてマンマグロビン１(ＭＧＢ１)発現と相関関係を有することが見出された。この同報告からはまた、遺伝子クラスタリング結果を裏付ける、ＭＧＢ１レベルがＥＲレベルと相関関係を示すことが見出された。
ＬＩＶ−１は、記録により充分立証されているＥＲ遺伝子である。それは、ＥＳＲ１−依存的機構を通して表皮成長因子(ＥＧＦ)、トランスフォーミング成長因子アルファ(ＴＧＦα)およびインシュリン成長因子１(ＩＧＦ１)により誘導される(EI‐Tanani et al,J.Steroid Biochem.Mol.Biol.,第６０巻、２６９−２７６頁(１９９７)参照)。
ＰＩＰは、別名gross cystic disease fluid protein１５としても知られており、プロラクチンおよびアンドロゲンにより誘導される。ＰＩＰ発現レベルは、ＥＳＲ１−およびＰＧＲ−陽性状態と相関関係を示す(Clark et al., Br. J. Cancer, 第８１巻、１００２−１００８頁(１９９９)参照)。
ＭＧＰは、骨および軟骨の有機マトリックスと関連するオステオカルシン／マトリックスｇｌａタンパク質ファミリーに属し、骨形成阻害剤として作用すると考えられている。エストロゲンは、ＭＧＰ遺伝子発現の強力な誘導物質である。
エストロゲンはまた、ＴＴＦ１およびＴＴＦ３を強く誘導する。トレフォイル因子は、胃腸粘膜で発現される安定した分泌タンパク質である。それらは、傷害から粘膜上皮保護し、治癒を促進すべく機能し得る。ＴＴＦ３は、乳癌内分泌療法についての予測的生物マーカーであり得る。それは、エストロゲン非応答性ではなく、エストロゲン応答性の乳癌セルラインで発現され、ＡＰＣおよびＥ−カドヘリン−カテニン複合体の発現を制御することにより、細胞移動の促進においてある役割を演じ得る(Efstathiou et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第９５巻、３１２２−３１２７頁(１９９８)参照)。先に検討した通り、ＴＦＦ１は、エストロゲン療法応答性についてのかなり十分に確立された予測的生物マーカーであり、ＴＦＦ１ ｍＲＮＡレベルは、プロゲステロン、デキサメタゾンまたはジヒドロテストステロンによるのではなく、エストラジオールにより高められると報告されている(Prud'homme et al., DNA、第４巻、１１−２１頁(１９８５)参照)。さらに、ＴＦＦ１のエストラジオール誘導は、タモキシフェンにより阻害されると報告されている(Prud'homme、前出、参照)。
ＥＳＲ１と共クラスタリングする別の遺伝子、すなわち肝細胞核因子３・アルファ(ＨＮＦ３Ａ)は、ＴＦＦ１を活性化する(Beck et al., DNA Cell Biol., 第１８巻、１５７−１６４頁(１９９９)参照)。ＨＮＦ３Ａは、以前にPerou et al., Nature、第４０６巻、７４７−７５２頁(２０００)による６５胸部腫瘍からの発現プロフィールにおいてＥＳＲ１と共クラスタリングすることが示された。表１に列挙されている次の３種の追加遺伝子もまた、Perou et al., 前出による報告ではＥＳＲ１と共クラスタリングした：すなわち、ＬＩＶ−１；ヘプシン(ＨＰＮ)、細胞成長および細胞形態の維持において本質的役割を演じる貫膜プロテアーゼ；およびＨＬＡ−ＤＲ−アルファプロモーターに結合し、Ｂ細胞において転写因子として作用し得るＸ−ボックス結合タンパク質１(ＸＢＰ１)(Liou et al., Science、第２４７巻、１５８１−１５８４頁(１９９０)参照)。
ＡＺＧＰ１は、以前にはエストロゲン応答性と結びつけられてはいなかったが、乳癌における分化の生化学マーカーとして見なされているという点で、ＥＳＲ１と共クラスタリングする遺伝子の間では独特である(Diez-Itza et al., Eur. J. Cancer、第２９Ａ巻、１２５６−１２６０頁(１９９３)参照)。ＡＺＧＰ１は、脂肪細胞で脂質分解を刺激し、進行癌患者において充分な脂肪喪失に貢献し得る分泌タンパク質である。それは、クラスＩ ＭＨＣ抗原のアルファ鎖の細胞外ドメインと高い類似性を有する。
ｍＲＮＡレベルでの遺伝子発現の包括的分析は、複雑な生物学的問題、例えば乳癌を研究するための強力なツールである。ここで、発現アレイデータについての標準相関アルゴリズムを用いるクラスタリングは、ＥＳＲ１により調節される遺伝子を同定することができた。ＥＳＲ１−調節されているかまたは乳癌腫瘍発生と関連していることが知られている１１遺伝子を含む、１８遺伝子が見出された。興味深いことに、本明細書に記載されているＥＳＲ１分岐に存在する遺伝子のうち４種、すなわちＬＩＶ１、ＨＰＮ、ＸＢＰ１およびＨＮＦ３Ａは、Perou et al., Nature、第４０６巻、７４７−７５２頁(２０００)により報告された管腔上皮ＥＳＲ１遺伝子クラスターの構成員として同定された。ＸＢＰ１はまた、Bertucci et al., Hum. Mol. Genet., 第９巻、２９８１−２９９１頁(２０００)による胸部腫瘍の遺伝子発現プロファイリングの第３報告においてＥＳＲ１状態と結びつけられていた。ＥＳＲ１とＨＰＮ、ＨＮＦ３ＡおよびＸＢＰ１の共クラスタリングは、これらの遺伝子が、ＬＩＶ１と同様、エストロゲンにより調節され、無傷のＥＲシグナル伝達経路についての可能なマーカーとして見なされるべきであることを示唆している。
これは、ＥＲおよび以下の７遺伝子：ＳＣＮＮ１Ａ、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＡＳＡＨ、ＬＣＮ１、ＴＧＦＢＲ３、ＧＲＩＡ２およびＣＹＰ２Ｂ間における関連性についての第１報告である。遺伝子ＴＧＦＢＲ３およびＬＣＮ１は、細胞分化および増殖に関与しており、もともとＥＳＲ１陽性でもある特定細胞系におけるそれらの脱調節は、腫瘍発生およびこれらの遺伝子とＥＳＲ１の共クラスタリングを誘発し得る(Bratt, Biochim. Biophys. Acta., 第１４８２巻、３１８−３２６頁(２０００)参照)。
表１は、５３胸部腫瘍生検、１正常乳腺および５セルライン試料における１１２６遺伝子の階層的クラスタリングでＥＳＲ１と共クラスタリングする遺伝子を示す。各遺伝子について示されたジェンバンク(GenBank)受託番号は、アフィメトリックス・ジーンチップで使用される２５量体プローブがその遺伝子の検出用に入手される配列についての受託番号である。以前にＥＲとの正の相関関係を示す発現性を有することが示された遺伝子は、＋により示されている。
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前処理生検における内分泌応答性についての予測的マーカー
本発明の別の態様において、５３患者からの１３６胸部生検を入手した。ＲＮＡを１１６生検から抽出した。発現プロフィールを３５患者からの４３生検について作成した。胸部腫瘍における内分泌療法応答性の予測的マーカーが同定された。前レトロゾール(フェマーラ(登録商標))処置からプロファイリングされた生検および患者の臨床結果の内訳は以下の通りであった：４患者はＣＲ、９患者はＰＲ、７患者はＮＣおよび４患者はＰＤ。
タモキシフェンにより処置された群について、ＣＲ範ちゅうには患者無し、ＰＲには１０患者、ＮＣには７患者およびＰＤには４患者であった。
ＣＲまたはＰＲを示す患者を「奏効者」と分類し、ＮＣまたはＰＤを示す患者を「非奏効者」と分類した。レトロゾール(フェマーラ(登録商標))投与患者からの前処置生検におけるこれら２群間で８０００遺伝子の発現を比較した。絶対値(ＡｖＤｉｆｆ)は、特定試料におけるその遺伝子についての発現レベルを表す。コンピューター操作上の理由で、ＡｖＤｉｆｆ値の平均を、奏効者の全部についてのアレイにおける各遺伝子について計算した。次いで、これらの平均を、非奏効者群における個々の各試料についての各遺伝子と比較した。奏効者の平均および非奏効者の各試料間における発現差異が３倍またはそれより大きい２種の遺伝子、すなわちＮＯＶＡ１およびＩＧＨＧ３が同定された(両方とも表２および６に列挙されている)。表２はまた、レファレンスのみについてのＶ５生検(処置後)データを含む。
２種の遺伝子、ＩＧＨＧ３およびＮＯＶＡ１は、フェマーラ(登録商標)処置中にＮＣまたはＰＤを呈する女性からの生検と比べて、最終的にフェマーラ(登録商標)処置に対し正に応答する女性からの処置前腫瘍において高いレベルで発現されることが見出された。遺伝子ＮＯＶＡ１の場合、Ｖ５試料を含む、２群間における中央値の差異は、マン−ホイットニー順位和検定を用いて偶然に(Ｐ＝０.０１２)予測されるものよりも大きい。データは、遺伝子ＩＧＨＧ３については統計的に有意ではない。これらの遺伝子(ＩＧＨＧ３およびＮＯＶＡ１)は、タモキシフェン処置患者からの生検において差次的発現されなかったため、タモキシフェンに対する有利な応答についてのマーカーを提供しない。
ＮＯＶＡ１遺伝子を唯一識別するために、以下の識別名が使用され得る：ＮＯＶＡ１(ユニジーンＩＤ Ｈｓ.２１４)は染色体１４ｑに位置し、ＮＭ＿００２５１５のｍＲＮＡ受託番号およびタンパク質受託番号ＮＰ＿００２５０６により識別される。
ＩＧＨＧ３遺伝子(Ｈｓ.３００６９７)について、この遺伝子もまた、染色体１４ｑに位置し、ｍＲＮＡ受託番号ＢＣ０１６３８１により識別される。タンパク質受託番号は無い。
遺伝子ＩＧＨＧ３およびＮＯＶＡ１には、これらの遺伝子を診断的マーカーおよび／または治療標的として適切なものにする幾つかの生物学的特徴がある。ＩＧＨＧ３は、Ｈ鎖病(ＨＣＤ)に関連している。ＨＣＤは、変異型モノクローナルＩｇ重(Ｈ)鎖フラグメントが血清または尿から見出される自然発症リンパ球増殖性疾患である。ＮＯＶＡ１は、発生期マウスにおけるＣＮＳのニューロンに制限される発現が堅固に調節された核ＲＮＡ結合性タンパク質である。この抗原に対する抗体は、腫瘍随伴性眼球クローヌス−運動失調(ＰＯＡ)患者で見られる。ＰＯＡは、目、胴体および手足の運動制御異常が乳癌または小肺癌の女性で発現する自己免疫疾患である。この疾患における胸部腫瘍はＮＯＶＡ１遺伝子を異常に発現する。これは、ＮＯＶＡ１を自然に発現するＣＮＳを攻撃する免疫応答を不正に発する。ＮＯＶＡ１融合タンパク質との血清反応性は、ＰＯＡについて診断上特徴的なものであり、不顕性胸部、婦人科または肺腫瘍の存在を示唆する。
Figure 2005512510
処置後生検からの予測的マーカー
本発明のさらに別の態様において、処置後患者からの応答性のマーカーを同定した。この目的のため、レトロゾール(フェマーラ(登録商標))処置患者からの生検、Ｖ５からの試料、すなわち処置後生検を、２つの範ちゅう、すなわち奏効者または非奏効者の一方へ入れた。ＣＲまたはＰＲを有する患者からの生検を奏効者であるとみなし、ＮＣまたはＰＤを有する患者の生検を非奏効者として分類した。コンピューター操作上の理由により、ＡｖｇＤｉｆｆ値の平均を、Ｖ５奏効者についてのアレイ上の各遺伝子について計算した。次いで、これらの平均を、非奏効者群における個々の各試料についての各遺伝子と比較した。８プローブセットにより示された７遺伝子が、奏効者の平均および非奏効者群における試料の各一つの間において３倍より大きい発現差異を有するものとして同定された(表３)。表３はまた、レファレンスのみについての処置前生検Ｖ０からのデータを含む。ベータヘモグロビンについての２種の異なるプローブセットは、フェマーラ(登録商標)に応答する患者からの生検が、非奏効者からの生検と比べるとこの遺伝子の発現性が高かったことを示唆している。興味深いことに、同定された２遺伝子、ＨＰＮおよびＰＩＰは、遺伝子発現によるＥＲ陽性およびＥＲ陰性生検の二次元階層的クラスタリングにおいてＥＳＲ１と共クラスタリングする。ＨＰＮ(Ｐ＝０.０４６)およびラクトトランスフェリン(Ｐ＝＜０.００１)は、マン−ホイットニー順位和検定を用いたところ、奏効者および非奏効者間の中央値において統計的有意差を有する。マン−ホイットニー順位和検定を遂行するため、Ｖ０およびＶ５生検を含む全生検データを使用した。
マーカーのリストは、ＨＰＮおよびＰＩＰを含む。これらの遺伝子はまた、階層的クラスタリング分析においてＥＳＲ１と共クラスタリングすることが見出された。２種の別々の分析に基くと、ＨＰＮおよびＰＩＰは、レトロゾール(フェマーラ(登録商標))に対する応答性を予測するのに有用である機能的ＥＲトランスクリプトゾームの生物マーカーとしてみなされるべきである。
ＨＰＮは、ヒトVII因子を活性化し、例えば Kazama, J. Biol. Chem., 第２７０巻、６６−７２頁(１９９５)により報告されている通りトロンビン形成に至る細胞表面での血液凝固経路を開始させることが示されたII型膜関連セリンプロテアーゼである。例えば、Torres-Rosadaetal., Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第９０巻、７１８１−７１８５頁(１９９３)で報告されている通り、若干の新生物細胞は血液凝固系を活性化し、その結果、この経路および他の経路を通して凝固能亢進および脈管内血栓症が誘発され、ヘプシンはそれらの細胞成長においてある役割を演じると考えられている。ＨＰＮ遺伝子の発現は高度に制限されており、すなわち、この遺伝子は、Tsuji et al., J. Biol. Chem.、第２６６巻、１６９４８−１６９５３頁(１９９１)で報告された通り、肝臓での高レベルおよび腎臓での中レベル以外、ほとんどの体内組織において低レベルで発現される。
ＨＰＮは、幾つかの癌セルラインで高度発現されると報告されており、最も近いところでは、卵巣癌について例えばTanimoto et al., Cancer Res., 第５７巻、２８８４−２８８７頁(１９９７)により報告されている。さらに、ＨＰＮの発現性は肝臓では高いが、ＨＰＮの両コピーに崩壊を伴うノックアウトマウスは肝臓の異常または機能不全を全く示さない。事実、これらのマウスは、例えばWu et al., J. Clin. Invest., 第１０１巻、３２１−６頁(１９９８)により報告された認識可能な表現型を全く示さない。ＨＰＮの細胞外ドメインに対してターゲッティングされた抗体は、例えばTorres-Rosada et al. (前出)で記載されている通りＨＰＮを過剰発現する肝癌細胞の増殖を遅延させることが示されている。
ベータヘモグロビンについての２種のプローブが同定された。これは、ベータヘモグロブリンが、処置後(Ｖ５)腫瘍において非奏効者と比べて奏効者ではより高度に発現されることを示唆している。レトロゾール(フェマーラ(登録商標))は、血管化が不十分な腫瘍と比べて十分に血管化された胸部腫瘍をより有効にターゲッティングし、そしてベータヘモグロビン発現レベルは、これらの生検における血管新生の程度と相関関係を有する可能性がある。ラクトトランスフェリン(ＬＴＦ)はまた、可能性のあるマーカーのリストに含まれた。ＬＴＦは乳汁で発現される鉄結合タンパク質であり、好中球の二次顆粒でも発現される。ＬＴＦは、鉄輸送貯蔵およびキレート化、および宿主防御機構に関与する。これは、検定された胸部腫瘍の〜５０％には存在しないことが報告された(Perou et al., Nature, 第４０６巻、７４７−７５２頁(２０００)参照)。
Figure 2005512510
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すなわち、これらの遺伝子またはそれらの遺伝子産物の絶対発現レベルは、限定されるわけではないが、本明細書に開示された手段を含む何らかの信頼できる手段によりフェマーラに応答する対象およびフェマーラに応答しない対象において測定され得、結果を未知対象において同じ遺伝子または遺伝子産物の発現レベルと比較することにより、未知腫瘍がレトロゾール(フェマーラ(登録商標))処置を含む内分泌療法に応答するか否かが決定され得る。
Figure 2005512510
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薬理ゲノミクス
薬理ゲノミクス／ゲノミクスは、外来化合物または薬剤に対する個々の応答に関与する遺伝子／ゲノム因子の研究である。本発明マーカーの発現に対し刺激または阻害効果を有する薬剤またはモジュレーターを個体に投与することにより、患者における乳癌が(予防的または治療的)処置され得る。上記処置と連係して、個体の薬理ゲノミクスを考慮しなければならない。治療薬代謝の差異は、薬理学的活性薬剤の用量および血液濃度間の関係を変化させることにより深刻な毒性または治療上の失敗を招き得る。すなわち、個体の薬理ゲノミクスを理解することにより、予防的または治療的処置についての有効な薬(例、薬剤)が選択され得る。さらに上記薬理ゲノミクスを用いることにより、適切な用量および治療方法が決定され得る。従って、一個体における本発明マーカーの発現レベルを測定することにより、個体の治療的または予防的処置に適切な薬剤(複数も可)が選択され得る。
薬理ゲノミクスは、個体における薬剤の性質および作用の変化に起因する薬剤の効力または毒性の臨床的に重大な変化を扱うものである(例、Linder, Clin. Chem., 第４３巻、２号、２５４−２６６頁(１９９７)参照)。一般に、２タイプの薬理遺伝学的条件に区別され得る。薬剤の体に対する作用の仕方を変性させる単一因子として伝達される遺伝的条件は、「変性薬剤作用」という。体の薬剤に対する作用の仕方を変性させる単一因子として伝達される遺伝的条件は、「変性薬剤代謝」という。これらの薬理遺伝学的条件は、希有欠損または共通多型性として生じ得る。例えば、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ(Ｇ６ＰＤ)欠損症は、オキシダント剤(抗マラリア剤、スルホンアミド、鎮痛薬、ニトロフラン)摂取およびソラマメ消費後の主たる臨床的合併症が溶血である共通の遺伝性酵素病である。
実施態様の一例として、薬剤代謝性酵素の活性は、薬剤作用の強さおよび持続時間の両方の主たる決定因子である。薬剤代謝性酵素(例、Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ２(ＮＡＴ２)およびシトクロムＰ４５０酵素ＣＹＰ２Ｄ６およびＣＹＰ２Ｃ１９)の遺伝的多型性の発見により、患者によっては標準的安全用量の薬剤摂取後に期待された薬剤効果が得られなかったり、または過度の薬剤応答および深刻な毒性を示す場合がある理由についての説明が提供された。
これらの多型性は、集団における２種の表現型：高代謝能群(ＥＭ)および低代謝能群(ＰＭ)で発現される。ＰＭの有病率は異なる集団間では異なる。例えば、ＣＹＰ２Ｄ６をコーディングする遺伝子は高度多型性であって、幾つかの突然変異がＰＭで同定されており、全て機能的ＣＹＰ２Ｄ６の欠如に至る。ＣＹＰ２Ｄ６およびＣＹＰ２Ｃ１９の低代謝能群は、標準用量を投与されたときに過度の薬剤応答および副作用を極めて高頻度で経験する。コデインのＣＹＰ２Ｄ６形成代謝産物モルヒネにより伝達されるその鎮痛効果について立証されたところによると、代謝産物が活性治療部分である場合、ＰＭは治療応答を全く示さない。他の極端なものは、標準投与量に応答しないいわゆる超高速代謝能群である。最近では、超高速代謝の分子理論が、ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子増幅に起因することが確認された。
すなわち、個体における本発明マーカーの発現レベル、または機能のレベルを測定することにより、個体の治療的または予防的処置について適切な薬剤(複数も可)が選択され得る。さらに、薬理遺伝的試験を用いて薬剤代謝性酵素をコード化する多型性対立遺伝子または薬剤標的の遺伝子型分類に適用すると、個体の薬剤応答性表現型が予測できる。この知識を投与量または薬剤選択に適用すると、有害な反応または治療の失敗を回避し得るため、本発明マーカーの発現のモジュレーターで対象を処置する場合に治療的または予防的有効性が高められ得る。
プロテオミクス
培養中の正常および形質転換細胞の両方により分泌されるタンパク質を分析することにより、体液中へ癌細胞により分泌されると思われ、この発明方法において貴重であり得るタンパク質が同定され得る。上清が単離され得、ＭＷＴ−ＣＯフィルターを用いてタンパク質の混合物が単純化され得る。次いでタンパク質はトリプシンにより消化され得る。次いで、トリプシンによって生じたペプチドを微細毛管状ＨＰＬＣカラムへローディングすると、そこでそれらは分離され、そして特別注文のエレクトロスプレーイオン化供給源を通して直接イオントラップ質量分光計へ溶離され得る。勾配全体を通じて、既にフラグメント化されたものを動力学的に排除しながら、カラムから溶離する４つの最強イオン(ペプチド)のフラグメント化を通して配列データが得られる。こうして、試料中の約５０〜２００種の異なるタンパク質に対応する、マルチスキャンからの配列データが入手され得る。相関分析道具、例えばＭＳタッグを用いてこれらのデータをデータベースに対して検索することにより、上清中のタンパク質が同定される。
測定方法
この発明の実験方法は、細胞成分の測定結果により異なる。測定される細胞成分は、細胞の生物学的状態のあらゆる局面からのものであり得る。それらは、ＲＮＡ存在量が測定される転写状態、タンパク質存在量が測定される翻訳状態、タンパク質活性が測定される活性状態からのものであり得る。細胞特性はまた混合局面からのものであり得、例えば１種またはそれ以上のタンパク質の活性が、他の細胞成分のＲＮＡ存在量(遺伝子発現量)と一緒に測定される。このセクションでは、薬剤または経路応答における細胞成分を測定するための実例となる方法について記載している。この発明は、他の上記測定方法に適用可能である。
好ましくは、この発明では、他の細胞成分の転写状態が測定される。転写状態は、次のサブセクションで記載されている核酸または核酸模倣プローブのアレイへのハイブリダイゼーション技術により、または後続のサブセクションで記載されている他の遺伝子発現技術により測定され得る。しかしながら、測定された結果は、ｍＲＮＡ存在量および／または割合を表す値を含むデータであり、通常ＤＮＡ発現割合(ＲＮＡ分解速度における差異の不存在下)を反映している。
本発明の様々な代替的実施態様では、転写状態以外の生物学的状態の局面、例えば翻訳状態、活性状態または混合局面が測定され得る。
本発明の一態様において、対象における乳癌の存在、進行または予後は、時間経過に伴い、すなわち胸部疾患の様々な段階で患者から得られた体液または胸部組織試料における表１、２、３または４で同定された遺伝子の少なくとも一つに対応するｍＲＮＡまたはコード化されたタンパク質の発現レベルを測定することによりモニターされ得る。全般的予後に関連性があるものとして見なされた遺伝子(複数も可)に対応するｍＲＮＡまたはコード化されたタンパク質の発現レベルは、乳癌の処置または進行に関する貴重な情報を提供し得る。遺伝子(複数も可)に対応するｍＲＮＡおよびタンパク質発現レベルは、下記の標準的方法により検出され得る。
特に有用な実施態様では、開示された複数の遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルを、胸部疾患の様々な段階で対象において同時に測定することにより、時間経過に伴う胸部疾患の転写または発現プロフィールが作製され得る。例えば、複数のこれら遺伝子に対応するｍＲＮＡ転写物を、様々な時点で対象の胸部細胞から入手し、目的遺伝子の転写物に相補的であるオリゴヌクレオチドプローブ含有チップにハイブリダイズすることにより、乳癌の様々な段階における多数の遺伝子の発現が比較され得る。
別の態様では、開示された遺伝子を基にした細胞に基く検定法を用いることにより、乳癌処置用薬剤が同定され得る。この方法では、ａ）胸部疾患の疑いがある対象から得た体液または胸部組織の試料を候補薬剤と接触させ、ｂ）表１、２、３または４に示された少なくとも一遺伝子の発現レベルを検出し、そしてｃ）候補薬剤の非存在下での試料における遺伝子の発現レベルと比較し、その場合、薬剤の非存在下での発現レベルに対する薬剤の存在下での試料における遺伝子の発現レベルの変化が乳癌の処置に有用な薬剤を示すものとする。遺伝子の発現レベルは、下記の遺伝子に対応するｍＲＮＡまたはそれによりコード化されるタンパク質のレベルを測定することにより検出される。
本明細書で使用されている「類似した」の語は、２またはそれ以上の値の比較に適用された場合、それらの値は互いの１０％以内にあることを意味する。
本明細書で使用されている「候補薬剤」の語は、開示された遺伝子の少なくとも一つに対応するｍＲＮＡまたはそれによりコード化されたタンパク質のレベルを変性または減少させ得る分子をいう。候補薬剤は、天然または合成分子、例えばタンパク質またはそのフラグメント、抗体、小分子阻害剤、核酸分子、例えばアンチセンスヌクレオチド、リボザイム、二本鎖ＲＮＡ、有機および無機化合物などであり得る。
また、無細胞検定法を用いて、開示された遺伝子の一つによりコード化されるタンパク質またはタンパク質結合パートナーと相互作用することにより、タンパク質またはその結合パートナーの活性を変性させ得る化合物が同定され得る。また、無細胞検定法を用いることにより、コード化タンパク質およびその結合パートナー、例えば標的ペプチド間の相互作用を変調する化合物が同定され得る。
一実施態様において、上記化合物を同定するための無細胞検定法は、開示された遺伝子の一つによりコード化されるタンパク質および結合パートナーの存在または非存在下試験化合物または試験化合物のライブラリー、例えば生物学的不活性標的ペプチドまたは小分子を含有する反応混合物を含む。従って、タンパク質またはその機能性フラグメントまたはタンパク質結合パートナーを試験化合物または試験化合物のライブラリーと接触させ、複合体の形成を検出することを含む、乳癌処置に有用な薬剤を同定するための無細胞方法の一例が提供される。検出目的の場合、タンパク質は特異的マーカーで標識され得、試験化合物または試験化合物のライブラリーは異なるマーカーで標識され得る。次いで、試験化合物とタンパク質またはそのフラグメントまたはタンパク質結合パートナーとの相互作用は、インキュベーションおよび洗浄段階後に２標識のレベルを測定することにより検出され得る。２標識の存在は、相互作用の指標である。
分子間の相互作用は、光学現象である、表面プラスモン共鳴を検出するリアルタイムＢＩＡ(バイオモレキュラー・インターアクション・アナリシス、ファルマシア・バイオセンサー(ＡＢ))を用いることにより評価され得る。検出は、生物特異的界面における大規模高分子の質量濃度の変化に依存するもので、分子の標識を必要とはしない。有用な一実施態様では、試験化合物のライブラリーをセンサー表面、例えばマイクロ−フローセルの壁に固定化し得る。次いで、タンパク質、その機能性フラグメントまたはタンパク質結合パートナーを含有する溶液を、センサー表面上で連続循環させる。シグナル記録装置で示される通り、共鳴角度の変化は相互作用の発生を示す。この技術は、ファルマシアによるBIAtechnology Handbookに詳述されている。
無細胞検定法の別の実施態様では、ａ)少なくとも一遺伝子によりコード化されるタンパク質、タンパク質結合パートナーおよび試験化合物を合わせて反応混合物を形成させ、そしてｂ)試験化合物の存在および非存在下タンパク質およびタンパク質結合パートナーの相互作用を検出する。試験化合物の非存在下における相互作用と比べて試験化合物の存在下におけるタンパク質および結合パートナーの相互作用に相当な変化(増強または阻害)があることは、試験化合物についてのタンパク質の活性の潜在的アゴニスト(模倣物質または増強剤)またはアンタゴニスト(阻害剤)であることを示す。検定の成分を同時に合わせ得るかまたはタンパク質をある一定期間試験化合物と接触させた後、反応混合物に結合パートナーを加え得る。化合物の効力は、様々な濃度の化合物を用いて用量応答曲線を作成することにより評価され得る。また、試験化合物の非存在下におけるタンパク質およびその結合パートナー間の複合体形成を定量することにより、対照検定が遂行され得る。
タンパク質およびその結合パートナー間における複合体の形成は、検出可能標識タンパク質、例えば放射性標識、蛍光標識または酵素標識タンパク質またはその結合パートナーを用いることにより、イムノアッセイにより、またはクロマトグラフィー検出法により検出され得る。
好ましい実施態様では、タンパク質またはその結合パートナーを固定化することにより、タンパク質およびその結合パートナーの非複合体形成形態からの複合体の分離および検定の自動化が簡便化され得る。タンパク質のその結合パートナーへの複合体形成は、例えばマイクロタイタープレート、微細遠心管および試験管といった任意のタイプの容器中において達成され得る。特に好ましい実施態様では、タンパク質を別のタンパク質、例えばグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼに融合させて、マトリックス、例えばグルタチオンセファロースビーズ(シグマ・ケミカルズ、セントルイス、ミズーリ)に吸着され得る融合タンパク質を形成させ得、次いでこれらを、例えば３５Ｓで標識した、標識タンパク質パートナーおよび試験化合物と合わせ、そして複合体形成に十分な条件下でインキュベーションする。それに続いて、ビーズを洗浄して非結合標識を除去し、マトリックスを固定し、放射性標識を測定する。
マトリックスにタンパク質を固定する別の方法では、ビオチンおよびストレプトアビジンの利用を含む。例えば、よく知られた技術を用い、ビオチンＮＨＳ(Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド)を用いてタンパク質をビオチニル化し、ストレプトアビジンでコーティングしたプレートのウェルに固定化し得る。
また、無細胞検定法を用いることにより、少なくとも一遺伝子によりコード化されるタンパク質と相互作用し得、遺伝子によりコード化されるタンパク質の活性を変調させる薬剤が同定され得る。一実施態様では、タンパク質を試験化合物とインキュベーションし、タンパク質の触媒活性を測定する。別の実施態様では、当業界で公知の方法により、標的分子へのタンパク質の結合親和力が測定され得る。
本発明はまた、胸部疾患に罹患または罹患の危険がある対象の予防的および治療的処置方法を提供する。胸部疾患の発現が阻止されるかまたはその進行が遅らされるように、胸部疾患に特有な徴候が現れる前に予防薬剤の投与が行われ得る。胸部疾患の処置に関しては、胸部細胞、例えば癌細胞を殺すかまたは細胞死が起こるように誘導することは要求されない。その代わりとして、胸部疾患の処置を遂行するには、腫瘍の成長をある程度まで遅らせるか、またはある程度の異常細胞を正常に復帰させるだけでよい。適切な治療剤の例には、限定されるわけではないが、下記で詳述されている通りアンチセンスヌクレオチド、リボザイム、二本鎖ＲＮＡおよびアンタゴニストがある。
本明細書で使用されている「アンチセンス」の語は、開示された遺伝子の少なくとも一つのＲＮＡ発現産物の一部分に相補的であるヌクレオチド配列をいう。「相補的」ヌクレオチド配列は、標準ワトソン−クリック相補塩基対原則にしたがって塩基対合し得るヌクレオチド配列をいう。すなわち、プリンはピリミジンと塩基対合して、ＤＮＡの場合にはグアニン：シトシンおよびアデニン：チミン、またはＲＮＡの場合にはアデニン：ウラシルの組み合わせを形成する。他のそれほど一般的ではない塩基、例えばイオシン、５−メチルシトシン、６−メチルアデニン、ヒポキサンチンなどは、ハイブリダイズしている配列に含まれ得、対合を妨害しない。
全実施態様において、細胞成分の測定は、測定がいつ為されるかとは比較的無関係な方法で為されるべきである。
転写状態測定
好ましくは、転写状態の測定は、このサブセクションに記載されている、オリゴヌクレオチドアレイへの核酸のハイブリダイゼーションにより行なわれる。ある種の他の転写状態測定方法は、このサブセクションで後述されている。
転写物アレイ概説
好ましい実施態様において、本発明は、「オリゴヌクレオチドアレイ」(ここでは「マイクロアレイ」とも呼ばれる)を利用する。マイクロアレイは、細胞における転写状態を分析し、そして特に癌細胞の転写状態を測定するのに使用され得る。
一実施態様において、細胞に存在するｍＲＮＡ転写物を表す検出可能標識ポリヌクレオチド(例、全細胞ｍＲＮＡまたは標識ｃＲＮＡから合成された蛍光標識ｃＤＮＡ)をマイクロアレイにハイブリダイズすることにより、転写物アレイを製造する。マイクロアレイは、細胞または生物体のゲノムにおける遺伝子の多く、好ましくは大部分またはほぼ全部の遺伝子産物についての結合(例、ハイブリダイゼーション)部位を整列させたアレイをもつ表面である。マイクロアレイは若干の方法で製造され得、それらの幾つかは下記に記載されている。しかしながら、製造されたマイクロアレイは、ある種の特徴を共有する。アレイは再現性があり、所定のアレイのコピーが多数製造され、容易に互いに比較され得る。好ましくは、マイクロアレイは小型で、通常５ｃｍ２より小さく、結合(例、核酸ハイブリダイゼーション)条件下で安定している材料から製造される。マイクロアレイにおける所定の結合部位または結合部位の特有なセットは、細胞における単一遺伝子の生成物と特異的に結合する。一特異的ｍＲＮＡについて複数の物理的結合部位(以後、「部位」)が存在し得るが、明確にするため、下記検討は、単一部位が存在するものと仮定する。一実施態様では、各位置に既知配列の付加核酸を含む位置的にアドレス可能なアレイを使用する。
細胞のＲＮＡに相補的なｃＤＮＡが製造され、適切なハイブリダイゼーション条件下でマイクロアレイにハイブリダイズされると、特定遺伝子に対応するアレイにおける部位へのハイブリダイゼーションレベルは、その遺伝子から転写されたｍＲＮＡの細胞における罹患率を反映するものとする。例えば、全細胞ｍＲＮＡに相補的な検出可能標識(例、発蛍光団による)ｃＤＮＡまたはｃＲＮＡがマイクロアレイにハイブリダイズされると、細胞において転写されない遺伝子に対応する(すなわち、遺伝子産物と特異的に結合し得る)アレイ上の部位は、ほとんどまたは全くシグナル(例、蛍光シグナル)を有しておらず、そしてコード化ｍＲＮＡが優勢である遺伝子は比較的強いシグナルを有する。
マイクロアレイの製造
マイクロアレイは当業界では公知であり、遺伝子産物(例、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＲＮＡ、ポリペプチドおよびそのフラグメント)に次々と対応するプローブが既知位置で特異的にハイブリダイズまたは結合され得る表面により構成される。一態様において、マイクロアレイは、各位置が遺伝子によりコード化された生成物(例、タンパク質またはＲＮＡ)について別々の結合部位を表し、結合部位が生物体のゲノムにおける遺伝子の大部分またはほぼ全部の生成物について存在するアレイ(すなわちマトリックス)である。好ましい実施態様において、「結合部位」(以後「部位」)は、特定同族体ｃＤＮＡまたはｃＲＮＡが特異的にハイブリダイズし得る核酸または核酸類似体である。結合部位の核酸または類似体は、例えば合成オリゴマー、完全長ｃＤＮＡ、完全長に満たないｃＤＮＡまたは遺伝子フラグメントであり得る。
好ましい実施態様では、マイクロアレイは標的生物体ゲノムにおける全部またはほぼ全部の遺伝子の生成物についての結合部位を含むが、かかる包括性は必ずしも必要とはされない。マイクロアレイは、標的生物体における遺伝子の小部分のみについての結合部位を有し得る。しかしながら、一般に、マイクロアレイは、ゲノムにおける遺伝子の少なくとも約５０％、多くは少なくとも約７５％、さらに多くの場合少なくとも約８５％、さらに多くは約９０％より大、そして最も多くの場合、少なくとも約９９％に対応する結合部位を有する。好ましくは、マイクロアレイは、興味の対象である生物学的ネットワークモデルの試験および確認と関連性のある遺伝子についての結合部位を有する。「遺伝子」は、メッセンジャーＲＮＡが生物体(例、単一細胞の場合)または多細胞生物体における何らかの細胞で転写される好ましくは少なくとも５０、７５または９９アミノ酸の読み枠(ＯＲＦ)として認識される。ゲノムにおける遺伝子の数は、生物体により発現されるｍＲＮＡの数から、またはゲノムの十分に特性確認された部分からの外挿法により推測され得る。興味の対象である生物体のゲノムが配列決定されたとき、ＯＲＦの数が決定され、ｍＲＮＡコーディング領域がＤＮＡ配列分析により同定され得る。例えば、サッカロマイシス・セレヴィシエ(Saccharomyces cerevisiae)ゲノムは完全に配列決定されており、９９アミノ酸より長い約６２７５のＯＲＦを有すると報告されている。これらのＯＲＦの分析は、タンパク質生成物を特定すると思われる５８８５のＯＲＦがあることを示している(例えば、Goffeau et al., “Life with 6000 genes”、Science、第２７４巻、５４６−５６７頁(１９９６)参照、全目的について出典明示により援用する)。対照的に、ヒトゲノムは、約２５０００〜３５０００遺伝子を含むと推定されている。
マイクロアレイ用の核酸の製造
上記で示した通り、特定同族体ｃＤＮＡが特異的にハイブリダイズする「結合部位」は、通常、その結合部位で結合される核酸または核酸類似体である。一実施態様では、マイクロアレイの結合部位は、生物体ゲノムにおける各遺伝子の少なくとも一部分に対応するＤＮＡポリヌクレオチドである。これらのＤＮＡは、例えばゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ(例、ＲＴ−ＰＣＲによる)、またはクローン化配列からの遺伝子セグメントのポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)増幅により得られるか、または配列は、例えばフォトリソグラフィー技術の使用により、チップの表面で新たに合成され得、例えばアフィメトリックスは、チップ上で直接それらのオリゴを合成するといった異なる技術を使用する。ＰＣＲプライマーは、遺伝子またはｃＤＮＡの既知配列に基いて選択され、その結果、特有フラグメント(すなわち、マイクロアレイにおける他のフラグメントと共有する連続同一配列があるとしても１０塩基を越えることはないフラグメント)の増幅が誘発される。コンピュータープログラムは、要求される特異性および最適な増幅特性をもつプライマーの設計において有用である(例えば、オリゴｐｌバージョン５.０(ナショナル・バイオサイエンシーズ)参照)。非常に長い遺伝子に対応する結合部位の場合、オリゴ−ｄＴプライムｃＤＮＡプローブがマイクロアレイとハイブリダイズしたとき、完全長より短いプローブが有効に結合するように、遺伝子の３'末端付近のセグメントを増幅するのが望ましいこともある。典型的には、マイクロアレイ上の各遺伝子フラグメントは、長さが約２０ｂｐおよび約２０００ｂｐ間、さらに一般的には約１００ｂｐおよび約１０００ｂｐの間、および通常は約３００ｂｐおよび約８００ｂｐの間の範囲である。ＰＣＲ方法は公知であり、例えば、Innis et al.編、“PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications”、アカデミック・プレス・インコーポレイテッド、サンディエゴ、カリフォルニア(１９９０)に記載されており、あらゆる目的について出典明示で援用する。コンピューター制御ロボットシステムは、核酸の単離および増幅に有用であると認められている。
マイクロアレイ用の核酸を製造する別の手段は、例えば、Ｎ−ホスホネートまたはホスホルアミダイト化学作用を用いることによる、合成ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの合成によるものである(Froehler et al., Nucleic Acid Res., 第１４巻、５３９９−５４０７頁(１９８６)、McBride et al., Tetrahedron Lett., 第２４巻、２４５−２４８頁(１９８３))。合成配列は、長さが約１５および約５００塩基、さらに一般的には約２０および約５０塩基の間である。実施態様の中には、合成核酸が非天然塩基、例えばイノシンを含む場合もある。上述した通り、核酸類似体は、ハイブリダイゼーションについての結合部位として使用され得る。適切な核酸類似体の一例は、ペプチド核酸である（例、Egholm et al.,“PNA Hybridizes to Complementary Oligonucleotides Obeying the Watson-Crick Hydrogen-Bonding Rules”、Nature、第３６５巻、５６６−５６８頁(１９９３)参照、また米国特許第５５３９０８３号も参照）。
別の実施態様では、結合(ハイブリダイゼーション)部位は、遺伝子、ｃＤＮＡ(例、発現された配列標識)またはそこからの挿入体のプラスミドまたはファージクローンから調製される(Nguyen et al.,“Differential Gene Expression in the Murine Thymus Assayed by Quantitative Hybridization of Arrayed ｃDNA Clones”、Genomics、第２９巻、２０７−２０９頁(１９９５))。さらに別の実施態様では、結合部位のポリヌクレオチドはＲＮＡである。
固体表面への核酸の結合
核酸または類似体を、ガラス、プラスチック(例、ポリプロピレン、ナイロン)、ポリアクリルアミド、ニトロセルロースまたは他の材料から製造され得る固体支持体に結合させる。核酸を表面へ結合させる好ましい方法は、Schena et al.,“Quantitative Monitoring of Gene Expression Patterns With a Complementary DNA Microarray”、Science、第２７０巻、４６７−４７０頁(１９９５)により概説されている、ガラス板への印字によるものである。この方法は、ｃＤＮＡのマイクロアレイを製造するのに特に有用である。また、DeRisi et al.,“Use of a ｃDNA Microarray to Analyze Gene Expression Patterns in Human Cancer”、Nature Genetics、第１４巻、４５７−４６０頁(１９９６)；Shalon et al.,“A DNA Microarray System for Analyzing Complex DNA Samples Using Two-Color Fluorescent Probe Hybridization”、Genomes Res.、第６巻、６３９−６４５頁(１９９６)；およびSchena et al.,“Parallel Human Genome Analysis；Microarray-Based Expression of 1000 Genes”、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第９３巻、１０５３９−１１２８６頁(１９９５)参照。前述の文献は各々、全目的について出典明示で援用する。
第２の好ましいマイクロアレイ製造方法は、高密度オリゴヌクレオチドアレイの製造によるものである。in situ 合成用のフォトリトグラフィー技術を用いて表面上の規定位置で、規定配列に相補的な何千のオリゴヌクレオチドを含むアレイを製造する技術(Fodor et al.,“Light-Directed Spatially Addressable Parallel Chemical Synthesis”、Science、第２５１巻、７６７−７７３頁(１９９１)；Pease et al.,“Light-Directed Oligonucleotide Arrays for Rapid DNA Sequence Analysis”、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第９１巻、５０２２−５０２６頁(１９９４)；Lockhart et al.,“Expression Monitoring by Hybridization to High-Density Oligonucleotide Arrays”、Nature Biotech.,第１４巻、１６７５頁(１９９６)；米国特許第５５７８８３２、５５５６７５２および５５１０２７０号参照、これらを全目的に関して出典明示で援用する)または規定オリゴヌクレオチドを迅速に合成および沈積させる他の方法(Blanchard et al.,“High-Density Oligonucleotide Arrays”、Biosensors & Bioelectronics、第１１巻、６８７−６９０頁(１９９６))が知られている。これらの方法を使用するとき、既知配列のオリゴヌクレオチド(例、２５量体)を、表面、例えば誘導体化ガラススライド上で直接合成する。通常、製造されたアレイは重複しており、一ＲＮＡにつき幾つかのオリゴヌクレオチド分子を伴う。別にスプライシングされたｍＲＮＡを検出するのにオリゴヌクレオチドプローブが選択され得る。
他のマイクロアレイ製造方法、例えばマスキング(MaskosおよびSouthern、Nuc.Acids Res.、第２０巻、１６７９−１６８４頁(１９９２)参照)もまた使用され得る。原則として、あらゆるタイプのアレイ、例えばナイロンハイブリダイゼーション膜上でのドットブロット(Sambrook et al.,“Molecular Cloning‐‐A Laboratory Manual(第２版)”、第１〜３巻、コールドスプリングハーバー・ラボラトリー、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク(１９８９)参照、全目的について出典明示で援用する)が使用され得るが、当業者に認められているように、ハイブリダイゼーション体積が小さくなるため、非常に小さいアレイが好ましい。
標識プローブの生成
全およびポリ(Ａ)＋ＲＮＡの調製方法は、よく知られており、Sambrook et al.(前出)により概説されている。一実施態様では、グアニジニウムチオシアネート溶解後、ＣｓＣｌ遠心分離を用いることにより、この発明において興味の対象である様々な型の細胞からＲＮＡを抽出する(Chirgwin et al., Biochemistry、第１８巻、５２９４−５２９９頁(１９７９))。ポリ(Ａ)＋ＲＮＡは、オリゴ−ｄＴセルロース選別により選択される(Sambrook et al. (前出)参照)。興味の対象である細胞には、野生型細胞、薬剤暴露野生型細胞、修飾／動揺細胞成分(複数も可)を伴う細胞、および修飾／動揺細胞成分(複数も可)を伴う薬剤暴露細胞がある。
標識ｃＤＮＡは、ｍＲＮＡからまたは別法として直接ＲＮＡからオリゴｄＴ−プライムまたはランダムプライム逆転写により調製されるが、両方とも当業界では公知である(例、KlugおよびBerger、Methods Enzymol., 第１５２巻、３１６−３２５頁(１９８７)参照)。逆転写は、検出可能な標識にコンジュゲートされたｄＮＴＰ、最も好ましくは蛍光標識ｄＮＴＰの存在下で実施され得る。別法として、単離ｍＲＮＡは、標識ｄＮＴＰの存在下二本鎖ｃＤＮＡのインビトロ転写により合成される標識アンチセンスＲＮＡに変換され得る(Lockhart et al.,“Expression Monitoring by Hybridization to High-Density Oligonucleotide Arrays”、Nature Biotech.、第１４巻、１６７５頁(１９９６)参照、出典明示で援用する)。別の実施態様では、ｃＤＮＡまたはＲＮＡプローブは、検出可能な標識の非存在下で合成され得、それに続いて、例えばビオチニル化ｄＮＴＰまたはｒＮＴＰを取込ませることにより、または何らかの類似手段(例、ビオチンのプソラレン誘導体をＲＮＡに光架橋させる)により標識された後、標識ストレプトアビジン(例、フィコエリスリンコンジュゲートストレプトアビジン)または均等内容物質が加えられ得る。
蛍光標識プローブを使用する場合、フルオレセイン、リッサミン、フィコエリスリン、ローダミン(パーキン・エルマー・シータス)、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３.５、Ｃｙ５、Ｃｙ５.５、Ｃｙ７、蛍光体(Fluor)Ｘ(アマーシャム)などを含む、多くの適切な発蛍光団が知られている(例えば、Kricka、“Nonisotopic DNA Probe Techniques”、アカデミック・プレス、サンディエゴ、カリフォルニア(１９９２)参照)。容易に区別され得るように、異なる放射スペクトルを有する発蛍光団の対が選択されるものとする。
別の実施態様では、蛍光標識以外の標識が使用される。例えば、放射性標識、または異なる放射スペクトルをもつ放射性標識の対が使用され得る(Zhao et al.,“High Density ｃDNA Filter Analysis: A Novel Approach for Large-Scale, Quantitative Analysis of Gene Expression”、Gene、第１５６巻、２０７頁(１９９５)；Pietu et al.,“Novel Gene Transcripts Preferentially Expressed in Human Muscles Revealed by Quantitative Hybridization of a High Density cDNA Array”、Genome Res.、第６巻、４９２頁(１９９６)参照)。しかしながら、放射性粒子が散乱し、その結果広い空間をとった結合部位が必要となるため、放射性同位元素の使用はそれほど好ましい実施態様ではない。
一実施態様では、６０分間４２℃で逆転写酵素(例、(登録商標)II、ＬＴＩインコーポレイテッド)と共に０.５ｍＭのｄＧＴＰ、ｄＡＴＰおよびｄＣＴＰ＋０.１ｍＭのｄＴＴＰ＋蛍光デオキシリボヌクレオチド(例、０.１ｍＭのローダミン １１０ ＵＴＰ(パーキン・エルマー・シータス)または０.１ｍＭのＣｙ３ ｄＵＴＰ(アマーシャム))を含む混合物をインキュベーションすることにより標識ＤＮＡを合成する。
マイクロアレイへのハイブリダイゼーション
プローブが特異的アレイ部位へ「特異的に結合する」かまたは「特異的にハイブリダイズする」ように、すなわちプローブが、相補的核酸配列を伴う配列アレイ部位とはハイブリダイズ、二本鎖形成または結合するが、非相補的核酸配列を伴う部位とはハイブリダイズしないように、核酸ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件を選択する。ここで使用されている一ポリヌクレオチド配列は、もう一方のと相補的であると見なされ、短い方のポリヌクレオチドが２５塩基以下である場合、標準塩基対合法則によるミスマッチは全く存在せず、または短い方のポリヌクレオチドが２５塩基より長い場合、ミスマッチは僅か５％に過ぎない。好ましくは、ポリヌクレオチドは完全に相補的(ミスマッチ無し)である。特異的ハイブリダイゼーション条件の結果、陰性対照を含むハイブリダイゼーション検定法を実施することにより特異的ハイブリダイゼーションが行なわれることは容易に立証され得る(例、Shalon et al.、前出、および Chee et al.、前出参照)。
最適ハイブリダイゼーション条件は、標識プローブおよび固定化ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの長さ(例、オリゴマー対２００塩基より大きいポリヌクレオチド)およびタイプ(例、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＰＮＡ)により異なる。核酸についての特異的(すなわちストリンジェントな)ハイブリダイゼーションに関する一般的パラメーターは、Sambrook et al.(前出)およびAusubel et al.,“Current Protocols in Molecular Biology”、グリーン・パブリッシング・アンド・ウィリー−インターサイエンス、ニューヨーク(１９８７)に記載されており、これらを出典明示で援用する。Schena et al.のｃＤＮＡマイクロアレイを使用する場合、典型的ハイブリダイゼーション条件は、６５℃で４時間、５×ＳＳＣ＋０.２％ＳＤＳ中でのハイブリダイゼーション後、低ストリンジェンシー洗浄緩衝液(１×ＳＳＣ＋０.２％ＳＤＳ)中２５℃で洗浄、次いで高ストリンジェンシー洗浄緩衝液(１×ＳＳＣ＋０.２％ＳＤＳ)中２５℃で１０分である(Shene et al.、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第９３巻、１０６１４頁(１９９６)参照)。また、有用なハイブリダイゼーション条件は、例えば、Tijessen,“Hybridization With Nucleic Acid Probes”、エルスヴィア・サイエンス・パブリッシャーズＢ.Ｖ.(１９９３)および Kricka、“Nonisotopic DNA Probe Techniques”、アカデミック・プレス、サンディエゴ、カリフォルニア(１９９２)に提供されている。
シグナル検出およびデータ分析
蛍光標識プローブを使用する場合、転写物アレイの各部位における蛍光放射は、好ましくは共焦レーザー走査顕微鏡により検出され得る。一実施態様では、適切な励起線を用いて、使用されている２発蛍光団の各々について別々の走査を実施する。別法として、使用されている発蛍光団に特異的な波長での試料照明を可能にするレーザーが使用され得、発蛍光団からの放射が分析され得る。好ましい実施態様では、コンピューター制御Ｘ−Ｙステージおよび対物レンズを備えたレーザー蛍光スキャナーでアレイを走査する。発蛍光団の連続励起を、多重線混合ガスレーザーにより遂行し、放射光線を波長により分離させ、光電子増倍管で検出する。蛍光レーザー走査装置は、Schena et al., Genome Res., 第６巻、６３９−６４５頁(１９９６)およびそこに引用された他の参考文献で報告されている。別法として、Ferguson et al., Nature Biotech., 第１４巻、１６８１−１６８４頁(１９９６)により報告された光ファイバー束を用いることにより、多数の部位におけるｍＲＮＡ存在量レベルを同時にモニターすることができる。
シグナルを記録し、そして好ましい実施態様では、コンピューターにより、例えば１２ビットのアナログ−ディジタルボードを用いて分析する。一実施態様では、走査画像をグラフィックプログラム(例、Hijaakグラフィックス・スイート)を用いてシミ取りし、次いで各部位における各波長での平均ハイブリダイゼーションのスプレッドシートを作製する画像グリッドプログラムを用いて分析する。
アギレント・テクノロジーのジーンアレイ(登録商標)スキャナーは、ベンチ−トップ、４８８ｎＭアルゴンイオンレーザーに基く分析器具である。このレーザーは、４ミクロン未満のスポットサイズに集束され得る。この精度により、２０ミクロン程度の小さいプローブセルをもつプローブアレイの走査が可能となる。レーザービームはプローブアレイに集束し、蛍光標識ヌクレオチドを励起する。次いで、検定で使用されている染料について選択したフィルターを用いて走査を行う。直交座標における走査は、プローブアレイを動かすことにより遂行される。レーザー放射線は、ハイブリダイズ試料に組込まれた染料分子により吸収され、蛍光放射線の放射が誘発される。この蛍光の光線をレンズにより平行にし、波長選択用フィルターに通す。次いで、第２レンズにより光を深度識別用開口部へ集め、次いで、高感度光電子増倍管(ＰＭＴ)により検出する。ＰＭＴの出力電流をアナログ−ディジタルコンバーター(ＡＤＣ)により読み取られた電圧に変換し、処理されたデータを、試料ポイントの蛍光強度レベル、または現在走査されている画素(ピクセル)としてコンピューターに戻す。コンピューターは、走査の進行に応じて、画像としてデータを表示する。さらに、試料の発現プロフィールを表す、全試料の蛍光強度レベルをコンピューター読取可能フォーマットで記録する。
必要ならば、２つの蛍光体についてのチャンネル間における「クロストーク」(またはオーバーラップ、重複)に関して実験的測定による補正が行われ得る。転写物アレイ上の特定ハイブリダイゼーション部位について、２つの発蛍光団の放射割合が計算され得る。この割合は、同族体遺伝子の絶対発現レベルとは関係無いが、発現が薬剤投与、遺伝子欠失または他の試験された事象により顕著に調節され得る遺伝子には有用であり得る。
好ましくは、陽性または陰性としての撹乱(perturbation)の識別に加えて、撹乱の大きさを測定するのが有利である。これは、当業者にとっては容易に理解できる方法により実施され得る。
本明細書で使用されている「類似した」の語は、２つまたはそれ以上の値の比較に使用される場合、２つの値は、同じ単位を用いたとき、絶対値が互いの２０％以内、またはさらに好ましくは１０％以内にあることを意味する。
他の転写状態測定方法
細胞の転写状態は、当業界で公知の他の遺伝子発現技術により測定され得る。幾つかのかかる技術により、電気泳動分析についてのコンプレキシティーが限られた制限フラグメントのプールが製造され、例えばフェージングプライマーによる二重制限酵素消化を合わせる方法(例えば、Zabeau et al.による、１９９２年９月２４日付欧州特許第０５３４８５８Ａ１号参照)または規定のｍＲＮＡ末端に最も近い部位をもつ制限フラグメントを選択する方法(例、Prashar et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第９３巻、６５９−６６３頁(１９９６)参照)がある。他の方法としては、例えば多重ｃＤＮＡの各々における充分な塩基(例、２０〜５０塩基)を配列決定して各ｃＤＮＡを同定することにより、または規定ｍＲＮＡ末端(例、Velculescu, Science、第２７０巻、４８４−４８７頁(１９９５)参照)経路パターンに対して既知位置で生成される短い標識(例、９〜１０塩基)を配列決定することにより、ｃＤＮＡプールを統計的にサンプリングする。
他局面の測定
本発明の様々な実施態様において、転写状態以外の生物学的状態の局面、例えば翻訳状態、活性状態または混合局面を測定することにより、薬剤および経路応答が得られる。これらの実施態様の詳細はこのセクションに記載されている。
翻訳状態の測定
遺伝子(複数も可)によりコード化されるタンパク質の発現は、検出可能標識されているか、または続いて標識され得るプローブにより検出され得る。一般的に、プローブは、発現されたタンパク質を認識する抗体である。
本明細書で使用されている「抗体」の語は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化またはキメラ抗体、およびタンパク質への抗体フラグメントの結合に十分な生物学的機能性抗体フラグメントを包含するが、これらに限定されるわけではない。
開示された遺伝子の一つによりコード化されるタンパク質に対する抗体の産生については、様々な宿主動物が、ポリペプチドまたはその一部分の注射により免疫化され得る。上記宿主動物には、少し例を挙げれば、ウサギ、マウスおよびラットが含まれ得るが、これらに限定されるわけではない。宿主の種によって、様々なアジュバントを使用することにより、免疫学的応答が高められ得、それらの例としては、限定されるわけではないが、フロイントアジュバント(完全および不完全)、無機ゲル、例えば水酸化アルミニウム、表面活性物質、例えばリゾレシチン、プルロニックポリオール類、ポリアニオン類、ペプチド類、油エマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノールおよび潜在的に有用なヒトアジュバント、例えばＢＣＧ(bacille Camette-Guerin)およびコリネバクテリウム・パルブム(Corynebacterium parvum)が含まれる。
ポリクローナル抗体は、抗原、例えば標的遺伝子産物またはその抗原性機能的誘導体により免疫化された動物の血清から誘導された抗体分子の異種集団である。ポリクローナル抗体を製造する場合、宿主動物、例えば上記のものが、同じく上記アジュバントを補足したコード化タンパク質またはその一部分による注射により免疫化され得る。
モノクローナル抗体(ｍＡｂ)は、特定抗原に対する抗体の同種集団であり、培養中の連続セルラインにより抗体分子を製造させる技術により得られる。これらには、限定されるわけではないが、KohlerおよびMilstein、Nature、第２５６巻、４９５−４９７頁(１９７５)；および米国特許第４３７６１１０号のハイブリドーマ技術、Kosbor et al., Immunology Today、第４巻、７２号(１９８３)；Cole et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第８０巻、２０２６−２０３０頁(１９８３)のヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術；およびCole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy、Alan R.Liss, インコーポレイテッド、７７−９６頁(１９８５)のヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術がある。上記抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびそのサブクラスを含む免疫グロブリンクラスに属し得る。この発明のｍＡｂを生産するハイブリドーマは、インビトロまたはインビボで培養され得る。インビボで高力価のｍＡｂが製造されるため、これが現時点では好ましい製造方法となっている。
さらに、「キメラ抗体」の製造について開発された技術、Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第８１巻、６８５１−６８５５頁(１９８４)；Neuberger et al., Nature、第３１２巻、６０４−６０８頁(１９８４)；Takeda et al., Nature、第３１４巻、４５２−４５４頁(１９８５)、適切な生物学的活性を有するヒト抗体分子からの遺伝子と一緒に適切な抗原特異性を有するマウス抗体分子からの遺伝子をスプライシングすることによる技術が使用され得る。キメラ抗体は、異なる部分は異なる動物種から誘導されたものである分子、例えばネズミｍＡｂから誘導された可変または超可変域およびヒト免疫グロブリン定常域を有するものである。
別法として、一本鎖抗体製造について報告された技術、米国特許第４９４６７７８号；Bird、Science、第２４２巻、４２３−４２６頁(１９８８)；Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第８５巻、５８７９−５８８３頁(１９８８)、およびWard et al.、Nature,第３３４巻、５４４−５４６頁(１９８９)記載のものは、差次的発現遺伝子−一本鎖抗体を製造するのに適合化され得る。一本鎖抗体は、アミノ酸架橋によりＦｖ領域の重および軽鎖フラグメントを結合して一本鎖ポリペプチドを生成させることにより形成される。
さらに好ましくは、「ヒト化抗体」の製造に有用な技術は、タンパク質、そのフラグメントまたは誘導体に対する抗体の製造に適合化され得る。上記技術は、米国特許第５９３２４４８、５６９３７６２、５６９３７６１、５５８５０８９、５５３０１０１、５５６９８２５、５６２５１２６、５６３３４２５、５７８９６５０、５６６１０１６および５７７０４２９号に開示されている。
特異的エピトープを認識する抗体フラグメントは、公知技術により生成され得る。例えば、上記フラグメントには、抗体分子のペプシン消化により製造され得るＦ(ａｂ')２フラグメントおよびＦ(ａｂ')２フラグメントのジスルフィド架橋を還元することにより生成され得るＦａｂフラグメントがあるが、限定されるわけではない。別法として、Ｆａｂ発現ライブラリーを構築することにより(Huse et al., Science、第２４６巻、１２７５−１２８１頁(１９８９))、所望の特異性をもつモノクローナルＦａｂフラグメントの同定が迅速かつ容易に行われ得る。
次いで、既知タンパク質が試料中で発現される程度を、上記抗体を利用するイムノアッセイ方法により測定する。上記イムノアッセイ方法には、限定されるわけではないが、ドット・ブロッティング、ウエスタンブロッティング、競争的および非競争的タンパク質結合検定法、固相酵素免疫測定法(ＥＬＩＳＡ)、免疫組織化学法、蛍光活性化細胞選別法(ＦＡＣＳ)および科学および特許文献に広く記載されている他の常用方法が含まれ、多くは商業的に使用されている。
検出の容易さについて特に好ましいのは、サンドイッチＥＬＩＳＡであり、それには若干の変形が存在するが、それらも全て本発明に包含されるものとする。例えば、典型的フォワード検定法では、非標識抗体を固体サブストレートに固定し、適切なインキュベーション期間後、抗体−抗原二元複合体を形成させるのに十分な期間、試験すべき試料を結合分子と接触させる。次にこの時点で、検出可能シグナルを誘導し得るリポーター分子で標識した第２抗体を加え、抗体−抗原−標識抗体の三元複合体を形成させるのに十分な時間インキュベーションする。未反応物質があれば洗い流し、そして抗原の存在をシグナルの観察により測定するか、または既知量の抗原を含有する対照試料と比較することにより定量し得る。フォワード検定法に対する変形には、試料および抗体の両方を同時に結合抗体に加える同時検定法、または標識抗体および試験すべき試料をまず合わせ、インキュベーションし、非標識表面結合抗体に加える逆検定法がある。これらの技術は当業者にはよく知られており、些細な変形の可能性については容易に理解できるはずである。本明細書で使用されている「サンドイッチ検定法」は、基本的２サイト技術に対する変形を全て包含するものとする。本発明のイムノアッセイの場合、唯一の制限因子は、標識抗体が興味の対象である遺伝子により発現されるタンパク質に特異的な抗体でなくてはならないことである。
このタイプの検定法において最も一般的に使用されるリポーター分子は、酵素、発蛍光団−または放射性核種−含有分子である。酵素イムノアッセイの場合、通常グルタルアルデヒドまたは過ヨウ素酸手段により、酵素を第２抗体にコンジュゲートする。しかしながら、容易に認められるように、広く多様な異なるライゲーション技術が存在し、当業者にはよく知られている。常用される酵素には、特に西洋ワサビペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼおよびアルカリ性ホスファターゼがある。特異酵素と共に使用される基質は、一般的に、対応する酵素による加水分解時に検出可能な色の変化を生じるように選択される。例えば、ｐ−ニトロフェニルホスフェートは、アルカリ性ホスファターゼコンジュゲートとの使用に適切であり、ペルオキシダーゼコンジュゲートの場合、１,２−フェニレンジアミンまたはトルイジンが常用される。また、蛍光基質を使用することも可能であり、上記色素原基質以外の蛍光生成物が生成される。次いで、適切な基質を含む溶液を三元複合体に加える。基質は第２抗体に結合された酵素と反応して定性的可視シグナルを生じ、さらに通常は分光測光法でこれを定量することにより、血清試料中に存在するタンパク質量の評価が与えられ得る。
別法として、蛍光化合物、例えばフルオレセインおよびローダミンは、それらの結合能を変えることなく抗体へ化学的にカップリングされ得る。特定波長の光線での照明により活性化されると、蛍光色素標識抗体は光エネルギーを吸収し、分子において被刺激状態を誘導した後、特有のさらに長い波長の光を放出する。この放射は、光学顕微鏡で視覚的に検出され得る特有の色として現れる。免疫蛍光およびＥＩＡ技術は両方とも当業界では十分に確立されており、本方法には特に好ましい。しかしながら、他のリポーター分子、例えば放射性同位元素、化学発光または生物発光分子もまた使用され得る。当業者にとって要求される用途に適合するよう手順を如何に変えるべきかは容易に理解できることである。
また翻訳状態の測定は、幾つかの追加的方法にしたがって遂行され得る。例えば、タンパク質の全ゲノムモニタリング(すなわち、「プロテオーム」、Goffeau et al., 前出)は、結合部位が細胞ゲノムによりコード化される複数のタンパク質種に特異的である固定された、好ましくはモノクローナルの抗体を含むマイクロアレイを構築することにより実施され得る。好ましくは、抗体は、コード化タンパク質の実質的フラクションについて、または少なくとも興味の対象である生物学的ネットワークモデルの試験または確認に関連性のあるタンパク質について存在する。モノクローナル抗体の製造方法は公知である(例えば、HarlowおよびLane、“Antibodies: A Laboratory Manual”、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク(１９８８)参照、出典明示で援用する)。好ましい一実施態様では、モノクローナル抗体を、細胞のゲノム配列に基いて設計された合成ペプチドフラグメントに対して産生させる。かかる抗体アレイにより、細胞からのタンパク質をアレイに接触させ、当業界公知の検定法でそれらの結合状態を検定する。
別法として、タンパク質は、二次元ゲル電気泳動システムにより分離され得る。二次元ゲル電気泳動は当業界では公知であり、典型的には第１次元に沿って等電点電気泳動、次いで第２次元に沿ってＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を行う(例えば、Hames et al.,“Gel Electrophoresis of Proteins: A Practical Approach”、ＩＲＬプレス、ニューヨーク(１９９０)；Shevchenko et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第９３巻、１４４０−１４４５頁(１９９６)；Sagliocco et al.、Yeast、第１２巻、１５１９−１５３３頁(１９９６)；Lander、Science、第２７４巻、５３６−５３９頁(１９９６)参照)。その結果得られた電気泳動図は、質量分析技術、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体を用いるウエスタンブロッティングおよび免疫ブロット分析、および内部およびＮ−末端ミクロシークエンシングを含む多様な技術により分析され得る。これらの技術を用いると、薬剤に暴露された細胞(例、酵母)、または例えば特異的遺伝子の欠失または過剰発現により修飾された細胞における場合を含む、所定の生理学的条件下で製造された全タンパク質の実質的フラクションを同定することが可能である。
生物学的状態の他の局面に基いた実施態様
ｍＲＮＡ存在量以外の細胞成分のモニタリングは、現時点ではｍＲＮＡのモニタリングでは遭遇しないある種の技術的困難を提示するが、この発明方法の使用により細胞機能の特性検定に関連性のあるタンパク質の活性が測定され得、この発明の実施態様は上記測定結果に基づき得ることは当業者にとって明白なことである。活性測定は、特性検定されている特定活性に適切な機能的、生化学的または物理的手段により遂行され得る。活性が化学的変換を伴う場合、細胞タンパク質を天然基質と接触させ、変換速度を測定し得る。活性が多量体ユニットにおける会合、例えばＤＮＡとの活性化ＤＮＡ結合複合体の会合を伴う場合、会合したタンパク質の量または会合の二次的結果、例えば転写されたｍＲＮＡの量が測定され得る。また、例えば細胞周期制御の場合のように、機能的活性のみが既知である場合、機能の達成能が観察され得る。しかしながら、既知および測定された、タンパク質活性の変化は、前述の本発明方法により分析された応答データを形成する。
代替的および非限定的実施態様において、応答データは、細胞の生物学的状態の混合局面により形成され得る。応答データは、例えばある種のｍＲＮＡ存在量の変化、ある種のタンパク質存在量の変化およびある種のタンパク質活性の変化から構築され得る。
コンピューター実装
好ましい実施態様では、前方法のコンピューター操作段階を、一コンピューターシステムまたは一つまたはそれ以上のネットワーク化コンピューターシステムで実装することにより、生物学的系モデルの形成および試験について強力で好都合な設備が提供され得る。コンピューターシステムは、内部構成要素を含み、外部構成要素に連結されている単一ハードウェアプラットホームであり得る。このコンピューターシステムの内部構成要素は、主メモリーと相互連結されたプロセッサーエレメントを含む。例えば、コンピューターシステムは、クロック周波数が２００Ｍｈｚまたはそれより大きく、主メモリーが３２ＭＢまたはそれより大きい、インテル社のＰｅｎｔｉｕｍ（登録商標）に基いた処理装置であり得る。
外部構成要素は、大量データ記憶装置を含む。この大量データ記憶装置は、一つまたはそれ以上のハードディスクであり得る(典型的にはプロセッサーおよびメモリーと一緒にパッケージされている)。典型的には、上記ハードディスクは、少なくとも１ＧＢのストレージを提供する。他の外部構成要素は、「マウス」または他のグラフィック入力装置であり得る位置指示装置と一緒にモニターおよびキーボードであり得るユーザーインターフェース装置を含む。典型的には、コンピューターシステムはまた、他のローカルコンピューターシステム、リモートコンピューターシステムまたは広域通信ネットワーク、例えばインターネットに接続されている。このネットワークリンクにより、コンピューターシステムは他のコンピューターシステムとデータおよび処理タスクを共有することができる。
このシステムの操作中に、当業界では標準的であり、かつ本発明にとっては特殊である、幾つかのソフトウェア構成要素をメモリーへ読み込ませる。これらのソフトウェア構成要素は、集合的にこの発明方法にしたがってコンピューターシステムを機能させる。典型的には、これらのソフトウェア構成要素を大量記憶装置に入れておく。別法として、ソフトウェア構成要素を、取り外しのきく記録媒体、例えばフロッピー（登録商標）ディスクまたはＣＤ−ＲＯＭ(説明されていない)に入れておく場合もあり得る。ソフトウェア構成要素は、コンピューターシステムおよびそのネットワーク相互連結の管理に関与する基本ソフトを表す。この基本ソフトは、例えばマイクロソフト社のＷｉｎｄｏｗｓ（登録商標）ファミリー、例えばＷｉｎｄｏｗｓ（登録商標）９５、Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）９８またはＷｉｎｄｏｗｓ（登録商標） ＮＴ、またはユニックス基本ソフト、例えばＳｕｎ Ｓｏｌａｒｉｓであり得る。ソフトウェアは、このシステムで好都合に存在する共通原語および機能を含むもので、この発明に特異的な方法を実施するプログラムを支援する。この発明の分析方法をプログラムするのに使用され得る言語には、Ｃ、Ｃ＋＋、またはそれほど好ましくはないがＪＡＶＡ（登録商標）がある。最も好ましくは、この発明方法は、数学的ソフトウェアパッケージでプログラム化されているため、方程式の記号入力および高レベルの処理仕様を可能にし、使用すべきアルゴリズムを含むことにより、ユーザーは個々の方程式またはアルゴリズムを手順的にプログラムにする必要性から解放される。上記パッケージには、例えばマスワークス(ナティック、マサチューセッツ)からのＭＡＴＬＡＢ(登録商標)、ウォルフラム・リサーチ(シャンペイン、イリノイ)からのＭＡＴＨＥＭＡＴＩＣＡ(登録商標)、およびマスソフト(ケンブリッジ、マサチューセッツ)からのＭＡＴＨＣＡＤ(登録商標)がある。
好ましい実施態様では、分析ソフトウェア構成要素は、実際には互いに相互作用する別々のソフトウェア構成要素を含む。分析ソフトウェアは、システムの操作に必要なデータを全て含むデータベースを表す。上記データには、一般的に、先行実験の結果、ゲノムデータ、実験手順および費用、および他の情報が含まれるが、これらに限定されるとは限らず、当業者にとっては明白なものである。分析ソフトウェアは、本発明分析方法を実行する一つまたはそれ以上のプログラムを含むデータ還元およびコンピューター操作構成要素を含む。分析ソフトウェアはまた、試験ネットワークモデルおよび所望による実験データの制御および入力機能ををコンピューターシステムのユーザーに提供するユーザーインターフェース(ＵＩ)を包含する。ユーザーインターフェースは、システムに対し仮説を特定するドラッグ−アンド−ドロップインターフェースを含み得る。ユーザーインターフェースはまた、大量記憶装置構成要素(例、ハードドライブ)から、取り外しのきく記録媒体(例、フロッピー(登録商標)ディスクまたはＣＤ−ＲＯＭ)から、またはネットワーク(例、構内ネットワーク、または広域通信ネットワーク、例えばインターネット)全体におよぶ現システムと通信する異なるコンピューターシステムからの実験データを読み込ませる手段を含み得る。
この発明はまた、この発明で示されたマーカー、例えばｍＲＮＡまたはタンパク質生成物の少なくとも一つを含むデータベースの製造方法を提供する。例えば、乳癌細胞を同定する遺伝子の標準化された発現量についてのデータ処理システムが編集されるように、ポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列はディジタルストレージ記録媒体に入れられている。データ処理システムは、まず新生物表現型または遺伝子型に属する疑いがある細胞を選別し、次いで細胞からポリヌクレオチドを単離することにより２細胞間における遺伝子発現を分析するのに有用である。単離されたポリヌクレオチドを配列決定する。試料からの配列を、相同性検索技術を用いてデータベースに存在する配列(複数も可)と比較する。試験配列および本発明ポリヌクレオチド間における配列相同性が９０％より大、さらにこのましくは９５％より大、およびさらに好ましくは９７％より大またはそれに等しい場合は、ポリヌクレオチドが上記乳癌細胞から単離されたことの陽性指標となる。
この発明の分析方法を実施するための代替的コンピューターシステムおよび方法は、当業者には明らかなものであり、添付の請求の範囲内に包含されるものとする。特に、添付の請求の範囲は、当業者には容易に理解できるこの発明方法を実施するための代替プログラム構造を包含するものとする。
ｍＲＮＡの存在量または活性の修飾方法
この発明の様々な実施態様において、発現されたｍＲＮＡの存在量または活性を変えるか修飾することにより、臨床的に有利な効果が誘発される。ＲＮＡ存在量および活性の修飾方法は、現時点では４つの種類：リボザイム、アンチセンス類、二本鎖ＲＮＡおよびＲＮＡアプタマーに分類される(Good et al., Gene Therapy、第４巻、４５−５４頁(１９９７))。これらのものへの細胞の制御可能な適用または暴露により、活性または検出可能な遺伝子発現産物、すなわちタンパク質への翻訳を含む、ｍＲＮＡ発現量および活性を含むＲＮＡ存在量の制御可能な撹乱が行われ得る。
リボザイム
リボザイムは、ＤＮＡ制限エンドヌクレアーゼと類似した形で他の一本鎖ＲＮＡを特異的に開裂するＲＮＡ分子である。リボザイムは、ＲＮＡ開裂反応を触媒し得る(Cech, Science、第２３６巻、１５３２−１５３９頁(１９８７)；１９９０年１０月４日公開のＰＣＴ国際公開第ＷＯ９０／１１３６４号；Sarver et al., Science、第２４７巻、１２２２−１２２５頁(１９９０))。ＲＮＡをコード化するヌクレオチド配列を修飾することにより、例えばCech、Amer. Med. Assn.、第２６０巻、３０３０頁(１９８８)に記載されている通り、分子中における特異的ヌクレオチド配列を認識し、それを開裂するようにリボザイムが合成され得る。したがって、特異的配列をもつｍＲＮＡのみが開裂および不活化される。
リボザイムの２つの基本型には、例えばRossie et al.、Pharmac. Ther.、第５０巻、２４５−２５４頁(１９９１)に記載された「ハンマーヘッド」型、および例えばHampel et al.、Nucl. Acids Res.、第１８巻、２９９−３０４頁(１９９９)および米国特許第５２５４６７８号に記載された「ヘアピン」型リボザイムがある。ヘアピンおよびハンマーヘッド型ＲＮＡリボザイムは、特定標的ｍＲＮＡを特異的に開裂するよう設計され得る。高度配列特異的方法で他のＲＮＡ分子を開裂し得、事実上全種のＲＮＡにターゲッティングされ得る、リボザイム活性を有する短いＲＮＡ分子の設計についての規則が確立されている(Haseloff et al.、Nature、第３３４巻、５８５−５９１頁(１９８８)；Koizumi et al.、FEBS Lett.、第２２８巻、２２８−２３０頁(１９８８)；Koizumi et al.、FEBS Lett.、第２３９巻、２８５−２８８頁(１９８８))。
リボザイム方法では、細胞を上記小ＲＮＡリボザイム分子に暴露し、その細胞等における発現を誘導する(GrassiおよびMarini、Annals of Medicine、第２８巻、４９９−５１０頁(１９９６)、Gibson、Cancer and Metastasis Reviews、第１５巻、２８７−２９９頁(１９９６))。開示された遺伝子の少なくとも一つに対応するｍＲＮＡにターゲッティングされたハンマーヘッドおよびヘアピンリボザイムの細胞内発現を利用することにより、遺伝子によりコード化されるタンパク質が阻害され得る。
リボザイムは、リボザイム配列が組込まれたＲＮＡオリゴヌクレオチド形態で細胞に直接送達されるか、または所望のリボザイムＲＮＡをコード化する発現ベクターとして細胞へ導入され得る。リボザイムは、細胞におけるｍＲＮＡの開裂およびそれによるｍＲＮＡ存在量の修飾において触媒的に有効であるのに十分な数で常用の手順によりインビボ発現され得る(Cotten et al.、“Ribozyme Mediated Destruction of RNA In Vivo”、The EMBO J.、第８巻、３８６１−３８６６頁(１９８９)参照)。特に、リボザイムコーディングＤＮＡ配列は、前記規則にしたがって設計され、例えば標準ホスホルアミダイト化学作用により合成されるもので、ｔＲＮＡをコード化する遺伝子のアンチコドンステムおよびループにおける制限酵素部位にライゲーションされ得、次いで当業界における常用方法により興味の対象である細胞へ形質転換され、そこで発現され得る。好ましくは、誘導性プロモーター(例、グルココルチコイドまたはテトラサイクリン応答エレメント)もまた、この構築物に導入されることにより、リボザイム発現は選択的に制御され得る。飽和使用については、高度および構成的活性プロモーターが使用され得る。ｔＤＮＡ遺伝子(すなわち、ｔＲＮＡをコード化する遺伝子)は、サイズが小さく、転写割合が高く、異なる種類の組織でも遍在的に発現されるため、本願において有用である
したがって、リボザイムは、事実上いかなるｍＲＮＡ配列でも開裂するように常用の手順で設計され得、細胞は、常用の手順で上記リボザイム配列についてコーディングするＤＮＡにより形質転換され得、その結果、制御可能で触媒的有効量のリボザイムが発現される。したがって、細胞における事実上いかなる種のＲＮＡの存在量でも修飾または撹乱され得る。
リボザイム配列は、アンチセンスヌクレオチドについて記載した方法と本質的に同様にして修飾され得、例えばリボザイム配列は修飾塩基部分を含み得る。
アンチセンス分子
別の実施態様において、標的ＲＮＡ(好ましくはｍＲＮＡ)種の活性、具体的には、その翻訳速度は、アンチセンス核酸の制御可能な適用により制御可能な形で阻害され得る。高レベルで適用すると、飽和阻害が起こる。本明細書で使用されている「アンチセンス」核酸は、コーディングおよび／または非コーディング領域とのある程度の配列相補性により、標的ＲＮＡの配列特異的(例、非ポリＡ)部分、例えばその翻訳開始領域とハイブリダイズし得る核酸をいう。本発明のアンチセンス核酸は、二本鎖または一本鎖の、ＲＮＡまたはＤＮＡまたはその修飾または誘導体であるオリゴヌクレオチドであり得、制御可能な方法で細胞に直接投与され得るか、または標的ＲＮＡの翻訳を撹乱するのに十分な制御可能量での外因性導入配列の転写により細胞内製造され得る。
好ましくは、アンチセンス核酸は、少なくとも６個のヌクレオチドを有し、好ましくはオリゴヌクレオチド(６〜約２００オリゴヌクレオチドの範囲である)である。具体的な態様では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも１５ヌクレオチド、少なくとも１００ヌクレオチド、または少なくとも２００ヌクレオチドである。オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡまたはキメラ混合物または誘導体または修飾バージョンの一本鎖または二本鎖状であり得る。オリゴヌクレオチドは、塩基部分、糖部分またはリン酸バックボーンが修飾され得る。オリゴヌクレオチドは、他の付随する基、例えばペプチド、または細胞膜を横切る輸送を容易にする作用物質(例、Letsinger et al.、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第８６巻、６５５３−６５５６頁(１９８９)；Lemaitre et al.、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第８４巻、６４８−６５２頁(１９８７)；１９８８年１２月１５日公開のＰＣＴ公開第ＷＯ８８／０９８１０号参照)、ハイブリダイゼーション誘発開裂剤(例えば、Krol et al.、BioTechniques、第６巻、９５８−９７６頁(１９８８)参照)または挿入剤(例、Zon、Pharm. Res.、第５巻、５３９−５４９頁(１９８８)参照)を含み得る。
本発明の好ましい実施態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、好ましくは一本鎖ＤＮＡとして提供される。オリゴヌクレオチドは、当業界で公知の構成成分によりその構造におけるいかなる位置でも修飾され得る。
典型的アンチセンス方法では、オリゴヌクレオチド、遺伝子のコード化ｍＲＮＡに相補的であるＤＮＡまたはＲＮＡの製造が含まれる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、遺伝子のコード化ｍＲＮＡにハイブリダイズし、翻訳を阻止する。所望の遺伝子とのアンチセンスヌクレオチド配列のハイブリダイズ能は、相補性の程度およびアンチセンスヌクレオチド配列の長さにより異なる。典型的には、ハイブリダイズしている核酸の長さが増加するとき、それが含むが、依然として安定した二重らせんまたは三重らせんを形成し得るＲＮＡとの塩基ミスマッチも多くなる。当業者であれば、慣用的手順を用いてハイブリダイズした複合体の融解点を測定することにより、ミスマッチの許容できる度合を決定し得るはずである。
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、好ましくはｍＲＮＡの５'末端、例えばｍＲＮＡ開始部位、すなわちＡＵＧに相補的な領域を含め、そこまでの非翻訳配列に相補的であるように設計される。しかしながら、ｍＲＮＡの３'非翻訳配列に相補的であるオリゴヌクレオチド配列はまた、例えばWagner、Nature、第３７２巻、３３３頁(１９９４)に記載されているように、ｍＲＮＡの翻訳阻害に有効であることが示されている。アンチセンスオリゴヌクレオチドはｍＲＮＡコーディング領域に相補的であるよう設計され得るが、かかるオリゴヌクレオチドは有効性の劣る翻訳阻害剤である。
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、限定されるわけではないが、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−(カルボキシヒドロキシメチル)ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ−Ｄ−ガラクトシルケオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２,２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、ベータ−Ｄ−マンノシルケオシン、５'−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸(ｖ)、ワイブトキソシン、プソイドウラシル、ケオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸(ｖ)、５−メチル−２−チオウラシル、３−(３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル)ウラシル、(ａｃｐ３)ｗおよび２,６−ジアミノプリンを含む群から選択される少なくとも１つの修飾塩基部分を含み得る。
別の実施態様において、オリゴヌクレオチドは、限定されるわけではないが、アラビノース、２−フルオロアラビノース、キシルロースおよびヘキソースを含む群から選択される少なくとも１個の修飾糖部分を含む。
さらに別の実施態様において、オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホルアミドチオエート、ホスホルアミデート、ホスホルジアミデート、メチルホスホネート、アルキルホスホトリエステルおよびホルムアセタールおよびその類似体から成る群から選択される少なくとも１個の修飾リン酸バックボーンを含む。
さらに別の実施態様において、オリゴヌクレオチドは２−ａ−アノマーオリゴヌクレオチドである。ａ−アノマーオリゴヌクレオチドは、相補的ＲＮＡとの特異的二本鎖ハイブリッドを形成し、その場合、通常のＢユニットとは対照的に、鎖は互いに平行にはしる(Gautier et al.、Nucl. Acids Res.、第１５巻、６６２５−６６４１頁(１９８７))。
オリゴヌクレオチドは、別の分子、例えばペプチド、ハイブリダイゼーション誘発架橋剤、輸送剤、ハイブリダイゼーション誘発開裂剤などにコンジュゲートされ得る。
本発明のアンチセンス核酸は、標的ＲＮＡ種の少なくとも一部分に相補的な配列を含む。しかしながら、絶対相補性は、好ましいが、必要とはされない。本明細書でいう「ＲＮＡの少なくとも一部分に相補的な」配列は、ＲＮＡとハイブリダイズできるほどの十分な相補性を有し、安定した二重らせんを形成する配列を意味する。二本鎖アンチセンス核酸の場合、例えば二重らせんＤＮＡの一本鎖が試験され得るか、または三重らせん形成が検定され得る。ハイブリダイズ能力は、相補性の度合およびアンチセンス核酸の長さの両方により異なる。一般的に、ハイブリダイズしている核酸が長いと、それが含むが依然として安定した二重らせん(または場合によっては三重らせん)を形成し得る標的ＲＮＡとの塩基ミスマッチが多くなる。当業者であれば、標準的手順を用いてハイブリダイズした複合体の融解点を測定することによりミスマッチの許容できる度合を確認できるはずである。標的ＲＮＡの翻訳阻害に有効であるアンチセンス核酸の量は、標準的検定技術により測定され得る。
本発明オリゴヌクレオチドは、例えば自動化ＤＮＡ合成装置(例えば、バイオサーチ、アプライド・バイオシステムズなどから市販されているもの)の使用により、当業界で公知の標準方法により合成され得る。例として、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、Stein et al.、Nucl. Acids Res.、第１６巻、３２０９頁(１９８８)の方法により合成され得、メチルホスホネートオリゴヌクレオチドは、制御型有孔ガラスポリマー支持体の使用により製造され得る(Sarin et al.、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第８５巻、７４４８−７４５１頁(１９８８)参照)など。別の実施態様では、オリゴヌクレオチドは、２'−Ｏ−メチルリボヌクレオチド(Inoue et al.、Nucl. Acids Res.、第１５巻、６１３１−６１４８頁(１９８７))、またはキメラＲＮＡ−ＤＮＡ類似体(Inoue et al.、FEBS Lett.、第２１５巻、３２７−３３０頁(１９８７))である。
次いで、合成されたアンチセンスオリゴヌクレオチドは、制御または飽和的方法で細胞に投与され得る。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、それらが細胞により取込まれ得る制御レベルで細胞の成長環境に置かれ得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドの取込みは、当業界で公知の方法の使用により支援される。
宿主細胞に導入されると、アンチセンスヌクレオチド配列は、遺伝子(複数も可)に対応する細胞ｍＲＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡと特異的にハイブリダイズすることによって、例えば細胞内での転写および／または翻訳を阻害することにより、コード化タンパク質の発現を阻害する。
アンチセンスヌクレオチド配列を含む単離核酸分子は、例えば発現ベクターとして送達され得、細胞で転写されると、遺伝子(複数も可)のコード化ｍＲＮＡの少なくとも特有な部分と相補的であるＲＮＡを製造する。別法として、アンチセンスヌクレオチド配列を含む単離核酸分子は、エクスビボで製造され、細胞へ導入されると、遺伝子(複数も可)のｍＲＮＡおよび／またはゲノム配列とハイブリダイズすることによりコード化タンパク質の発現阻害をもたらすオリゴヌクレオチドプローブである。
好ましくは、オリゴヌクレオチドは、人工的ヌクレオチド間連鎖を含むことにより、アンチセンス分子をエキソヌクレアーゼおよびエンドヌクレアーゼに対し耐性にするため、細胞において安定している。アンチセンスヌクレオチド配列として使用される修飾核酸分子の例には、例えば、米国特許第５１７６９９６、５２６４５６４および５２５６７７５号に記載されている通りＤＮＡのホスホルアミデート、ホスホロチオエートおよびメチルホスホネート類似体がある。アンチセンス療法で有用なオリゴマーの一般的製造方法は、例えば、Van der Krol.、BioTechniques、第６巻、９５８−９７６頁(１９８８)およびStein et al.、Cancer Res.、第４８巻、２６５９−２６６８頁(１９８８)に記載されている。
細胞内発現されるアンチセンス分子
上記で検討したところによると、アンチセンスヌクレオチドは、様々な技術、例えばアンチセンスヌクレオチドをリポソームに包み込み、胸部組織部位への直接注入により、細胞表面で発現される受容体または抗原と特異的に結合するペプチドまたは抗体にアンチセンスヌクレオチドを結合させることにより胸部細胞にターゲッティングされる修飾アンチセンスヌクレオチドを投与することにより、報告された遺伝子をインビボ発現する細胞に送達され得る。
しかしながら、上述の送達方法を用いても、内因性ｍＲＮＡの翻訳阻害に十分な細胞内濃度を達成するのは困難であり得る。したがって、別の実施態様において、アンチセンスヌクレオチド配列を含む核酸は、プロモーター、すなわち特異的遺伝子の転写を開始させて発現構築物を形成させるのに必要とされるＤＮＡ配列の転写制御下に置かれる。本発明のアンチセンス核酸は、外因性配列からの転写により制御可能な形で細胞内発現される。発現が高レベルであるように制御される場合、飽和的撹乱または修飾が起こる。例えば、ベクターは、細胞によって取込まれるようにインビボ導入され得、その細胞内でベクターまたはその一部分は転写され、本発明のアンチセンス核酸(ＲＮＡ)を製造する。かかるベクターは、アンチセンス核酸をコード化する配列を含む。かかるベクターは、転写されて所望のアンチセンスＲＮＡを製造し得る限りは、エピソームのままで残るかまたは染色体に組込まれ得る。上記ベクターは、当業界では標準的な組換えＤＮＡ技法により構築され得る。ベクターは、哺乳類細胞での複製および発現に使用される、当業界で公知のプラスミド、ウイルス性のものなどであり得る。アンチセンスＲＮＡをコード化する配列の発現は、興味の対象である細胞で作用するものとして当業界で知られているプロモーターにより行われ得る。上記プロモーターは、誘導性または構成的であり得る。最も好ましくは、プロモーターは、外因性部分の投与により制御可能または誘導可能なものであることにより、アンチセンスオリゴヌクレオチドの発現制御を達成させ得る。上記の制御可能なプロモーターには、Ｔｅｔプロモーターがある。哺乳類細胞に関する他の使用可能なプロモーターには、ＳＶ４０初期プロモーター領域(BernoistおよびChambon、Nature、第２９０巻、３０４−３１０頁(１９８１)参照)、ラウス肉腫ウイルスの３'長末端反復に含まれるプロモーター(Yamamoto et al.、Cell、第２２巻、７８７−７９７頁(１９８０))、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター(Wagner et al.、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第７８巻、１４４１−１４４５頁(１９８１))、メタロチオネイン遺伝子の調節配列(Brinster et al.、Nature、第２９６巻、３９−４２頁(１９８２))などがあるが、これらに限定されるわけではない。
したがって、アンチセンス核酸は、事実上いかなるｍＲＮＡ配列でもターゲッティングするように常用手順で設計され得、そして細胞は、上記アンチセンス配列についてコーディングする核酸により常用手順で形質転換または暴露され得、その結果、有効で制御可能または飽和量のアンチセンス核酸が発現される。したがって、細胞における事実上いかなるＲＮＡ種でもその翻訳は修飾または撹乱され得る。
二本鎖ＲＮＡ
また、開示された遺伝子の少なくとも一つに対応する、二本鎖ＲＮＡ、すなわちセンス−アンチセンスＲＮＡを用いることにより、開示された遺伝子の少なくとも一つの発現が妨害され得る。二本鎖ＲＮＡによる内因性遺伝子の機能および発現に対する妨害は、例えば、Fire et al.、Nature、第３９１巻、８０６−８１１頁(１９９８)に記載されている通り様々な生物体、例えばシー・エレガンス(C.elegans)で示されている。
ＲＮＡアプタマー
最後に、さらに別の実施態様において、ＲＮＡアプタマーは、細胞へ導入または細胞で発現され得る。ＲＮＡアプタマーは、翻訳を特異的に阻害し得るタンパク質、例えばＴａｔおよびＲｅｖ ＲＮＡ(Good et al.、Gene Therapy、第４巻、４５−５４頁(１９９７))についての特異的ＲＮＡリガンドである。
発現されたタンパク質の存在量または活性の修飾方法
タンパク質存在量の修飾方法には、特に、タンパク質分解速度を変える方法および抗体(天然標的タンパク質種の存在量または活性に影響するタンパク質に結合する)を用いる方法がある。タンパク質活性の直接的修飾方法には、特に、抗体、優性抑制変異、特異的薬剤または化学的部分の使用がある。
タンパク質種の分解速度を高める(または減じる)と、その種の存在量は減少(または増加)する。当業界では公知である、温度上昇および／または特定薬剤への暴露に応じて標的タンパク質の分解速度を高める方法が、この発明では使用され得る。例えば、上記の一方法は熱誘導性または薬剤誘導性Ｎ−末端デグロン(degron)を使用するもので、これは、高温(例、３７℃)で急速なタンパク質分解を促進する分解シグナルを顕示するＮ−末端タンパク質フラグメントであり、隠されると低温(例、２３℃)での急速な分解が阻止される(Dohmen et al.、Science、第２６３巻、１２７３−１２７６頁(１９９４)参照)。上記デグロンの一例は、Ａｒｇ−ＤＨＦＲｔｓ、すなわちＮ−末端ＶａｌがＡｒｇにより置換され、６６位のＰｒｏがＬｅｕにより置換されているネズミジヒドロ葉酸レダクターゼの変異体である。この方法によると、例えば、標的タンパク質についての遺伝子、Ｐが、当業界で公知の標準遺伝子ターゲッティング方法(Lodish et al.、“Molecular Biology of the Cell”、W.H.Freeman・アンド・カンパニー、ニューヨーク(１９９５)、特に８章)により融合タンパク質Ｕｂ−Ａｒｇ−ＤＨＦＲｔｓ−Ｐ(「Ｕｂ」はユビキチンを表す)をコーディングする遺伝子と置き換えられる。Ｎ−末端ユビキチンは、翻訳後急速に開裂されてＮ−末端デグロンを露出する。低温では、Ａｒｇ−ＤＨＦＲｔｓに対し内部のリシンは露出されず、融合タンパク質のユビキチン化は起こらず、分解は緩慢であり、そして活性標的タンパク質レベルは高い。高温では(メトトレキセートの非存在下)、Ａｒｇ−ＤＨＦＲｔｓ−に対し内部のリシンは露出され、融合タンパク質のユビキチン化が起こり、分解は急速であり、そして活性標的タンパク質レベルは低い。
分解の熱活性化は露出メトトレキセートにより制御可能な形で遮断されるため、この技術はまた分解速度の制御可能な修飾を可能にする。この方法は、他の誘導性因子、例えば薬剤および温度変化に応答する他のＮ−末端デグロンに適合され得る。また、当業者であれば、標的タンパク質に結合し、阻害する抗体の発現が別の主要な負の戦略として使用され得ることは理解できるはずである。
小分子薬剤またはリガンドによる発現されたタンパク質活性の修飾
さらに、ある種の標的タンパク質の活性は、内因性薬剤またはリガンドへの露出により制御または飽和的方法で修飾または撹乱され得る。この発明方法は癌を処置するための様々な薬剤の有用性を試験または確認するのに適用されることが多いため、薬剤露出は、細胞成分、ｍＲＮＡおよび発現されたタンパク質の両方の重要な修飾／撹乱方法である。好ましい実施態様では、インプット細胞成分を薬剤暴露または遺伝子操作(例えば遺伝子欠失またはノックアウト)により撹乱させ、遺伝子発現技術(例えば、遺伝子転写物アレイへのハイブリダイゼーション、以下に記載)によりシステム応答を測定する。
好ましい場合、細胞における唯一の標的タンパク質と相互作用し、その唯一の標的タンパク質の活性を変化、活性を増加または減少させる薬剤が知られている。その薬剤の様々な量に細胞を段階的暴露することにより、インプットとしてその標的タンパク質を有するネットワークモデルの段階的撹乱が誘発される。飽和的暴露により、飽和的修飾／撹乱が誘発される。例えば、シクロスポリンＡは、シクロフィリンとの複合体を介して作用する、カルシニューリンタンパク質の非常に特異的な調節剤である。したがって、シクロスポリンＡの一連の滴定を用いることにより、所望のカルシニューリンタンパク質阻害量が生成され得る。別法として、シクロスポリンＡへの飽和的暴露は、カルシニューリンタンパク質を最大限に阻害する。
抗体およびアンタゴニストによるタンパク質活性の修飾
「アンタゴニスト」の語は、遺伝子によりコード化されたタンパク質に結合したとき、その活性を阻害する分子をいう。アンタゴニストには、ペプチド、タンパク質、炭水化物および小分子が含まれ得るが、これらに限定されるわけではない。
特に有用な実施態様では、アンタゴニストは、少なくとも１個の遺伝子により発現される細胞表面タンパク質に特異的な抗体である。治療薬として有用な抗体は、上記抗体を包含する。抗体は単独で治療のエフェクターとして作用し得るか、またはそれは他の細胞を起用して実際に細胞を殺させる。抗体はまた、試薬、例えば化学療法剤、放射性核種、リシンＡ鎖、コレラ毒素、百日咳毒素等にコンジュゲートされ、標的薬剤としての機能を果たし得る。別法として、エフェクターは、腫瘍標的と直接的または間接的に相互作用する表面分子をもつリンパ球であり得る。様々なエフェクター細胞には、細胞傷害性Ｔ細胞およびＮＫ細胞が含まれる。
治療で使用され得る抗体−治療剤コンジュゲートの例には、以下のものがあるが、限定するわけではない：
１)放射性核種、例えば125Ｉ、131Ｉ、123Ｉ、111Ｉｎ、105Ｒｈ、153Ｓｍ、67Ｃｕ、67Ｇａ、166Ｈｏ'、177Ｌｕ、186Ｒｅおよび188Ｒｅにカップリングされた抗体、例えば、Goldenberg et al.、Cancer Res.、第４１巻、４３５４−４３６０頁(１９８１)；Carrasquillo et al.、Cancer Treat. Rep.、第６８巻、３１７−３２８頁(１９８４)；Zalcberg et al.、J. Natl. Cancer Inst.、第７２巻、６９７−７０４頁(１９８４)；Jones et al.、Int. J. Cancer、第３５巻、７１５−７２０頁(１９８５)；Lange et al.、Surgery、第９８巻、１４３−１５０頁(１９８５)；Kaltovich et al.、J. Nucl. Med.、第２７巻、８９７頁(１９８６)；Order et al.、Int. J. Radiother. Oncol. Biol. Phys.、第８巻、２５９−２６１頁(１９８２)；Courtenay-Luck et al.、Lancet、第１巻、１４４１−１４４３頁(１９８４)；およびEttinger et al.、Cancer Treat. Rep.、第６６巻、２８９−２９７頁(１９８２)に記載；
２)薬剤または生物学的応答変更因子、例えばメトトレキセート、アドリアマイシンおよびリンホカイン類、例えばインターフェロンにカップリングされた抗体、例えば、Chabner et al.、“Cancer, Principles and Practice of Oncology”、J. B. Lippincott カンパニー、フィラデルフィア、ペンシルベニア、第１巻、２９０−３２８頁(１９８５)；Oldham et al.、“Principles and Practice of Oncology”、Cancer、J. B. Lippincott カンパニー、フィラデルフィア、ペンシルベニア、第２巻、２２２３−２２４５頁(１９８５)；Deguchi et al.、Cancer Res.、第４６巻、４３７５１−４３７５５頁(１９８６)；Deguchi et al.、Fed. Proc.、第４４巻、１６８４頁(１９８５)；Embleton et al.、Br. J. Cancer、第４９巻、５５９−５６５頁(１９８４)；およびPimm et al.、Cancer Immunol. Immunother.、第１２巻、１２５−１３４頁(１９８２)に記載；
３)毒素にコンジュゲートされた抗体、例えば、Uhr et al.、“Monoclonal Antibodies and Cancer”、アカデミック・プレス、インコーポレイテッド、８５−９８頁(１９８３)；Vitetta et al.、“Biotechnology and Bio. Frontiers”、P. H. Abelson編、７３−８５頁(１９８４)；およびVitetta et al.、Science、第２１９巻、６４４−６５０頁(１９８３)に記載；
４)ヘテロ機能性抗体、例えば、複合体が癌腫およびエフェクター細胞、例えばキラー細胞、例えばＴ細胞の両方に結合するように別の抗体とカップリングまたは組み合わされた抗体、例えば、Perez et al.、J. Exp. Med.、第１６３巻、１６６−１７８頁(１９８６)、およびLau et al.、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第８２巻、８６４８−８６５２頁(１９８５)に記載；および
５)天然、すなわち非コンジュゲートまたは非複合体形成の抗体、例えば、Herlyn et al.、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第７９巻、４７６１−４７６５頁(１９８２)；Schulz et al.、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第８０巻、５４０７−５４１１頁(１９８３)；Capone et al.、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第８０巻、７３２８−７３３２頁(１９８３)；Sears et al.、Cancer Res.、第４５巻、５９１０−５９１３頁(１９８５)；Nepom et al.、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第８１巻、２８６４−２８６７頁(１９８４)；Koprowski et al.、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第８１巻、２１６−２１９頁(１９８４)；およびHoughton et al.、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第８２巻、１２４２−１２４６頁(１９８５)に記載。
上記のように抗体またはそのフラグメントを治療剤にカップリングさせる方法は、当業界ではよく知られており、例えば上記参考文献で提供されている方法で報告されている。
治療剤としてのアンタゴニストの使用
さらに別の実施態様において、乳癌処置用治療剤として有用なアンタゴニストは、開示された遺伝子の一つによりコード化されるタンパク質の阻害剤であり得る。例えば、膜結合セリンプロテアーゼヘプシンの活性は、特異的セリンプロテアーゼ阻害剤を用いることにより阻害され得、次にこれは、最小の全身毒性で悪性胸部細胞の増大を遮断する。上記セリン−プロテアーゼ阻害剤は当業界ではよく知られている。例えば、アロチニンは、心肺バイパスにおける血液喪失および輸血の必要性を低減化することが立証されているセリンプロテアーゼ阻害剤であり、カリクレインおよびプラスミンを阻害することにより、炎症応答に関与する多重系統を抑制する(Ann. Thorac. Surg.、第７１巻、第２号、７４５−７５４頁(２００１)参照)。
マスピン(哺乳類セルピン)は、乳癌における腫瘍抑制機能をもつセルピンファミリーに関連した新規セリンプロテアーゼ阻害剤である(Acta. Oncol.、第３９巻、第８号、９３１−９３４頁(２０００)参照)。
小さく、強力で、選択的な非共有結合阻害剤が開発されたセリンプロテアーゼは、トロンビンおよび因子Ｘａ(ｆＸａ)のみであり、これらは最終的に薬剤開発候補として(この場合抗凝血薬として)意図されている(Med. Res. Rev.、第１９巻、第２号、１７９−１９７頁(１９９９)参照)。
標的タンパク質活性はまた、(中和性)抗体により減じられ得る。上記抗体に制御または飽和的暴露させることにより、タンパク質存在量／活性は制御または飽和的方法で修飾または撹乱(perturbation)され得る。例えば、タンパク質表面上の適切なエピトープに対する抗体は、野生型非凝集野生型形態の場合と比べて活性が低いかまたは最小である複合体へ活性形態を凝集させることにより標的タンパク質の野生型活性形態の存在量を減少させ、それによって、その活性を間接的に減少させ得る。別法として、抗体は、例えば活性部位と直接相互作用するかまたは活性部位への基質の接近を遮断することにより、直接タンパク質活性を減少させ得る。逆に、場合によっては、(活性化)抗体はまた、タンパク質およびそれらの活性部位と相互作用することにより結果的に活性を増加させ得る。いずれの場合にしても、(報告されている様々な型の)抗体を、(報告されている方法により)特異的タンパク質種に対して産生させ、それらの効果がスクリーニングされ得る。抗体の効果を検定することにより、標的タンパク質種濃度および／または活性を上昇または低下させる適切な抗体が選択され得る。上記検定法では、抗体を細胞へ導入し(下記参照)、そして当業界で公知の標準的手段(例えばイムノアッセイ)により野生型量または活性の標的タンパク質の濃度を検定する。野生型形態の正味の活性は、標的タンパク質の既知活性に適切な検定手段により検定され得る。
細胞への抗体の導入
抗体は、例えば、細胞への抗体の顕微注入(Morgan et al.、Immunology Today、第９巻、８４−８６頁(１９８８)参照)または細胞への所望の抗体をコード化するハイブリドーマｍＲＮＡの形質転換(Burke et al.、Cell、第３６巻、８４７−８５８頁(１９８４)参照)を含む多数の方法で細胞へ導入され得る。さらに別の技術では、組換え抗体を遺伝子工学技術で作製し、広く多様な非リンパ様細胞型で異所性発現させることにより、標的タンパク質と結合させ、標的タンパク質活性を遮断させ得る(Biocca et al.、Trends in Cell Biology、第５巻、２４８−２５２頁(１９９５))。抗体の発現は、好ましくは制御可能なプロモーター、例えばＴｅｔプロモーター、または構成的活性プロモーター(飽和的撹乱を発生させる場合)の制御下で行なわれる。第一段階は、標的タンパク質に対し適切な特異性をもつ特定モノクローナル抗体の選択である(下記参照)。次いで、選択された抗体の可変域をコード化する配列を、様々な遺伝子工学的抗体フォーマット、例えば全抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆｖフラグメント、一本鎖Ｆｖフラグメント(ペプチドリンカーにより結合されたＶＨおよびＶＬ領域)(「ＳｃＦｖ」フラグメント)、二重特異性抗体(特異性が異なる２つの会合したＳｃＦｖフラグメント)などへクローン化し得る(Hayden et al.、Current Opinion in Immunology、第９巻、２１０−２１２頁(１９９７))。様々なフォーマットの細胞内発現抗体は、様々な既知細胞内先導配列との融合体としてそれらを発現させることにより細胞区画(例、細胞質、核、ミトコンドリアなど)へターゲッティングされ得る(Bradbury et al.、Antibody Engineering、第２巻、Borrebaeck編、２９５−３６１頁、ＩＲＬプレス(１９９５))。特に、ＳｃＦｖフォーマットは、細胞質ターゲッティングに特に適切であると思われる。
有用な抗体型の多様性
抗体型には、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、一本鎖、ＦａｂフラグメントおよびＦａｂ発現ライブラリーがあるが、これらに限定されるわけではない。標的タンパク質に対するポリクローナル抗体の製造については当業界公知の様々な手順が使用され得る。抗体の製造については、様々な宿主動物が標的タンパク質の注射により免疫化され得、上記宿主動物としてはウサギ、マウス、ラットなどがあるが、これらに限定はされない。宿主の種によって、免疫学的応答を増加させるのに様々なアジュバントが使用され得、例えばフロイント(完全および不完全)、無機ゲル、例えば水酸化アルミニウム、表面活性物質、例えばリソレシチン、プルロニックポリオール類、ポリアニオン、ペプチド、油エマルジョン、ジニトロフェノールおよび潜在的に有用なヒトアジュバント、例えばバシラス・カルメッテ−グエリン(ＢＣＧ)およびコリネバクテリウム・パルブム(corynebacterium parvum)が含まれるが、これらに限定はされない。
モノクローナル抗体
標的タンパク質に指向したモノクローナル抗体の製造については、培養中の連続セルラインによる抗体分子の製造をもたらすものであればいかなる技術でも使用され得る。上記技術には、KohlerおよびMilstein（Nature、第２５６巻、４９５−４９７頁(１９７５))によりもともと開発されたハイブリドーマ技術、トリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術(Kozbor et al.、Immunology Today、第４巻、７２頁(１９８３)参照)およびヒトモノクローナル抗体を製造するためのＥＢＶハイブリドーマ技術(Cole et al.、“Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy”、Alan R.Liss，Inc.、７７−９６頁(１９８５))があるが、限定されるわけではない。本発明の追加的実施態様において、モノクローナル抗体は、最新技術(ＰＣＴ／ＵＳ９０／０２５４５)を用いることにより無菌動物で製造され得る。本発明によると、使用され得るヒト抗体は、ヒトハイブリドーマを用いることにより(Cote et al.、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第８０巻、２０２６−２０３０頁(１９８３)参照)、またはＥＢＶウイルスでヒトＢ細胞をインビトロ形質転換することにより(Cole et al.、“Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy”、Alan R.Liss,Inc.、７７−９６頁(１９８５)参照)得られる。事実、本発明によると、適切な生物学的活性を有するヒト抗体分子からの遺伝子と一緒に標的タンパク質に特異的なマウス抗体分子からの遺伝子をスプライシングすることによる「キメラ抗体」の製造用に開発された技術(Morrison et al.、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第８１巻、６８５１−６８５５頁(１９８４)；Neuberger et al.、Nature、第３１２巻、６０４−６０８頁(１９８４)；Takeda et al.、Nature、第３１４巻、４５２−４５４頁(１９８５)参照)が使用され得る。上記抗体はこの発明の範囲内に含まれる。
さらに、モノクローナル抗体が有利な場合、それらは、別報としてファージディスプレー技術を用いて大型抗体ライブラリーから選択され得る(Marks et al.、J.Biol.Chem.、第２６７巻、１６００７−１６０１０頁(１９９２)参照)。この技術を用いることにより、１０12以下の異なる抗体のライブラリーが、ｆｄ繊維状ファージの表面で発現され、モノクローナル抗体の選択に利用可能な抗体の「単一ポット」インビトロ免疫系が作製されている(Griffiths et al.、EMBO J.、第１３巻、３２４５−３２６０頁(１９９４)参照)。上記ライブラリーからの抗体の選択は、ファージを固定化した標的タンパク質に接触させ、標的に結合したファージを選択およびクローニングし、そして抗体可変域をコード化する配列を、所望の抗体フォーマットを発現する適切なベクターへサブクローニングすることを含む、当業界で公知の技術により行われ得る。
本発明によると、一本鎖抗体の製造について報告された技術(米国特許第４９４６７７８号)を適合させることにより、標的タンパク質に特異的な一本鎖抗体が製造され得る。本発明の追加的実施態様は、Ｆａｂ発現ライブラリーの構築について報告された技術(Huse et al.、Science、第２４６巻、１２７５−１２８１頁(１９８９)参照)を利用することにより、標的タンパク質についての所望の特異性をもつモノクローナルＦａｂフラグメントの迅速で容易な同定を可能にしている。
標的タンパク質のイディオタイプを含む抗体フラグメントは、当業界で公知の技術により作製され得る。例えば、上記フラグメントには、抗体分子のペプシン消化により製造され得るＦ(ａｂ')２フラグメント；Ｆ(ａｂ')２フラグメントのジスルフィド架橋を還元することにより生成され得るＦａｂ'フラグメント、抗体分子をパパインおよび還元剤で処理することにより生成され得るＦａｂフラグメント、およびＦｖフラグメントがあるが、これらに限定はされない。
抗体の製造において、所望の抗体についてのスクリーニングは、当業界で公知の技術、例えばＥＬＩＳＡにより達成され得る。標的タンパク質に特異的な抗体を選択するため、生成されたハイブリドーマまたは標的タンパク質に結合する抗体についてのファージディスプレー抗体ライブラリーが検定され得る。
他のタンパク質活性修飾方法
優性抑制変異は、細胞で発現されると、ターゲッティングされたタンパク質種の活性を破壊する、内在性遺伝子または突然変異体外在性遺伝子に対する突然変異である。ターゲッティングされたタンパク質の構造および活性により、その標的の活性を破壊する優性抑制変異の構築に適切な戦略の選択を導く一般的規則が存在する(Hershkowitz、Nature、第３２９巻、２１９−２２２頁(１９８７)参照)。活性モノマー形態の場合、不活性形態の過剰発現により、標的タンパク質の正味の活性を著しく低減化させるのに十分な天然基質またはリガンドについての競争が誘発され得る。かかる過剰発現は、例えば、突然変異体遺伝子と増加活性のプロモーター、好ましくは制御可能または誘導可能なプロモーター、または構成的に発現されるプロモーターを会合させることにより達成され得る。別法として、事実上不可逆的会合が標的リガンドとの間で行なわれるように活性部位残基に対する変化が加えられ得る。上記変化は活性部位セリン残基を注意深く置換することによってある種のチロシンキナーゼにより達成され得る(Permutter et al.、Current Opinion in Immunology、第８巻、２８５−２９０頁(１９９６)参照)。
活性多量体形態の場合、幾つかの戦略により優性抑制変異体の選択が誘導され得る。多量体活性は、多量体会合ドメインに結合し、多量体形成を阻止する内在性タンパク質フラグメントをコーディングする遺伝子の発現により制御型または飽和的方法で減少され得る。別法として、特定タイプに属する不活性タンパク質ユニットの制御可能または飽和的過剰発現は、不活性多量体において野生型活性ユニットを拘束することにより、多量体活性を減少させ得る(Nocka et al.、EMBO J.、第９巻、１８０５−１８１３頁(１９９０)参照)。例えば、二量体ＤＮＡ結合タンパク質の場合、ＤＮＡ結合ドメインはＤＮＡ結合ユニットから欠失され得るか、または活性化ドメインは活性化ユニットから欠失され得る。また、この場合、ＤＮＡ結合ドメインユニットは、活性化ユニットとの会合を誘発するドメインを伴わずに発現され得る。それによって、ＤＮＡ結合部位は、発現活性化の可能性を全く伴わずに拘束される。通常、特定型のユニットが活性状態中に立体配座の変化を被る場合、堅固なユニットの発現により生成した複合体は不活化され得る。さらに別の例の場合、細胞機構、例えば細胞運動性、有糸分裂プロセス、細胞構造などに関与するタンパク質は、典型的には数タイプに属する多くのサブユニットの会合により構成される。これらの構造は、構造的欠陥を伴う数個のモノマーユニットの封入により崩壊に対し高い感受性を示すことが多い。上記突然変異体モノマーは、関連性のあるタンパク質活性を破壊し、制御または飽和的方法で細胞において発現され得る。
優性抑制変異に加えて、温度(または他の外因性因子)に感受性を示す突然変異体標的タンパク質は、当業界ではよく知られている突然変異誘発およびスクリーニング手順により見出され得る。
処置様式
アンチセンスヌクレオチドによる処置の場合、本方法は、表１、２、３または４に示されている少なくとも一遺伝子から誘導されたアンチセンスヌクレオチド配列を含む単離核酸分子の治療有効量を投与することを含み、その場合、アンチセンスヌクレオチドは、少なくとも一遺伝子の転写／翻訳を変える能力を有するものとする。「単離」核酸分子の語は、核酸分子が、そのもともとの環境(例、それが天然に存する場合、自然環境)から離されていることを意味する。例えば天然に存する核酸分子は単離されていないが、同じ核酸分子でも、自然系で共存する物質のある程度の部分または全部から離されていると、たとえその後自然系へ再導入されるとしても単離されていることになる。上記核酸分子は、ベクターの一部または組成物の一部であり得、上記ベクターまたは組成物がその自然環境の一部ではないという点で、やはり単離されていることになり得る。
リボザイムまたは二本鎖ＲＮＡ分子による処置に関して述べると、本方法は、リボザイムまたは二本鎖ＲＮＡ分子をコード化するヌクレオチド配列の治療有効量を投与することを含み、この場合リボザイム／二本鎖ＲＮＡ分子をコード化するヌクレオチド配列は、少なくとも一遺伝子の転写／翻訳を変える能力を有するものとする。
アンタゴニストによる処置の場合、本方法は、対象に、表１、２、３または４に示されている少なくとも一遺伝子によりコード化されるタンパク質を阻害または活性化するアンタゴニストの治療有効量を投与することを含む。
アンチセンスヌクレオチドを含む単離核酸分子、リボザイム、二本鎖ＲＮＡをコード化するヌクレオチド配列、またはアンタゴニストの「治療有効量」とは、乳癌を処置する(例、胸部腫瘍増大を制限するかまたは腫瘍転移を遅延または遮断する)のに十分なこれら治療剤のうちの一つの量をいう。治療有効量の決定は、当業者でできる範囲に十分含まれる。いずれの治療についても、治療有効量は、例えば新生物細胞の細胞培養検定法、または動物モデル、通常はマウス、ウサギ、イヌまたはブタで最初に評価され得る。動物モデルはまた、適切な濃度範囲および投与経路を決定するのに使用され得る。次いで、上記情報を用いることにより、ヒトでの投与に有用な用量および経路が決定され得る。
治療効力および毒性は、細胞培養物または実験動物における標準的医薬手順により測定され得、例えばＥＤ50(集団の５０％における治療有効量)およびＬＤ50(集団の５０％に対する致死量)で示される。毒性および治療効果間の用量比が治療指数であり、それはＬＤ50／ＥＤ50比として表され得る。大きな治療指数を呈するアンチセンスヌクレオチド、リボザイム、二本鎖ＲＮＡおよびアンタゴニストが好ましい。細胞培養検定法および動物試験から得られたデータは、ヒト使用についての用量範囲を処方するのに使用される。上記組成物に含まれる用量は、好ましくは毒性をほとんどまたは全く伴わないＥＤ50を含む循環濃度の範囲内である。用量は、使用される用量形態、患者の感受性および投与経路により、この範囲内で変化する。
正確な用量は、処置を必要とする対象に関する因子に照らし合わせて、実際の担当医により決定される。用量および投与を調節することにより、十分なレベルの活性部分を提供するかまたは所望の効果を維持する。考慮され得る因子には、病状の重さ、対象の全般的健康状態、対象の年齢、体重および性別、食餌療法、投与時間および頻度、薬剤組み合わせ(複数も可)、反応感受性、および治療に対する寛容性／応答がある。
通常の用量は、投与経路によって、総用量約１ｇ以下として、０.１〜１０００００マイクログラムの範囲で変化し得る。特定用量および送達方法に関する手引きは、文献に提供されており、一般的に現場の当業者にとって入手可能なものである。当業者であれば、アンタゴニストよりもヌクレオチドについての種々の製剤を使用するはずである。
治療適用については、アンチセンスヌクレオチド、リボザイム、二本鎖ＲＮＡをコード化するヌクレオチド配列(リポソームに包括またはウイルスベクターに含まれている)および抗体を、好ましくは１種またはそれ以上の医薬上許容される担体と組合わせて治療剤を含む医薬組成物として投与する。組成物は、単独または少なくとも１種の他の薬剤、例えば安定性化合物と組合わせて投与され得、滅菌生物適合性医薬用担体、例えば限定されるわけではないが、食塩水、緩衝食塩水、デキストロースおよび水中で投与され得る。組成物は、患者に単独でまたは他の薬剤、薬物またはホルモンと組合わせて投与され得る。
医薬組成物は、限定されるわけではないが、経口、静脈内、筋肉内、関節腔内、動脈内、骨髄内、鞘内、心室内、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、経腸、局所、舌下または直腸手段を含む若干の経路により投与され得る。有効成分に加えて、これらの医薬組成物は、活性化合物を医薬上使用され得る製剤に加工処理し易くする賦形剤および助剤を含む適切な医薬上許容される担体を含み得る。処方および投与についての技術に関するさらなる詳細は、Remingtonの“Pharmaceutical Sciences”(マック・パブリッシング・カンパニー、イーストン、ペンシルベニア)の最新版に記載されている。
経口投与用医薬組成物は、経口投与に適切な用量で、当業界で公知の医薬上許容される担体を用いて処方され得る。上記担体により、医薬組成物は、患者に摂取される、錠剤、丸薬、糖衣錠、カプセル、液剤、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液などとして製剤化され得る。
経口用医薬製剤は、固体賦形剤と活性化合物を組合わせ、生成した混合物を所望により粉砕し、そして顆粒の混合物を加工処理した後、所望ならば錠剤または糖衣錠のコアを得るのに適切な助剤を加えることにより得られる。適切な賦形剤は、炭水化物またはタンパク質充填剤、例えば糖類、例えば乳糖、しょ糖、マンニトール、またはソルビトール；トウモロコシ、小麦、イネ、ジャガイモまたは他の植物由来の澱粉；セルロース、例えばメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、またはカルボキシメチルセルロースナトリウム；アラビアおよびトラガカントゴム；およびタンパク質、例えばゼラチンおよびコラーゲンである。所望ならば、崩壊または可溶化剤、例えば架橋ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸またはその塩、例えばアルギン酸ナトリウムが加えられ得る。
糖衣錠コアは、適切なコーティング、例えば濃縮糖液と連係的に使用され得、またアラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール、および／または二酸化チタン、ラッカー液、および適切な有機溶媒または溶媒混合物を含み得る。染料または色素は、製品を識別または活性化合物の量、すなわち用量を特性確認するため、錠剤または糖衣錠コーティングに添加され得る。
経口使用され得る医薬調製物には、ゼラチンでできたプッシュ−フィット式カプセル、並びに、ゼラチンおよびコーティング、例えばグリセリンまたはソルビトールから成る密閉式ソフトカプセルが含まれる。プッシュ−フィット式カプセルは、充填剤または結合剤、例えば乳糖または澱粉、滑沢剤、例えばタルクまたはステアリン酸マグネシウム、および所望による安定剤と混合した形で有効成分を含み得る。ソフトカプセルの場合、活性化合物は、適切な液体、例えば脂肪油、液体または液体ポリエチレングリコールに安定剤含有または不含有で溶解または懸濁され得る。
非経口投与に適した医薬処方物は、水溶液、好ましくは生理学的に適合し得る緩衝液、例えばハンクス溶液、リンゲル溶液または生理学的緩衝食塩水中で製剤化され得る。水性注射懸濁液は、懸濁液の粘稠性を高める物質、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールまたはデキストランを含み得る。さらに、活性化合物の懸濁液は、油状注射懸濁液として調製され得る。適切な親油性溶媒または賦形剤には、脂肪油類、例えばゴマ油、または合成脂肪酸エステル類、例えばエチルオレエートまたはトリグリセリド、またはリポソームがある。非脂質ポリカチオン系アミノポリマーもまた、デリバリー用に使用され得る。所望により、懸濁液はまた、適切な安定剤または化合物の溶解度を高めることにより、高濃縮液の調製を可能にする薬剤を含み得る。
局所または鼻腔投与については、特定障壁を透過させるのに適切な浸透剤が処方物で使用される。上記浸透剤は当業界では公知である。
本発明医薬組成物は、当業界公知の方法で、例えば慣用的混合、溶解、造粒、糖衣錠加工、均質混合、乳化、封入、包括または凍結乾燥方法により製造され得る。
医薬組成物は、塩として提供され得、多くの酸、例えば限定されるわけではないが、塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸などにより形成され得る。塩類は、対応する遊離塩基形態の場合よりも水性または他のプロトン溶媒に溶解しやすくなる傾向がある。他の場合、好ましい調製物は、４.５〜５.５のｐＨ範囲で、以下の成分：１〜５０ｍＭのヒスチジン、０.１〜２％のしょ糖および２〜７％のマンニトールのいずれかまたは全部を含み得る凍結乾燥粉末であり得、これは使用前に緩衝液と合わされる。
医薬組成物が調整された後、それらは適切な容器に入れられ、適応症の処置についてのラベルが貼られ得る。アンチセンスヌクレオチドまたはアンタゴニストの投与については、上記ラベルには、投与の量、頻度、および方法が示される。当業者であれば、アンタゴニスト、例えば抗体または阻害剤についてよりも、アンチセンスヌクレオチドについての種々の処方物を用いると思われる。タンパク質の経口投与に適切な医薬処方物は、例えば米国特許第５００８１１４、５５０５９６２、５６４１５１５、５６８１８１１、５７００４８６、５７６６６３３、５７９２４５１、５８５３７４８、５９７２３８７、５９７６５６９および６０５１５６１号に記載されている。
別の態様において、治療剤、例えば上記のものによる対象の処置は、開示された遺伝子の少なくとも一つによりコード化されるｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベル、または開示された遺伝子の少なくとも一つによりコード化されるタンパク質の活性を検出することによりモニターされ得る。これらの測定結果は、処置が有効であるか否かまたはそれを調節または最適化すべきか否かを示す。したがって、本明細書に記載されている遺伝子の１個またはそれ以上は、臨床試験中における薬剤の効力についてのマーカーとして使用され得る。
特に有用な実施態様においては、薬剤(例、本明細書記載のスクリーニング検定法で同定されるアンタゴニスト、タンパク質、核酸、小分子、または他の治療剤または候補剤)による乳癌に罹患または乳癌発病の危険がある対象の処置の効力をモニターする方法であって、
ａ）薬剤投与前に対象から投与前試料を得、
ｂ）投与前試料において、少なくとも一遺伝子によりコード化されるｍＲＮＡまたはタンパク質の発現、または少なくとも一遺伝子によりコード化されるタンパク質の活性のレベルを検出し、
ｃ）対象から一つまたはそれ以上の投与後試料を得、
ｄ）投与後試料(複数も可)において、少なくとも一遺伝子によりコード化されるｍＲＮＡまたはタンパク質の発現、または少なくとも一遺伝子によりコード化されるタンパク質の活性のレベルを検出し、
ｅ）投与前試料における少なくとも一遺伝子によりコード化されるｍＲＮＡまたはタンパク質の発現、または少なくとも一遺伝子によりコード化されるタンパク質の活性のレベルを、投与後試料(複数も可)における少なくとも一遺伝子によりコード化されるｍＲＮＡまたはタンパク質の発現、または少なくとも一遺伝子によりコード化されるタンパク質の活性のレベルと比較し、そして
ｆ）それに応じて薬剤(の投与)を調節する
段階を含む方法が提供される。
例えば、薬剤の投与を増すことは、少なくとも一遺伝子の発現または活性のレベルを検出されたレベルよりも高いかまたは低いレベルに変える、すなわち薬剤の有効性を高めるのに望ましい場合もあり得る。別法として、薬剤の投与を減らすことは、少なくとも一遺伝子の発現を検出されたレベルよりも高いかまたは低いレベルに変える、すなわち薬剤の有効性を減少させるのに望ましい場合もあり得る。
別の態様では、対象における乳癌組織の増殖を阻害する方法であって、上記治療剤、例えばアンチセンスヌクレオチド、リボザイム、二本鎖ＲＮＡ、およびアンタゴニスト、例えば抗体を用いる方法が提供される。アンチセンスヌクレオチドを用いて乳癌組織の増殖を阻害する方法は、表１、２、３または４に示されている少なくとも一遺伝子から誘導されたアンチセンスヌクレオチド配列を含む単離核酸分子の治療有効量を対象に投与することを含み、その場合アンチセンスヌクレオチドは、少なくとも一遺伝子の転写／翻訳を変え得るものとする。
リボザイムを用いて乳癌組織の増殖を阻害する方法は、リボザイムをコード化するヌクレオチド配列の治療有効量を対象に投与することを含み、そのリボザイムは表１、２、３または４に示されている少なくとも一遺伝子の転写／翻訳を変え得るものとする。
二本鎖ＲＮＡを用いて乳癌組織の増殖を阻害する方法は、表１、２、３または４に示されている少なくとも一遺伝子に対応する二本鎖ＲＮＡの治療有効量を対象に投与することを含み、その場合二本鎖ＲＮＡは、少なくとも一遺伝子の転写／翻訳を変え得るものとする。
アンタゴニストを用いて乳癌組織の増殖を阻害する方法では、表１、２、３または４に示されている少なくとも一遺伝子によりコード化されるタンパク質の阻害または活性化をもたらすアンタゴニストの治療有効量を対象に投与する。
乳癌組織の増殖阻害に関係する状況において、アンチセンスヌクレオチドを含む単離核酸分子、リボザイムこコード化するヌクレオチド配列、二本鎖ＲＮＡ、またはアンタゴニストの「治療有効量」は、乳癌組織の増殖を阻害する(例えば、乳癌組織の細胞増殖を阻害または安定化する)のに十分であるこれら治療剤の一つの用量をいい、上記要領で決定され得る。
ウイルスベクターの使用
別の態様では、ベクターの複製に不可欠である遺伝子のコーディング領域へ機能し得るように結合された、表１、２、３または４に示された遺伝子の少なくとも一つから成る群から選択された遺伝子のプロモーターを含むウイルスベクターであって、胸部細胞へトランスフェクションされたときに複製するよう適合化されたベクターが提供される。
上記ベクターは、非胸部組織ではなく、胸部組織において選択的に複製し得る。複製は、開示された遺伝子のプロモーターを活性化する正の転写因子の、非胸部組織ではなく、胸部組織における存在に左右される。それはまた、通常非胸部組織に存し、プロモーターの結果として転写を阻止する転写阻害因子の欠如により行なわれ得る。したがって、転写が行なわれるとき、複製に不可欠な遺伝子へと進行し、その結果、非胸部組織ではなく、胸部組織において、ベクターが複製され、その付随機能が発揮される。このベクターにより、罹患胸部組織、例えば胸部腫瘍は、全身傷害性は最小限で、選択的に処置され得る。
一実施態様において、ウイルスベクターは、ベクターの複製に不可欠な遺伝子のコーディング領域を含むアデノウイルスベクターであり、そのコーディング領域は、Ｅ１a、Ｅ１ｂ、Ｅ２およびＥ４コーディング領域から成る群から選択される。上記ベクターの製造方法は、例えば、Sambrook et al.、“Molecular Cloning: A Laboratory Manual”、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク(１９８９)に記載されている通り、当業者にはよく知られている。
さらに別の実施態様において、ベクターは、胸部細胞でベクターから発現される異種遺伝子産物をコード化する。異種遺伝子産物は、罹患胸部組織、例えば胸部腫瘍の増大の阻害、阻止または破壊をもたらす。
遺伝子産物は、ＲＮＡ、例えばアンチセンスＲＮＡまたはリボザイム、またはタンパク質、例えばサイトカイン、例えばインターロイキン、インターフェロン、または毒素、例えばジフテリア毒素、シュードモナス毒素などであり得る。異種遺伝子産物はまた、負の選択マーカー、例えばシトシンデアミナーゼであり得る。上記負の選択マーカーは、他の薬剤と相互作用することにより、罹患胸部細胞の増大を阻止、阻害または破壊し得る。
本発明ベクターをヘルパーセルラインへトランスフェクションすることにより、ウイルス複製が行われ、感染性ウイルス粒子が生成され得る。別法として、胸部細胞へのベクターのトランスフェクションは、電気穿孔、リン酸カルシウム沈澱、顕微注入により、またはプロテオリポソームを通じて行われ得る。組織特異的複製ベクターの製造方法および腫瘍細胞および対象において危険であるかまたは他の点でインビボでは望ましくない他の型の異常細胞の処置におけるそれらの使用は、例えば米国特許第５９９８２０５号に詳記されている。
マーカーとしての核酸およびタンパク質の検出
特定実施態様において、マーカーに対応するｍＲＮＡのレベルは、当業界公知の方法を用いて生物学的試料においてin situおよびインビトロの両フォーマットにより測定され得る。「生物学的試料」の語は、対象から分離された、組織、細胞、生物学的流体およびその単離物、並びに対象内に存在する組織、細胞および流体を包含するものとする。多くの発現検出方法は単離ＲＮＡを使用する。インビトロ方法については、ｍＲＮＡの単離に対して選択しないＲＮＡ単離技術が、胸部細胞からのＲＮＡの精製用に使用され得る(例えば、Ausubel et al.編、“Current Protocols in Molecular Biology”、John Wiley & Sons、ニューヨーク(１９８７−１９９９)参照)。さらに、多数の組織試料は、当業者に熟知されている技術、例えばChomczynski、米国特許第４８４３１５５号(１９８９)の一段階ＲＮＡ単離方法を用いて容易に調製され得る。
単離ｍＲＮＡは、限定されるわけではないが、サザーンまたはノーザン分析法、ポリメラーゼ連鎖反応分析法およびプローブアレイを含むハイブリダイゼーションまたは増幅検定法で使用され得る。ｍＲＮＡレベルの検出についての好ましい一診断方法では、検出されている遺伝子によりコード化されるｍＲＮＡとハイブリダイズし得る核酸分子(プローブ)と単離ｍＲＮＡを接触させる。核酸プローブは、例えば、完全長ｃＤＮＡまたはその一部分、例えば長さが少なくとも７、１５、３０、５０、１００、２５０または５００ヌクレオチドで、本発明マーカーをコード化するｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡとストリンジェント条件下で特異的にハイブリダイズするのに十分なオリゴヌクレオチドであり得る。本発明の診断検定法での使用に適した他のプローブは、本明細書に記載されている。ｍＲＮＡとプローブのハイブリダイゼーションは、問題のマーカーが発現されていることを示す。
一フォーマットでは、ｍＲＮＡを固体表面に固定し、例えば、アガロースゲル上で単離ｍＲＮＡを走らせ、ゲルからメンブラン、例えばニトロセルロースへｍＲＮＡを移動させることによりプローブと接触させる。別のフォーマットでは、プローブ(複数も可)を固体表面に固定し、例えばアフィメトリックス遺伝子チップアレイにおいてｍＲＮＡをプローブ(複数も可)と接触させる。当業者であれば、本発明マーカーによりコード化されるｍＲＮＡのレベルの検出で使用される公知ｍＲＮＡ検出方法を容易に適合させることができるはずである。
試料中の本発明マーカーに対応するｍＲＮＡのレベルを測定する別の方法には、核酸増幅方法、例えばｒｔＰＣＲによる方法(実験的実施態様は、Mullis、米国特許第４６８３２０２号(１９８７)に示されている)、リガーゼ連鎖反応(Barany、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第８８巻、１８９−１９３頁(１９９１))、自立配列複製(Guatelli et al.、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第８７巻、１８７４−１８７８頁(１９９０))、転写増幅システム(Kwoh et al.、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第８６巻、１１７３−１１７７頁(１９８９))、Ｑ−ベータレプリカーゼ(Lizardi et al.、Bio/Technology、第６巻、１１９７頁(１９８８))、ローリングサークル複製(Lizardi et al.、米国特許第５８５４０３３号(１９８８))、または他の核酸増幅方法、次いで当業者によく知られている技術を用いることによる増幅された分子の検出が含まれる。核酸分子が非常に低い数で存在する場合、これらの検出スキームは上記分子の検出に特に有用である。本明細書で使用されている増幅プライマーは、遺伝子の５'または３'領域にアニーリングし(それぞれプラスおよびマイナス鎖、または逆もまた同様)、間に短い領域を含み得る一対の核酸分子であるものとして定義される。一般に、増幅プライマーは、長さ約１０〜３０ヌクレオチドであり、長さ約５０〜２００ヌクレオチドの領域の両端に隣接する。適切な条件下および適切な試薬により、上記プライマーは、プライマーが両端に隣接するヌクレオチド配列を含む核酸分子の増幅を可能にする。
in situ方法の場合、検出前にｍＲＮＡを胸部細胞から単離する必要は無い。上記方法において、細胞または組織試料は、公知組織学的方法を用いて調製／製造される。次いで、試料を支持体、典型的にはガラススライドに固定し、次いでマーカーをコード化するｍＲＮＡとハイブリダイズし得るプローブと接触させる。
マーカーの絶対発現レベルに基いた別の測定方法として、測定は、マーカーの正規化発現レベルに基いたものであり得る。発現レベルは、マーカーの発現をマーカーではない遺伝子、例えば構成的に発現されるハウスキーピング遺伝子の発現と比較することによってマーカーの絶対発現レベルを補正することにより正規化される。正規化に適切な遺伝子には、ハウスキーピング遺伝子、例えばアクチン遺伝子、または上皮細胞特異的遺伝子がある。この正規化により、一試料、例えば患者試料と別の試料、例えば非乳癌試料の発現レベルの比較、または異なる供給源からの試料間比較が行われ得る。
別法として、発現レベルは、相対発現レベルとして提供され得る。マーカーの相対発現レベルを測定するため、マーカーの発現レベルを、問題の試料についての発現レベルを測定する前に、正常細胞対癌細胞分離物の１０またはそれ以上の試料、好ましくは５０またはそれ以上の試料について測定する。多数の試料で検定された遺伝子の各々の平均発現レベルが決定され、これをマーカーについてのベースライン発現レベルとして使用する。次いで、試験試料について測定したマーカーの発現レベル(絶対発現レベル)を、そのマーカーについて得られた平均発現値で割る。これによって相対発現レベルが提供される。
好ましくは、ベースライン測定で使用する試料を、乳癌または胸部組織の非乳癌細胞から入手する。細胞供給源の選択は、相対発現レベルの使用により異なる。平均発現スコアとして正常組織で見出される発現を用いることは、検定されているマーカーが胸部特異的(対正常細胞)であるか否かを確認する場合の助けとなる。これに加えて、さらにデータが蓄積されると、平均発現値が訂正され、蓄積されたデータに基づいて改善された相対発現値が与えられ得る。胸部細胞からの発現データは、乳癌病状の重さを等級付けする手段を提供する。
本発明の別の実施態様では、マーカーに対応するポリペプチドが検出される。本発明ポリペプチドを検出するための好ましい薬剤は、本発明マーカーに対応するポリペプチドに結合し得る抗体、好ましくは検出可能な標識を伴う抗体である。抗体は、ポリクローナル、さらに好ましくはモノクローナルであり得る。無傷の抗体、またはそのフラグメント(例、ＦａｂまたはＦ(ａｂ')２)が使用され得る。プローブまたは抗体に関して用いられている「標識(された)」の語は、検出可能な物質をプローブまたは抗体にカップリング(すなわち、物理的結合)させることによるプローブまたは抗体の直接的標識、並びに直接標識されている別の試薬との反応性によるプローブまたは抗体の間接的標識を包含するものとする。間接的標識の例には、蛍光標識二次抗体を用いて一次抗体を検出する方法およびＤＮＡプローブをビオチンで末端標識することによって蛍光標識ストレプトアビジンにより検出し得る方法がある。
胸部細胞からのタンパク質は、当業者によく知られた技術を用いて単離され得る。使用されるタンパク質単離方法は、例えば、HarlowおよびLane、“Antibodies: A Laboratory Manual”、HarlowおよびLane、コールドスプリングハーバー・ラボラトリー・プレス、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク(１９８８)記載のものであり得る。
様々なフォーマットが、試料が所定の抗体に結合するタンパク質を含むか否かを測定するのに使用され得る。上記フォーマットの例には、酵素免疫検定法(ＥＩＡ)、ラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)、ウエスタンブロット分析およびＥＬＩＳＡがあるが、これらに限定されるわけではない。当業者であれば、胸部細胞が本発明マーカーを発現するか否かを測定するための使用に公知タンパク質／抗体検出方法を容易に適合させ得るはずである。
一フォーマットでは、抗体または抗体フラグメントを、例えばウエスタンブロットまたは免疫蛍光技術といった方法で使用することにより、発現されたタンパク質を検出し得る。上記使用では、固体支持体に抗体またはタンパク質を固定することが一般的には好ましい。適切な固相支持体または担体には、抗原または抗体を結合させ得る支持体が全て含まれる。よく知られている支持体または担体には、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然および修飾セルロース、ポリアクリルアミド、斑レイ岩および磁鉄鉱がある。
当業者であれば、抗体または抗原との結合に適した多くの他の担体を知っているはずであり、本発明での使用に上記支持体を適合させ得るはずである。例えば、胸部細胞から単離されたタンパク質をポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、固相支持体、例えばニトロセルロースに固定させ得る。次いで、支持体を適切な緩衝液で洗浄後、検出可能な標識抗体で処理し得る。次いで、固相支持体を緩衝液でもう一度洗浄することにより、未結合抗体が除去され得る。次いで、固体支持体上の結合標識の量が慣用的手段により検出され得る。
本発明はまた、生物学的試料(例、胸部関連の体液、血清、血漿、リンパ、嚢胞液、尿、糞、脳脊髄液、腹水または血液)から本発明マーカーに対応するポリペプチドまたは核酸の存在を検出するキットを包含する。上記キットは、対象が乳癌に罹患しているかまたは発病の危険が高い状態であるか否かを測定するのに使用され得る。例えば、このキットは、生物学的試料から本発明マーカーに対応するポリペプチドまたはポリペプチドをコード化するｍＲＮＡを検出し得る標識化合物または薬剤および試料中のポリペプチドまたはｍＲＮＡの量の測定手段(例、ポリペプチドと結合する抗体またはポリペプチドをコード化するＤＮＡまたはｍＲＮＡに結合するオリゴヌクレオチドプローブ)を含み得る。キットはまた、キットを用いて得られた結果を解釈するための使用説明書を含み得る。
抗体に基くキットの場合、キットは、例えば１)本発明マーカーに対応するポリペプチドに結合する第一抗体(例、固体支持体に結合されている)、および所望により２)ポリペプチドまたは第一抗体に結合し、検出可能な標識にコンジュゲートされている第二の異なる抗体を含み得る。
オリゴヌクレオチドに基くキットの場合、キットは、例えば、１)本発明マーカーに対応するポリペプチドをコード化する核酸配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、例えば検出可能標識オリゴヌクレオチド、または２)本発明マーカーに対応する核酸分子を増幅するのに有用な一対のプライマーを含み得る。このキットはまた、例えば緩衝剤、保存剤またはタンパク質安定剤を含み得る。さらにこのキットは、検出可能標識を検出するのに必要な成分(例、酵素または基質)を含み得る。このキットはまた、検定され、試験試料と比較され得る、対照試料または一連の対照試料を含み得る。キットの各成分は、個々の容器内に収納され得、様々な容器は全て、キットを用いて実施された検定の結果を解釈するための使用説明書と一緒に単一パッケージ内に収められ得る。
臨床試験のモニタリング
本発明マーカーの発現レベルに対する薬剤(例、薬剤化合物)の影響のモニタリングは、基本的薬剤スクリーニングだけでなく、臨床試験においても適用され得る。例えば、マーカー発現に及ぼす薬剤の有効性は、乳癌についての処置を受けている対象の臨床試験でモニターされ得る。好ましい実施態様において、本発明は、薬剤(例、アゴニスト、アンタゴニスト、ペプチドミメティック、タンパク質、ペプチド、核酸、小分子または他の薬剤候補)による対象処置の有効性のモニター方法であって、
(ｉ)薬剤投与前に対象から投与前試料を得、
(ii)投与前試料において１種またはそれ以上の選択された本発明マーカーの発現レベルを検出し、
(iii)対象から一つまたはそれ以上の投与後試料を得、
(iv)投与後試料においてマーカー(複数も可)の発現レベルを検出し、
(ｖ)投与前試料におけるマーカー(複数も可)の発現レベルを投与後試料(複数も可)におけるマーカー(複数も可)の発現レベルと比較し、
(vi)それに応じて対象への薬剤の投与を変える
処置を含む方法を提供する。
例えば、薬剤の投与を増すことが、検出されたレベルよりも高いレベルまでマーカー(複数も可)の発現を増加させる、すなわち薬剤の有効性を高めるのに望ましい場合があり得る。別法として、薬剤の投与を減らすことが、薬剤の有効性を減少させるのに望ましい場合もあり得る。
実験プロトコル
サブトラクトライブラリーおよび転写物プロファイリング
ｍＲＮＡの一集団(テスター)において別の集団(ドライバー)と比べ高レベルで発現されたクローンを単離させ得るＰＣＲに基いた方法を用いてサブトラクトライブラリーを作製する。テスターおよびドライバーｍＲＮＡの両集団を逆転写によりｃＤＮＡに変換し、次いで、クロンテック製ＳＭＡＲＴ(登録商標)ＰＣＲ−キットを用いてＰＣＲ増幅する。次いで、クロンテック製ＰＣＲ−セレクトｃＤＮＡサブトラクションキットを用いてテスターおよびドライバーｃＤＮＡをハイブリダイズさせる。この技術により、サブトラクションおよび正規化、すなわち低存在量および高存在量の配列のコピー数の平準化の両方が達成される。サブトラクティブライブラリーの作製後、各ライブラリーからの９６またはそれ以上のクローンの一群を試験し、逆サザーンハイブリダイゼーションにより、差次的発現を確認する。
上記サブトラクティブライブラリーハイブリダイゼーション技術を通して同定された本発明マーカーについて述べると、サブトラクトライブラリーについての「テスター」供給源は、３タイプの乳癌(ヒト患者から得た)からの組織試料、または乳癌セルラインから生成されるｃＤＮＡにより構成された。サブトラクトライブラリーについての「ドライバー」供給源は、非癌腫胸部組織細胞から調製されるｃＤＮＡにより構成された。
転写物プロファイリングについては、試料データベースと連結されたロボットグリッディングシステムを用いてナイロン膜へ精製ＰＣＲ生成物をスポットすることによりナイロンアレイを調製する。数千個のクローンが各ナイロンフィルターにスポットされている。
臨床試料(腫瘍および正常)およびセルラインからのＲＮＡまたはＤＮＡを、ナイロンアレイに対するハイブリダイゼーションに使用する。反応中に組込まれている放射性標識ヌクレオチドを含むインビトロ逆転写反応を用いてＲＮＡまたはＤＮＡを標識する。別法として、ｍＲＮＡを逆転写によりｃＤＮＡに変換し、次いでクロンテック製のＳＭＡＲＴ ＰＣＲキットを用いてＰＣＲ増幅する。ハイブリダイゼーション実験は、ハイブリダイゼーションチャンバー中で標識ＲＮＡまたはＤＮＡ試料をナイロンフィルターと合わせることにより実施される。デュプリケイトの独立ハイブリダイゼーション実験を行うことにより、転写プロファイリングデータが作製される(Nature Genetics、第２１巻(１９９９)参照)。
引用された参考文献
本明細書で引用されている全参考文献については、全ての目的のためそのまま完全に出典明示で援用しており、それは、個々の各出版物または特許または特許出願を具体的かつ個々に示すことにより全ての目的のためそのまま完全に引用しているのと同じことである。さらに、本明細書で引用されている全てのジェンバンク受託番号、ユニジーン・クラスター番号およびタンパク質受託番号については、全ての目的のためそのまま完全に出典明示で援用しており、それは、各番号を具体的かつ個々に示すことにより、全ての目的のためそのまま完全に引用しているのと同じことである。
本発明は、この明細書に記載されている特定実施態様に関して限定されているのではなく、それらの態様は本発明の個々の局面の単なる説明として意図されたものである。当業者にとっては明らかなように、この発明の多くの修飾および変形がその精神および範囲から逸脱することなく行なわれ得る。本発明の範囲内における機能的均等内容の方法および装置は、本明細書で列挙されているものに加えて、前述の記載および添付図面から当業者にとっては容易に理解できるものである。上記修飾および変形は、添付の請求の範囲内に含まれるものとする。本発明は添付の請求の範囲によってのみ制限されており、上記請求の範囲に対し認められる均等内容範囲も全て包含されるものとする。

Claims (81)

  1. 乳癌対象をスクリーニングにかけることにより内分泌療法に対する乳癌の応答を予想する方法であって、
    ａ）対象から得た胸部腫瘍生検において遺伝子ＮＯＶＡ１に対応するｍＲＮＡ発現レベルを検出することにより第１の値を得、
    ｂ）腫瘍が内分泌療法に応答した患者から得た胸部腫瘍生検において遺伝子ＮＯＶＡ１に対応するｍＲＮＡ発現レベルを検出することにより第２の値を得、
    ｃ）腫瘍が内分泌療法に対して応答しなかった患者から得た胸部腫瘍生検において遺伝子ＮＯＶＡ１に対応するｍＲＮＡ発現レベルを検出することにより第３の値を得、そして
    ｄ）第１の値を第２および第３の値と比較し、その結果、第１の値が第２の値と類似し、第３の値より大きい場合は、対象の腫瘍は内分泌療法に応答すると予測され、第１の値が第２の値より小さく、第３の値と類似していることが、対象は内分泌療法に応答しないことを示す
    ものである方法。
  2. 乳癌対象をスクリーニングにかけることにより内分泌療法に対する乳癌の応答を予想する方法であって、
    ａ）対象から得た胸部腫瘍生検において遺伝子ＩＧＨＧ３に対応するｍＲＮＡ発現レベルを検出することにより第１の値を得、
    ｂ）腫瘍が内分泌療法に応答した患者から得た胸部腫瘍生検において遺伝子ＩＧＨＧ３に対応するｍＲＮＡ発現レベルを検出することにより第２の値を得、
    ｃ）腫瘍が内分泌療法に対して応答しなかった患者から得た胸部腫瘍生検において遺伝子ＩＧＨＧ３に対応するｍＲＮＡ発現レベルを検出することにより第３の値を得、そして
    ｄ）第１の値を第２および第３の値と比較し、その結果、第１の値が第２の値と類似し、第３の値より大きい場合は、対象の腫瘍は内分泌療法に応答すると予測され、第１の値が第２の値より小さく、第３の値と類似していることが、対象は内分泌療法に応答しないことを示す
    ものである方法。
  3. 乳癌対象をスクリーニングにかけることにより内分泌療法に対する乳癌の応答を予想する方法であって、
    ａ）対象から得た胸部腫瘍生検において表３に示されている少なくとも一遺伝子に対応するｍＲＮＡ発現レベルを検出することにより第１の値を得、
    ｂ）腫瘍が内分泌療法に応答した患者から得た胸部腫瘍生検において（ａ）で示された少なくとも一遺伝子に対応するｍＲＮＡ発現レベルを検出することにより第２の値を得、
    ｃ）腫瘍が内分泌療法に対して応答しなかった患者から得た胸部腫瘍生検において（ａ）で示された少なくとも一遺伝子に対応するｍＲＮＡ発現レベルを検出することにより第３の値を得、そして
    ｄ）第１の値を第２および第３の値と比較し、その結果、第１の値が第２の値と類似し、第３の値より大きい場合は、対象の腫瘍は内分泌療法に応答すると予測され、第１の値が第２の値より小さく、第３の値と類似していることが、対象は内分泌療法に応答しないことを示す
    ものである方法。
  4. 乳癌対象をスクリーニングにかけることにより内分泌療法に対する乳癌の応答を予想する方法であって、
    ａ）対象から得た胸部腫瘍生検において表４に示されている少なくとも一遺伝子に対応するｍＲＮＡ発現レベルを検出することにより第１の値を得、
    ｂ）腫瘍が内分泌療法に応答した患者から得た胸部腫瘍生検において（ａ）で示された少なくとも一遺伝子に対応するｍＲＮＡ発現レベルを検出することにより第２の値を得、
    ｃ）腫瘍が内分泌療法に対して応答しなかった患者から得た胸部腫瘍生検において（ａ）で示された少なくとも一遺伝子に対応するｍＲＮＡ発現レベルを検出することにより第３の値を得、そして
    ｄ）第１の値を第２および第３の値と比較し、その結果、第１の値が第２の値と類似し、第３の値より低い場合は、対象の腫瘍は内分泌療法に応答すると予測され、第１の値が第３の値と類似し、第２の値より大きい場合は、対象の腫瘍は内分泌療法に応答しないと予測される
    ことを含む方法。
  5. 処置を必要とする対象における乳癌の処置方法であって、表１、２、３または４に示されている遺伝子の遺伝子(複数も可)産物の一つまたはそれ以上の合成、発現または活性を調節する化合物を対象に投与することにより、乳癌の少なくとも一つの症状を改善させることを含む方法。
  6. 遺伝子が、ナトリウムチャンネル・非電位依存性１アルファ(ＳＣＮＮ１Ａ)、セリンまたはシステインプロテイナーゼ阻害剤、クレードＡメンバー３(ＳＥＲＰＩＮＡ３)、Ｎ−アシルスフィンゴシンアミドヒドラーゼ(ＡＳＡＨ)、リポカリン１(ＬＣＮ１)、トランスフォーミング成長因子−ベータIII型レセプター(ＴＧＦＢＲ３)、グルタミン酸レセプター前駆体２(ＧＲＩＡ２)およびシトクロムＰ４５０、サブファミリーIIＢ(フェノバルビタール−誘導性)ＣＹＰ２Ｂ)、ＡＺＧＰ１、ＮＯＶＡ１またはＩＧＨＧ３から成る群から選択される、請求項５記載の方法。
  7. 遺伝子産物が、遺伝子；ナトリウムチャンネル・非電位依存性１アルファ(ＳＣＮＮ１Ａ)、セリンまたはシステインプロテイナーゼ阻害剤、クレードＡメンバー３(ＳＥＲＰＩＮＡ３)、Ｎ−アシルスフィンゴシンアミドヒドラーゼ(ＡＳＡＨ)、リポカリン１(ＬＣＮ１)、トランスフォーミング成長因子−ベータIII型レセプター(ＴＧＦＢＲ３)、グルタミン酸レセプター前駆体２(ＧＲＩＡ２)およびシトクロムＰ４５０、サブファミリーIIＢ(フェノバルビタール−誘導性)ＣＹＰ２Ｂ)、ＡＺＧＰ１、ＮＯＶＡ１またはＩＧＨＧ３により発現されるタンパク質から成る群から選択される、請求項５記載の方法。
  8. 乳癌が内分泌に基く治療に対して応答性を示すか否かを測定する方法であって、
    ａ）胸部腫瘍組織試料において表１、２、３または４に示されている少なくとも一遺伝子に対応するｍＲＮＡの発現レベルを検出することにより、第１の値を出し、
    ｂ）非罹患対象から得た胸部組織試料において表１、２、３または４に示されている少なくとも一遺伝子に対応するｍＲＮＡの発現レベルを検出することにより、第２の値を出し、そして
    ｃ）第１の値を第２の値と比較し、その結果、第２の値に対し第１の値が大きい場合は対象の胸部腫瘍が内分泌に基く治療法に応答するものとする
    ことを含む方法。
  9. 対象の乳癌が内分泌に基く治療法に応答するか否かを測定する方法であって、
    ａ）対象からの患者試料においてＮＯＶＡ１遺伝子の遺伝子発現産物の発現レベルを検出することにより、第１の値を得、
    ｂ）腫瘍が内分泌療法に応答した患者から得た患者試料においてＮＯＶＡ１遺伝子の遺伝子発現産物の発現レベルを検出することにより第２の値を得、
    ｃ）腫瘍が内分泌療法に対して応答しなかった患者から得た患者試料においてＮＯＶＡ１遺伝子の遺伝子発現産物の発現レベルを検出することにより第３の値を得、そして
    ｄ）第１の値を第２および第３の値と比較し、その結果、第１の値が第２の値と類似し、第３の値より大きいことが、対象の腫瘍は内分泌療法に応答することを示すものであり、第１の値が第２の値より小さく、第３の値と類似していることが、対象は内分泌療法に応答しないことを示す
    ものである方法。
  10. ＮＯＶＡ１遺伝子ではなくＩＧＨＧ３遺伝子の遺伝子産物の発現レベルを検出する、請求項９記載の方法。
  11. 患者試料が、胸部生検、血液、血清、血漿、リンパ液、腹水、嚢胞液、尿、ＣＳＦ(脳脊髄液)、胸部滲出液または乳汁から成る群から選択される胸部関連身体試料である、請求項９または１０記載の方法。
  12. 遺伝子発現の発現レベルを、遺伝子発現産物に対応するタンパク質の存在を検出することにより評価する、請求項９、１０または１１記載の方法。
  13. タンパク質の存在を、タンパク質と特異的に結合する試薬を用いて検出する、請求項１２記載の方法。
  14. 試薬が、抗体、抗体誘導体および抗体フラグメントから成る群から選択される、請求項１３記載の方法。
  15. 胸部関連体液と接触させるのに適した容器中に請求項１３または１４記載の試薬を含む、患者の乳癌が内分泌に基く治療法に応答するか否かを測定する場合に使用される試験。
  16. 試薬が抗体を含み、抗体が請求項１２記載の遺伝子発現産物に対応するタンパク質と特異的に結合する、請求項１５記載の試験。
  17. 対象における乳癌の処置方法であって、表１、２、３または４に示されたものを含む遺伝子群の遺伝子(複数も可)発現産物の一つまたはそれ以上の合成、発現または活性を調節する化合物を対象に投与することにより、乳癌の少なくとも一つの症状を改善させることを含む方法。
  18. 化合物が、アンチセンス分子、二本鎖ＲＮＡ、リボザイム、小分子化合物、抗体または抗体のフラグメントから成る群から選択される、請求項１７記載の方法。
  19. 乳癌に罹患または罹患の危険がある対象において乳癌の進行をモニターする方法であって、対象から得た体液または胸部組織の試料において時間の経過に伴って表１、２、３または４に示されたものを含む遺伝子群の少なくとも一つに対応するｍＲＮＡの発現レベルを測定することを含み、時間経過に伴う少なくとも一遺伝子のｍＲＮＡの発現レベルの増加が対象における乳癌の進行を示すものである方法。
  20. 表１、２、３または４に示されている少なくとも一遺伝子が、ＴＦＦ１、ＴＦＦ３、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＰＩＰ、ＭＧＰ、ＴＧＦＲＢ３およびＡＺＧＰ１から成る群から選択される、請求項１９記載の方法。
  21. ｍＲＮＡの発現レベルを、ノーザンブロット分析、逆転写ＰＣＲおよびリアルタイム定量的ＰＣＲから成る群から選択される技術により検出する、請求項１９記載の方法。
  22. 乳癌に罹患または罹患の危険がある対象において乳癌の進行をモニターする方法であって、対象から得た体液または胸部組織の試料において時間の経過に伴って表１、２、３または４に示されている少なくとも一遺伝子によりコード化されるタンパク質の発現レベルを測定することを含み、時間経過に伴う少なくとも一遺伝子によりコード化されるタンパク質の発現レベルの増加が対象における乳癌の進行を示すものである方法。
  23. 表１、２、３または４に示されている少なくとも一遺伝子が、ＴＦＦ１、ＴＦＦ３、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＰＩＰ、ＭＧＰ、ＴＧＦＲＢ３およびＡＺＧＰ１から成る群から選択される、請求項２２記載の方法。
  24. 乳癌に罹患または罹患の危険がある対象において乳癌の進行をモニターする方法であって、対象から得た体液または胸部組織の試料において時間の経過に伴って表１、２、３または４に示されたものから成る群から選択された少なくとも一遺伝子に対応するｍＲＮＡの発現レベルを測定することを含み、時間経過に伴う少なくとも一遺伝子のｍＲＮＡの発現レベルにおける変化が対象における乳癌の進行を示すものである方法。
  25. 乳癌に罹患または罹患の危険がある対象において乳癌の進行をモニターする方法であって、対象から得た体液または胸部組織の試料において時間の経過に伴って表１、２、３または４に示されている遺伝子から成る群から選択された少なくとも一遺伝子によりコード化されるタンパク質の発現レベルを測定することを含み、時間経過に伴う少なくとも一遺伝子によりコード化されるタンパク質の発現レベルにおける変化が対象における乳癌の進行を示すものである方法。
  26. 少なくとも一遺伝子によりコード化されるタンパク質の発現レベルを、タンパク質に特異的な標識プローブを用いることによるウエスタンブロッティングを通して検出する、請求項２５記載の方法。
  27. 標識プローブが抗体である、請求項２６記載の方法。
  28. 抗体がモノクローナル抗体である、請求項２７記載の方法。
  29. 乳癌の処置に使用される薬剤の同定方法であって、
    ａ）乳癌の疑いがある対象から得た胸部組織試料を候補薬剤と接触させ、
    ｂ）試料において少なくとも一遺伝子のｍＲＮＡの発現レベルを検出し、その場合、少なくとも一遺伝子は、表１、２、３または４に示された遺伝子を含む群から選択されるものとし、そして
    ｃ）候補薬剤の存在下での試料における少なくとも一遺伝子のｍＲＮＡの発現レベルを、候補薬剤の非存在下での試料における少なくとも一遺伝子のｍＲＮＡの発現レベルと比較し、その場合、候補薬剤の非存在下での試料における少なくとも一遺伝子のｍＲＮＡの発現レベルに対する候補薬剤の存在下での試料における少なくとも一遺伝子のｍＲＮＡの発現レベルの減少または増加が乳癌の処置に有用な薬剤を示すものとする
    方法。
  30. 表１、２、３または４に示されている少なくとも一遺伝子が、ＴＦＦ１、ＴＦＦ３、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＰＩＰ、ＭＧＰ、ＴＧＦＲＢ３およびＡＺＧＰ１から成る群から選択される、請求項２９記載の方法。
  31. ｍＲＮＡの発現レベルを、ノーザンブロット分析、逆転写ＰＣＲおよびリアルタイム定量的ＰＣＲから成る群から選択される技術により検出する、請求項２９記載の方法。
  32. 薬剤が、小分子およびアンチセンスポリヌクレオチドから成る群から選択される、請求項２９記載の方法。
  33. 乳癌の処置に使用される薬剤の同定方法であって、
    ａ）乳癌の疑いがある対象から得た体液または胸部組織の試料を候補薬剤と接触させ、
    ｂ）試料において少なくとも一遺伝子によりコード化されるタンパク質の発現レベルを検出し、その場合、少なくとも一遺伝子は、表１、２、３または４に示された遺伝子を含む群から選択されるものとし、そして
    ｃ）候補薬剤の存在下での試料における少なくとも一遺伝子によりコード化されるタンパク質の発現レベルを、候補薬剤の非存在下での試料における少なくとも一遺伝子によりコード化されるタンパク質の発現レベルと比較し、その場合、候補薬剤の非存在下での試料における少なくとも一遺伝子によりコード化されるタンパク質の発現レベルに対する候補薬剤の存在下での試料における少なくとも一遺伝子のタンパク質の発現レベルの減少または増加が乳癌の処置に有用な薬剤を示すものとする
    方法。
  34. 表１、２、３または４に示されている遺伝子を含む群において同定された少なくとも一遺伝子が、ＴＦＦ１、ＴＦＦ３、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＰＩＰ、ＭＧＰ、ＴＧＦＲＢ３およびＡＺＧＰ１である、請求項３３記載の方法。
  35. 少なくとも一遺伝子によりコード化されるタンパク質の発現レベルを、タンパク質に特異的な標識プローブを用いることによるウエスタンブロッティングを通して検出する、請求項３３記載の方法。
  36. 標識プローブが抗体である、請求項３５記載の方法。
  37. 抗体がモノクローナル抗体である、請求項３６記載の方法。
  38. 乳癌の処置に使用される薬剤の同定方法であって、
    ａ）乳癌の疑いがある対象から得た胸部組織の試料を候補薬剤と接触させ、
    ｂ）試料において少なくとも一遺伝子のｍＲＮＡの発現レベルを検出し、その場合、遺伝子は、表１、２、３または４に示された遺伝子を含む群から選択されたものから成る群から選択されるものとし、
    ｃ）候補薬剤の存在下での試料における少なくとも一遺伝子のｍＲＮＡの発現レベルを、候補薬剤の非存在下での試料における少なくとも一遺伝子のｍＲＮＡの発現レベルと比較し、その場合、候補薬剤の非存在下での試料における少なくとも一遺伝子のｍＲＮＡの発現レベルに対する薬剤の存在下での試料における少なくとも一遺伝子のｍＲＮＡの発現レベルにおける変化が乳癌の処置に有用な薬剤を示すものとする
    方法。
  39. ｍＲＮＡの発現レベルを、ノーザンブロット分析、逆転写ＰＣＲおよびリアルタイム定量的ＰＣＲから成る群から選択される技術により検出する、請求項３８記載の方法。
  40. 薬剤が、小分子およびアンチセンスポリヌクレオチドから成る群から選択される、請求項４１記載の方法。
  41. 乳癌の処置に使用される薬剤の同定方法であって、
    ａ）乳癌の疑いがある対象から得た体液または胸部組織の試料を候補薬剤と接触させ、
    ｂ）試料において少なくとも一遺伝子によりコード化されるタンパク質の発現レベルを検出し、その場合、遺伝子は、表１、２、３または４に示された遺伝子から成る群から選択されるものとし、
    ｃ）候補薬剤の存在下での試料における少なくとも一遺伝子によりコード化されるタンパク質の発現レベルを、候補薬剤の非存在下での試料における少なくとも一遺伝子によりコード化されるタンパク質の発現レベルと比較し、その場合、候補薬剤の非存在下での試料における少なくとも一遺伝子によりコード化されるタンパク質の発現レベルに対する候補薬剤の存在下での試料における少なくとも一遺伝子のタンパク質の発現レベルにおける変化が乳癌の処置に有用な薬剤を示すものとする
    方法。
  42. 少なくとも一遺伝子によりコード化されるタンパク質の発現レベルを、タンパク質に特異的な標識プローブを用いることによるウエスタンブロッティングを通して検出する、請求項４１記載の方法。
  43. 標識プローブが抗体である、請求項４１記載の方法。
  44. 抗体がモノクローナル抗体である、請求項４３記載の方法。
  45. 薬剤が、小分子およびアンチセンスポリヌクレオチドから成る群から選択される、請求項４１記載の方法。
  46. 乳癌に罹患しているかまたは罹患の危険がある対象の処置方法であって、表１、２、３または４に示された遺伝子から成る群から選択される遺伝子により構成される群から選択される少なくとも一遺伝子から誘導されたアンチセンスヌクレオチド配列から成り、少なくとも一遺伝子の転写／翻訳を変える能力を有する単離核酸分子の治療有効量を対象に投与することを含む方法。
  47. 少なくとも一遺伝子が、ＴＦＦ１、ＴＦＦ３、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＰＩＰ、ＭＧＰ、ＴＧＦＲＢ３およびＡＺＧＰ１から成る群から選択される、請求項４６記載の方法。
  48. 乳癌に罹患しているかまたは罹患の危険がある対象の処置方法であって、表１、２、３または４に示された遺伝子から成る群から選択される遺伝子により構成される群から選択される少なくとも一遺伝子によりコード化されるタンパク質を阻害／活性化するアンタゴニストの治療有効量を対象に投与することを含む方法。
  49. 少なくとも一遺伝子が、ＴＦＦ１、ＴＦＦ３、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＰＩＰ、ＭＧＰ、ＴＧＦＲＢ３およびＡＺＧＰ１から成る群から選択される、請求項４８記載の方法。
  50. アンタゴニストがタンパク質に特異的な抗体である、請求項４８記載の方法。
  51. 抗体がモノクローナル抗体である、請求項５０記載の方法。
  52. モノクローナル抗体が毒性試薬にコンジュゲートされている、請求項５１記載の方法。
  53. 乳癌に罹患しているかまたは罹患の危険がある対象の処置方法であって、表１、２、３または４に示された遺伝子から成る群から選択される遺伝子により構成される群から選択される少なくとも一遺伝子から誘導されたアンチセンスヌクレオチド配列から成り、少なくとも一遺伝子の転写／翻訳を減少／増加させる能力を有する単離核酸分子の治療有効量を対象に投与することを含む方法。
  54. 乳癌に罹患しているかまたは罹患の危険がある対象の処置方法であって、表１、２、３または４に示された遺伝子から成る群から選択される少なくとも一遺伝子によりコード化されるタンパク質を阻害／活性化するアンタゴニストの治療有効量を対象に投与することを含む方法。
  55. アンタゴニストがタンパク質に特異的な抗体である、請求項５４記載の方法。
  56. 抗体がモノクローナル抗体である、請求項５５記載の方法。
  57. モノクローナル抗体が毒性試薬にコンジュゲートされている、請求項５６記載の方法。
  58. 乳癌に罹患しているかまたは罹患の危険がある対象の処置方法であって、表１、２、３または４に示された遺伝子から成る群から選択される少なくとも一遺伝子の転写／翻訳を減少／増加させる能力を有する、リボザイムをコード化するヌクレオチド配列の治療有効量を対象に投与することを含む方法。
  59. 乳癌に罹患しているかまたは罹患の危険がある対象の処置方法であって、請求項５８記載の少なくとも一遺伝子の転写／翻訳を減少させる能力を有する、少なくとも一遺伝子に対応する二本鎖ＲＮＡの治療有効量を対象に投与することを含む方法。
  60. 乳癌に罹患しているかまたは罹患の危険がある対象の処置方法であって、表１、２、３または４に示された遺伝子から成る群から選択される少なくとも一遺伝子の転写／翻訳を変える能力を有する、リボザイムをコード化するヌクレオチド配列の治療有効量を対象に投与することを含む方法。
  61. 乳癌に罹患しているかまたは罹患の危険がある対象の処置方法であって、表１、２、３または４に示された遺伝子から成る群から選択される少なくとも一遺伝子の転写／翻訳を変える能力を有する、少なくとも一遺伝子に対応する二本鎖ＲＮＡの治療有効量を対象に投与することを含む方法。
  62. 乳癌に罹患しているかまたは乳癌発症の危険がある対象の薬剤による処置の効力をモニターする方法であって、
    ａ）薬剤の投与前に対象から投与前試料を得、
    ｂ）表１、２、３または４に示された遺伝子から成る群から選択された遺伝子に対応するｍＲＮＡの発現レベルを検出し、
    ｃ）対象から一つまたはそれ以上の投与後試料を得、
    ｄ）投与後試料(複数も可)において少なくとも一遺伝子に対応するｍＲＮＡの発現レベルを検出し、
    ｅ）投与前試料における少なくとも一遺伝子に対応するｍＲＮＡの発現レベルを、投与後試料における少なくとも一遺伝子に対応するｍＲＮＡの発現レベルと比較し、そして
    ｆ）それに応じて薬剤の投与を調節する
    ことを含む方法。
  63. 乳癌に罹患しているかまたは乳癌発症の危険がある対象の薬剤による処置の効力をモニターする方法であって、
    ａ）薬剤の投与前に対象から投与前試料を得、
    ｂ）表１、２、３または４に示された遺伝子から成る群から選択された少なくとも一遺伝子によりコード化されるタンパク質の発現レベルを検出し、
    ｃ）対象から一つまたはそれ以上の投与後試料を得、
    ｄ）投与後試料(複数も可)において少なくとも一遺伝子によりコード化されるタンパク質の発現レベルを検出し、
    ｅ）投与前試料における少なくとも一遺伝子によりコード化されるタンパク質の発現レベルを、投与後試料における少なくとも一遺伝子によりコード化されるタンパク質の発現レベルと比較し、そして
    ｆ）それに応じて薬剤の投与を調節する
    ことを含む方法。
  64. 対象における乳癌組織の増殖を阻害する方法であって、表１、２、３または４に示されている遺伝子から成る群から選択される少なくとも一遺伝子から誘導されたアンチセンスヌクレオチド配列から成り、少なくとも一遺伝子の転写／翻訳を変える能力を有する、単離核酸分子の治療有効量を対象に投与することを含む方法。
  65. 対象における乳癌組織の増殖を阻害する方法であって、表１、２、３または４に示されている遺伝子から成る群から選択される少なくとも一遺伝子から誘導されたアンチセンスヌクレオチド配列から成り、少なくとも一遺伝子の転写／翻訳を変える能力を有する、単離核酸分子の治療有効量を対象に投与することを含む方法。
  66. 対象における乳癌組織の増殖を阻害する方法であって、表１、２、３または４に示されている遺伝子から成る群から選択される少なくとも一遺伝子の転写／翻訳を変える能力を有する、リボザイムをコード化するヌクレオチド配列の治療有効量を対象に投与することを含む方法。
  67. 対象における乳癌組織の増殖を阻害する方法であって、表１、２、３または４に示されている遺伝子から成る群から選択される少なくとも一遺伝子の転写／翻訳を変える能力を有する、リボザイムをコード化するヌクレオチド配列の治療有効量を対象に投与することを含む方法。
  68. 対象における乳癌組織の増殖を阻害する方法であって、表１、２、３または４に示されている遺伝子から成る群から選択される少なくとも一遺伝子の転写／翻訳を変える能力を有する、少なくとも一遺伝子に対応する二本鎖ＲＮＡの治療有効量を対象に投与することを含む方法。
  69. 対象における乳癌組織の増殖を阻害する方法であって、表１、２、３または４に示されている遺伝子から成る群から選択される少なくとも一遺伝子の転写／翻訳を変える能力を有する、少なくとも一遺伝子に対応する二本鎖ＲＮＡの治療有効量を対象に投与することを含む方法。
  70. 対象における乳癌組織の増殖を阻害する方法であって、表１、２、３または４に示されている遺伝子から成る群から選択される少なくとも一遺伝子によりコード化されるタンパク質を阻害／活性化するアンタゴニストの治療有効量を対象に投与することを含む方法。
  71. アンタゴニストがタンパク質に特異的な抗体である、請求項７０記載の方法。
  72. 抗体がモノクローナル抗体である、請求項７１記載の方法。
  73. モノクローナル抗体が毒性試薬にコンジュゲートされている、請求項７２記載の方法。
  74. 対象における乳癌組織の増殖を阻害する方法であって、表１、２、３または４に示されている遺伝子から成る群から選択される少なくとも一遺伝子によりコード化されるタンパク質を阻害するアンタゴニストの治療有効量を対象に投与することを含む方法。
  75. アンタゴニストがタンパク質に特異的な抗体である、請求項７４記載の方法。
  76. 抗体がモノクローナル抗体である、請求項７５記載の方法。
  77. モノクローナル抗体が毒性試薬にコンジュゲートされている、請求項７６記載の方法。
  78. ベクターの複製に不可欠な遺伝子のコーディング領域に機能し得るように結合された、表１、２、３または４に示された遺伝子から成る群から選択された遺伝子から選択された少なくとも一遺伝子のプロモーターを含むウイルスベクターであって、胸部細胞へのトランスフェクション時に複製すべく適合化されているベクター。
  79. ウイルスベクターがアデノウイルスベクターである、請求項７８記載のベクター。
  80. ベクターの複製に不可欠な遺伝子のコーディング領域が、Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２およびＥ４コーディング領域から成る群から選択される、請求項７８記載のベクター。
  81. さらに異種遺伝子産物をコード化するヌクレオチド配列を含む、請求項７８、７９または８０記載のベクター。
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