KR20200096914A - 암 치료용 아릴 이미다졸 - Google Patents

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윌리암 쥐 라이스
스티븐 호웰
쳉 유 차이
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압토스 바이오사이언시스 인코포레이티드
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Abstract

본 발명은 대상체에 치료 유효량의 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 유리 염기, 수화물, 복합체, 또는 킬레이트(철, 아연 등과 같은 금속 킬레이트를 포함)를 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 암을 예방하거나, 감소시키거나, 치료하는 방법에 관한 것으로서, 여기서 대상체는 DNA 보수 유전자에 돌연변이를 갖는다.

Description

암 치료용 아릴 이미다졸
관련 출원에 대한 교차 참조
본 출원은 그 내용의 전문이 본원에 참조로 포함되는, 2017년 10월 30일에 출원된 미국 가출원 번호 62/578,938의 이익을 청구한다.
발명의 분야
본 발명은 일반적으로 대상체에서 암을 예방하거나, 감소시키거나, 치료하는 방법에 관한 것이다.
배경기술
유방암 감수성 유전자에 의해 인코딩되는 단백질(BRCA 단백질)은 유방암, 난소암 및 다른 암에 대한 소인과 연관되었다. 이들 단백질은 도처에서 발현되고 이에 따라 이들은 DNA 보수 및 재조합, 세포 주기의 체크포인트 제어 및 전사를 포함하는 모든 세포에 근본적인 여러 공정에 연루된다.
구체적으로, 유방암에 대한 유전적 감수성은 소정 유전자(예로, BRCA-1 및 BRCA-2)의 돌연변이에 연관되었다. 이들 유전자에 의해 인코딩되는 단백질은 염색체 구조를 보존하는 기능을 하는 것으로 여겨지지만, 이들이 여러 공정에 관여되므로 이의 정확한 역할은 불명확하다. 돌연변이는 BRCA 결핍 세포에서 염색체 불안정성을 유도하는 단백질의 손상을 유도하고 이에 따라 이들을 종양적 형질전환에 대해 소인을 갖게 하는 것으로 추정된다.
유방암 사례의 약 10%는 가족에서 클러스터링되어 일어나며, 일부는 BRCA-1 및 BRCA-2 유전자의 돌연변이에 기인하여 암 위험을 더 높인다. 종양 억제에 연관되는 다른 유전자의 돌연변이가 암 소인에 대해 설명할 수 있다. 이들에는 p53 종양 억제, STK11/LKB, 단백질 키나제 또는 PTEN 포스파타제의 돌연변이가 포함된다.
종양에서의 상동 재조합의 결손은 종양 세포의 선택적 사멸 기회를 제공한다; 그러나, 상기 기회를 활용하기 위해 현재 사용되는 약물은 용량을 제한하는 심각한 골수억제를 유도한다. 따라서, BRCA1 또는 BRCA2 기능의 손실로 과민성이 일어나지만 골수 억제는 유도하지 않는 약물을 확인하는 것에 대한 필요성은 당분야에서 높은 중요도를 가지며 여전히 충족되지 않고 있다.
발명의 요약
본 개시는 대상체에서 암을 예방하거나, 감소시키거나, 치료하는 방법에 관한 것이다.
하나의 구현예에서, 본 개시는 대상체에 치료 유효량의 화합물 I,
Figure pct00001
또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 유리 염기, 수화물, 복합체, 또는 킬레이트(철, 아연 등과 같은 금속 킬레이트를 포함)를 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 암을 예방하거나, 감소시키거나, 치료하는 방법에 관한 것으로서, 여기서 대상체는 DNA 보수 유전자에 돌연변이를 갖는다. 소정 구현예에서, DNA 보수 유전자는 상동 재조합 유전자이다. 예를 들어, DNA 보수 유전자는 상동 재조합(HR) 의존적 데옥시리보핵산(DNA) 이중 가닥 절단(DSB) 보수 경로의 유전자이다. 일부 구현예에서, DNA 보수 유전자는 BRCA-1, BRCA-2, ATM, ATR, CHK1, CHK2, Rad51, RPA 및 XRCC3으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자이다. 예를 들어, DNA 보수 유전자는 BRCA-1 및/또는 BRCA-2이다. 하나의 구현예에서, 대상체는 인간이다.
하나의 구현예에서, 대상체는 DNA 보수 유전자에서의 돌연변이에 대해 이종접합성이다. 소정 구현예에서, 대상체는 상동 재조합(HR) 의존적 데옥시리보핵산(DNA) 이중 가닥 절단(DSB) 보수 경로의 유전자에서의 돌연변이에 대해 이종접합성이다. 하나의 구현예에서, 대상체는 BRCA1 또는 BRCA2에서의 돌연변이에 대해 이종접합성이다. 또 다른 구현예에서, 대상체는 BRCA1 또는 BRCA2에서의 돌연변이에 대해 동종접합성이다.
하나의 구현예에서, 암은 혈액암, 결장직장암, 난소암, 유방암, 자궁경부암, 폐암, 간암, 췌장암, 림프절의 암, 백혈병, 신장암, 결장암, 전립샘암, 뇌암, 두부경부암, 뼈암, 후두 및 구강의 암종, 어윙 육종, 피부암, 신장 암, 및 심장의 암으로 구성되는 군으로부터 선택된다. 소정 구현예에서, 암은 유방암, 폐암, 난소암, 림프절의 암, 결장암, 백혈병, 신장암, 및 전립샘암으로 구성되는 군으로부터 선택된다. 하나의 구현예에서, 암은 유방암이다.
일부 구현예에서, 암은 혈액 종양이다. 혈액 종양의 예에는 비제한적으로 백혈병, 림프종, 호지킨병, 및 골수종이 포함된다. 또한, 급성 림프구 백혈병(ALL), 급성 골수 백혈병(AML), 급성 전골수구 백혈병(APL), 만성 림프구 백혈병(CLL), 만성 골수 백혈병(CML), 만성 호중구 백혈병(CNL), 급성 미분화 백혈병(AUL), 역형성 큰 세포 림프종(ALCL), 전림프구 백혈병(PML), 소아 골수단핵구 백혈병(JMML), 성인 T-세포 ALL, 3계통 척수형성이상을 갖는, AML(AMLITMDS), 혼합 계통 백혈병(MLL), 호산구 백혈병, 맨틀 세포 림프종, 골수형성이상 증후군(MDS)(예로 고위험 MDS), 골수증식 장애(MPD), 및 다발성 골수종(MM)이 포함된다. 일부 구현예에서, 암은 급성 골수 백혈병이다. 일부 구현예에서, 암은 만성 골수 백혈병이다. 일부 구현예에서, 암은 림프종이다. 일부 구현예에서, 암은 고위험 골수형성이상 증후군이다.
하나의 구현예에서, 암은 BRCA-연관 암이다. 소정 구현예에서, BRCA-연관 암은 BRCA-1 및/또는 BRCA-2 유전자의 하나 이상의 돌연변이를 갖는다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 방법은 치료 유효량의 제2 치료 활성 제제를 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 제2 치료 활성 제제는 대상체에
Figure pct00002
가 투여되기 전에, 투여되는 동안, 또는 투여된 후에 투여된다. 제2 치료 활성 제제는 면역치료제, 항암제, 및 혈관신생제제로 구성되는 군 중 하나 이상으로부터 선택된다. 하나의 구현예에서, 제2 치료 활성 제제는 PARP 억제제이다. 예를 들어, PARP 억제제는 올라파립(olaparib)이다.
하나의 구현예에서, 대상체는 치료 유효량의
Figure pct00003
또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 유리 염기, 수화물, 복합체, 또는 킬레이트(철, 아연 등과 같은 금속 킬레이트를 포함)를 투여받지 않은 대상체 대비 골수 활성의 90% 미만 감소를 경험한다. 예를 들어, 대상체는 골수 활성의 10% 미만 감소를 경험하거나 골수 활성의 감소를 경험하지 않을 수 있다.
하나의 구현예에서, 대상체는 이미 암을 갖고 있다. 소정 구현예에서, 이미 암을 갖고 있는 대상체는 암과 연관된 종양의 크기 감소 또는 축소를 경험한다. 예를 들어, 대상체는 암과 연관된 종양의 완전 제거를 경험한다. 소정 구현예에서, 이미 암을 갖고 있는 대상체는 암과 연관된 종양에서 신-혈관형성 또는 혈관신생의 억제, 축소, 또는 감소를 경험한다.
또 다른 구현예에서, 본 개시는 암 세포를 치료 유효량의
Figure pct00004
또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 유리 염기, 수화물, 복합체, 또는 킬레이트(철, 아연 등과 같은 금속 킬레이트를 포함)와 접촉시키는 단계를 포함하는, 암 세포를 사멸시키는 방법에 관한 것이다. 하나의 구현예에서, 암 세포는 BRCA-1, BRCA-2, ATM, ATR, CHK1, CHK2, Rad51, RPA 및 XRCC3으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자에 결핍을 갖는다.
또 다른 구현예에서, 본 개시는 암 세포를 치료 유효량의 세포와 접촉시킴으로써 이들을 종양적 형질전환에 대해 소인을 갖게 하는 단계를 포함하는, 암 세포에서 세포 주기 정지를 유도하는 방법에 관한 것이다.
또 다른 구현예에서, 본 개시는 하나 이상의 금속 원자와 복합화된 치료 유효량의
Figure pct00005
의 하나 이상의 분자를 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 암을 예방하거나, 감소시키거나, 치료하는 방법에 관한 것이며, 여기서 대상체는 DNA 보수 유전자에 돌연변이를 갖는다. 하나의 구현예에서, 하나 이상의 금속 원자는 철, 아연, 알루미늄, 마그네슘, 백금, 은, 금, 크롬, 니켈, 티탄, 구리, 스칸듐, 지르코늄, 바나듐, 몰리브덴, 망간, 텅스텐 및 코발트로 구성되는 군으로부터 선택된다. 하나의 구현예에서, 하나 이상의 금속 원자는 철이다. 소정 구현예에서, 복합체는 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00006
.
상기 개념 및 아래에서 더 상세히 논의되는 추가 개념의 모든 조합(이러한 개념이 상호 일관되는 한)은 본원에서 개시되는 발명의 요지 사안의 일부인 것으로 고려됨이 이해되어야 한다. 특히, 본 개시의 말단부에 나타나는 청구되는 요지 사안의 모든 조합은 본원에서 개시되는 발명의 요지 사안의 일부인 것으로 고려된다. 또한 참조로 포함되는 모든 개시에 나타날 수 있는 본원에서 명시적으로 채택되는 용어는 본원에서 개시되는 특정 개념과 가장 일치하는 의미로 허용됨이 또한 이해되어야 한다.
도 1은 Fe(화합물 I)3이 화합물 I의 활성 세포내 형태임을 나타낸다. (A) 화합물 I의 구조. (B) Fe(화합물 I)3의 구조. (C) Raji 세포에서 화합물 I(■) 및 Fe(화합물 I)3(●)의 상대 세포독성. (D) 6 h 동안 0.5 μM 화합물 I 또는 Fe(화합물 I)3에 노출된 Raji 세포에서 화합물(■) 및 Fe(화합물)3(■)의 세포내 축적. 수직 막대, ± SEM; SEM이 없는 경우는 기호 크기보다 작은 것임; ***, P<0.001; ****, p<0.0001.
도 2는 화합물 I이 DNA 손상을 유도함을 나타낸다. (A) 0.5 μM 화합물 I에 대한 노출 기간의 함수로서의 Raji 세포에서 포스포-ATM, γ-H2AX 및 절단된 PARP의 축적. 나타낸 면역블롯은 3회의 독립적 실험을 나타낸다. (B) DMSO- 및 화합물 I-처리 CAOV3 세포를 비교하는 핵 초점부 형성의 대표 면역형광 이미지. (C) 세포 당 γ-H2AX 초점부의 수 평균 ± SEM; N = 100. (D) 6 h 동안 DMSO 또는 0.5 μM 화합물 I로 처리된 CAOV3 세포에서 테일 DNA의 %의 중성 코멘트 검정 정량을 나타내는 상자 및 휘스커 그래프, N = 검사된 세포의 수. 수직 막대, ± SEM; *, p<0.05, ****, p<0.0001.
도 3은 BRCA1 및 BRCA2 기능의 손실이 화합물 I에 대한 과민성을 일으킴을 나타낸다. 올라파립(오른쪽) 및 화합물 I(왼쪽)에 대한 BRCA1-기능 및 -결핍 동종 MCF10A 클론(A), hTERT-IMEC 클론(B) 및 MCF7(C)의 민감성. 올라파립 및 화합물 I에 대한 BRCA2-기능 및 -결핍 동종 PEO4 및 PEO1(D), 및 HCT116 BRCA2-결핍 클론(E)의 민감성. 24시간 동안 DMSO 또는 나타낸 농도의 화합물 I로 처리된 MCF7 대조군 및 shBRCA1 클론 E7 세포(F) 및 BRCA2-기능 HCT116 및 결핍 클론 B18 세포(G)에서의 g-H2AFX의 축적. 수직 막대, ± SEM. *, P < 0.05; **, P < 0.01; ***, P < 0.001.
도 4는 화합물 I에 대해 내성이 있는 세포(화합물 IR로 언급됨)의 특성규명을 나타낸다. (A) Raji(●), Raji/화합물 IR(■) Raji/화합물 IR 및 3개월 동안 약물-비함유 배지에서 배양 후 Raji/화합물 IR 세포(▲)에 대한 농도-생존 곡선. (B) 24 h 동안 DMSO 또는 화합물 I 0.5 μM로 처리된 Raji 및 Raji/화합물 IR에서 아폽토시스에 관여되는 단백질의 웨스턴 블롯 분석. (C) 0.5 μM 화합물 I에 대한 6 h 노출 후 Raji 및 Raji/화합물 IR 세포에서 화합물 I(■) 및 Fe(화합물 I)3(■)의 세포내 축적. (D) 화합물 I 농도의 함수로서의 6 h째에 Raji 및 Raji/화합물 IR 세포에서 Fe(화합물 I)3의 세포내 축적. 수직 막대, ± SEM; ** p<0.01; ***, p<0.001; ****, p<0.0001.
도 5는 화합물 I에 대한 내성에서 ABCG2의 역할을 나타낸다. (A) Raji 및 Raji/화합물 IR에서 ABCG2 mRNA의 상대 수준. (B) 바이오틴화 단백질의 웨스턴 블롯을 항-ABCG2 항체로 탐침분석하였다. Na/K ATP아제가 로딩 대조군으로 작용하였다. (C) Raji(●) 및 Raji/화합물 IR(■)에서 Kol43의 세포독성. (D) 화합물 I 단독 및 화합물 I과 5 nM(▲) 또는 50 nM Kol43(▼)의 조합으로 처리된 Raji(●) 및 Raji/화합물 IR(■)에 대한 농도-생존 곡선. (E) Raji(●) 및 Raji/화합물 IR(■)에서 토포테칸의 및 Raji/화합물 IR(▲)에서 토포테칸 및 50 nM Kol43의 조합의 세포독성. (F) Raji(●) 및 Raji/화합물 IR(■)에서 카보플라틴의 및 Raji/화합물 IR(▲)에서 카보플라틴 및 50 nM Kol43의 조합의 세포독성. (G) pcDNA로 전달감염된 HEK-293(●) 및 화합물 I로 처리된 ABCG2, 클론 R5(■)에 대한 농도-생존 곡선. 수직 막대, ± SEM; **, p<0.01.
도 6은 화합물 I 및 Fe(화합물 I)3의 유입 및 유출을 나타낸다. (A) 0.5 μM 화합물 I과 인큐베이션된 Raji 및 Raji/화합물 IR 세포 내로의 화합물 I 및 Fe(화합물 I)3의 축적의 시간 경과. (B) 0.5 μM Fe(화합물 I)3과 인큐베이션된 Raji 및 Raji/화합물 IR 세포 내로의 Fe(화합물 I)3의 축적의 시간 경과. (C) 6 h 동안 0.5 μM 화합물 I에 대한 노출에 의해 로딩된 Raji 및 Raji/화합물 IR 세포로부터 2 h에 걸친 화합물 I 및 Fe(화합물 I)3의 유출.
도 7은 Raji/화합물 IR 세포의 경우에 비교된, Raji에서 포스포-ATM, γ-H2AX 및 절단된 PARP의 축적을 나타낸다.
도 8은 백혈병 및 림프종 세포주에 대한 화합물 I의 항증식 활성을 나타낸다. A) 화합물 I로 5일 동안 처리된 AML 세포주에 대한 농도-반응 곡선. 세포 성장은 비히클-처리 세포 성장의 %로 표현됨. B) 다른 백혈병 및 림프종 세포주에 대한 농도-반응 곡선. 오차 막대, 적어도 3회 반복 검정의 ± SD.
도 9는 화합물 I이 AML 세포주에서 용량- 및 시간-의존적 방식으로 G0-G1 세포 주기 정지를 유도함을 나타낸다. A) 상부, 24시간 동안 나타낸 농도의 화합물 I로 처리된 MV4-11 세포. 세포 주기 분포는 물질 및 방법 섹션에 기재된 바와 같이 검정됨. 하부, 화합물 I에 대한 24시간 노출 후 MV4-11 세포에서의 CDK4 및 CCND3 단백질 수준. 단백질 수준은 3회의 독립적인 웨스턴 블롯으로부터 정량되고, 비히클 대비 변화 배율(fold change)로 그래프화됨. B) 및 C) KG-1 및 EOL-1 세포에서 세포 주기 분포에 대한 화합물 I의 효과. D)~F), 노출 기간의 함수로서의 세포 주기 분포에 대한 화합물 I의 효과(MV4-11 세포, 500 nmol/ℓ; KG-1 세포, 600 nmol/ℓ 화합물 I; 및 EOL-1 세포, 300 nmol/ℓ 화합물 I). 오차 막대, 유세포 측정을 위한 2회의 반복 검정 및 웨스턴 블롯을 위한 3회 반복의 ± SD.
도 10은 화합물 I 처리가 시간- 및 농도-의존적 방식으로 아폽토시스를 유도함을 나타낸다. A, 화합물 I에 대한 24시간 노출 후 아폽토시스성 (초기 및 후기) MV4-11, KG-1, 및 EOL-1 세포의 %. 아폽토시스는 물질 및 방법 섹션에 기재된 바와 같이 측정되었다. B, V-비히클 또는 A-화합물 I로 24시간 동안 처리된 AML 세포의 PARP1-특이적 항체를 이용한 웨스턴 블롯 분석. PARP1 항체는 전장(상부 밴드) 및 절단된 PARP1(하부 밴드)을 모두 인식한다. C, 500 nmol/ℓ의 화합물 I로 1 내지 24시간 동안 처리된 MV4-11, KG-1, 및 EOL-1 세포에서 PARP1 절단의 웨스턴 블롯 분석. GAPDH는 로딩 대조군으로 포함된다. D, MV4-11(500 nmol/ℓ), KG-1(600 nmol/ℓ), 및 EOL-1(300 nmol/ℓ) 세포에서 화합물 I 유도 아폽토시스의 시간 경과. 오차 막대, 2회 반복 검정의 ± SD.
도 11은 MYC RNA 및 단백질 발현이 화합물 I에 의해 음성적으로 조절됨을 나타낸다. A, AML 세포주가 24시간 동안 처리되었고 MYC mRNA 수준이 MYC-특이적 프라이머/탐침 페어로 qRT-PCR에 의해 측정되었다. GraphPad Prism을 사용하여 비히클의 %로 그래프화됨. B, 기재된 농도에서 24시간 동안 처리된 MV4-11, KG-1, 및 EOL-1 세포에서 MYC 단백질 수준의 웨스턴 블롯 분석. GAPDH는 로딩 대조군으로 작용하였다. C, 기재된 시간 동안 500 nmol/ℓ 화합물 I로 처리된 MV4-11, KG-1, 및 EOL-1 세포에서 비히클 대비 변화 배율로 그래프화된 MYC mRNA 발현의 히스토그램 그래프. D, 건강한 공여체로부터의 PBC 대비 AML 세포주에서 MYC mRNA의 기저 발현 수준. qRT-PCR에 의해 검정된 GAPDH 대비 발현. 오차 막대, 적어도 3회 반복 실험으로부터의 ± SD.
도 12는 화합물 I이 DDR 경로를 유도함을 나타낸다. A, 증가하는 시기 동안 (V) 비히클 또는 500 nmol/ℓ (A) 화합물 I로 처리된 MV4-11 세포에서의 전체 TP53 단백질 수준. B, A에서와 같이 처리된 MV4-11 세포에서 웨스턴 블롯 분석에 의해 검출되는 TP53의 번역 후 개질. C, 500 nmol/ℓ 화합물 I에 노출된 MV4-11 세포의 웨스턴 블롯 분석. D, 주지된 농도에서 24시간 동안 화합물 I로 처리된 MV4-11, KG-1, 및 EOL-1 세포에서 γ-H2AX(H2AX phos-S139) 수준의 웨스턴 블롯 분석.
도 13은 Fe(화합물 I)3 복합체의 시험관내 및 세포 활성을 나타낸다. A, 모체 화합물 I 또는 Fe(화합물 I)3으로 5일 동안 처리된 AML 세포주에 대한 농도-반응 곡선. 비히클-처리 세포 성장의 %로 표현되는 세포 성장. 오차 막대, 3~5회 반복 검정으로부터의 평균 SD. B, 왼쪽, 기재된 농도에서 Fe(화합물 I)3으로 24시간 처리 후 KLF4, CDKN1A, 및 MYC mRNA 발현. 오차 막대, 평균 ± SD. 오른쪽, 비히클(v) 또는 증가하는 농도의 Fe(화합물 I)3에 대한 24시간 노출 후 MV4-11 세포에서 c-PARP1, MYC, 및 γH2AX 단백질 수준의 웨스턴 블롯 분석. C, 도 22 및 23에 나타낸 FRET 곡선 대표예로부터 계산된 ΔT 1/2 값으로, 각각의 곡선에 대해 적어도 3회 반복을 가짐. 각각의 올리고의 ΔT 1/2이 평가된 각각의 화합물에 대해 log[약물] mol/ℓ 대비 도시된다.
도 14는 Fe(화합물 I)3에 대한 내성에서 ABCG2의 역할을 나타낸다. (A) Fe(화합물 I)3 단독으로 처리된 Raji(●) 및 Raji/화합물 IR(■) 또는 50 nM Kol43과의 조합으로 처리된 Raji/화합물 IR(▼)에 대한 농도-생존 곡선. (B) 빈 벡터(●) 또는 Fe(화합물 I)3으로 처리된 ABCG2를 발현하는 벡터(■)로 전달감염된 HEK-293 클론 R5에 대한 농도-생존 곡선.
도 15는 AML 세포주에서 화합물 I에 의한 KLF4 및 CDKN1A(p21)의 유도를 나타낸다. A) 기재된 농도에서 화합물 I로의 24 hr 처리 후 KLF4 mRNA 유도. B) AML 세포주에서 CDKN1A mRNA 발현의 농도-의존적 증가. C) 비히클(v) 또는 증가하는 농도의 화합물 I에 대한 24 h 노출 후 MV4-11 세포에서 CDKN1A 단백질 수준의 웨스턴 블롯 분석. D) p21 mRNA의 시간 의존적 증가. E) 비히클(V) 대비 500 nM 화합물 I(A)에 대한 노출 기간의 함수로서의 MV4-11 세포에서 CDKN1A 단백질 수준의 웨스턴 블롯 분석. 모든 mRNA 측정은 qRT-PCR에 의해 수행되었고 GAPDH 로딩 대조군 대비 그래프화되었다. 오차 막대, 3회 반복 실험으로부터의 ± SD.
도 16은 화합물 I이 AML 세포주에서 용량- 및 시간-의존적 방식으로 G0/G1 세포 주기 정지를 유도함을 나타낸다. A) 도 16A~C의 하부 패널에서 정량된 MV4-11, KG-1, 및 EOL-1 세포에서의 CDK4 및 CCND3 단백질 수준의 대표 웨스턴 블롯. B) 주지된 시간 동안 화합물 I의 IC50 농도에 대한 노출 후 CDK4 및 CCND3 단백질 수준. 단백질 수준은 3회의 독립적 웨스턴 블롯으로부터 정량되었고, 비히클 대비 변화 배율로 그래프화됨. 오차 막대, ± SD. C) 화합물 I 노출 기간의 함수로서의 CDK4 및 CCND3 단백질 수준의 대표 웨스턴 블롯(MV4-11 세포 500 nM, KG-1 세포 600 nM, 및 EOL-1 세포 300 nM). V-비히클, A-화합물 I.
도 17은 화합물 I 처리가 시간- 및 농도-의존적 방식으로 아폽토시스를 유도함을 나타낸다. A) 초기 대 후기 아폽토시스성 세포의 분포를 나타내는 히스토그램. B) 시간의 함수로서의 화합물 I 대 비히클 처리 MV4-11, KG-1, 및 EOL-1 세포에서의 전체 아폽토시스성 세포. 오차 막대, 2회의 반복 실험으로부터의 ± SD.
도 18은 MV4-11 세포에서 화합물 I에 의해 조절되는 경로를 나타낸다. A) 6 h 동안 비히클 또는 500 nM 화합물 I로 처리된 MV4-11 세포의 RNA-seq 분석에 의해 검출되는 차별적으로 발현된 유전자의 유전자 존재론 분석(GO). GO 용어 및 p-값은 광범위 분자 특징부 데이터베이스(MSigDB)를 사용하여 연산되었다. B) 6 h 후 비히클 및 화합물 I(500 nM) 처리 MV4-11 세포 에서 정상화된 단백질 수준. 역상 단백질 어레이에 의해 검출되는 단백질 수준. GraphPad Prism에서 생성된 열지도, 3회 반복 샘플의 평균. C) MSigDB를 이용하는 차별적으로 발현된 단백질의 GO 분석.
도 19는 AML 세포에서 화합물 I에 의한 MYC 발현의 조절을 나타낸다. A) 주지된 시간 동안 500 nM 화합물 I로 처리된 MV4-11, KG-1, 및 EOL-1 세포에서의 전체 MYC 단백질 수준. 단백질 수준은 3회의 독립적 웨스턴 블롯으로부터 정량되고, GAPDH에 대해 정상화되어, 비히클 대비 변화 배율로 그래프화됨. 오차 막대, ± SD. B) A)에서 정량된 대표 웨스턴 블롯. C) AML 세포주 대 건강한 공여체로부터의 PBMC에서 MYC의 기저 단백질 발현. D) ChIP-qPCR 분석에서 사용되는 MYC 특이적 프라이머 페어의 위치. E) 입력물에 대한 정상화 후 비히클 처리 대비 변화 배율로 그래프화되는 2, 6, 및 24 h 동안 500 nM 화합물 I로 처리된 MV4-11 세포에서의 MYC 프로모터에서의 H3K27ac의 ChIP-qPCR 분석. F) 3 h 동안 화합물 I(500 nM) 또는 비히클로 전처리된 MV4-11 세포에서 RT-qPCR에 의해 검정된 MYC mRNA 수준. 1 μM 액티노마이신 D의 첨가 후 기재된 시점에 채취된 샘플. 오차 막대, 3회의 생물학적 반복 실험으로부터의 ± SD. * P-값 <0.05, ** <0.005, 엑셀을 사용하여 TTEST에 의해 계산됨.
도 20은 화합물 I의 세포 약리학을 나타낸다. A) KG-1 세포 내로의 화합물 I 흡수의 시간 경과. B) 1 μM 화합물 I에 대한 KG-1 세포의 노출에 의해 1 또는 6 h 동안 로딩된 세포로부터의 화합물 I의 유출. C) 모체 단량체 화합물 I의 구조. D) Fe(화합물 I)3의 구조. E) MV4-11 세포 내로의 화합물 I 및 Fe(화합물 I)3 흡수.
도 21은 G-4중체 구조의 FRET 검정 분석을 나타낸다. A) 켄칭 FRET 검정의 모식도. 저온에서, G-4중체 구조가 형성되며, 형광 FAM 신호는 BHQ1에 의해 켄칭된다; 온도가 증가함에 따라, G4 구조의 폴딩이 풀리고 FAM 신호가 증가한다. 형광 신호가 최대의 50%인 온도(T1/2)가 각각의 약물 농도에 대해 계산된 후 ΔT1/2(약물 T1/2 - 비히클 T1/2)이 약물 농도에 대해 도시되었다. B) ds-DNA 대조군 올리고의 용융 곡선. C) 화합물 I과의 6 hr 인큐베이션 후 G4 올리고에 대한 용융 곡선. 오차 막대, 3회의 생물학적 반복 실험으로부터의 ± SD.
도 22는 Fe(화합물 I)3이 G-4중체 올리고의 Tm을 안정화함을 나타낸다. A~D) A) 인간 텔로미어, B) MYC 유전자 프로모터, C) rRNA 유전자위, 및 D) KIT 유전자 프로모터에 대한 G-4중체 서열을 함유하는 5' FAM - 3' BHQ1 이중 표지 올리고의 용융 곡선. 오차 막대, 3회의 생물학적 반복 실험으로부터의 ± SD.
BRCA1 또는 BRCA2 기능의 손실이 세포 과민성을 일으키지만 개체에서 골수 억제를 유도하지 않는 약물의 확인에 관한 상기 어려움의 관점에서, 화합물 I이 확인되었다. 예상치 못하게, 화합물 I이 DNA 손상을 유도하며, 상동 재조합이 결핍된 세포는 이들이 FDA-승인된 PARP 억제제인 올라파립에 대한 것과 마찬가지로 상기 약물에 대해 과민함이 발견되었다. 화합물 I은 골수억제를 유도하지 않으면서 상동 재조합의 결함을 활용할 수 있는 제한된 약물 레파토리에 연결된다.
조합 약물 연구를 가이드할 수 있는 합성 치사 상호작용을 확인하기 위해, 화합물 I의 작용 기전 및 내성에 대한 기계론적 연구가 또한 수행되었다. 본원에 기재된 바와 같이, 화합물 I은 약물의 활성 형태인 Fe 복합체(Fe(화합물 I)3)로 세포내 전환된다. 화합물 I은 γH2AX 축적 및 초점부 형성에 의해 보고된 바와 같이, 초기 시점에 DNA 손상을 일으켰다. BRCA1- 및 BRCA2-결핍 세포는 올라파립의 경우에 필적하는 정도로 화합물 I에 대해 과민성인 것으로 확인되었다. Raji 세포에서 화합물 I에 대한 내성은 유출 트랜스포터 ABCG2의 상향조절과 연관되며 내성은 ABCG2 억제에 의해 부분적으로 역전된다. 화합물 I이 상동 재조합 결핍을 활용하는 능력은, 이러한 보수 기능의 손실이 과민성을 일으키는 모든 다른 약물과는 다르게, 화합물 I이 최대 관용 용량에서도 골수억제를 일으키지 않으므로 특히 관심의 대상이다.
화합물 I은 광범위한 고형 종양 및 혈약 종양 모두에 대해 강력한 세포독성을 나타내며 골수억제를 유도하지 않는 화합물의 신규한 클래스의 구성원이므로 관심의 대상이다. 본원에서 보고되는 핵심 발견내용은 화합물 I 단량체가 제1철 Fe 원자 및 3개 분자의 화합물 I을 함유하는 활성 복합체로 세포내 전환될 수 있다는 것이며, 그 세포내 농도는 원상태 약물의 농도를 초과할 수 있다. 화합물 I 및/또는 철과의 그 복합체는 DNA 손상을 유도하며, 여기서 DNA 보수는 화합물 I로의 합성 치사성에 의해 입증된 바와 같이 BRCA1 및 BRCA2 모두의 기능을 필요로 한다. Raji 림프종 세포의 경우, 획득 내성은 그 억제가 내성을 부분적으로 역전시키는 ABCG2 약물 유출 펌프의 현저한 과발현 및 감소된 약물 흡수와 연관된다.
림프종을 치료하기 위해 사용되는 여러 다른 화학치료제에 비해, 화합물 I의 세포 축적은 상대적으로 느리지만, 약물의 원상태 형태가 세포에서 검출되자마자 Fe(화합물 I)3 복합체가 존재하므로, Fe(화합물 I)3으로 신속하게 전환되는 것으로 나타난다. 6 h 경, Fe(화합물 I)3의 세포 함량은 원상태 형태의 함량을 약 18배만큼 초과하였다. 화합물 I이 중성인 반면, Fe(화합물 I)3은 훨씬 더 크고 막통과 유입을 손상시킬 것으로 예상될 2+ 전하를 함유한다는 점에 의해 설명될 수 있는 Fe(화합물 I)3 복합체의 효능은 원상태 약물의 효능보다 단지 2배 더 적다. Fe(화합물 I)3 복합체와 인큐베이션된 세포에서 원상태 약물이 검출 불가능하다는 점은 Fe(화합물 I)3이 약물의 활성 세포내 형태임을 강력히 제시한다. 2,10 인돌 고리 구조를 함유하는 약물은 Fe 및 Zn을 킬레이트화하는 것으로 알려져 있다. 화합물 I의 경우, Fe 킬레이트는 세포에 풍부한 반면, Zn 킬레이트는 검출 불가능했다. 실제로, Fe 킬레이트 수준은 화합물 I에 노출된 세포의 색상에 분홍색이 되도록 충분히 높았다. 고수준의 Fe(화합물 I)3은 그 형성이 세포 대사가 손상되는 지점까지 세포의 Fe를 고갈시키는지에 대한 의문을 일으키며 이는 추가 연구를 위해 흥미로운 지점으로 남아있다. 임의의 특정 이론에 의해 구애받지 않고, 화합물 I이 완전 조직 배양 배지와 인큐베이션된 경우 세포외 Fe(화합물 I)3이 검출되지 않았으므로, 킬레이트화는 세포내 환경에 의해 촉진될 수 있다.
BRCA1/2 기능의 손실에 의해 생성되는 상동 재조합의 결핍이 소정 유형의 DNA 손상 약물에 대한 과민성을 일으킨다는 관찰은 특히 난소암의 경우, 백금-함유 약물 시스플라틴(cisplatin) 및 카보플라틴(carboplatin), 및 PARP 억제제 올라파립 및 니라파립(niraparib)의 효과를 증가시키기 위해 활용되었다. Ledermann 등, "Olaparib Maintenance Therapy in Platinum-Sensitive Relapsed Ovarian Cancer," N. Engl. J. Med., 2012;366(15):1382-92; Mirza 등, "Niraparib Maintenance Therapy in Platinum-Sensitive, Recurrent Ovarian Cancer," N. Engl. J. Med., 2016;375(22):2154-64가 둘 다 참조로 포함된다. 다양한 정도의 상동 재조합 결핍이 다양한 다른 종양에서 더 낮은 빈도로 확인되었다. Davies 등, "HRDetect is a Predictor of BRCA1 and BRCA2 Deficiency Based on Mutational Signatures," Nat. Med. 2017;23(4):517-525가 본원에 참조로 포함된다. 화합물 I이 상동 재조합 결핍을 활용하는 능력은 상기 보수 기능의 손실이 과민성을 일으키는 모든 다른 약물과는 달리, 화합물 I이 최대 관용 용량에서도 골수억제를 일으키지 않으므로 특히 관심의 대상이다. Cercek 등, "Phase 1 study of COMPOUND I HCl, an Inducer of KLF4, in Patients with Advanced or Metastatic Solid Tumors," Invest. New Drugs, 2015;33(5):1086-92가 본원에 참조로 포함된다. 따라서, 화합물 I은 상기 중요한 치료 윈도우의 장점을 취할 수 있는 제한된 약물 레파토리에 연결된다. 본원에서 보고된 관찰은 γ-H2AX를 임상 약물 효과의 잠재적 바이오마커로 확인하며 화합물 I이 DNA 손상을 어떻게 유도하는지에 대한 보다 상세한 연구에 대한 방식을 지목한다. Ivashkevich 등, "Use of the Gamma-H2AX Assay to Monitor DNA Damage and Repair in Translational cancer Research," Cancer Lett, 2012;327(1-2):123-33이 본원에 참조로 포함된다.
Raji 림프종 세포에서 화합물 I에 대한 획득 내성의 발생은 화합물 I 및 Fe(화합물 I)3 복합체의 축적 감소와 연관되었다. 감수성 세포 대비 Raji/화합물 IR의 상대 내성에 완벽하게 대응하는 내성 세포(16.7 ± 3.9배)에 비해 Raji 감수성 세포에 16.5 ± 1.94배 더 많은 세포내 Fe(화합물 I)3이 존재하였다. Raji/화합물 IR 세포의 RNA-seq 분석은 가능한 내성 기전으로 ABCG2의 과발현을 가장 직접적으로 지목하였다. 웨스턴 블롯 분석은 단백질 수준에서 상향조절을 확인시켜주었고, ABCG2가 기능적이며 화합물 I 내성에 직접 관여된다는 것은 그 억제제가 화합물 I뿐만 아니라 토포테칸에 대한 내성을 부분적으로 역전시키는 능력에 의해 확립되었다. Fe(화합물 I)3의 축적이 사전-형성된 복합체와 인큐베이션된 내성 세포에서 감소되었다는 사실은 Fe(화합물 I)3뿐만 아니라 원상태 약물이 ABCG2 트랜스포터에 대한 기질일 수 있음을 제시한다. 증가된 ABCG2가 내성을 부여하는 알려진 클래스의 어느 약물도 화합물 I 또는 Fe(화합물 I)3과 뚜렷한 구조적 유사성을 갖지 않는다. 따라서, ABCG2가 화합물 I에 대한 내성을 매개할 수 있다는 발견은 상기 중요한 트랜스포터에 대해 알려진 기질의 범위를 확장시킨다. ABCG2가 화합물 I에 대한 민감성을 위한 바이오마커로 사용될 수 있는지 여부는 대규모 세포주 패널에서 탐색될 필요가 있을 것이다. 연결성 지도(https://portals.broadinstitute.org/cmap/)의 검색은 대규모 세포주 패널에서 화합물 I 및 지금까지 평가된 임의의 다른 약물의 세포독성 패턴 간에 여하한 유의미한 유사성을 개시하지 않아서 상기 화합물의 고유함을 더욱 강조하였다.
ABCG2의 특이적 억제제, Kol43이 획득된 화합물 I 내성을 완전 역전시키지 않았으므로, 다른 기전도 표현형에 기여할 가능성이 있는 것으로 보인다. 이에 관해, 카보플라틴에 대한 교차-내성이 특히 관심의 대상이다. 카보플라틴은 알려진 ABCG2 기질은 아니지만, 역시 DNA 손상을 유도하며 전사-커플링 보수의 상향조절은 둘 다 DNA에서 동일한 유형의 부가물을 생성하는 카보플라틴 및 시스플라틴 모두에 대한 내성에 기여하는 것으로 널리 보고되었다. Enoiu 등, "Repair of Cisplatin-induced DNA Interstrand Crosslinks by a Replication-independent Pathway Involving Transcription-coupled Repair and Translesion Synthesis," Nucleic Acids Res. 2012;40(18):8953-64가 본원에 참조로 포함된다. DNA 보수능의 상향조절이 카보플라틴 및 화합물 I 내성에 모두 기여하는지 여부는 여전히 결정되어야 한다.
또한 본원에 기재된 바와 같이, 화합물 I이 AML 세포에서 CDKN1A 상향조절 및 MYC 하향조절에 이어 G0-G1 세포 주기 정지 및 아폽토시스와 연관됨이 발견되었다. 또한, AML에서 널리 인식되는 중추적 종양유전자인 MYC의 억제는 화합물 I의 세포독성과 관련되었다. 차별적 발현 분석은 화합물 I 처리 후 γ-H2AX 축적의 유도, 및 세포성 스트레스 경로를 포함하는, DNA 손상의 관여를 제시하였다. 선행 세포 약리역학 연구는 화합물 I이 세포에서 단량체 형태로부터 제1철 복합체 [Fe(화합물 I)3]로 형질전환되며, 상기 복합체가 약물의 주요한 세포내 형태임을 실증하였다. 본 연구에서, 본 발명자들은 모체 화합물 I 및 Fe(화합물 I)3 복합체가 G-4중체(G4) 모티브에 결합하여 이를 안정화함을 실증한다. Fe(화합물 I)3 복합체는 핵심 종양 유전자(예로, MYC, KIT)의 프로모터에서 뿐만 아니라 rRNA 유전자 및 텔로미어에서 확인되는 G4 모티브를 안정화하였다. 모체 화합물 I 및 Fe(화합물 I)3은 dsDNA와 상호작용하지 않았으므로, 이차 DNA 구조의 이러한 안정화는 G4 모티브에 대해 특이적이었다. 사전형성된 Fe(화합물 I)3으로의 MV4-11 AML 세포의 처리는 또한 아폽토시스성 및 DNA 손상 경로의 유도와 더불어 MYC 발현을 억제하며 CDKN1A 발현을 유도한다. 종합하면, 결과는 MYC 및 그 하류 표적 유전자의 발현, 세포 주기 정지, 및 DNA 손상 그리고 스트레스에 대한 화합물 I의 효과가 G-4중체 DNA 모티브 상에서 화합물 I 및 Fe(화합물 I)3의 작용에 연관될 수 있다는 결론을 뒷받침한다.
정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 출원이 속하는 분야의 당업자에게 일반적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재되는 것들과 유사하거나 동등한 임의의 물질 및 방법이 본 출원의 실시 또는 평가에서 사용될 수 있지만, 대표 방법 및 물질이 본원에 기재된다.
본 명세서에 걸쳐 "하나의 구현예" 또는 "일 구현예"에 대한 언급은 구현예에 관해 기재되는 특정 특성, 구조 또는 특징이 적어도 하나의 구현예에 포함됨을 의미한다. 따라서, 본 명세서에 걸쳐 다양한 위치에서 어구 "하나의 구현예에서" 또는 "일 구현예에서"의 출현이 반드시 모두 동일한 구현예를 나타내는 것은 아니다. 또한, 특정 특성, 구조, 또는 특징은 하나 이상의 구현예에서 임의의 적합한 방식으로 조합될 수 있다. 또한, 본 명세서 및 첨부되는 청구범위에서 사용된 바와 같이, 내용 상 명확히 달리 지시되지 않는 한, 단수 형태("a", "an" 및 "the")에는 복수 언급이 포함된다. 또한 용어 "또는"은 내용 상 명확히 달리 나타내지 않는 한, 그 의미 내에 "및/또는"을 포함하여 일반적으로 채택됨이 주지되어야 한다.
달리 나타내지 않는 한, 명세서 및 청구범위에서 사용되는 성분, 반응 조건 등의 양을 표현하는 모든 수가 모든 경우 용어 "약"에 의해 수식되는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 반대로 나타내지 않는 한, 본 명세서 및 첨부되는 청구범위에 나타내는 수치 파라미터는 본 출원에 의해 수득하려는 요망되는 특성에 따라 변할 수 있는 근사치이다.
본 명세서를 통해, 소정 양에 대해 수치 범위가 제공된다. 이들 범위가 내부의 모든 하위범위를 포함하는 것이 이해되어야 한다. 따라서, 범위 "50 내지 80"에는 내부의 모든 가능한 범위(예로, 51~79, 52~78, 53~77, 54~76, 55~75, 60~70 등)가 포함된다. 또한, 주어진 범위 내의 모든 값은 이에 의해 포괄되는 범위에 대한 종단점일 수 있다(예로, 범위 50~80에는 종단점을 갖는 범위, 예컨대 55~80, 50~75 등이 포함됨).
화합물 I은 아래의 구조에 대한, 2-(5-플루오로-2-메틸-1H-인돌-3-일)-1H-이미다조[4,5-f][1,10]펜안트롤린, 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 에스테르, 전구약물, 수화물, 용매화물 및 이성질체를 나타낸다.
Figure pct00007
화합물 I
Fe(화합물 I)3은 하기 구조를 나타낸다:
Figure pct00008
Fe(화합물 I)3
"약학적으로 허용 가능한 염"에는 산 및 염기 부가염이 모두 포함된다.
화합물 I의 약학적으로 허용 가능한 염은 무기산 또는 유기산으로부터 유래되는 "약학적으로 허용 가능한 산 부가염"일 수 있고, 이러한 염은 음이온을 함유하는 약학적으로 허용 가능한 무독성 산 부가염일 수 있다. 예를 들어, 염에는 무기산, 예컨대 염산, 황산, 질산, 인산, 브롬화수소산, 요오드화수소산 등; 유기 카본산, 예컨대 타르타르산, 포름산, 시트르산, 아세트산, 트리클로로아세트산, 트리플루오로아세트산, 글루콘산, 벤조산, 락트산, 푸마르산, 말레산 등; 및 설폰산, 예컨대 메탄설폰산, 벤젠설폰산, p-톨루엔설폰산, 나프탈렌설폰산 등에 의해 형성되는 산 부가염이 포함될 수 있다.
화합물 I의 약학적으로 허용 가능한 염은 당분야에 널리 알려진 통상적 방법에 의해 제조될 수 있다. 구체적으로, 본 발명에 따른 "약학적으로 허용 가능한 염"은, 예로 수혼화성 유기 용매, 예컨대 아세톤, 메탄올, 에탄올 또는 아세토니트릴 등에 화합물 I을 용해시키고; 과량의 유기산 또는 무기산의 수용액을 여기에 첨가하고; 이렇게 수득된 혼합물을 침전시키거나 결정화하여 제조될 수 있다. 또한, 이는 용매 또는 과도한 산을 이로부터 추가 증발시킨 후; 혼합물을 건조하거나, 예로 흡입 필터를 사용해서 추출물을 여과하여 제조될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "킬레이트"는 적어도 하나의 2좌 리간드와 연관되고 선택적으로 하나 이상의 1좌 또는 다좌 리간드와 연관되는 중심 금속으로 제조되는 분자 물체를 의미한다. 예를 들어, 사용되는 "킬레이트"는 화합물 I의 적어도 하나의 2좌 리간드와 연관된 중심 금속으로 제조되는 분자 물체를 의미한다. 중심 금속 및 임의의 리간드 간 상호작용에서, 리간드 및 중심 금속 간 결합에는 공유 결합, 이온 결합, 및/또는 배위 공유 결합이 포함될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "복합체" 또는 "금속 복합체"는 금속 및 리간드의 배위 복합체를 의미한다. 예를 들어, 본원에서 사용되는 "복합체" 또는 "금속 복합체"는 금속 및 화합물 I의 배위 복합체를 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "금속"은 리간드와 배위결합할 수 있는 임의의 알칼리, 알칼리토, 전이, 희토, 기본, 및 반-금속을 의미한다. 대표 금속에는 전이 금속, 란탄계 금속, 및 악티늄계 금속이 포함된다. 일부 구현예에서, 금속은 리간드와 상호작용할 수 있는 d-오비탈을 갖는다. 예를 들어, 금속은 철, 아연, 알루미늄, 마그네슘, 백금, 은, 금, 크롬, 니켈, 티탄, 구리, 스칸듐, 지르코늄, 바나듐, 몰리브덴, 망간, 텅스텐 및 코발트일 수 있다. 하나의 구현예에서, 금속은 철이다.
본원에서 사용되는 용어 "에스테르"는 -(R)n-COOR'의 화학 구조를 갖는 화학적 모이어티를 나타내며, 식 중 달리 나타내지 않는 한, R 및 R'은 각각 독립적으로 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 헤테로아릴(방향족 고리에 의해 산소 원자에 연결됨) 및 헤테로지환족(방향족 고리에 의해 연결됨)으로 구성되는 군으로부터 선택되고, n은 0 또는 1이다.
본원에서 사용되는 용어 "전구약물"은 생체내 대사 활성화를 거쳐서 모체 약물을 생성할 전구체 화합물을 나타낸다. 전구약물은 일부 경우에서 이의 모체 약물에 비해 쉽게 투여될 수 있으므로, 종종 유용하다. 일부 경우에서, 일부 전구약물은 종종 불량한 생체이용률을 나타내는 이의 모체 약물과는 달리 경구 투여를 통해 생체 이용 가능하다. 또한, 전구약물은 이의 모체 약물에 비해 약학 조성물에서 개선된 용해도를 나타낼 수 있다. 예를 들어, 화합물 I은 약물의 용해도가 세포막을 통한 투과도에 악영향을 미칠 수 있으므로 약물 전달 효율을 증가시키기 위해 에스테르 전구약물의 형태로 투여될 수 있다. 이어서, 에스테르 전구약물 형태의 화합물이 표적 세포에 들어가면, 이는 카복실산 및 활성 물체로 대사적으로 가수분해될 수 있다.
화합물 I의 수화물 또는 용매화물은 본 발명의 범위 내에 포함된다. 본원에서 사용되는 "용매화물"은 용매화(용매 분자와 본 발명의 활성 제제의 분자 또는 이온과의 조합)에 의해 형성되는 복합체, 또는 용질 이온 또는 분자(본 발명의 활성 제제)와 하나 이상의 용매 분자로 구성되는 응집물을 의미한다. 용매는 물일 수 있고, 이 경우 용매화물은 수화물일 수 있다. 수화물의 예에는 비제한적으로 반수화물, 1수화물, 2수화물, 3수화물, 6수화물 등이 포함된다. 당업자에게는 본 발명의 화합물의 약학적으로 허용 가능한 염이 또한 용매화물 형태로 존재할 수 있음이 이해되어야 한다. 용매화물은 전형적으로 본 발명의 화합물의 제조의 일환인 수화를 통해 또는 본 발명의 무수 화합물에 의한 수분의 자연적 흡수를 통해 형성된다. 수화물을 포함하는 용매화물은 화학양론적 비로, 예로 용매화물 당 또는 수화물 분자 당 2개, 3개, 4개의 염 분자로 구성될 수 있다. 또 다른 가능성은, 예를 들어, 2개의 염 분자가 3개, 5개, 7개 용매 또는 수화물 분자와 화학양론적으로 관련된다. 결정화를 위해 사용되는 용매, 예컨대 알코올, 특히 메탄올 및 에탄올; 알데하이드; 케톤, 특히 아세톤; 에스테르, 예로 에틸 아세테이트는 특히 약학적으로 허용 가능한 용매로 격자화되는 결정에 포매될 수 있다.
본 개시의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 아트로프이성화(atropisomerization)가 가능하도록 하나 이상의 키랄 축을 함유할 수 있다. 아트로프이성질체(Atropisomer)는 단일 결합 주위의 회전이 방해되기 때문에 발생하는 입체이성질체로서, 여기서 입체 장애 또는 다른 기여인자로 인한 에너지차는 개별 이형태체의 단리를 허용하도록 충분히 높은 회전에 대한 장벽을 생성한다. 본 개시는 이들이 본원에서 구체적으로 도시되건 도시되지 않건, 모든 이러한 가능한 이성질체뿐만 아니라 이의 라세미체 및 광학적으로 순수한 형태를 포함하려는 것이다. 광학 활성 이성질체는 키랄 신톤(synthon) 또는 키랄 시약을 사용하여 제조되거나 통상적 기법, 예를 들어, 크로마토그래피 및 분별 결정화를 사용하여 분해될 수 있다. 개별 아트로프이성질체의 제조/단리를 위한 통상적인 기법에는, 예를 들어, 키랄 고압 액체 크로마토그래피(HPLC)를 사용하는 적합한 광학적으로 순수한 전구체로부터의 키랄 합성 또는 라세미체(또는 염 또는 유도체의 라세미체)의 분해가 포함된다.
"입체이성질체"는 동일한 결합에 의해 결합된 동일한 원자로 제조되지만 상호 교환 불가능한, 상이한 3차원 구조를 갖는 화합물을 나타낸다. 본 발명은 아트로프이성화에 관한 것이므로, 다양한 입체이성질체 및 이의 혼합물을 고려한다.
특정 질병 또는 장애에 대한 용어 "치료하다", "치료하는" 또는 "치료"에는 질병 또는 장애의 예방, 및/또는 질병 또는 장애의 증상 및/또는 병리의 감소, 개선, 완화 또는 폐지가 포함된다. 일반적으로, 본원에서 사용되는 용어는 질병 또는 병태의 증상 완화, 경감, 감소, 및 제거를 나타낸다. 본원에서 화합물 I은 제형물 또는 약제에서 치료 유효량으로 있을 수 있고, 이는 생물학적 효과, 예컨대 소정 세포(예로, 암 세포)의 DNA 손상, 아폽토시스, 소정 세포의 증식 감소를 야기하거나, 예를 들어 질병 또는 병태의 증상 완화, 경감, 감소, 또는 제거를 야기할 수 있는 양이다. 이 용어는 또한 세포 증식 속도의 감소 또는 중지(예로, 종양 성장의 둔화 또는 정지) 또는 증식하는 암 세포의 수 감소(예로, 종양의 일부 또는 전부의 제거)를 나타낼 수 있다.
상술된 바와 같은 치료가 질병, 장애, 또는 병태의 예방을 나타내는 경우, 상기 치료는 예방적으로 명명된다. 상기 예방제의 투여는 질병 또는 장애가 예방되거나, 대안적으로 그 진행이 지연되도록 하는 증식성 장애의 증상 특징의 발현 전에 일어날 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 세포 증식의 "억제" 또는 "감소"는 당업자에게 알려진 방법을 사용하여 측정된 바와 같이, 예를 들어 세포 증식의 양을 본 출원의 방법, 조성물, 및 조합을 거치지 않는 증식 세포와 비교되는 경우, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 100%만큼 둔화시키거나, 감소시키거나, 예를 들어 중지시키는 것을 의미한다.
본원에서 사용되는 "세포 주기 정지"는 그 분열 및 복제를 야기하는 세포에서 일어나는 일련의 이벤트의 정지를 나타내며, 이는 비제한적으로 DNA 손상, X-방사선, 이온화 방사선, 및 화학치료제를 포함하는 여러 요인에 의해 유도될 수 있다. 소정 구현예에서, "DNA 손상" 및 "세포 주기 정지"는 상호 교환적으로 사용된다.
본원에서 사용되는 용어 "아폽토시스"는 내인성 세포 자가-파괴 또는 자살 프로그램을 나타낸다. 유발 자극에 대해 반응하여, 세포는 세포 수축, 세포막의 물집형성 및 염색체 응축 및 단편화를 포함하는 이벤트의 캐스케이드를 거친다. 이들 이벤트는 막-결합 입자 클러스터(아폽토시스성 몸체)로의 세포 전환으로 완결되며, 이후 대식구에 의해 삼켜진다.
본원에서 사용되는 "골수억제"는 조혈의 하나 이상의 성분의 억제를 나타내며, 이는 상기 공정의 산물인 비정상적 수준의 하나 이상의 세포 유형으로 발현된다. 조혈, 및 조혈 세포의 특징의 리뷰에 대해서는 본원에 참조로 포함되는 Clinical Immunology: Principles and Practice, Vol. 1, Ch. 2, pp. 15-24 (Lewis and Harriman, eds. Mosby―Year Book, Inc. 1996)을 참고한다. 일반적 수준에서, 이는 백혈구 및/또는 혈소판 수의 감소를 나타낸다. 이는 또한 보다 구체적 수준에서, 조혈로 생성되는 하나 이상의 하기 세포: B-세포, T-세포, 자연 살해 세포, 수지상 세포, 대식구, 호중구, 호산구, 호염기구, 비만 세포 및 혈소판의 정상 수준 대비 억제를 나타낸다. 다른 용어가 골수억제와 상호 교환적으로 사용될 수 있고 당업자에게 용이하게 명백할 것이다. 이러한 용어의 비제한적 예에는 "골수 억제", "골수독성" 및 "골수제거"가 포함된다. 따라서, 반면에, "골수회복"은 골수억제의 반대이다. 따라서, 하나의 구현예에서, 용어 "골수 활성"은 조혈로 생성되는 하기 세포: B-세포, T-세포, 자연 살해 세포, 수지상 세포, 대식구, 호중구, 호산구, 호염기구, 비만 세포 혈소판, 적혈구, 혈소판, 골수 및 림프구 백혈구 및 당업자에게 명백한 다른 세포의 수준을 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "대상체"는 동물, 예컨대 포유류 또는 비-포유류를 나타낸다. 예를 들어, 대상체는 암의 치료 또는 예방을 필요로 하는 포유류, 예컨대 인간일 수 있다. 용어 대상체는　본 발명의 맥락에서 용어 환자와 상호 교환적으로　사용될 수 있다.
"포유류"에는 인간 및 가축 동물, 예컨대 실험실 동물 및 가정 애완동물(예로, 고양이, 개, 돼지, 소, 양, 염소, 말, 토끼), 및 비-가축 동물, 예컨대 야생동물 등이 모두 포함된다. 본원에서 사용되는 용어 "환자" 또는 "대상체"에는 인간 및 동물이 포함된다.
"비-포유류"에는 비-포유류 무척추동물 및 비-포유류 척추동물, 예컨대 조류(예로, 닭 또는 오리) 또는 어류가 포함된다.
"약학 조성물"은 본 개시의 화합물 및 포유류, 예로, 인간에 대한 생물학적 활성 화합물의 전달을 위해 당분야에서 일반적으로 허용되는 배지의 제형물을 나타낸다. 이러한 배지에는 이를 위한 모든 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형체가 포함된다.
"유효량"은 치료 유효량 또는 예방 유효량을 나타낸다. "치료 유효량"은 요망되는 치료 결과, 예컨대 암 세포사, 종양 크기 감소, 수명 증가 또는 예상 수명 증가를 달성하기 위해 필요한 투여량 및 그 시기 동안 효과적인 양을 나타낸다. 치료 유효량의 화합물은 요인, 예컨대 대상체의 질병 상태, 연령, 성별, 및 체중, 그리고 화합물이 대상체에서 요망되는 반응을 야기하는 능력에 따라 변할 수 있다. 투여량 요법은 최적 치료 반응을 제공하기 위해 조정될 수 있다. 치료 유효량은 또한 화합물의 임의의 독성 또는 유해한 효과를 치료적으로 유익한 효과가 능가하는 양이다. "예방 유효량"은 요망되는 예방 결과, 예컨대 더 작은 종양 또는 더 느린 세포 증식을 달성하기 위해 필요한 투여량 및 그 시기 동안 효과적인 양을 나타낸다. 전형적으로, 예방 용량은 질병 전에 또는 초기 단계에 대상체에서 사용되며, 이에 따라 예방 유효량은 치료 유효량 미만일 수 있다.
방법
본 발명은 대상체에서 암을 예방하거나, 감소시키거나, 치료하는 방법을 제공한다.
본 개시의 하나의 구현예에서, 대상체에 치료 유효량의
Figure pct00009
(화합물 I) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 유리 염기, 수화물, 복합체, 또는 킬레이트(철, 아연 등과 같은 금속 킬레이트를 포함)를 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 암을 예방하거나, 감소시키거나, 치료하는 방법이 제공되며, 여기서 대상체는 DNA 보수 유전자에 돌연변이를 갖는다. 하나의 구현예에서, 대상체는 인간이다. 또 다른 구현예에서, 대상체는 이미 암을 갖고 있다.
또 다른 구현예에서, 본 개시는 하나 이상의 금속 원자와 복합화된 치료 유효량의 화합물 I의 하나 이상의 분자를 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 암을 예방하거나, 감소시키거나, 치료하는 방법에 관한 것이며, 여기서 대상체는 DNA 보수 유전자에 돌연변이를 갖는다. 하나의 구현예에서, 하나 이상의 금속 원자는 철, 아연, 알루미늄, 마그네슘, 백금, 은, 금, 크롬, 니켈, 티탄, 구리, 스칸듐, 지르코늄, 바나듐, 몰리브덴, 망간, 텅스텐 및 코발트로 구성되는 군으로부터 선택된다. 하나의 구현예에서, 하나 이상의 금속 원자는 철이다. 소정 구현예에서, 복합체는 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00010
.
하나의 구현예에서, DNA 보수 유전자는 상동 재조합 유전자이다. 소정 구현예에서, DNA 보수 유전자는 상동 재조합(HR) 의존적 데옥시리보핵산(DNA) 이중 가닥 절단(DSB) 보수 경로의 유전자이다. 당업자는 HR 의존적 DNA DSB 보수 경로가 연속 DNA 나선을 재형성하기 위해 상동 기전을 통해 DNA에서 이중 가닥 절단(DSB)을 보수함을 이해할 것이다. K. K. Khanna and S. P. Jackson, Nat. Genet. 27(3): 247-254 (2001)의 전문이 본원에 참조로 포함된다. HR 의존적 DNA DSB 보수 경로의 성분에는 비제한적으로 ATM, ATR, CHK1, CHK2, RPA, RAD51, RAD51L1, RAD51C, RAD51L3, DMC1, XRCC2, XRCC3, RAD52, RAD54L, RAD54B, BRCA1, BRCA2, RAD50, MRE11A 및 NBS1이 포함된다. HR 의존적 DNA DSB 보수 경로에 관여되는 다른 단백질에는 조절 인자, 예컨대 EMSY가 포함된다. Hughes-Davies et al, Cell, Vol 115, pp 523-535가 본원에 그 전문이 참조로 포함된다. 따라서, 소정 구현예에서, DNA 보수 유전자는 BRCA-1, BRCA-2, ATM, ATR, CHK1, CHK2, Rad51, RPA, 및 XRCC3으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자이다. 소정 구현예에서, DNA 보수 유전자는 BRCA-1 및/또는 BRCA-2이다.
본 개시의 하나의 구현예에서, 대상체는 DNA 보수 유전자에서의 돌연변이에 대해 이종접합성이다. 소정 구현예에서, 대상체는 상동 재조합(HR) 의존적 데옥시리보핵산(DNA) 이중 가닥 절단(DSB) 보수 경로의 유전자에서의 돌연변이에 대해 이종접합성이다. 따라서, 소정 구현예에서, 상동 재조합(HR) 의존적 데옥시리보핵산(DNA) 이중 가닥 절단(DSB) 보수 경로의 유전자는 BRCA-1, BRCA-2, ATM, ATR, CHK1, CHK2, Rad51, RPA 및 XRCC3으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자이다. 소정 구현예에서, DNA 보수 유전자는 BRCA-1 및/또는 BRCA-2이다.
본 개시의 하나의 구현예에서, 대상체는 DNA 보수 유전자에서의 돌연변이에 대해 동종접합성이다. 소정 구현예에서, 대상체는 상동 재조합(HR) 의존적 데옥시리보핵산(DNA) 이중 가닥 절단(DSB) 보수 경로의 유전자에서의 돌연변이에 대해 동종접합성이다. 따라서, 소정 구현예에서, 상동 재조합(HR) 의존적 데옥시리보핵산(DNA) 이중 가닥 절단(DSB) 보수 경로의 유전자는 BRCA-1, BRCA-2, ATM, ATR, CHK1, CHK2, Rad51, RPA 및 XRCC3으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자이다. 소정 구현예에서, DNA 보수 유전자는 BRCA-1 및/또는 BRCA-2이다.
하나의 구현예에서, 대상체에는 암의 치료 또는 예방을 위해 치료 유효량의 화합물 I, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 유리 염기, 수화물, 복합체, 또는 킬레이트(철, 아연 등과 같은 금속 킬레이트를 포함)가 투여된다. 당업자는 본 개시의 맥락 내에서, 다양한 암이 치료되거나 예방될 수 있음을 이해할 것이다. 따라서, 하나의 구현예에서, 암은 헴(heme) 암, 결장직장암, 난소암, 유방암, 자궁경부암, 폐암, 간암, 췌장암, 림프절의 암, 백혈병, 직장암, 결장암, 전립샘암, 뇌암, 두부경부암, 뼈암, 후두 및 구강의 암종, 어윙 육종, 피부암, 신장 암, 및 심장의 암으로 구성되는 군으로부터 선택된다. 소정 구현예에서, 암은 유방암, 폐암, 림프절의 암, 결장암, 백혈병, 신장암, 및 전립샘암으로 구성되는 군으로부터 선택된다. 하나의 구현예에서, 암은 유방암이다. 일부 구현예에서, 암은 혈액 종양이다. 혈액 종양의 예에는 비제한적으로 백혈병, 림프종, 호지킨병, 및 골수종이 포함된다. 또한, 급성 림프구 백혈병(ALL), 급성 골수 백혈병(AML), 급성 전골수구 백혈병(APL), 만성 림프구 백혈병(CLL), 만성 골수 백혈병(CML), 만성 호중구 백혈병(CNL), 급성 미분화 백혈병(AUL), 역형성 큰 세포 림프종(ALCL), 전림프구 백혈병(PML), 소아 골수단핵구 백혈병(JMML), 성인 T-세포 ALL, 3계통 척수형성이상을 갖는, AML(AMLITMDS), 혼합 계통 백혈병(MLL), 호산구 백혈병, 맨틀 세포 림프종, 골수형성이상 증후군(MDS)(예로 고위험 MDS), 골수증식 장애(MPD), 및 다발성 골수종(MM). 일부 구현예에서, 암은 급성 골수 백혈병이다. 일부 구현예에서, 암은 만성 골수 백혈병이다. 일부 구현예에서, 암은 림프종이다. 일부 구현예에서, 암은 고위험 골수형성이상 증후군이다.
하나의 구현예에서, 대상체에는 BRCA-연관 암의 치료 또는 예방을 위해 치료 유효량의 화합물 I, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 유리 염기, 수화물, 복합체, 또는 킬레이트(철, 아연 등과 같은 금속 킬레이트를 포함)가 투여된다. 당업자는 다양한 암이 BRCA와 연관됨을 이해할 것이다. 하나의 구현예에서, BRCA-연관 암은 BRCA-1 및/또는 BRCA-2 유전자의 하나 이상의 돌연변이를 갖는다.
암 세포는 HR 의존적 DNA DSB 보수 경로의 성분에서 결핍의 특징인 표현형을 가질 수 있다, 즉 경로 성분의 활성이 암 세포에서 감소되거나 제거된다. 이러한 표현형을 갖는 암 세포는 경로의 성분, 예를 들어 상기 기재된 성분이 결핍될 수 있다, 즉 성분의 발현 및/또는 활성이, 예를 들어 인코딩 핵산에서 또는 조절 인자를 인코딩하는 유전자에서 돌연변이, 다형성 또는 후생적 개질, 예컨대 과메틸화에 의해 암 세포에서 감소되거나 제거될 수 있다.
일부 바람직한 구현예에서, 암 세포는 BRCA1 및/또는 BRCA2 결핍 표현형을 가질 수 있다, 즉 BRCA1 및/또는 BRCA2 활성이 암 세포에서 감소되거나 제거된다. 상기 표현형을 갖는 암 세포는 BRCA1 및/또는 BRCA2가 결핍될 수 있다, 즉 BRCA1 및/또는 BRCA2의 발현 및/또는 활성이, 예를 들어 인코딩 핵산에서 또는 조절 인자를 인코딩하는 유전자, 예를 들어 BRCA2 조절 인자를 인코딩하는 EMSY 유전자에서, 돌연변이, 다형성 또는 후생적 개질, 예컨대 과메틸화에 의해 암 세포에서 감소되거나 제거될 수 있다(Hughes-Davies et al, Cell, Vol 115, pp 523-535가 본원에 참조로 포함됨).
BRCA1 및 BRCA2는 그 야생형 대립유전자가 이종접합성 보인자의 종양에서 빈번하게 소실되는 것으로 알려진 종양 억제인자이다(Jasin M. Oncogene. 2002 Dec. 16; 21(58):8981-93; Tutt et al Trends Mol Med. (2002)8(12):571-6). 유방암과 BRCA1 및/또는 BRCA2 돌연변이의 연합은 당분야에서 잘 특성규명되어 있다(Radice P J Exp Clin Cancer Res. 2002 September; 21(3 Suppl):9-12가 본원에 참조로 포함됨). BRCA2 결합 인자를 인코딩하는 EMSY 유전자의 증폭도 유방암 및 난소암과 연관된 것으로 알려져 있다.
BRCA1 및/또는 BRCA2에서의 돌연변이의 보인자는 또한 난소암, 전립샘암 및 췌장암의 위험이 상승되어 있다.
다른 바람직한 구현예에서, 암 세포는 ATM, ATR, CHK1, CHK2, Rad51, DSS1, RPA 및/또는 XRCC3 결핍 표현형을 가질 수 있다, 즉 하나 이상의 이들 성분의 활성이 암 세포에서 감소되거나 제거된다. 암 세포는, 예를 들어, ATM, ATR, CHK1, CHK2, Rad51, DSS1, RPA 및/또는 XRCC3이 결핍될 수 있다, 즉 ATM, ATR, CHK1, CHK2, Rad51, DSS1, RPA 및/또는 XRCC3의 발현 및/또는 활성이, 예를 들어, 인코딩 핵산에서 또는 조절 인자를 인코딩하는 유전자에서 돌연변이, 다형성 또는 후성적 개질, 예컨대 과메틸화에 의해 암 세포에서 감소되거나 제거될 수 있다.
하나의 구현예에서, 치료 유효량의 화합물 I, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 유리 염기, 수화물, 복합체, 또는 킬레이트(철, 아연 등과 같은 금속 킬레이트를 포함)가 투여되는 돌연변이된 DNA-보수 유전자를 갖는 대상체는 동물이다. 소정 구현예에서, 대상체는 포유류이다. 따라서, 본 개시의 맥락 내에서 대상체는 인간, 가축 동물(예로, 실험실 동물), 가정 애완동물(예로, 고양이, 개, 돼지, 소, 양, 염소, 말, 토끼), 및 비-가축 동물, 예컨대 야생동물 등일 수 있다. 하나의 구현예에서, 대상체는 인간이다.
골수억제
하나의 구현예에서, 본 개시의 방법은 대상체에 대한 치료 유효량의 화합물 I, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 유리 염기, 수화물, 복합체, 또는 킬레이트의 투여에 대한 것이며, 여기서 치료 유효량의 화합물 I을 투여받지 않은 대상체에 비해 상기 대상체에서의 골수억제의 발생율은 예방되거나 저하된다. 소정 구현예에서, 치료 유효량의 화합물 I을 투여받지 않은 대상체에는 암의 치료 또는 예방을 위해 화합물 I이 아닌 화학치료제가 투여되었다. 따라서, 하나의 구현예에서, 본 개시의 방법은 대상체에 대한 치료 유효량의 화합물 I, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 유리 염기, 수화물, 복합체, 또는 킬레이트(철, 아연 등과 같은 금속 킬레이트를 포함)의 투여에 대한 것이며, 여기서 화합물 I이 아닌 화학치료제를 투여받은 대상체에 비해 상기 대상체에서의 골수억제의 발생률은 예방되거나 저하된다. 본원에서 사용되는, 골수억제는 일반적으로 조혈(예로, 골수 활성)의 하나 이상의 성분의 억제를 나타내며, 이는 상기 공정의 산물인 비정상적인 수준의 하나 이상의 세포 유형으로 발현된다. 조혈(예로, 골수 활성)의 하나 이상의 성분의 억제는, 예를 들어, 백혈구수 및/또는 혈소판수의 억제를 나타낼 수 있다. 따라서, 하나의 구현예에서, 대상체에 치료 유효량의 화합물 I 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 유리 염기, 수화물, 복합체, 또는 킬레이트(철, 아연 등과 같은 금속 킬레이트를 포함)를 투여하는 단계를 포함하는 본 개시의 방법은 대상체에서의 암 예방, 감소 또는 치료를 위해 제공되며, 여기서 대상체는 DNA 보수 유전자에 돌연변이를 갖고 대상체는 치료 유효량의 화합물 I을 투여받지 않은 대상체에 비해 골수 활성의 90% 미만 감소를 경험한다. 예를 들어, 대상체는 치료 유효량의 화합물 I을 투여받지 않은 대상체에 비해 골수 활성의 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 24%, 23%, 22%, 21%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.75%, 0.5%, 0.25% 미만 감소를 경험한다. 하나의 구현예에서, 치료 유효량의 화합물 I을 투여받은 대상체는 치료 유효량의 화합물 I을 투여받지 않은 대상체에 비해 골수 활성의 10% 미만 감소를 경험한다. 하나의 구현예에서, 치료 유효량의 화합물 I을 투여받은 대상체는 치료 유효량의 화합물 I을 투여받지 않은 대상체에 비해 골수 활성의 감소를 경험하지 않는다.
하나의 구현예에서, 대상체에 치료 유효량의 화합물 I, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 유리 염기, 수화물, 복합체, 또는 킬레이트(철, 아연 등과 같은 금속 킬레이트를 포함)를 투여하는 단계를 포함하는 방법이 대상체에서의 암 치료를 위해 제공되며, 여기서 대상체는 DNA 보수 유전자에 돌연변이를 갖는다. 소정 구현예에서, 암과 연관되며, 당업자에게 용이하게 명백한 다양한 병리학적 병태는 치료 유효량의 화합물 I 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 유리 염기, 수화물, 복합체, 또는 킬레이트(철, 아연 등과 같은 금속 킬레이트를 포함)를 투여함으로써 암을 갖는 대상체에서 치료될 수 있다. 따라서, 하나의 구현예에서, 대상체는 암과 연관된 종양의 크기 감소 또는 축소를 경험한다. 종양 크기의 감소 또는 축소는 그 안의 모든 정수 및 범위를 포함하여, 종양 크기의 약 1% 감소 또는 축소 내지 종양 크기의 약 100% 감소 또는 축소의 임의의 지점에 있을 수 있다. 예를 들어, 종양 크기의 감소 또는 축소는 약 1%, 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 또는 약 100%일 수 있다. 하나의 구현예에서, 대상체는 암과 연관된 종양의 완전 제거(즉, 종양 크기의 100% 감소 또는 축소)를 경험한다. 또 다른 구현예에서, 대상체는 암과 연관된 종양에서 신혈관형성 또는 혈관신생의 억제, 감소, 또는 축소를 경험한다. 암과 연관된 종양에서 신혈관형성 또는 혈관신생의 감소 또는 축소는 그 안의 모든 정수 및 범위를 포함하여, 신혈관형성 또는 혈관신생의 약 1% 감소 또는 축소 내지 신혈관형성 또는 혈관신생의 약 100% 감소 또는 축소의 임의의 지점에 있을 수 있다. 예를 들어, 신혈관형성 또는 혈관신생의 감소 또는 축소는 약 1%, 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 또는 약 100%일 수 있다. 하나의 구현예에서, 대상체는 암과 연관된 신혈관형성 또는 혈관신생의 완전 감소 또는 축소(즉, 신혈관형성 또는 혈관신생의 100% 감소 또는 축소)를 경험 한다.
하나의 구현예에서, 본 개시는 암 세포를 치료 유효량의 화합물 I, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 유리 염기, 수화물, 복합체, 또는 킬레이트(철, 아연 등과 같은 금속 킬레이트를 포함)와 접촉시키는 단계를 포함하는, 암 세포를 사멸시키는 방법에 대한 것이다. 소정 구현예에서, 암 세포는 BRCA-1, BRCA-2, ATM, ATR, CHK1, CHK2, Rad51, RPA 및 XRCC3으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자에 결핍을 갖는다.
하나의 구현예에서, 본 개시는 암 세포를 치료 유효량의
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또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 유리 염기, 수화물, 복합체, 또는 킬레이트(철, 아연 등과 같은 금속 킬레이트를 포함)와 접촉시키는 단계를 포함하는, 암 세포에서 세포 주기 정지를 유도하는 방법에 관한 것이다. 소정 구현예에서, 암 세포는 BRCA-1, BRCA-2, ATM, ATR, CHK1, CHK2, Rad51, RPA 및 XRCC3으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자에 결핍을 갖는다.
하나의 구현예에서, 대상체에서 G-4중체(G4)를 안정화하는 방법이 제공되며, 여기서 방법은 대상체에 치료 유효량의 화합물 I, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 유리 염기, 수화물, 복합체, 또는 킬레이트(철, 아연 등과 같은 금속 킬레이트를 포함)를 투여하는 단계를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 대상체에서 G-4중체(G4)를 안정화하는 방법이 제공되며, 여기서 방법은 대상체에 화합물 I, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 유리 염기, 수화물, 복합체, 또는 킬레이트(철, 아연 등과 같은 금속 킬레이트를 포함), 및 본원에 기재된 바와 같은 적어도 하나의 추가적인 치료 활성 제제를 포함하는 치료 유효량의 약학 조합을 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 대상체에서 G-4중체(G4)를 안정화하는 방법이 제공되며, 여기서 방법은 대상체에 화합물 I, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 유리 염기, 수화물, 복합체, 또는 킬레이트(철, 아연 등과 같은 금속 킬레이트를 포함)를 포함하는 치료 유효량의 약학 조합을 투여하는 단계, 및 대상체에 상기 언급된 화합물이 투여되기 전에, 동안, 또는 후에 방사선 치료법 또는 적어도 하나의 추가적인 치료 활성 제제를 투여하는 단계를 포함한다.
하나의 구현예에서, 화합물 I, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 유리 염기, 수화물, 복합체, 또는 킬레이트(철, 아연 등과 같은 금속 킬레이트를 포함)는 약 1 ㎎/일 내지 약 3 g/일의 용량으로 투여된다. 소정 구현예에서, 화합물 I, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 유리 염기, 수화물, 복합체, 또는 킬레이트(철, 아연 등과 같은 금속 킬레이트를 포함)는 약 1 ㎎/일 내지 약 200 ㎎/일의 용량으로 투여된다. 소정 구현예에서, 화합물 I, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 유리 염기, 수화물, 복합체, 또는 킬레이트(철, 아연 등과 같은 금속 킬레이트를 포함)는 약 50 ㎎/일 내지 약 200 ㎎/일의 용량으로 투여된다.
조합 치료법
하나의 구현예에서, 본 발명은 화합물 I을 적어도 하나의 추가적인 치료 활성 제제와 함께 포함하는 조합 치료법을 제공한다.
하나의 구현예에서, 본 발명은 치료를 필요로 하는 환자에서 세포 증식과 연관된 병태를 치료하는 방법을 제공한다. 하나의 구현예에서, 본 발명은 암 또는 종양을 치료하는 방법을 제공한다. 방법은 치료를 필요로 하는 환자에게 치료 유효량의 화합물 I, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 유리 염기, 수화물, 에스테르, 용매화물 및/또는 전구약물 및 적어도 하나의 추가적인 치료 활성 제제를 공동-투여하는 단계를 포함한다. 하나의 구현예에서, 적어도 하나의 추가적인 치료 활성 제제는 올라파립이다.
용어 "공동-투여" 또는 "공동투여"는 함께 협력된 방식으로의 (a) 화합물 I, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 유리 염기, 수화물, 복합체, 또는 킬레이트(철, 아연 등과 같은 금속 킬레이트를 포함) 및 (b) 적어도 하나의 추가적인 치료 활성 제제의 투여를 나타낸다. 예를 들어, 공동-투여는 동시적 투여, 순차적 투여, 중복 투여, 간격 투여, 연속 투여, 또는 이의 조합일 수 있다. 하나의 구현예에서, 화합물 I, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 유리 염기, 수화물, 복합체, 또는 킬레이트(철, 아연 등과 같은 금속 킬레이트를 포함) 및 적어도 하나의 추가적인 치료 활성 제제는 단일 투여형으로 제형화된다. 또 다른 구현예에서, 화합물 I, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 유리 염기, 수화물, 복합체, 또는 킬레이트(철, 아연 등과 같은 금속 킬레이트를 포함) 및 적어도 하나의 추가적인 치료 활성 제제는 별도 투여형으로 제공된다.
약학 제형물
또 다른 구현예에서, 본 발명은 약학적으로 허용 가능한 부형제 또는 담체와 조합되어, 활성 성분으로 본원에 개시된 바와 같은 치료 유효량의 화합물 I 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 유리 염기, 수화물, 복합체, 또는 킬레이트(철, 아연 등과 같은 금속 킬레이트를 포함)를 포함하는 약학 조성물 및/또는 조합을 제공한다. 부형제는 다양한 목적을 위해 제형물에 첨가된다.
일부 구현예에서, 화합물 I 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 유리 염기, 수화물, 복합체, 또는 킬레이트(철, 아연 등과 같은 금속 킬레이트를 포함) 및 적어도 하나의 치료 활성 제제는 단일 약학 조성물 및/또는 조합으로 제형화될 수 있다. 일부 구현예에서, 화합물 I 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 유리 염기, 수화물, 복합체, 또는 킬레이트(철, 아연 등과 같은 금속 킬레이트를 포함) 및 적어도 하나의 치료 활성 제제는 약학적으로 허용 가능한 부형제 또는 담체를 포함하는 별도 약학 조성물 및/또는 조합으로 제형화된다.
특정 구현예에서, 화합물 I 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 유리 염기, 수화물, 복합체, 또는 킬레이트(철, 아연 등과 같은 금속 킬레이트를 포함) 및 적어도 하나의 치료 활성 제제는 단일 약학 조성물 및/또는 조합 조성물로 제형화될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 조성물은 약 1 ㎎ 내지 약 1 g의 양으로 본원에 개시된 바와 같은 화합물 I 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 유리 염기, 수화물, 복합체, 또는 킬레이트(철, 아연 등과 같은 금속 킬레이트를 포함)를 포함할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 양은 약 5 ㎎ 내지 약 500 ㎎이다. 또 다른 구현예에서, 양은 약 20 ㎎ 내지 약 400 ㎎이다. 또 다른 구현예에서, 양은 약 50 ㎎ 내지 약 300 ㎎이다. 또 다른 구현예에서, 양은 약 100 ㎎ 내지 약 200 ㎎이다. 또 다른 구현예에서, 화합물은 화합물 I의 염, 에스테르, 용매화물 또는 전구약물이다.
또 다른 구현예에서, 약학 조성물은 약 0.1 ㎎/㎖ 내지 약 10 ㎎/㎖인 농도의 화합물 I 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 유리 염기, 수화물, 복합체, 또는 킬레이트(철, 아연 등과 같은 금속 킬레이트를 포함)를 포함할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 농도는 약 0.5 ㎎/㎖ 내지 약 5 ㎎/㎖이다. 또 다른 구현예에서, 농도는 약 0.75 ㎎/㎖ 내지 약 4.5 ㎎/㎖이다. 또 다른 구현예에서, 농도는 약 3 ㎎/㎖ 내지 약 5 ㎎/㎖이다.
또 다른 구현예에서, 화합물은 화합물 I의 염, 에스테르, 용매화물 또는 전구약물이다. 또 다른 구현예에서, 조성물은 화합물 I, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 유리 염기, 수화물, 에스테르, 용매화물 및/또는 전구약물, 및 PARP 억제제를 포함할 수 있다. 또 다른 구현예에서, PARP 억제제는 올라파립이다.
또 다른 구현예에서, 조성물은 화합물 I, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 유리 염기, 수화물, 에스테르, 용매화물 및/또는 전구약물 및 올라파립을 포함할 수 있고, 여기서 조성물 중 올라파립의 양은 약 10 ㎎ 내지 약 800 ㎎이다. 또 다른 구현예에서, 올라파립의 양은 약 20 ㎎ 내지 약 600 ㎎이다. 또 다른 구현예에서, 올라파립의 양은 약 100 ㎎ 내지 약 500 ㎎이다. 또 다른 구현예에서, 올라파립의 양은 약 300 ㎎ 내지 약 400 ㎎이다.
약학적으로 허용 가능한 부형제가 조성물/제형물에 첨가될 수 있다. 예를 들어, 희석제가 본 발명의 제형물에 첨가될 수 있다. 희석제는 고체 약학 조성물 및/또는 조합의 부피를 증가시키며, 환자 및 케어 제공자가 취급하기 더 쉬운 조성물 및/또는 조합을 함유하는 약학 투여형을 제조할 수 있다. 고체 조성물 및/또는 조합을 위한 희석제에는, 예를 들어, 미세결정성 셀룰로스(예로, AVICEL), 마이크로파인 셀룰로스, 락토스, 전분, 사전젤라틴화 전분, 칼슘 카보네이트, 칼슘 설페이트, 설탕, 덱스트레이트, 덱스트린, 덱스트로스, 2염기성 칼슘 포스페이트 2수화물, 3염기성 칼슘 포스페이트, 카올린, 마그네슘 카보네이트, 마그네슘 옥사이드, 말토덱스트린, 만니톨, 폴리메타크릴레이트(예로, EUDRAGIT(r)), 염화 칼륨, 분말화 셀룰로스, 나트륨 클로라이드, 소르비톨, 및 활석이 포함된다.
투여형, 예컨대 정제로 압축되는 고체 약학 조성물 및/또는 조합에는 그 기능에 압축 후 활성 성분 및 다른 부형제를 함께 결합하도록 돕는 것이 포함되는 부형제가 포함될 수 있다. 고체 약학 조성물 및/또는 조합에 대한 결합제에는 아카시아, 알긴산, 카보머(예로, 카보폴), 카복시메틸셀룰로스 나트륨, 덱스트린, 에틸 셀룰로스, 젤라틴, 구아 검, 트래거캔스 검, 수소화 식물성 오일, 하이드록시에틸 셀룰로스, 하이드록시프로필 셀룰로스(예로, KLUCEL), 하이드록시프로필 메틸 셀룰로스(예로, METHOCEL), 액체 글루코스, 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 말토덱스트린, 메틸셀룰로스, 폴리메타크릴레이트, 포비돈(예로, KOLLIDON, PLASDONE), 사전젤라틴화 전분, 나트륨 알기네이트, 및 전분이 포함된다.
환자의 위에서 압축 고체 약학 조성물 및/또는 조합의 용해 속도는 조성물 및/또는 조합에 대한 붕해제의 첨가에 의해 증가될 수 있다. 붕해제에는 알긴산, 카복시메틸셀룰로스 칼슘, 카복시메틸셀룰로스 나트륨(예로, AC-DI-SOL 및 PRIMELLOSE), 콜로이드성 실리콘 디옥사이드, 크로스카르멜로스 나트륨, 크로스포비돈(예로, KOLLIDON 및 POLYPLASDONE), 구아 검, 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 메틸 셀룰로스, 미세결정성 셀룰로스, 폴아크릴린 칼륨, 분말화 셀룰로스, 사전젤라틴화 전분, 나트륨 알기네이트, 나트륨 전분 글리콜레이트(예로, EXPLOTAB), 감자 전분, 및 전분이 포함된다.
활택제는 비압축 고체 조성물 및/또는 조합의 유동성을 개선하고 투여의 정확성을 개선하기 위해 첨가될 수 있다. 활택제로 기능할 수 있는 부형제에는 콜로이드성 실리콘 디옥사이드, 마그네슘 트리실리케이트, 분말화 셀룰로스, 전분, 활석, 및 3염기성 칼슘 포스페이트가 포함된다.
투여형, 예컨대 정제가 분말화 조성물 및/또는 조합의 압축에 의해 제조되는 경우, 조성물 및/또는 조합은 펀치 및 염료부터의 압력을 거친다. 일부 부형제 및 활성 성분은 펀치 및 염료의 표면에 부착하는 경향을 가지며, 이는 제품이 표면구멍(pitting) 및 다른 표면 불규칙부를 갖도록 유도할 수 있다. 윤활제는 조성물 및/또는 조합에 첨가되어 염료로부터의 제품의 방출을 용이하게 하고 접착을 감소시킬 수 있다. 윤활제에는 마그네슘 스테아레이트, 칼슘 스테아레이트, 글리세릴 모노스테아레이트, 글리세릴 팔미토스테아레이트, 수소화 피마자 오일, 수소화 식물성 오일, 미네랄 오일, 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨 벤조에이트, 나트륨 라우릴 설페이트, 나트륨 스테아릴 푸마레이트, 스테아르산, 활석, 및 아연 스테아레이트가 포함된다.
풍미화제 및 풍미 증강제는 투여형을 환자에게 좀더 맛있게 만든다. 본 발명의 조성물 및/또는 조합에 포함될 수 있는 약학 제품에 대한 일반 풍미화제 및 풍미 증강제에는 말톨, 바닐린, 에틸 바닐린, 멘톨, 시트르산, 푸마르산, 에틸 말톨, 및 타르타르산이 포함된다.
고체 및 액체 조성물 및/또는 조합은 또한 이의 외관을 개선하고/하거나 제품 및 단위 투여량 수준의 환자 확인을 촉진하기 위해 임의의 약학적으로 허용 가능한 착색제를 사용하여 염색될 수 있다.
액체 약학 조성물 및/또는 조합은 본 발명의 화합물 I, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 유리 염기, 수화물, 에스테르, 용매화물 및/또는 전구약물 및 임의의 다른 고체 부형제를 사용하여 제조될 수 있고 여기서 상기 성분은 액체 담체, 예컨대 물, 식물성 오일, 알코올, 폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 글리세린, 또는 마크로골 15 하이드록시스테아레이트(Solutol) 중에 용해되거나 현탁된다.
액체 약학 조성물 및/또는 조합은 액체 담체 중에 가용성이 아닌 활성 성분 또는 다른 부형제를 조성물 및/또는 조합에 걸쳐 균일하기 분산시키기 위해 유화제를 함유할 수 있다. 본 발명의 액체 조성물 및/또는 조합에서 유용할 수 있는 유화제에는, 예를 들어, 젤라틴, 난황, 카제인, 콜레스테롤, 아카시아, 트래거캔스, 콘드러스(chondrus), 펙틴, 메틸 셀룰로스, 카보머, 세토스테아릴 알코올, 및 세틸 알코올이 포함된다.
액체 약학 조성물 및/또는 조합은 또한 제품의 구감을 개선하고/하거나 위장관벽을 코팅하기 위해 점도 증강제를 함유할 수 있다. 이러한 제제에는 아카시아, 알긴산 벤토나이트, 카보머, 카복시메틸셀룰로스 칼슘 또는 나트륨, 세토스테아릴 알코올, 메틸 셀룰로스, 에틸셀룰로스, 젤라틴 구아 검, 하이드록시에틸 셀룰로스, 하이드록시프로필 셀룰로스, 하이드록시프로필 메틸 셀룰로스, 말토덱스트린, 폴리비닐 알코올, 포비돈, 프로필렌 카보네이트, 프로필렌 글리콜 알기네이트, 나트륨 알기네이트, 나트륨 전분 글리콜레이트, 전분 트래거캔스, 및 잔탄 검이 포함된다.
감미제, 예컨대 아스파탐, 락토스, 소르비톨, 사카린, 나트륨 사카린, 수크로스, 아스파탐, 프룩토스, 만니톨, 및 전화당이 맛을 개선하기 위해 첨가될 수 있다.
보존제 및 킬레이트화제, 예컨대 알코올, 나트륨 벤조에이트, 부틸화 하이드록실 톨루엔, 부틸화 하이드록시아니솔, 및 에틸렌디아민 테트라아세트산이 저장 안정성을 개선하기 위해 섭취에 안전한 수준으로 첨가될 수 있다.
액체 조성물 및/또는 조합은 또한 완충제, 예컨대 구콘산(guconic acid), 락트산, 시트르산 또는 아세트산, 나트륨 구코네이트(guconate), 나트륨 락테이트, 나트륨 시트레이트, 또는 나트륨 아세테이트를 함유할 수 있다. 부형제 및 사용량의 선택은 경험 및 당분야에서의 표준 절차 및 참고 작업의 고려에 기반하여 제형 과학자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 고체 조성물 및/또는 조합에는 분말, 과립, 응집물 및 압축 조성물 및/또는 조합이 포함된다. 투여량에는 경구, 협측, 직장, 비경구(피하, 근육내, 및 정맥내 포함), 흡입 및 안과적 투여에 적합한 투여량이 포함된다. 임의의 주어진 경우에서 가장 적합한 투여는 치료받는 병태의 성질 및 중증도에 의존할 것이지만, 본 발명의 가장 바람직한 경로는 경구이다. 투여량은 단위 투여형으로 편리하게 제공되고 약학 분야에 널리 알려진 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다.
투여형에는 고체 투여형, 예컨대 정제, 분말, 캡슐, 좌약, 사체트, 트로키 및 로젠지뿐만 아니라 액체 시럽, 현탁액, 에어로졸 및 엘릭서가 포함된다.
본 발명의 투여형은 경질 또는 연질 셸 내에 본 발명의 조성물 및/또는 조합, 바람직하게는 분말화 또는 과립화 고체 조성물 및/또는 조합을 함유하는 캡슐일 수 있다. 셸은 젤라틴으로 제조되고 선택적으로 가소제, 예컨대 글리세린 및 소르비톨, 및 불투명화제 또는 착색제를 함유할 수 있다.
정제화 또는 캡슐 충전을 위한 조성물 및/또는 조합은 습식 제립에 의해 제조될 수 있다. 습식 제립에서, 분말 형태의 활성 성분 및 부형제의 일부 또는 전부가 배합된 후 분말이 과립으로 덩어리지도록 유도하는 액체, 전형적으로 물의 존재 하에 추가 혼합된다. 과립이 스크리닝되고/되거나 제분되고, 건조된 후 요망되는 입자 크기로 스크리닝되고/되거나 제분된다. 과립이 정제화될 수 있거나, 다른 부형제, 예컨대 활택제 및/또는 윤활제가 정제화 전에 첨가될 수 있다.
정제화 조성물 및/또는 조합은 건식 배합에 의해 통상적으로 제조될 수 있다. 예를 들어, 활성제 및 부형제의 배합 조성물 및/또는 조합이 슬러그(slug) 또는 시트로 압축된 후 압축 과립으로 세분될 수 있다. 압축 과립은 이후 정제로 압축될 수 있다.
건조 제립에 대한 대안으로서, 배합 조성물 및/또는 조합은 직접 압축 기법을 사용하여 압축 투여형으로 직접 압축될 수 있다. 직접 압축은 과립이 없는 보다 균일한 정제를 생성한다. 특히 직접 압축 정제화에 매우 적합한 부형제에는 미세결정성 셀룰로스, 분무 건조 락토스, 2칼슘 포스페이트 2수화물 및 콜로이드성 실리카가 포함된다. 직접 압축 정제화에서 이들 및 다른 부형제의 적절한 사용은 특히 직접 압축 정제화의 제형화 어려움에 경험과 기술을 갖춘 당업자에게 알려져 있다.
본 발명의 캡슐 충전은 정제화에 관해 기재된 임의의 상기 언급되는 배합물 및 과립을 포함할 수 있다; 그러나, 이들은 최종 정제화 단계를 거치지 않는다.
활성 성분 및 부형제는 당분야에 알려진 방법에 따라 조성물 및/또는 조합 및 투여형으로 제형화될 수 있다.
하나의 구현예에서, 투여형은 화합물 I, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 유리 염기, 수화물, 에스테르, 용매화물 및/또는 전구약물 및 약학적으로 허용 가능한 부형제 및 담체를 별도 성분으로 포함하는 키트로 제공될 수 있다. 하나의 구현예에서, 투여형은 화합물 I, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 유리 염기, 수화물, 에스테르, 용매화물 및/또는 전구약물, 적어도 하나의 추가적인 치료 활성 제제, 및 약학적으로 허용 가능한 부형제 및 담체를 별도 성분으로 포함하는 키트로 제공될 수 있다. 일부 구현예에서, 투여형 키트는 의사 및 환자가 화합물 I, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 유리 염기, 수화물, 에스테르, 용매화물 및/또는 전구약물을 약학적으로 허용 가능한 부형제 및 담체의 용해, 현탁화, 또는 혼합에 의해 사용 전에 경구 용액 또는 주사 용액으로 제형화할 수 있도록 한다. 하나의 구현예에서, 화합물 I, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 유리 염기, 수화물, 에스테르, 용매화물 및/또는 전구약물의 사전 제형화된 제형물과 비교되는 경우 안정성이 개선된 화합물 I, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 유리 염기, 수화물, 에스테르, 용매화물 및/또는 전구약물을 제공하는 투여형 키트.
하나의 구현예에서, 본 발명의 약학 제형물 또는 조성물 및/또는 조합은 제형물 또는 조성물 및/또는 조합에서 본원에서 기재된 바와 같은 화합물 I, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 유리 염기, 수화물, 에스테르, 용매화물 및/또는 전구약물을 25~100 중량% 또는 50~100 중량% 함유한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 방법에는 상술된 약학 제형물 또는 조성물 및/또는 조합으로 치료 유효량의 화합물 I 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 유리 염기, 수화물, 복합체, 또는 킬레이트(철, 아연 등과 같은 금속 킬레이트를 포함)를 투여하는 단계가 포함된다. 특정 구현예에서, 방법은 대상체에서 암을 예방하거나, 감소시키거나, 치료하기 위한 것이다. 또 다른 구현예에서, 방법은 암 세포를 사멸시키기 위한 것이다. 또 다른 구현예에서, 방법은 암 세포에서 세포 주기 정지를 유도하기 위한 것이다.
하기 실시예는 본 발명을 추가로 예시하지만 어떠한 방식으로든 그 범위를 제한하는 것으로 간주되어서는 안 된다.
실시예
실시예 1: 실시예 2~7을 위한 물질 및 방법
약물 및 시약
화합물 I 및 중수소화 화합물 I(화합물 I-d6)은 APTOSE Biosciences(샌디에고, 캘리포니아)에서 제공받았다. 세제-상용성 단백질 검정 키트, DC™ 단백질 검정은 BioRad Laboratories, Inc.(헤르큘레스, 캘리포니아)에서 구입하였다. CellTiter 96® Aqueous One Solution 세포 증식 검정(MTS)은 Promega(매디슨, 위스콘신)에서 구입하였다. PARP, MCL-1, BAD, BIK, Na+/K+ ATP아제 항체는 Cell Signaling Technology, Inc.(댄버스, 매사츄세츠)에서 구입하였다. pSer139 H2AX 및 ATM 항체는 Abcam(캠브리지, 영국)에서 구입하였다. ABCG2 항체는 KAMIYA Biomedical(투퀼라, 워싱턴)에서 구입하였다. Kol43 및 pSer1981-ATM 항체는 Millipore Sigma(세인트 루이스, 미주리)에서 입수하였다. 올라파립은 Selleckchem(휴스톤, 텍사스)에서 구입하였다. 카보플라틴 및 토포테칸은 UCSD Moores Cancer Center Pharmacy에서 입수하였다.
세포 유형 및 배양
인간 버키트 림프종 세포주 Raji를 미국 타입 조직 배양 컬렉션에서 입수하여 37℃ 및 5% CO2에서 10% 우태 혈청(ATCC)이 보충된 RPMI 1640 배지(ATCC) 중에 배양하였다. 6개월의 기간에 걸쳐 점차적으로 높은 농도의 화합물 I에 대한 노출에 의해 화합물 I-내성 Raji(Raji/화합물 IR) 세포주를 생성하였다. CAOV3 세포를 ATCC에서 입수하여 10% 우태 혈청이 보충된 완전 DMEM 중에 배양하였다. MCF7 벡터 대조 및 BRCA1 shRNA 서브클론은 Dr. Simon Powell(Memorial Sloan-Kettering Cancer Center)에서 입수하여 10% 우태 혈청 함유 EMBM 중에 배양하였다. MCF10A 및 hTERT-IMEC 클론은 Ben Ho Park 박사(Johns Hopkins University)에게서 입수하였다. HCT116 BRCA2+/+ 세포 및 BRCA2-/- 세포는 Samuel Aparicio 박사(British Columbia Cancer Research Centre)에게서 입수하였다. PEO1 및 PEO4 세포는 Sharon Cantor 박사(University of Massachusetts)에게서 입수하여 이들 세포주를 이전에 공개된 바와 동일한 조건 하에 배양하였다(Sakai 등, Functional restoration of BRCA2 protein by secondary BRCA2 mutations in BRCA2-mutated ovarian carcinoma, Cancer Res. 2009;69(16):6381-6; Konishi 등, Mutation of a single allele of the cancer susceptibility gene BRCA1 leads to genomic instability in human breast epithelial cells, Proc. Natl. Acad. Sci. 2011;108(43):17773-8; Xu 등, CX-5461 is a DNA G-quadruplex stabilizer with selective lethality in BRCA1/2 deficient tumours, Nature Communications 2017;8:14432가 모두 본원에 참조로 포함).
세포독성 연구
세포를 플레이팅하고 5일 동안 96웰 플레이트에서 나타낸 약물로 처리하였다. 세포 생활성은 Promega에서 구매한 CellTiter 96 AQueous one solution(MTS) 세포 증식 검정을 사용하여 측정하였고, IC50 값을 GraphPad Prism 6 소프트웨어를 사용해서 계산하였다.
바이오틴화 및 면역블로팅 절차
ABCG2 발현을 정량하기 위해, 세포를 EZ-LINK 설포-NHS-SS-바이오틴(Thermo Scientific, 피츠버그, 펜실베니아)으로 표면-바이오틴화하고 이전에 보고된 바와 같이 웨스턴 블롯 분석을 거치고 웨스턴 블롯 분석을 거쳤다. Tsai CY, Liebig JK, Tsigelny IF, Howell SB, The copper transporter 1 (CTR1) is required to maintain the stability of copper transporter 2 (CTR2). Metallomics 2015;7:1477-87이 본원에 참조로 포함된다.
RNA-seq 및 qRT-PCR
전체 세포 RNA를 각각의 실험에 대해 3개의 독립적 샘플로부터 RNeasy mini 키트(QIAGEN, 발렌시아, 캘리포니아)를 사용하여 단리하였다. RNA-seq 샘플을 Agilent Bioanalyzer를 사용하는 라이브러리 생성 및 검증을 위해 IGM 게노믹스 센터(University of California, 샌디에고, 라졸라, 캘리포니아 (http://igm.ucsd.edu/genomics/))로 제출하였다. Illumina Sequencer HiSeq4000 상에서 시퀀싱을 수행하였다. 바이오인포마틱 분석은 OHSU에서 수행하였다. ABCG2 과발현의 확인을 위해 사용된 순방향 및 역방향 프라이머는 각각 5'-TTA-GGA-TTG-AAG-CCA-AAG-G-3' 및 5'-TAG-GCA-ATT-GTG-AGG-AAA-ATA-3'이었다.
화합물 I의 세포 약리학
화합물 I 또는 Fe(화합물 I)3에 노출된 세포를 5 ng의 중수소화 화합물 I 표준물질을 함유하는 아세토니트릴 중에 균질화하였다. 샘플을 이온 소스로 양이온 모드 전기분무 이온화(ESI)를 사용하여 Thermo LCQdeca 질량 분광측정계와 커플링된 Agilent 1260 액체 크로마토그래프(LC) 시스템을 채택해서 UCSD 분자량 분광측정 시설에서 분석하였다. ESI 이온 소스 전압을 5 kV로 설정하였고, 각각 차단 가스 유속은 80단위, 보조 가스 유속은 20단위, 그리고 모세관 온도는 250℃였다. Phenomenex Kinetex 바이페닐 칼럼(ID 2.1 ㎜ × 길이 50 ㎜, 입자 크기 2.6 ㎛)을 이동상 A로 0.1% 포름산을 함유하는 물 및 이동상 B로 0.1% 포름산을 함유하는 아세토니트릴을 사용해서 LC 분리를 위해 이용하였다. LC 유속을 0.30 ㎖/분으로 설정하였다. LC 구배를 10분 동안 5% 이동상 B에서 95% 이동상 B로 증가시켰고, 2분 동안 95% B에서 유지하고, 1분 내에 5% B로 복귀시킨 후 6분 동안 5% B에서 유지하였다. 양이온 모드 ESI-MS/MS 분석을 사용하여, m/z 368([M+H]+)에서의 그 분자 이온 피크로부터 m/z 353에서 화합물 I의 주요 단편 피크가 정상화된 충돌 에너지 45%와 함께 관찰되었고, m/z 374([M+H]+)에서 그 분자 이온 피크로부터 m/z 359에서 화합물 I-d6의 주요 단편 피크가 45%의 정상화된 충돌 에너지와 함께 관찰되었다. 선택된 반응 모니터링(SRM) 모드를 사용하여 m/z 353 및 m/z 359 단편 피크를 획득하였다. 스파이크 첨가된 화합물 I-d6의 양에 관한 SRM 피크 면적비(화합물 I/화합물 I-d6)를 샘플 중 화합물 I 및 Fe(화합물 I)3의 정량을 위해 사용하였다. Thermo IonMax ESI 인터페이스를 채택하는 Agilent 1100 HPLC 및 Orbitrap XL(Thermo) 질량 분광측정계를 사용해서 검출되는 Fe(화합물 I)3의 검출을 위해 동일한 칼럼, 구배 및 유속을 사용하였다. Fe(화합물 I)3은 이러한 조건으로 11.5분 근처에서 용출되었다. 0.3 ㎖/분의 용출액 유속에 대해 10:1 플로우 분할을 사용하여, 분할 후 대략0.030 ㎖/분이 ESI 내로 도입되었다. 이온 소스 MS 파라미터는 하기와 같았다: 모세관 온도 250℃, 차단 가스 유속 20단위, 양극성, 소스 전압 5.0 kV, 모세관 전압 22 V, 및 튜브 렌즈 80 V. 푸리에 변환 MS(Orbitrap) 파라미터는 하기와 같았다: FTMS AGC 1e6, FTMS 마이크로스캔 평균 2, 및 FTMS 전체 스캔 최대 이온 시간 500 ms. 분해 파라미터 15,000(400 m/z에서, peak m/z를 절반 최대에서의 전체 폭으로 주어지는 피크 폭으로 나눔)을 사용하였다. MS-MS CID 스펙트럼에 있어서, 45%의 정상화된 충돌 에너지를 사용하였다.
Fe(화합물 I)3의 합성 및 특성규명
농축수 스톡 중 FeSO4로 5배 몰 당량의 제1철 이온을 에탄올 중 화합물 I에 첨가하여 진한 빨간색 침전을 생성한 후 DMSO 중에 용해시키고 HPLC 및 질량 분광측정에 의해 특성규명하였다. Fe(화합물 I)3은 95% 초과 순수하였고, 적어도 5일 동안 완전 RPMI-1640 배지 중에서 안정하였다.
코멧(Comet) 검정
코멧 검정 키트를 Trevigen(게터스버그, 메릴랜드)에서 구입하고 중성 코멧 검정을 제조업체의 지침에 따라 수행하였다. 이미지는 Keyence 형광 현미경(Keyence America, Itasca, IL)으로 수집하고 OpenComet 소프트웨어로 정량하였다.
면역형광 염색
세포를 수확하여 PBS로 2회 세척하고, Z-고정 용액(완충 아연 포르말린 고정제, Anatech, Inc, 크릭, 미시간) 중에 고정하여 투과하고 5% 소 혈청 알부민을 함유하는 PBS 중 0.3% Triton X-100으로 차단하였다. 이어서 세포를 하룻밤 동안 γ-H2AX 항체(1% 소 혈청 알부민 함유 PBS 중 0.3% Triton X-100에서 1:250 희석)와 인큐베이션한 후 3회 세척하였다. 세포를 형광-접합 이차 항체(1:1000 희석)와 1 h 동안 인큐베이션한 후 3회 세척하였다. 슬라이드를 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI) 함유 ProLong 금 페이드-방지(antifade) 시약(Molecular Probes)과 함께 실장하여 세포 핵을 염색하였다. 100× 대물렌즈를 사용해서 Keyence 형광 현미경으로 형광을 확인하고 Image J 소프트웨어(the National Institutes of Health)로 정량하였다.
통계 분석
모든 2-군 비교는 불평등 분산을 가정하여 스튜던트(Student) t-평가를 이용하였다. 데이터는 최소 3회의 독립적 실험의 평균 ± SEM으로 나타낸다.
실시예 2: 화합물 I의 세포 약리학.
화합물 I이 강력한 세포독성을 나타내는 세포 유형 중에서 림프종은 상기 질병을 치료하기 위해 사용되는 대부분의 표준 화학치료제가 용량을 제한하는 골수억제를 유도하므로 관심의 대상이다. 상기 이유로, Raji 버키트 림프종 세포를 화합물 I의 세포 약리학 연구를 위해 선택하였다. Raji 세포에서 화합물 I의 세포내 축적을 액체 크로마토그래피 일렬 질량 분광측정(LC-MS/MS)에 의해 정량하였다. 화합물 I 및 그 내부 표준 화합물 I-d6은 예리한 피크 프로필을 가지며 약 6.9분에 LC 칼럼으로부터 용출되었다. Raji 세포는 함량이 6 h 까지 항정-상태에 접근하며 상대적으로 느리게 화합물 I을 축적하였다(도 6A).
LC-MS/MS 추적의 주의깊은 조사로 화합물 I의 검출을 위해 선택된 것과 동일한 반응 모니터링 모드 하에 약 8.7분에 LC 칼럼으로부터 용출되는 작은 피크를 확인하였다. LC-HR-ESI-TOFMS(질량 분광측정의 액체 크로마토그래피 고해상 전기분무 이온화 비행 시간)를 사용하여 또한 약 8.7분에 용출된 m/z 578.65를 갖는 피크를 확인하였다. Obritrap-MS를 사용한 고해상 MS/MS 분석은 이것이 3 대 1의 비로 화합물 I과 제1 철의 복합체임을 실증하였다(도 1B). Fe(화합물 I)3 3원 복합체의 구조를 LC-MS-ESI에 의해 특성규명하였다. 전구체 이온 질량 스펙트럼의 2개의 주요 특성이 구조의 확인을 제약하였다. 첫 번째는 고해상 MS에 의한 그 2개의 양으로 하전된 이온의 질량-대-전하 비(m/z)의 정확한 질량 측정이었다. 두 번째 특성은 구조가 적어도 하나의 철 원자를 함유함을 나타낸 측정 피크의 동위원소 분포였다. 또한, 복합체의 MS-MS 스펙트럼은 자유 화합물 I과 동일한 368 m/z에서 확인된 이온과 철 및 2개의 잔여 화합물 I 리간드와 일치한 789 m/z에서 확인된 이온인 2개의 단편 이온을 나타내었다. 3원 복합체의 계산 질량, 578.6520 m/z는 각각 여러 다른 날에 관찰된 평균 m/z 결과인 578.6519 m/z와 매우 가까이 일치하였다. 측정치 대 계산치의 비 차이는 -0.2 ppm이었다. 일-간 표준 편차는 0.0003 m/z, n=3이었고, 일-내 질량 비 차이는 일관되게 1.0 ppm 미만이었다. 이러한 일치하는 측정치는 일반적으로 합성 유기 산물에 대한 구조-증명을 위해 적용되는, 표준의 3 ppm 이내이다. 철의 존재는 그 원소의 특징인 동위원소 패턴에 의해 확인되었다. 철은 4개의 안정한 동위원소, 54Fe, 56Fe, 57Fe, 및 58Fe를 가지며, 천연 존재비는 각각 5.85, 91.75, 2.12, 및 0.28 %이다. 54Fe 동위원소로 인해 생기는 MS 피크는 화합물 I 리간드의 탄소, 수소 및 질소의 천연 동위원소와 일치하지 않으므로 구별된다. 복합체의 스펙트럼에서, 그 계산 질량은 577.6542 m/z이다(이온이 +2 전하이므로 가장 풍부한 동위원소 피크보다 약 1 m/z 더 작음). 상기 피크에 대해 관찰된 평균 질량은 577.6545 m/z였고, 표준 편차는 0.0003 m/z였다. 비 차이는 일간, n=3으로 0.5 ppm이었다. 54Fe 피크의 세기도 천연 존재비로부터 예상된 바와 같이, 주요 56Fe 피크의 이온 존재비 세기의 약 6%로 일관되게 측정되었다. 상기 주어진 피크 위치의 측정을 위해, 결과를 주변 배경으로 인해 도처에 존재하는 디이소옥틸프탈레이트 이온의 391.2843 m/z의 내부 표준에 대해 재검정하였다.
에탄올 중 화합물 I에 FeSO4를 첨가함으로써 Fe(화합물 I)3 복합체를 간단히 합성할 수 있음을 발견하였다. Fe(화합물 I)3의 순도를 HPLC에 의해 보고하였고 복합체는 저장 시 안정한 것으로 확인되었다. Fe(화합물 I)3의 IC50은 145.7 ± 0.5 nM로, 아마도 그 2+로 하전된 Fe 이온과 함께 세포에 들어가는 어려움으로 인해 화합물 I보다 1.5배 덜 강력하였다(도 1C). 6 h 동안 0.5 μM의 각각의 화합물로 Raji 세포를 처리하고 각 분자 상의 이온화 효율에 기반하여 세포내 농도를 교정함으로써 화합물 I 및 Fe(화합물 I)3의 상대 흡수를 조사하였다(도 1D). 화합물 I-처리 세포는 Fe(화합물 I)3-처리 세포보다 많은 세포내 Fe(화합물 I)3을 축적하였으며, 이들 두 분자의 IC50 차이와 일치하였다. 대부분의 화합물 I은 화합물 I-처리 세포에서 Fe(화합물 I)3으로 세포내 전환되었지만, Fe(화합물 I)3은 세포내 해리하여 Fe(화합물 I)3-처리 세포에서 검출 가능한 자유 화합물 I을 생성하지 않았다. 따라서, Fe(화합물 I)3이 화합물 I의 우세한 활성 세포내 형태인 것으로 여겨진다.
실시예 3: 화합물 I이 DNA 손상을 유도함.
화합물 I의 구조는 가닥 절단을 일으키는 DNA에서의 4중체 구조에 결합하는 약물과 유사하다; 이는 화합물 I이 DNA에 대한 손상을 유도하는지 여부에 대한 연구로 이어졌다. 모체 Raji 세포를 증가하는 시기 동안 0.5 μM 화합물 I로 처리하고 DNA 손상의 유도를 웨스턴 블롯 분석에 의해 측정되는 인산화된 형태의 ATM 및 γH2AX의 축적에 의해 평가하였다. 도 2A는 화합물 I이 Raji 세포에서 6 h부터 시작해서 인산화된 ATM 및 γH2AX의 명확한 증거를 일으켰으며 이는 최대 24 h 약물 노출 기간과 함께 증가했음을 나타낸다. PARP의 절단은 8 h부터 시작해서 검출되어 아폽토시스의 유도를 시사하였다. Raji 세포는 γH2AX 초점부의 형성을 정량하기 어렵게 만드는 매우 작은 핵을 가지므로, 인간 난소 암종 세포주 CAOV3을 이 목적을 위해 사용하였다. 도 2B는 24 h 동안 DMSO 또는 1 μM 화합물 I에 노출된 CAOV3 세포에서 γH2AX 초점부 형성의 대표 이미지를 나타낸다. 도 2C는 초점부의 수 증가가 1 h째에 검출 가능하였으며 초점부의 수가 8 h 후 더욱 현저히 증가하였음을 나타낸다. DNA 손상의 증거는 주로 DNA 이중 가닥 절단을 검출하는 중성 comet 검정 결과에 의해 추가로 강화되었다(도 2D). 세포가 DMSO 처리 대비 6 h 동안 0.5 μM 화합물 I로 처리된 경우 테일 DNA의 증가는 없었으나, 세포가 6 h 동안 화합물 I로 처리된 후 18 h 동안 약물 비함유 배지 중에 인큐베이션된 경우(펄스-체이싱) 코멧 테일에 훨씬 더 많은 DNA가 존재하였다. 이들 결과는 화합물 I이 DNA 손상을 생성하고 아폽토시스를 유발할 수 있는 DNA 이중 가닥 절단의 축적을 일으킨다는 강력한 증거를 제공한다.
실시예 4: BRCA1/2 결핍 세포가 화합물 I에 대해 과민성임.
화합물 I이 DNA 손상을 일으킨다는 발견은 상동 재조합이 결핍된 세포가 상기 약물에 대해 과민성인지 여부에 대한 연구로 이어졌다. BRCA1-기능 및 -결핍 인간 세포주의 동종 페어를 사용하여 화합물 I 및 BRCA1 결핍 간에 합성 치사성이 존재할 것이라는 가설을 평가하였다. 각각 조기 종결 코돈을 생성하는 BRCA1에서의 2-bp 결실의 이종접합성 녹인(knock-in)을 함유하는 2개의 독립적 MCF10A 서브클론(BRCA1-het #1 및 #2)은 이의 게놈 내에 표적화 벡터의 무작위 통합을 거친 클론(대조군)에 비해 올라파립에 더 민감한 것으로 확인되어, 두 개의 녹인 클론에서 BRCA1 기능의 손실을 확인시켜주었다(도 3A, 왼쪽). 이들 두 개의 녹인 클론은 화합물 I(도 3A, 오른쪽)에 대해서도 더 과민성이었다. 손상된 BRCA1 기능의 효과가 hTERT-IMEC 세포주로부터 유래된 동일한 2-bp 녹인을 함유하는 클론에서 확인되었고, 이 때도 역시 올라파립 및 화합물 I 모두에 대해 과민성으로 확인되었다(도 3B). BRCA1-결핍 세포가 화합물 I에 대해 과민성이라는 결론은 BRCA1 발현이 shRNAi의 발현에 의해 안정적으로 녹다운되는 MCF7 E7 세포에서 수득된 결과에 의해 추가로 뒷받침되었다. 도 3C에 나타낸 바와 같이, E7 클론은 올라파립 및 화합물 I에 대해 유사한 정도의 과민성을 가졌다. BRCA1 적격 및 BRCA1 비적격 세포의 3개의 독립적 동종 페어에서의 이러한 결과는 화합물 I에 의해 생성되는 DNA 손상의 보수가 부분적으로 상동 재조합 및/또는 BRCA1이 기능하는 다른 DNA 보수 경로에 의존함을 시사한다. BRCA2-결핍 세포가 화합물 I에 더 민감한지 여부를 각각 BRCA2-기능 및 BRCA2-결핍 난소암 세포주, PEO4 및 PEO1을 사용하여 평가하였다. PEO1은 BRCA2-결핍이고 시스플라틴 및 폴리(ADP-리보스) 폴리머라제 억제제 AG14361에 대해 민감하다. PEO4는 시스플라틴 내성을 가지고 재발 시 복수로부터 유래되었고 BRCA2 기능을 복원하는 이차 돌연변이를 포함한다. BRCA2 기능의 복원은 올라파립(도 3D, 왼쪽), 및 화합물 I(도 3D, 오른쪽) 모두에 대한 내성을 증가시켰다. BRCA2-기능 HCT116 세포 및 2개의 BRCA2 -/- 서브클론, B18 및 B46(도 3E)을 사용하여 유사한 결과를 수득하였다. 따라서 BRCA1 또는 BRCA2 기능의 손실은 악성 세포를 화합물 I에 과민성으로 만든다.
실시예 5: 획득된 약물 내성에 대한 선택
화합물 I의 효과가 상기 약물에 대한 민감성에 가장 가깝게 연관됨을 묘사하기 위해, 6개월의 기간에 걸쳐 점차 더 높은 농도의 화합물 I에 대한 반복 노출의 결과 내성을 획득한 Raji 버키트 림프종 세포주의 서브세포주(Raji/화합물 IR)를 개발하였다. 내성은 선택 공정 동안 임의의 시점에서의 급격한 변화 없이 느리고 점차적으로 발생하였다. 약물에 대한 120 h 노출 동안 성장 속도를 정량하는 검정을 사용하여 평가되는 경우, 모체 Raji 세포에 대한 화합물 I의 IC50는 91.9 ± 22.3 nM이었다. 이는 신선 단리된 AML 모세포 및 CLL 세포에 대해 보고된 것과 동일한 범위 내이다(Zhang 등, "Inhibition of c-Myc by ATPO-COMPOUND I as an Innovative Therapeutic Approach to Induce Cell Cycle Arrest and Apoptosis in Acute Myeloid Leukemia [요약서]," Blood 2016;128:1716; Kurtz 등, "Broad Activity of COMPOUND I in AML and other Hematologic Malignancies Correlates with KFL4 Expression Level [요약서]," Blood 2015;126:1358]이 둘 다 본원에 참조로 포함됨). Raji/화합물 IR 세포는 화합물 I에 대해 16.7 ± 3.9배 내성이 있었다(IC50: 1387.7 ± 98.5 nM). 내성 수준은 약물 비함유 배지 중에서의 배양 동안 적어도 3개월 동안 안정적으로 유지되었다(도 4A). Raji/화합물 IR 세포는 모체 세포보다 약간 더 빨리 성장하였으나, 그 차이는 통계적으로 유의미하지 않았다. Raji 민감성 세포에서 아폽토시스를 유도한 농도에서, 화합물 I은 Raji/화합물 IR 세포에서 아폽토시스를 유발하지 못했다. 민감성 세포를 24 h 동안 0.5 μM 화합물 I로 처리한 경우, DMSO 대조군 대비 친-아폽토시스성 단백질 BIK 및 BAD는 각각 47.5 ± 16.8% 및 2.1 ± 0.25배만큼 증가하였고(p<0.05, n=3) 항-아폽토시스성 단백질 MCL-1은 38.1 ± 2.3%만큼 감소하였다(p<0.001, n = 3). 이들 변화 중 어느 것도 동일한 노출을 거친 Raji/화합물 IR 세포에서 검출되지 않았다(도 4B).
실시예 6: 약물 내성의 기전
Raji/화합물 IR 세포에서의 내성은 유입 또는 유출의 변경, 세포내 해독 또는 약물의 일차 표적의 변화에 기인할 수 있다. 원상태 화합물 I 또는 Fe(화합물 I)3 복합체와 인큐베이션된 Raji 및 Raji/화합물 IR 세포에서 원상태 화합물 I 및 Fe(화합물 I)3 둘 다의 세포내 축적을 모니터링하였다. 두 형태의 약물의 축적 속도는 화합물 I에 노출된 Raji/화합물 IR 세포에서 심하게 감소되었다(도 6A 및 표 1).
표 1. 최초 2시간에 걸친 Raji 및 Raji/화합물 IR 세포로부터의 화합물 I 및 Fe(화합물 I)3의 유출 속도(log fmole/10^7 세포/h).
Figure pct00012
세포가 Fe(화합물 I)3 복합체와 인큐베이션된 경우에도 더 적은 정도로 마찬가지였다(도 6B). 대조적으로, ATPO-화합물 I 또는 Fe(화합물 I)3 중 어느 한 형태의 약물로의 세포 로딩 후 상기 약물의 최초 2 h에 걸친 유출에서는 겉보기 차이가 없었다. 이들 결과는 Raji 세포에서 화합물 I에 대한 내성이 두 형태의 약물 모두의 축적 손상과 연관됨을 시사한다. 6 h째의 약물 축적의 보다 상세한 측정은 Raji/화합물 IR 세포가 화합물 I과 인큐베이션되는 경우 두 형태의 약물 모두의 축적이 현저히 감소됨을 확인시켜주었다; 그러나, Fe(화합물 I)3 복합체 수준은 여전히 원상태 약물 수준을 초과하였다(도 4C). Raji/화합물 IR 세포가 최소 3배만큼의 화합물 I로 처리된 경우에만 Fe(화합물 I)3의 세포내 함량이 민감성 세포에서의 함량과 유사한 수준에 최종 도달하였다(도 4D). 24 h 동안 Raji/화합물 IR 세포의 0.5 μM 화합물 I로의 처리는 내성 세포에서 실질적으로 더 적은 세포내 화합물 I 및 Fe(화합물 I)3과 일치하게, 포스포-ATM 또는 포스포-γH2AX의 증가를 일으키지 않았고, 검출 가능한 PARP 절단을 일으키지 않았다(도 7).
내성 기전에 대한 추가 식견을 수득하기 위해, 민감성 Raji 및 내성 Raji/화합물 IR 세포 모두의 3개의 독립적 샘플 상에서 RNA-seq 분석을 수행하였다. 낮은 수준의 발현만 갖는 유전자는 차별적 발현 분석에서 불규칙성을 유도할 수 있으므로, 모든 6개 샘플에 걸쳐 50개 판독 미만을 갖는 모든 유전자를 제거하여 유전자-수준 차별적 발현 분석을 수행하였다. 유전자는 이의 조정된 p-값이 0.05 수준 미만이고 이의 변화 배율이 어느 방향으로든 2를 초과하는 경우, 차별적으로 발현되는 것으로 간주하였다. 13,791개의 평가 가능한 유전자 중에서, 1,012개가 Raji/화합물 IR 세포에서 유의미하게 상향조절되었고 704개의 유전자가 유의미하게 하향조절되었다. ATP-결합 카세트 서브패밀리 구성원인 ABCG2는 전사체 수준에서 천배 초과의 증가를 가지며 가장 많이 상향조절된 유전자였다(표 2).
표 2.Raji/화합물 IR 세포에서 상향 조절된 유전자의 순위 목차
Figure pct00013
몇몇 다른 다중약물 내성 ABC 트랜스포터도 Raji/화합물 IR에서 상향조절되었으나, ABCG2 전사체의 증가가 가장 현저하였다(표 3). Raji/화합물 IR 세포에서 ABCG2의 현저한 상향조절은 qRT-PCR 및 웨스턴 블롯 분석에 의해 확인되었다(도 5A 및 B).
표 3.Raji/화합물 IR 세포에서 상향조절된 ABC 트랜스포터 패밀리 구성원 유전자.
Figure pct00014
Kol43은 P-gp 또는 MRP-1 트랜스포터를 억제하는 그 능력에 비해 200배 초과 선택성을 갖는 특이적 ABCG2 억제제이다. Kol43 자체는 최대 300 nM의 농도에서 Raji 또는 Raji/화합물 IR 세포에 독성이 아니다(도 5C). 화합물 I이 ABCG2에 대한 기질이라는 가설을 평가하기 위해, Kol43이 Raji/화합물 IR 세포의 내성을 역전시키는 능력을 평가하였다. 표 4 및 도 5D에서의 데이터는 Kol43으로의 동시적 처리가 Raji/화합물 IR 세포에서 화합물 I 내성을 유의미하게 역전시켰음을 나타낸다.
표 4.화합물 I에 대한 내성에 대한 ABCG2 억제제의 효과
Figure pct00015
강화된 ABCG2 기능의 추가 증거를 제공하기 위해, 내성 세포를 널리 보고된 ABCG2 기질인 토포테칸에 대한 교차-내성에 대해 평가하였다. Raji/화합물 IR 세포는 토포테칸에 대해 3배 교차-내성인 것으로 확인되었고 Kol43으로의 처리는 상기 내성을 완전히 역전시켰다(도 5E). 흥미롭게도, 카보플라틴은 ABCG2 기질로 여겨지지 않음에도 불구하고, Raji/화합물 IR은 카보플라틴에 대해서도 유의미하게 교차-내성이었다; Kol43으로의 처리는 Raji/화합물 IR 세포에서 카보플라틴 IC50을 감소시키지 않았다(도 5F). 놀랍게도, Raji/화합물 IR 세포는 ABCG2 기질이자 강력한 이중 가닥 절단 유도제인 에토포시드에 과민성인 것으로 확인되었다. RNA-seq 데이터로부터의 GO 및 경로 분석은 DNA 보수 경로가 Raji/화합물 IR에서 하향조절됨을 드러내었고 이는 부분적으로 에토포시드에 대한 과민성을 설명하였다.
실시예 7: G-4중체 DNA와의 화합물 I 상호작용이 c-MYC의 억제와 연관됨
최근의 기계론적 연구는 화합물 I이 그 프로모터에서 아세틸화 H3K27을 감소시키고 추가적으로 c-MYC mRNA를 탈안정화시키는 것에 의해 전사 수준에서 c-MYC을 조절함을 실증하였다. 또한, RNA-seq의 차별적 유전자 발현 분석 및 역상 단백질 어레이(RPPA) 데이터는 화합물 I의 기전에서 c-MYC의 역할을 강조하였다(GO 용어 - c-MYC에 의해 하향조절됨 p-값 6E-26, c-MYC에 의해 결합된 유전자 프로모터 p-값 4.2 E-10, c-MYC의 ChIP 표적 p-값 3.3E-8). 또한, RPPA 데이터로부터 p-Chk1, p-Chk2, γH2Ax, 및 전체 p53 및 E2F1의 증가가 관찰되었고, 이들 모두는 DNA 손상 반응 경로의 활성화를 시사한다. 여기에는 세포성 스트레스 반응 신호전달을 지목하는 상승 수준의 XBP1, GRP78, 및 p-p38이 수반되었다(GO 용어 세포 스트레스의 조절, p-값 1.89E-8).
화합물 I이 여러 기계론적 이벤트에 참여할 수 있지만, c-MYC 발현, 세포 주기 정지 및 DNA 손상뿐만 아니라 DNA 보수 기전이 손상된 세포에서의 합성 치사성에 대한 화합물 I의 효과는 G-4중체 DNA 모티브 상에서 Fe(화합물 I)3 복합체의 작용에 의해 설명될 수 있다.
실시예 8: 실시예 9~16에 대한 물질 및 방법
세포 및 화합물
EOL-1, GRANTA-519, Jeko-1, Jurkat, Molm-13, NOMO-1, SKM-1, 및 SU-DHL-6은 Leibniz-Institut DSMZ에서 입수하였다. HL-60, KG-1, Mino, MV4-11, Raji, 및 THP-1은 ATCC에서 입수하였다. HEL92.1.7은 인증 세포 배양 유럽 컬렉션(European Collection of Authenticated Cell Cultures)에서 입수하였고 Ramos 세포는 M. Andreeff 박사(MD Anderson Cancer Center, 휴스톤, 텍사스)에게서 선물받았다. 모든 세포는 제조업체의 지침에 따라 완전 배지 중에 배양하였다. 초기 계대 세포를 수집하여 제조업체로부터 수령 1개월 내에 냉동하였다. 모든 실험은 해동 6주 내에 초기 계대 세포 상에서 수행하였다. MycoScope 미코플라즈마 검출 키트(Genlantis 카탈로그 # MY01050)를 사용하여 6개월마다 잠재적 오염에 대해 스크리닝하였다. 말초혈 단핵구(PBMC)는 Ficoll-Paque PLUS(GE Healthcare, 카탈로그 #17-1440-02)를 사용하여 건강한 공여체의 신선 혈액으로부터 단리하였다. 화합물 I 유리 염기의 합성을 위해, 10-펜안트롤린-5,6-디온(1.2당량), 아세트산(22부피), 2-메틸-5-플루오로인돌-3-카복스알데하이드(1.0당량), 및 암모늄 아세테이트(15당량)를 3 내지 7시간 동안 95±5℃에서 가열하면서 중간 진탕 하에 반응시켰다. 반응을 20℃ 내지 25℃로 냉각하고, 여과하고, 아세트산 및 에탄올로 헹구고, N2 퍼징하며 건조한 후 4시간 동안 65℃에서 2:1 에탄올:물로 세척하고, 20℃ 내지 25℃로 냉각하고, 여과하고, 2:1 에탄올:물 및 EtOAc로 헹군 후, N2 퍼징하며 건조하였다. HPLC에 의한 순도는 99.5%였고, 구조적 정체를 FT-IR, 1HNMR, 13C NMR, 및 LC/MS에 의해 확인하였다. Fe(화합물 I)3 합성을 위해, 수중 5몰 당량의 제1철 이온 FeS04를 에탄올 중에 용해된 화합물 I에 첨가하였다. 생성된 진한 빨간색 침전, Fe(화합물 I)3을 수집하여 DMSO 중에 용해시키고 HPLC 및 질량 분광측정에 의해 95% 초과 순수한 것으로 특성규명하였다. CX-5461(7)은 MedChem Express(카탈로그 # HY-13323)에서 구입하였다.
세포독성 연구
세포를 플레이팅하고 37℃ 및 5% CO2에서 5일 동안 96웰 플레이트에서 비히클 DMSO 또는 화합물 I(10개 농도)로 처리하였다. 세포 생활성을 CellTiter 96 AQueous one solution(MTS) 세포 증식 검정(Promega, 카탈로그 #G3581)을 사용하여 측정하고, IC50 값을 GraphPad Prism 7 소프트웨어를 사용해서 계산하였다.
흡수 및 유출 검정
화합물 I에 노출된 세포를 5 ng의 중수소화 화합물 I 표준물질을 함유하는 아세토니트릴 중에 균질화하였다. 샘플을 이온 소스로 양이온 모드 전기분무 이온화를 사용하여 Thermo LCQdeca 질량 분광측정계와 커플링된 Agilent 1260 액체 크로마토그래프(LC) 시스템을 채택해서 UCSD 분자량 분광측정 시설에서 분석하였다.
qRT-PCR
세포를 24시간 동안 다양한 농도에서 또는 수확 전 1, 3, 6, 12, 및 24시간 동안 하나의 농도에서 비히클 또는 화합물 I로 처리하였다. 세포를 QiaShredder 칼럼(QIAGEN, 카탈로그 # 79656)에 의해 용해시키고, 전체 RNA를 QIAGEN RNeasy Plus Mini 키트(카탈로그 # 74134)를 사용해서 단리하고, cDNA를 Transcriptor Universal cDNA 마스터 믹스(Roche, 카탈로그 # 05893151001)를 이용해서 합성한 후 FastStart essential DNA 탐침 마스터 믹스(Roche, 카탈로그 # 06402682001) 및 Roche LightCycler96을 사용해서 qRT-PCR 분석을 위해 사용하였다. 프라이머 탐침 페어는 IDT에서 구입하였다(표 5). 발현을 GAPDH에 대한 정상화 후 비히클 처리 샘플 대비 변화 배율로 계산하였다(2ΔΔ C t).
표 5: IDT 프라이머 탐침 페어
Figure pct00016
웨스턴 블로팅
세포를 상술된 바와 같이 처리하였다. 전체 세포 용해액을 제조하고, SDS-PAGE에 의해 분리하고, 니트로셀룰로스막으로 옮겼다. 사용된 검출 항체를 표 6에 기재한다. 밀도측정을 ImageJ 또는 Image Studio Lite Version5.2 소프트웨어를 사용해서 수행하고 GAPDH의 밀도에 대해 정상화하였다.
표 6: 항체
Figure pct00017
아폽토시스에 대한 유세포 측정 및 세포 주기 분석
세포를 상술된 바와 같이 처리하였다. 아폽토시스를 결정하기 위해, 세포를 FITC-아넥신 V 및 프로피듐 요오다이드(PI; BD Pharmingen, 카탈로그 #556570)로 염색한 후 BD Accuri C6 유세포 측정장치 상에서 분석하였다. DNA 합성 및 세포 주기의 상을 측정하기 위해, 처리 세포를 5-에티닐-2'-데옥시우리딘(Edu) Alexa Fluor 488(Thermo Fisher Scientic, 카탈로그 #C10425) 및 PI(PI/RN아제 A 염색 용액, BD Biosciences, 카탈로그 #550825)로 염색하였다. 살아있는/죽은 세포 고정용 Far Red 죽은 세포 염색 키트(Thermo Fisher Scientic, 카탈로그 # L34973)를 사용하여 죽은 세포는 분석에서 제외하였다. 염색은 제조업체의 지침에 따라 수행하였다.
RNA 시퀀싱 분석
처리 MV4-11 세포로 전체 RNA 추출을 거치고(qRT-PCR 분석에 대한 것과 마찬가지로) UCSD 게노믹스 코어 시설에서 시퀀싱하였다. RNA를 Illumina TruSeq를 사용해서 가공하고 단일 말단을 Illumina HiSeq4000 상에서 50 bp 판독에 대해 시퀀싱하였다. 데이터는 오레곤 보건 과학 대학(Oregon Health and Science University (포틀랜드, 오리곤))의 McWeeny 실험실에서 분석하였다. FASTQ 파일을 FASTQC http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/를 사용해서 판독 염기 분포 및 서열 표시에 대해 평가하였다. 판독을 SubRead v1.5.0-pl를 사용해서 HG37에 대해 정렬하여 고유 맵핑된 판독을 유지하였다. 50회 미만 판독(모든 4개 샘플에 걸쳐)을 갖는 차별적 발현 유전자는 폐기하였다. 미가공 데이터 및 가공 파일은 GEO(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE111949) 접근 번호 GSE111949 상에서 이용 가능하다.
역상 단백질 어레이 분석
MV4-11 세포를 RNA 시퀀싱(RNA-seq) 분석에 대한 것과 마찬가지로 처리하고 전체-세포 추출물을 웨스턴 블로팅을 위해 제조하였다. 샘플을 MD Anderson 암 센터 역상 단백질 어레이(RPPA) 코어 시설에서 가공하였다(상세내용 https://www.mdanderson.org/research/research-resources/core-facilities/functional-proteomics-rppa-core/rppa-process.html). 단백질 발현 수준을 3회 반복에 대해 평균내고, GraphPad Prism 7을 사용해서 열지도를 그렸다.
qPCR과 커플링된 염색질 면역침전
MV4-11 세포를 2, 6, 또는 24시간 동안 비히클 DMSO 또는 500 nmol/ℓ 화합물 I로 처리한 후 1% 포름알데하이드로 가교하였다. 염색질을 초음파분쇄에 의해 추출한 후 하룻밤 동안 H3K27ac(활성 모티브 #39133) 항체와 인큐베이션하였다. 항체:DNA 복합체를 단백질 G 비드(Invitrogen Dynabeads 카탈로그 #10004D)로 단리하고 MYC 프로모터에 특이적인 프라이머로 qPCR에 의해 분석하였다(표 7). H3K27ac 농축을 입력 DNA 대조군 대비 배율로 계산하였다.
표 7: ChIP 프라이머
Figure pct00018
RNA 붕괴 검정
세포를 3시간 동안 비히클 DMSO 또는 500 nmol/ℓ 화합물 I에 이어 1 μmol/ℓ 액티노마이신 D로 처리하였다. 세포 분취물을 qRT-PCR 분석을 위한 것과 마찬가지로 RNA 추출 및 cDNA 합성을 위해 액티노마이신 D 첨가 전에 그리고 이후 10분마다 채취하였다. MYC 및 28s rRNA 수준을 특이적 프라이머를 사용하여 분석하고(표 8) MYC RNA 발현을 28s rRNA에 대해 정상화하였다[2^(28s C t 값 - MYC C t 값)].
표 8: 발현 프라이머
Figure pct00019
FRET 검정
FRET 검정 및 데이터 분석을 전술된 바와 같이 수행하고 이중 표지(5' FAM- 3' BHQ1) 단일-가닥 올리고를 사용하여 개질하였다. 각각의 올리고의 용융 온도를 Roche LightCycler 96을 사용하여 비히클 DMSO 또는 증가하는 농도의 화합물 I, Fe(화합물 I)3, CX-5461, 또는 TMPyP4의 존재 하에 평가하였다[300초 동안 37℃에 이어 91℃까지 3℃ 간격으로 승온시키고(25 단계), 각 온도에서 총 300초 인큐베이션 시간을 가짐]. 약물 및 올리고 반응 믹스를 즉시 분석하거나 실온에서 6시간 동안 인큐베이션한 후 분석하였다. 프라이머 정보를 표 9에 제공한다. 더 긴 인큐베이션 시간은 Fe(화합물 I)3, TMPyP4, 또는 CX-5461 활성에 영향을 미치지 않았으나 화합물 I G4-결합력을 증강시켰다. 화합물 I 데이터를 6시간 시점 동안 나타낸다.
표 9: G-4중체 올리고
Figure pct00020
실시예 9: 화합물 I이 세포독성을 유도하고, p21을 상향조절하고, AML 세포에서 G 0 -G 1 세포 주기 정지를 유도함
화합물 I은 57 nmol/ℓ 내지 1.75 μmol/ℓ 범위의 IC50 값을 가지며 AML 세포주 및 다양한 형태의 림프종 세포주에서 증식을 억제하였다(도 8; 표 10). 약물은 각각 48, 72, 및 120시간의 노출 동안 0.47, 0.40, 및 0.24 μmol/ℓ의 IC50 값으로 MV4-11 세포에서 노출 기간의 함수로서 효능의 온건한 변화만을 나타내었다. 이전 연구에서는 종양에서 APT0-화합물 I 활성의 잠재 기전으로 KLF4 및 CDKN1A 발현의 상향조절을 보고하였다. 화합물 I은 평가된 6개의 AML 세포주 중 4개에서 KLF4 발현을 상향조절하지만(도 15A), CDKN1A(p21) 발현은 농도-의존적 방식으로 모든 AML 세포주에서 유도되었다(도 15B 및 15C). CDKN1A mRNA의 상향조절은 평가된 모든 AML 세포주에서 노출 기간과 함께 증가하였다(도 15D 및 15E). 이후 시점에서, 가능하게는 세포사 증가로 인해, CDKN1A 발현이 감소하기 시작했다. CDKN1A 발현의 유도는 전형적으로 후속 G0-G1, 세포 주기 정지와 연관되며, 이는 고형 종양 세포주의 화합물 I 처리 후 관찰되었다. 이와 일치하게, G0-G1에서 세포의 용량-의존적 증가가 평가된 모든 AML 세포주에 대한 S- 및 G2-M 상에서의 세포 분율의 동시적 축소와 함께 관찰되었다(도　9A~C, 상부). MV4-11의 경우, 모든 살아있는 세포가 1 μmol/ℓ APT0-화합물 I.CCND3(사이클린 D3)으로의 24시간 노출 후 G0-G1에서 정지되었고 CDK4는 G1 세포 주기 진행을 촉진하는 것으로 알려져 있지만, CDKNIA는 상기 공정을 음성적으로 조절하는 작용을 한다. 화합물 I-처리 AML 세포의 웨스턴 블롯 분석은 CDK4 및 CCND3 둘 다의 용량-의존적 억제를 드러내었으나, 3개의 AML 세포주 각각에서 정도가 상이하였다(도 9A~C, 하부; 도 16A).
표 10: 백혈병 및 림프종 세포주에서의 화합물 I의 IC50 값
Figure pct00021
세포 주기 정지를 다양한 경로 교란과 관련시키고 기계론적 이벤트의 순서를 묘사하기 위해, 세포를 최대 24시간의 다양한 시간 동안 비히클 또는 화합물 I(IC50 농도)로 처리한 후 세포 주기 분석을 수행하였다. 비히클 단독으로 처리된 세포에서는 세포 주기의 상 교란이 없었다. G0-G1에서의 세포 분율 증가는 2시간만큼 빠르게 검출되었고, 상기 분율은 약물 노출 24시간의 기간에 걸쳐 시간-의존적 방식으로 계속 증가하였다(도 9D~F). 웨스턴 블롯 분석은 G0-G1 정지와 필적한 CDK4 및 CCND3 단백질 수준의 시간-의존적 감소를 나타내었다(도 16B 및 16C). 이들 데이터는 화합물 I이 AML 세포에서 시간- 및 농도-의존적 G0-G1 정지를 일으킴을 확립시켜주며 이것이 확립된 p21 및 사이클린-의존적 키나제 경로에 의해 매개됨을 제시한다.
실시예 10: 화합물 I이 AML 세포주에서 아폽토시스를 유도함
화합물 I이 세포사를 유도하는 기전을 연구하기 위해, MV4-11, EOL-1, 및 KG-1 AML 세포를 화합물 I을 사용하여 또는 사용하지 않고 처리하고 유세포 측정 및 웨스턴 블로팅에 의한 아폽토시스성 마커 검출을 거쳤다. 세포를 PI 및 아넥신 V로 염색하여 살아있는(아넥신 V 및 PI 음성), 초기 아폽토시스성(아넥신 V 양성 및 PI 음성), 후기 아폽토시스성(아넥신 V 및 PI 양성), 및 죽은(아넥신 V 음성 및 PI 양성) 세포 간을 구별하였다. 아폽토시스성 세포의 농도-의존적 증가가 모든 세포주에서 24시간째에 관찰되었다(도 10A; 도 17A). 아넥신 V 및 PI 염색에 기반한 IC50 값은 항증식 IC50 값과 필적하였다. PARP 절단(c-PARP1)은 내인성 및 외인성 경로 모두의 아폽토시스 하류의 전통적 신호이다. 화합물 I은 아넥신 V/PI 염색에 의해 측정된 바와 같은 아폽토시스 유도에 필적하는 농도- 및 시간-의존적 방식으로 c-PARP1의 축적을 유도하였다(도 10B~C; 도 17B). 모든 3개 AML 세포주에 있어서, 2시간 노출 시 관찰되는 G0-G1 세포 주기 정지에 뒤따라 화합물 I로의 노출 후 3 내지 6시간째에 아폽토시스성 세포의 증가가 드러났다(도 10D).
실시예 11: 화합물 I 약력학
세포 주기 정지 및 아폽토시스를 유도하기 위해 화합물 I에서 활용되는 경로에 대한 추가 식견을 얻기 위해, mRNA 및 단백질 수준 모두에서 차별적 발현 분석을 수행하였다. MV4-11 세포를 6시간 동안 비히클 또는 500 nmol/ℓ 화합물 I로 처리한 후, RNA-seq에 의해 유전자 발현을 분석하였다. 총 1,643개 유전자가 화합물 I 처리 시 차별적으로 조절되는 것으로 확인되었고(2배 초과 변화 및 P < 0.05) 416개는 상향조절되었고 1,227개는 하향조절되었다(표 11). RNA-seq 분석에서 KLF4의 2배 증가 및 CDKN1A 발현의 4.5배 증가가 검출되었고, 이는 MV4-11 세포로의 qRT-PCR 데이터에 의해 검정된다. 차별적으로 조절된 유전자를 광범위 분자 특징부 데이터베이스(http://software.broadinstitute.org/gsea/msigdb/index.jsp)를 이용하여 농축 경로 또는 GO(유전자 존재론) 용어(도 18A)에 대해 분석하였다. 예상된 바와 같이, 아폽토시스성 및 세포 주기 경로가 차별적으로 발현된 유전자 세트에 농축되었다. 예상치 못하게, 화합물 I 처리 후 유전자 발현 프로필도 DNA 손상 반응(DDR) 및 소포체(ER) 스트레스/폴딩되지 않은 단백질 반응 경로에서 농축되었다. 또한, 상향조절된 유전자는 TP53 경로에서 농축되었고 유전자는 MYC에 의해 하향조절되었다. MV4-11 세포에서 검출된 유전자 발현 변화는 화합물 I이 DNA 손상을 유도하고 세포성 스트레스 경로를 활성화함으로써 및/또는 MYC 종양유전자의 발현 억제에 의해 아폽토시스를 유도할 수 있다는 가능성을 제기하였다.
표 11: RNA-seq 및 RPPA로부터의 차별적 발현 유전자
Figure pct00022
단백질 발현에 대한 화합물 I의 효과를 조사하기 위해, MV4-11 세포를 상기와 같이 처리하고 RPPA 마이크로어레이에 의해 분석하여 300개 초과의 전체 및 번역-후 개질된 단백질을 정량하였다. 전체 및 번역-후 개질 단백질 둘 다의 수준 상에서 효과가 관찰되었고(1.25배 초과 및 P　<0.05) 하향조절된 것보다 상향조절된 단백질이 더 많았다(도 18B; 표 11). 주목할 것은, 아폽토시스를 시사하는 절단된 카스파제-7이 증가했다는 것이다. 차별적으로 발현된 단백질의 GO 분석을 광범위 분자 특징부 데이터베이스를 이용하여 수행하였다. 중요한 GO 용어에는 세포사 및 G0-G1 정지의 선행 설명인 G1-S 세포 주기 정지 경로가 포함되었고, 유세포 측정 및 RNA-seq 분석에 의해 검출된 세포 주기 효과와 일치하였다(도　18C). E2F1, TP53, γH2AX, CHEK1 phos-S296, 및 CHEK2 phos-T68의 증가는 DNA 손상 경로가 화합물 I 처리에 의해 유발된다는 개념을 뒷받침하였다. 또한, XBP1, HSPA5, 및 MAPK14(p38) phos- T180/182의 증가가 관찰되어, ER 또는 세포성 스트레스를 시사하였다(P = 1.89E-08; ref. 15). DDR 경로는 또한 MAPK 경로 활성화 MAPK14 및 MAPK8(JNK)을 통해 신호를 전달할 수 있고, DDR 경로 및 ER 스트레스 간 누화는 어느 경로가 개시 이벤트를 나타내는지가 불명확하지만 널리 확립된 현상이다. 상당부의 차별적으로 발현된 단백질 및 mRNA가 세포 주기 및 아폽토시스성 경로 조절 모두의 통합 부분으로 알려져 있는 MYC 종양 단백질의 표적 유전자이다. 종합적으로, 이들 데이터는 MYC 종양유전자의 조절이 화합물 I의 기전에서 초기 및 핵심 역할을 담당할 수 있음을 제시하였다.
실시예 12: 화합물 I이 AML 세포에서 MYC mRNA 및 단백질 수준을 농도- 및 시간-의존적으로 하향조절함
MYC 발현은 백혈병 및 림프종을 포함하는 광범위한 암의 발병기전에 연루된다. 최근 연구는 MYC 전사의 억제가 조혈 기원의 암 세포에서 아폽토시스를 야기함을 실증하여, MYC를 매력적인 치료 표적으로 만들었다. 본 발명의 RNA-seq 데이터세트의 리뷰는 MYC가 6시간째에 MV4-11 세포에서 화합물 I에 의해 하향조절됨을 드러내었다. 또한 유전자의 전사 증가가 화합물 I-처리 MV4-11 세포에서 MYC에 의해 음성적으로 조절됨이 관찰되었다. 화합물 I은 평가된 모든 AML 세포주에서 MYC mRNA 및 단백질 수준 모두에서 농도-의존적 감소를 일으켰고, MYC 억제에 대한 IC50 값은 항증식 IC50 값과 필적하였다(도 11A 및 B). 이들 변화는 MV4-11, EOL-1, 및 KG-1 AML 세포에서 최대 24시간의 노출 시간의 함수로서 증가하였다(도 11C; 도 19A 및 19B). MV4-11 세포에서 MYC 단백질 억제의 시간 경과는 RNA-seq에 의해 검출되는 MYC 유전자 발현 수준의 억제와 필적하였다. 모든 평가된 AML 세포주는 건강한 공여체로부터의 PBMC에 비해 유의미하게 더 높은 MYC의 기저 발현을 가졌다(도 11D; 도 19C). 따라서, 화합물 I은 조사된 모든 AML 세포주에서 mRNA 및 단백질 수준에서 MYC를 하향조절한다.
MYC 발현의 조절은 MYC 전사, mRNA 안정성, 및 단백질 턴오버(turnover)가 관여되는 복잡한 공정이다. 활성 염색질의 널리 확립된 마커인 H3K27ac에 대한 ChIP-qPCR 분석을 수행하여 화합물 I로의 처리 후 MYC 유전자 프로모터의 전사 적격성을 평가하였다(도 19D). MV4-11 세포에서 MYC 프로모터에서의 H3K27ac 감소는 2시간만큼 빨리 관찰되었고 경시적으로 진행되어, MYC 프로모터의 개질 및 MYC 유전자의 후속 전사 억제가 화합물 I 작용 기전의 초기 매개체임을 시사하였다(도 19E). 화합물 I이 MYC mRNA 안정성에 영향을 미쳤는지를 결정하기 위해, RNA 붕괴 검정을 EOL-1 세포 상에서 수행하였다. 화합물 I 사전처리 세포 대 비히클에서 MYC mRNA 수준의 명확한 감소가 존재하여(도 19F), 화합물 I이 MYC mRNA의 안정성을 감소시킬 수 있음을 시사하였다. 이들 데이터는 화합물 I이 전사 및 mRNA 안정성에 모두 영향을 미침으로써 MYC를 조절함을 제시한다.
실시예 13: 화합물 I이 DNA 손상 및 세포성 스트레스 경로를 유발함
MYC에 부가하여, RNA 및 단백질 차별적 발현 분석은 화합물 I의 작용 기전에서 TP53, DNA 손상, 및 ER 스트레스의 관여를 지목하였다. MV4-11 세포에서 화합물 I 처리 후 TP53 단백질 수준의 증가를 실증한 RPPA 데이터의 검증을 추진하였다. 500 nmol/ℓ 화합물 I로의 MV4-11 세포 노출은 초기 시점(1, 3, 및 6시간)에 TP53 수준의 유의미한 증가에 이어 12시간째에 기준선으로의 복귀 및 아마도 상기 시점에서의 광범위한 세포사로 인한 24시간째의 추가 감소를 일으켰다(도 12A). 전체 단백질의 증가는 포스포-Ser15 및 아세틸- K382에서의 증가와 일치하였다(도 12B). TP53은 DNA 손상에 반응하여 Ser15 및 Ser20에서 인산화되며, 이는 MDM2 결합 및 p53의 프로테아좀 분해를 감소시킨다. 또한, p53은 세포성 스트레스에 반응하여 아세틸화되고, 상기 개질은 TP53 단백질 수준을 추가 안정화하고 결합 활성을 조절할 수 있다. TP53의 활성화는 전-아폽토시스성 인자, 예컨대 BBC3(PUMA), PMAIP1(NOXA), 및 BAX의 상향조절을 통해 아폽토시스를 유발할 수 있다. RNA-seq 데이터세트는 화합물 I-처리 MV4-11 세포에서 BBC3의 3.95배 증가 및 PMAIP1의 1.38배 증가를 나타내었다. DNA 손상 및 세포성 스트레스 경로의 관여를 500 nmol/ℓ 화합물 I로의 처리 후 초기 시점에 MV4-11 세포에서 추가 조사하였다. phos-CHEK1의 증가는 화합물 I 첨가 후 1시간째에 검출되었고 대략 4시간째에 피크를 가져서, DNA 손상이 초기 이벤트임을 제시하였다(도 12C). CHEK1 인산화 후, 6시간경 DDR 마커 γH2AX의 강력한 증가가 존재하였다. γH2AX의 농도-의존적 증가가 평가된 모든 AML 세포주에서 검출되었고, 이에 따라 화합물 I이 DDR 경로를 유발한다는 개념에 대한 추가적 신빙성을 더했다(도 12D). 또한, 4- 내지 6-시간 처리 시 MAPK14 phos-T180 및 MAPK8 phos-Thr183/pTyr185 둘 다에서 증가가 존재하였고, 이는 DDR 또는 ER 스트레스 경로를 통한 신호전달을 시사하였다(도 12C). 전반적으로, 데이터는 화합물 I에 의해 유도된 DNA 손상이 화합물 I의 기전에서 초기 이벤트임을 제시한다.
실시예 14: 화합물 I의 세포내 약동학
질량 분광측정에 의해 결정되는 KG-1 AML 세포에서 화합물 I의 흡수 및 유출의 동력학 측정은 항정 상태에 대한 점진적 접근 및 신속한 초기 유출을, 그러나 매우 연장된 말기 유출을 시사하였다(도 20A 및 20B). KG-1 세포를 1 또는 6시간 동안 화합물 I에 노출시킨 후 약물 비함유 배지에 배치하였을 때, 유출 패턴은 최초 30분 동안 일어나는 신속한 상에 이어 연장된 말기상으로 구성되어, 상당량의 화합물 I이 24시간보다 오래 KG-1 세포에 보유되었다. 이들 데이터와 일치하게, 세포 약동학 연구는 화합물 I이 세포내에서 1개 원자의 Fe 및 3개 분자의 화합물 I을 함유하는 복합체[Fe(화합물 I)3]로 변환됨을 개시하였다(도 20C 및 20D). 실제로, 사전 복합체화된 Fe(화합물 I)3 약물은 세포독성 검정에서 모체 화합물 I 단량체만큼 강력하다(도 13A). 또한, Fe(화합물 I)3 복합체는 각각 c-PARP 및 γH2AX에 의해 측정된 바와 같이, MV-4-11 세포에서 아폽토시스성 및 DNA 손상 경로를 유발하였다. Fe(화합물 I)3은 또한 KLF4 및 CDKN1A 발현을 유도하였고 용량-의존적 방식으로 MYC를 억제하였다(도 13B). 그러나, 가능하게는 사전복합체화된 Fe(화합물 I)3에 대해 관찰된 더 느린 유입 속도로 인해 24시간 검정에서(세포독성 검정에서의 5일 처리와 대비되어) 모체 화합물 I과 동일한 반응을 야기하기 위해 더 높은 농도의 Fe(화합물 I)3이 요구되었다(도 20E).
실시예 15: 화합물 I이 G-4중체 서열을 안정화함
모체 화합물 I 및 그 세포내 Fe(화합물 I)3 형태는 소정 특성, 예컨대 금속-배위 펜안트롤린 고리 및 평면 구조를 포함하며, 이는 제제가 G-4중체(G4) DNA 리간드로 기능할 수 있도록 할 수 있다. G4는 서로의 상부에 적층되는, 평면 구아닌 테트라드(tetrad)를 형성하는 구아닌-풍부 영역 폴딩에 의해 유도되는 다이나믹한 이차 DNA 구조이다. G4-특이적 서열이 텔로미어에서 그리고 여러 중요한 종양유전자의 프로모터에서 확인된다. G4 서열은 유전자 발현의 조절인자로 작용하며 G4 4중체를 안정화하는 소분자 리간드가 중요한 종양유전자, 예컨대 KIT 및 MYC를 하향조절하기 위해 탐색되었다. 텔로미어 DNA에서 G4 모티브의 안정화는 텔로머라제의 억제, 텔로미어 불안정성, 및 탈보호를 유도할 수 있고, 이는 모두 DDR 경로를 유발할 수 있다. 또한, DNA 복제 부위의 기원이 DNA G4 서열과 중복되며, 이러한 부위에서 G-4중체 구조의 안정화는 복제 포크 및 세포 주기 정지의 중단을 유도한다.
개질된 FRET 검정을 사용하여 화합물 I(약물의 모체 단량체 형태) 및 Fe(화합물 I)3이 G4 서열에 결합하고 이를 안정화하는 능력을 평가하였다(도 21 및 22). 널리 알려진 G4 리간드인 TMPyP4, 및 G4-결합 특성을 갖는 것으로 최근에 보고된 임상 단계 분자인 CX-5461을 대조군으로 이용하여 G4-안정화 활성에 대한 화합물 I 및 Fe(화합물 I)3의 특이성을 평가하였다. 예상된 바와 같이, CX-5461은 평가된 모든 G4 서열의 강력한 안정화제였고, TMPyP4는 KIT 유전자 프로모터의 G4를 제외한 모든 G4 모티브를 안정화하였다(도 13C). 흥미롭게는, 증가하는 농도의 Fe(화합물 I)3이 TMPyP4와 유사한 효능으로 MYC 및 KIT 유전자 프로모터, rRNA, 및 텔로미어에 대응하는 G4 구조를 안정화하였다(도 13C; 도 22). 모체 단량체 화합물 I도 G4 모티브의 시간-의존적 안정화를 나타내었으나, MYC G4 서열의 안정화에 대해 가장 큰 경향성을 실증하였다(도 13C).
ds-DNA와의 비특이적 상호작용 대비 G4 구조에 대한 선택성을 평가하기 위해, FRET 검정을 용액 중 ds-DNA 헤어핀을 형성하는 자가-상보성 올리고로 반복하였다. 특히, Fe(화합물 I)3은 CX-5461 및 TMPyP4 둘 다에 비해 ds-DNA 대비 G4 구조에 있어서 훨씬 더 높은 정도의 선택성을 실증하여, 화합물 I이 구별력이 더 큰 G4 리간드라는 점을 강조하였다(도 13C; 도 21B). 유전자 발현 분석은 MYC 및 KIT의 발현이 화합물 I 처리에 반응하여 AML 세포에서 감소됨을 나타내었으나(RNA-seq 데이터, MV4-11 세포 6-시간 처리), 45s rRNA 수준은 감소하지 않았다. 45s rRNA 상에서의 효과 부재는 핵의 rRNA-풍부 인 영역 내로의 화합물 I 및/또는 Fe(화합물 I)3의 이용 가능성 차이를 반영할 수 있다. 그럼에도 불구하고, 화합물 I은 G4 구조를 명확히 안정화할 수 있고, 이는 MYC 및 다른 유전자의 발현 억제에 대한 설명을 제공한다. 임의의 특정 이론에 의해 구애받지 않고, 화합물 I에 의한 G4 모티브의 안정화가 복제 포크 및 텔로미어에서 단일- 및 이중-가닥 절단을 일으킨다고 가설을 세웠다; 화합물 I의 이러한 G4-결합능은 약물이 DDR 경로, 세포 주기 정지, 및 아폽토시스를 유발하는 기전을 확인시켜준다.
실시예 16: 논의
화합물 I은 비임상 모델에서의 그 유효성 및 동물에서 또는 고체 종양 환자에서의 그 최초 I상 시험에서 골수억제를 일으키지 않았다는 점으로 인해 AML의 치료를 위해 현재 임상 개발 중이다. 본원에서 보고된 데이터는 보다 정확한 임상 적용 및 바이오마커 개발을 위한 방식을 지목하는 상기 신규한 제제의 작용 기전에 대해 새로운 식견을 제공한다. 이들 연구는 화합물 I이 AML 세포에서 G0-G1 세포 주기 정지 및 아폽토시스의 강력한 유도제임을 확인시켜주었다. 추가적인 새로운 발견에는 화합물 I이 그 프로모터 및 mRNA 안정성 모두에 대한 효과를 통해 MYC의 시간- 및 농도-의존적 하향조절을 일으킨다는 것, 여러 AML 세포주에서 마스터 전사 인자 및 종양 억제인자 KLF4를 유도한다는 것, 그리고 DNA 손상을 유도한다는 것이 포함된다. 또한, 화합물 I의 사전-복합체화된 철 형태, Fe(화합물 I)3은 아폽토시스, DNA 손상, 및 MYC 발현의 하향조절을 포함하여, 필적하는 세포독성 세포 효과를 유도한다.
화합물 I이 그 모체 단량체 형태이건 Fe(화합물 I)3 철 복합체 형태이건 무관하게, DNA에서 G4 모티브를 안정화한다는 발견은 상기 약물의 여러 약력학 효과에 대한 설명을 제공한다. G4의 안정화는 텔로미어 안정성을 손상시키고 복제 포크를 중단시켜 단일- 및 이중-가닥 DNA 절단을 일으키는 것으로 알려져 있다. MYC 프로모터에서 G4의 이러한 안정화는 유전자 침묵화제로 기능하는 것으로 여겨진다. 이는 화합물 I에 의한 KIT 및 텔로미어 G4 구조의 표적화와 커플링되어, 화합물 I이 세포 주기 정지와 협력하고 AML 세포에서 아폽토시스를 촉진하는 DDR 경로를 활성화하는 기전을 제공한다.
또한, BRCA1/2 돌연변이를 보유하는 세포가 화합물 I에 대해 과민성이어서, 화합물 I 작용 기전에서 DNA 손상에 대한 역할을 추가로 뒷받침한다. 화합물 I은 일관되게 CDKN1A의 상향조절을 일으켰고, 이는 G0-G1에서의 정지를 매개한다. 또한, CDKN1A는 DNA 이중-가닥 절단 후 유도되어 세포 주기 진행을 차단함으로써 DNA를 보수하는 데 충분한 시간을 허용할 수 있다. CDKN1A 유도와 조합되어, 화합물 I은 여러 AML 세포주에서 KLF4 유전자 발현을 증가시켰고, 이는 G1 세포 주기 체크포인트의 일부로 CDKN1A를 조절하는 것으로 알려져 있다. KLF4는 또한 DNA 손상에 반응하여 상향조절되는 것으로 알려져 있고 G0-G1 정지 및 아폽토시스 둘 다에서 역할을 담당한다. 화합물 I의 작용 기전에서 KLF4의 역할은 추가 연구를 위한 관심의 대상이다. 화합물 I의 구조는 이것이 반응성 산소종을 생성할 수 있음을 제시하지만, MV4-11, EOL1, 또는 KG-1 세포에서 GSH의 변화 또는 분자 센서를 사용해서 이러한 종이 검출된 바는 없었다.
CHEK1/2의 활성화, TP53의 안정화, 및 E2F1의 유도도 화합물 I 처리 후의 초기 이벤트가 세포 주기 정지 및 DNA 보수에 대하여 신호를 전달하는 기능함을 시사한다. 세포 주기 정지는 화합물 I 처리 후 2시간경 검출된 반면, RNA 및 단백질 수준 모두에서 몇몇 전아폽토시스성 인자의 상향조절은 6시간경 관찰되었다. DNA 보수 공정의 활성화에 부가하여, pCHEK1/2 및 TP53도 아폽토시스를 유발하는 데 역할을 담당할 수 있다. DNA 보수가 실패하는 경우, p53은 BAX, BAD, BBC3, 또는 PMAIP1의 상향조절을 통해 아폽토시스를 활성화할 수 있다. 이들 전아폽토시스성 인자의 발현 증가는 화합물 I-처리 MV4-11 세포의 RNA-seq 분석에 의해 검출되었다. PARP1의 카스파제-의존적 절단이 아폽토시스가 진행되기 위해 필요하다고 알려져 있다. 화합물 I은 강력한 초기 PARP1 절단을 일으켜서, 화합물 I이 DDR 경로를 유발하여 기능한다는 가설에 대한 추가적인 신뢰도를 더했다. 이는 세포에 대해 괴멸적인 DNA 손상 수준 및 세포를 아폽토시스를 향해 편향시키는 전사 프로그램의 변경을 제시한다. MYC 조절이상은 여러 종양에서 공통적인 종양형성 유도인자여서, 이를 매력적인 잠재 치료 표적으로 만든다. 그러나, MYC의 표적화는 MYC 조절 및 신호전달의 복잡성으로 인해 어렵다. 최근에, BET 브로모도메인 억제제에 의한 MYC 발현의 억제가 백혈병 세포에서 아폽토시스의 유발에 효과적임을 증명하였다. 그러나, 브로모도메인 단백질은 모든 활성 유전자 상에 존재하며, 브로모도메인 단백질의 억제는 중증 독성 및 골수억제를 유도할 수 있다. 화합물 I은 평가된 모든 AML 세포주에서 RNA 및 단백질 수준 모두에서의 MYC 발현 감소를 일으켰고, MYC의 하향조절은 상이한 AML 세포에서의 그 세포독성 효능에 필적하였다. 건강한 공여체로부터의 PBMC에서보다 AML 세포주에서 더 높은 MYC 수준이 검출되었고, 이는 이들 유형의 세포 상에서 화합물 I의 차별적 효과와 연관될 수 있다. 최근 작업에서는 TP53의 상향조절 및 MYC의 하향조절의 협력이 CML에서 백혈병 줄기 세포 집단의 효율적 제거를 야기함을 실증하였다. MV4-11의 화합물 I 처리는 상기 동일한 효과를 일으켰으며, 이는 그 개발에 대한 추가 근거를 제공한다. 더 높은 MYC 발현이 상피 난소암 및 신경모세포종에서의 불량한 임상 결과와 관련됨이 보고되어, 화합물 I이 이들 종양에 대해 유익한 효과를 가질 수 있음을 제시하였다. 종합적으로, 상기 데이터는 주로 G-4중체 구조의 관여를 통해, 화합물 I에 대한 다면 작용 기전을 실증하며, 이는 조혈 종양을 표적화하는 데 독특하게 적합하다. 또한, 화합물 I은 골수억제를 유도하지 않는 클래스-최초 MYC 억제제를 나타내어, 이를 골수 기능이 손상된 AML 환자의 관리에 특히 적절하게 만든다.
상기 실시예 및 소정 구현예의 기재는 청구범위에 의해 정의된 바와 같은 본 발명을 제한하는 것이 아니라 예시하는 것으로 간주되어야 한다. 쉽게 이해될 바와 같이, 상기 나타낸 특성의 수많은 변이 및 조합이 청구범위에 나타낸 바와 같은 본 발명에서 벗어나지 않고 이용될 수 있다. 모든 이러한 변이는 본 발명의 범위 내에 포함되는 것으로 의도된다. 인용되는 모든 참고문헌은 이의 전문이 본원에 참조로 포함된다.
임의의 선행 기술의 문헌이 본원에서 언급되는 경우, 이러한 언급은 문헌이 어느 국가에서든 당분야의 공통적인 일반 지식의 일부를 형성한다는 인정을 구성하지 않음이 이해되어야 한다.
인용을 확인함으로써 본원에서 언급되는 모든 문헌, 특허, 특허 출원 및 공개된 특허 출원의 개시는 이의 전문이 본원에 참조로 포함된다.

Claims (35)

  1. 대상체에서 암을 예방하거나, 감소시키거나, 치료하는 방법으로서, 상기 대상체에게 치료 유효량의 하기 화합물 I:
    Figure pct00023

    I
    또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 유리 염기, 수화물, 복합체, 또는 킬레이트를 투여하는 단계를 포함하며; 상기 대상체는 DNA 보수 유전자에 돌연변이를 갖는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 DNA 보수 유전자가 상동 재조합 유전자인, 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 DNA 보수 유전자가 상동 재조합(HR) 의존적 데옥시리보핵산(DNA) 이중 가닥 절단(DSB) 보수 경로의 유전자인, 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 DNA 보수 유전자가 BRCA-1, BRCA-2, ATM, ATR, CHK1, CHK2, Rad51, RPA 및 XRCC3으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자인, 방법.
  5. 제2항에 있어서, 상기 DNA 보수 유전자가 BRCA-1 및/또는 BRCA-2인, 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 대상체가 DNA 보수 유전자에서의 돌연변이에 대해 이종접합성인, 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 대상체가 상동 재조합(HR) 의존적 데옥시리보핵산(DNA) 이중 가닥 절단(DSB) 보수 경로의 유전자에서의 돌연변이에 대해 이종접합성인, 방법.
  8. 제6항에 있어서, 상기 대상체가 BRCA1 또는 BRCA2에서의 돌연변이에 대해 이종접합성인, 방법.
  9. 제6항에 있어서, 상기 대상체가 BRCA1 또는 BRCA2에서의 돌연변이에 대해 동종접합성인, 방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 암이 헴 암, 결장직장암, 난소암, 유방암, 자궁경부암, 폐암, 간암, 췌장암, 림프절의 암, 백혈병, 신장암, 결장암, 전립샘암, 뇌암, 두부경부암, 뼈암, 후두 및 구강의 암종, 어윙 육종, 피부암, 신장 암, 및 심장의 암으로 구성되는 군으로부터 선택되는, 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 암이 유방암, 폐암, 림프절의 암, 결장암, 백혈병, 신장암, 및 전립샘암으로 구성되는 군으로부터 선택되는, 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 암이 유방암인, 방법.
  13. 제1항에 있어서, 상기 암이 BRCA-연관 암인, 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 BRCA-연관 암이 BRCA-1 및/또는 BRCA-2 유전자의 하나 이상의 돌연변이를 갖는, 방법.
  15. 제1항에 있어서, 상기 대상체가 인간인, 방법.
  16. 제1항에 있어서, 치료 유효량의 제2 치료 활성 제제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 대상체에 화합물 I이 투여되기 전에, 그 동안, 또는 그 후에 상기 제2 치료 활성 제제가 투여되는, 방법.
  18. 제16항에 있어서, 상기 제2 치료 활성 제제가 면역치료제, 항암제, 및 혈관신생제제로 구성되는 군의 하나 이상으로부터 선택되는, 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 제2 치료 활성 제제가 PARP 억제제인, 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 PARP 억제제가 올라파립인, 방법.
  21. 제1항에 있어서, 상기 대상체가, 치료 유효량의 화합물 I
    Figure pct00024
    또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 유리 염기, 수화물, 복합체, 또는 킬레이트를 투여받지 않은 대상체에 비해 골수 활성의 90% 미만 감소를 경험하는, 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 대상체가 골수 활성의 10% 미만 감소를 경험하는, 방법.
  23. 제21항에 있어서, 상기 대상체가 골수 활성의 감소를 경험하지 않는, 방법.
  24. 제1항에 있어서, 상기 대상체가 이미 암을 갖고 있는, 방법.
  25. 제24항에 있어서, 대상체가 암과 연관된 종양 크기의 감소 또는 축소를 경험하는, 방법.
  26. 제25항에 있어서, 상기 대상체가 암과 연관된 종양의 완전 제거를 경험하는, 방법.
  27. 제24항에 있어서, 상기 대상체가 암과 연관된 종양의 신혈관형성 또는 혈관신생의 억제, 축소(decrease), 또는 감소(reduction)를 경험하는, 방법.
  28. 암 세포를 사멸시키는 방법으로서, 상기 세포를 치료 유효량의 화합물 I
    Figure pct00025
    또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 유리 염기, 수화물, 복합체, 또는 킬레이트와 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
  29. 제28항에 있어서, 상기 암 세포가 BRCA-1, BRCA-2, ATM, ATR, CHK1, CHK2, Rad51, RPA 및 XRCC3으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자에 결핍을 갖는, 방법.
  30. 암 세포에서 세포 주기 정지를 유도하는 방법으로서, 상기 세포를 치료 유효량의 화합물 I
    Figure pct00026
    또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 유리 염기, 수화물, 복합체, 또는 킬레이트와 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
  31. 제30항에 있어서, 상기 암 세포가 BRCA-1, BRCA-2, ATM, ATR, CHK1, CHK2, Rad51, RPA 및 XRCC3으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자에 결핍을 갖는, 방법.
  32. 대상체에서 암을 예방하거나, 감소시키거나, 치료하는 방법으로서, 하나 이상의 금속 원자와의 복합체로 치료 유효량의
    Figure pct00027
    의 하나 이상의 분자를 투여하는 단계를 포함하며, 상기 대상체는 DNA 보수 유전자에 돌연변이를 갖는, 방법.
  33. 제32항에 있어서, 상기 하나 이상의 금속 원자가 철, 아연, 알루미늄, 마그네슘, 백금, 은, 금, 크롬, 니켈, 티탄, 구리, 스칸듐, 지르코늄, 바나듐, 몰리브덴, 망간, 텅스텐 및 코발트로 구성되는 군으로부터 선택되는, 방법.
  34. 제33항에 있어서, 상기 하나 이상의 금속 원자가 철인, 방법.
  35. 제34항에 있어서, 상기 복합체가 하기 구조를 갖는, 방법:
    Figure pct00028
    .
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