CN115919873B

CN115919873B - 一种化合物及其盐在癌症治疗药物中的应用

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Publication number: CN115919873B
Application number: CN202310212484.5A
Authority: CN
Inventors: 徐红
Original assignee: Xinyi Hexin Beijing Biotechnology Co ltd
Current assignee: Xinyi Hexin Beijing Biotechnology Co ltd
Priority date: 2023-03-07
Filing date: 2023-03-07
Publication date: 2023-09-29
Anticipated expiration: 2043-03-07
Also published as: CN115919873A

Abstract

本发明提供一种式I化合物、或其药学上可接受的盐在制备治疗及预防癌症药物中的应用：

Description

一种化合物及其盐在癌症治疗药物中的应用

技术领域

本发明属于化学药物领域，具体涉及一种式I化合物、药学上可接受的盐及其在癌症治疗药物中的应用。

背景技术

DNA通常以双链的形式存在，但是在某些鸟嘌呤串联重复的区域，鸟嘌呤由Hoogsteen氢键连接，4个G形成环状平面，两层或以上的四分体通过π-π堆积形成一种特殊的高级结构—四链结构。四链体DNA富集于染色体的末端及基因的启动子区域。位于染色体末端的四链体DNA具有抑制端粒酶的作用，因而稳定染色体末端的四链体DNA可以抑制癌症的生长。许多癌基因，例如CMYC、KRAS、CKIT的启动子区域富含四链体DNA结构，有证据表明，稳定这些区域的四链体DNA可以降低癌基因表达，从而抑制癌症生长。

四链体DNA通常可能是一种暂时的结构，常发生于DNA复制及转译时双链DNA解链时的情况。细胞内也拥有许多解链酶可以解开四链体DNA的高级结构。但是当四链体DNA与稳定剂药物结合，致使解链酶难以解开四链体结构时，这种稳定的结构必然会阻碍DNA复制及转译，甚至会造成DNA的断裂。BRCA1及BRCA2介导的同源重组DNA修复通路（HR），以及非同源末端连接修复通路（NHEJ）是修复断裂DNA的重要通路，也可能在DNA复制及转译过程中负责绕开四链体结构，保证DNA复制及转译的顺利进行。已有多篇文献报道BRCA1/2缺陷的癌症对于四链体DNA稳定剂高度敏感。此外，相对于正常细胞，癌细胞中具有更多的四链体DNA结构，四链体DNA稳定剂有希望成为治疗BRCA1/2缺陷型，HR缺陷型以及其他DNA损伤修复缺陷肿瘤的临床药物。

CX-5461曾经被认为是一种RNA polymerase I抑制剂，抑制rDNA的转译，也有文献表明CX-5461具有拓扑异构酶抑制的作用。2016年，CX-5461(NCT04890613， Study of CX-5461 in Patients With Solid Tumours and BRCA1/2, PALB2 or HomologousRecombination Deficiency (HRD) Mutation)在加拿大进入一期临床实验（NCT02719977），在实体瘤患者中探索药物使用剂量，之后又进入了临床1b 的实验，探索在BRCA1/2, PALB2, 以及同源重组修复缺陷（HRD）实体瘤病人中的使用剂量及药效（NCT04890613）。另外，它也用于澳大利亚的一项治疗多发性骨髓瘤，白血病及淋巴癌的一期临床实验（NCT05425862）, 以及和PARP抑制剂药物 Talazoparib (他拉唑帕利) 联合给药用于治疗转移性去势疗法无效的前列腺癌（NCT05425862）。

2017年Xu等发表的文章揭示了CX-5461对四链体DNA的稳定作用：CX-5461可以提高四链体DNA的解链温度；结合了CX-5461的四链体DNA阻碍DNA复制；并且加入CX-5461之后，可以检测到细胞中四链体DNA含量的增加(《Nature communications》，2017: 8(1), 1-18)。此外，CX-5461结合了四链体DNA之后会引起DNA的断裂损伤。BRCA1及BRCA2功能缺失的癌症对CX-5461非常敏感，证明BRCA1及BRCA2介导的同源重组修复通路对修复CX-5461引起的DNA损伤起重要作用。无论在细胞水平还是用小鼠的PDX模型，CX-5461都显示出对BRCA1/2缺陷型癌症极高的选择性杀伤能力。除了BRA1/2缺陷及HRD肿瘤之外，Xu在《Naturecommunications》发表的文章还揭示NHEJ缺陷及其它DNA损伤修复缺陷的肿瘤也对CX-5461非常敏感。CX-5461在2016年加拿大进入一期临床实验，在乳腺癌患者中探索药物使用剂量，并初步评价CX-5461在BRCA1/2缺陷患者中的疗效。此临床实验于2020年初结束，公布的数据显示CX-5461在同源重组功能缺失的实体瘤中显示了良好疗效，尤其是BRCA2和PALB2基因缺陷的肿瘤。在人体中治疗实体瘤的推荐用药量为475mg/m²，4个星期为一个疗程，第1，8，15天给药，给药方式为静脉滴注。

尽管CX-5461在HR缺陷的实体肿瘤中显示了初步疗效，但是CX-5461在临床试验中用药量大，在人体中治疗实体瘤的NCT02719977临床试验中，其推荐用药量为475 mg/m²，并观察到光毒性，中性粒细胞减少，肢端紅肿，恶心等副作用。另外，CX-5461在现有的临床试验中的给药方式为多次静脉滴注，需要在医院进行，占用大量医疗资源，不如口服给药方便经济，而且还引入了和静脉滴注相关的感染，静脉炎，形成血栓等等的风险。考虑到接受CX-5461治疗的癌症患者的基础健康状况，以及近年来的新冠，SARS等流行性传染性疾病的爆发，开发相关的不占用宝贵医疗资源的口服药非常必要。

针对CX-5461在临床使用上的缺陷，本专利拟提高化合物对肿瘤的杀伤活性并提高它的代谢稳定性，减少其毒副作用，并提高生物利用度，以便将此类化合物改造为更方便病人使用的口服制剂。

氘代药物是指将药物分子中的部分氢原子替换为氘。由于氘在药物分子中形状和体积与氢接近，氘代药物一般会保留原来药物的生物活性和选择性。氘质量是氢的两倍，因而C-D键的振动伸缩频率比C-H小，基态能量低。这导致C-D键断裂的活化能较C-H键高，C-D键更不容易断裂，使得氘代药物一般在体内更稳定，其半衰期会延长。

由于生物系统的代谢过程复杂，药物在生物体内的药代动力学性质受到多方面因素影响，也表现出相应的复杂性。与相应的非氘代药物相比，氘代药物药代动力学性质的变化表现出极大的偶然性和不可预测性。某些位点的氘代非但不能延长半衰期，反而可能会使其缩短，劣化其药代动力学性质；氘代分子对细胞活性的影响更是不可预测，没有定论的。另一方面，药物分子上某些位置的氢因为空间位阻等原因也不易被氘代，因此，药物的氘代并非随心所欲，可氘代的位点对药物的影响是不可预期的。

发明内容

I、使用方法

本发明涉及一种式I化合物及其药学上可接受的盐。

本发明化合物具有如式I所示的结构式：。

本发明所示的化合物“药学上可接受的盐”通常以游离酸的形式存在。可用本领域公知的方法制备本发明的游离氨基化合物的酸加合盐。适合的酸包括但不限于磷酸、盐酸、氢溴酸、氢氟酸、氢碘酸、硫酸、硝酸、马来酸、反丁烯二酸、安息香酸、抗坏血酸、琥珀酸、甲磺酸、甲酸、乙酸、三氟乙酸、草酸、丙酸、酒石酸、水杨酸、柠檬酸、葡萄糖酸、乳酸、扁桃酸、苯乙酸、天冬氨酸、硬脂酸、棕榈酸、乙二醇酸、谷氨酸、对甲苯磺酸和苯磺酸。另外，含碱性氮原子的基团可以用以下试剂季铵化：低级烷基卤化物，例如甲基、乙基和丁基的氯，溴及碘化物；二烷基硫酸盐，例如二甲基、二乙基、二丁基和二戊基硫酸盐；长链卤化物，例如癸基，十二烷基，十四烷基和十八烷基氯，溴及碘化物；芳烷基卤化物，例如苄基和苯乙基的溴化物及其它。由此得到水溶或油溶性的或可分散性的产物。因此，“药物可接受的盐”应包括所有可接受的盐形式。

本发明提供了上述化合物或其药学上可接受的盐在制备治疗具有BRCA-1或BRCA-2突变的癌症（纯和或杂合突变），同源重组修复缺陷型癌症，非同源末端连接(NHEJ)修复缺陷癌症，或其他DNA损伤修复缺陷癌症中的应用，以及在制备具有c-Myc、N-Myc或L-Myc过表达的癌症、其他癌基因（HIF，VEGF,ABL,TGF, PDGF, MYB, SPARC, HER2, C-KIT1, C-KIT2,VAV, RET, N-RAS, H-RAS, K-RAS, EGF, SRC, BCL-1, BCL-2, DHFR, HMGA等）过量表达的癌症和染色体数目异常的癌症中的应用。包括单独使用，及联合用药。联合用药可以是同时或者顺序施用。

本发明提供了上述化合物或其药学上可接受的盐在制备治疗因使用PARP抑制剂而改善或者产生抗性的疾病中的应用，或者与PARP抑制剂药物的联用。其中联合使用的PARP抑制剂药物选自Olaparib(奥拉帕尼)、Niraparib(尼拉帕尼)、Rucaparib(鲁卡帕尼)、Talazoparib(他拉唑帕利)、Fluzopari(氟唑帕利)，Pamipari(帕米帕利)，或者其他PARP抑制剂。

本发明提供了上述化合物或其药学上可接受的盐与拓朴异构酶I和拓朴异构酶II抑制剂，CHK1抑制剂，CHK2抑制剂，ATM抑制剂，ATR抑制剂，DNA-pK抑制剂，WEE1抑制剂，各种DNA聚合酶，RNA聚合酶抑制剂，DNA损伤修复网络靶向药物，mTORC1/2抑制剂，组蛋白脱乙酰酶抑制剂(histone deacetylase inhibitors)，蛋白酶体抑制剂(proteasomeinhibitors），RNA转录抑制剂（transcription inhibitors），mRNA翻译抑制剂(mRNAtranslation inhibitors)，PIM激酶及其他激酶抑制剂，p53激活剂的联用。

本发明还提供了上述的化合物或其药学上可接受的盐在制备用于肿瘤治疗的辅助药物中的应用。

进一步地，本发明还提供了上述化合物或其药学上可接受的盐在制备用于联合癌症化疗、放疗、靶向疗法、免疫疗法，免疫检查点抑制剂（PD-1, PD-L1, CTLA-4抑制剂等）、内分泌疗法、代谢疗法，溶瘤病毒疗法或联合其它疗法中的应用。

进一步地，所述癌症为乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、宫颈癌、口腔癌、胰腺癌、前列腺癌、脑癌、肺癌、肝癌(HCC)、白血病、淋巴癌、骨髓瘤、多发性骨髓瘤、皮肤癌、腹膜癌、结肠直肠癌、成胶质细胞瘤、黑素瘤、骨肉瘤、宫颈癌、尤因氏肉瘤、淋巴结癌、胃肠道恶性肿瘤、头颈癌、肾癌、心脏的癌症，或其它癌症。

本发明提供了上述化合物或其药学上可接受的盐在制备用于治疗多发性硬化症等自身免疫性缺陷型疾病中的应用，及联合用药。联合用药可以是同时或者顺序施用。

本发明提供了上述化合物或其药学上可接受的盐在制备治疗或其药学上可接受的盐在制备用于治疗细菌，真菌，及病毒引起的疾病中的应用。病毒感染包括但不限于乙肝，丙肝病毒，鼻病毒，带状疱疹病毒，单纯疱疹病毒，巨细胞病毒，痘疹病毒，脑炎病毒，汉坦病毒，虫媒病毒，人乳头瘤病毒(HPV)，西罗尼病毒，艾滋病毒，流感病毒，EB病毒(Epstein-Barr Virus)，呼吸道合胞病毒，冠状病毒（SARS-CoV, SARS-CoV-2, MERS-CoV）等。包括单独使用，及联合用药。联合用药可以是同时或者顺序施用。

II、制剂

本发明如式I所述的化合物或其药学上可接受的盐为活性成分，以及药学上可接受的辅料或者辅助性成分制备而成的制剂。所述药学上可接受的辅助性成分，它具有一定生理活性，但该成分的加入不会改变上述药物组合物在疾病治疗过程中的主导地位，而仅仅发挥辅助功效，这些辅助功效仅仅是对该成分已知活性的利用，是医药领域惯用的辅助治疗方式。若将上述辅助性成分与本发明药物组合物配合使用，仍然应属于本发明保护的范围。

“药学上可以接受的载体”指的是：一种或多种相容性固体或液体填料或凝胶物质，它们适合于人使用，而且必须有足够的纯度和足够低的毒性。药学上可以接受的载体部分例子有纤维素及其衍生物 (如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素钠、纤维素乙酸酯等)、明胶、滑石、固体润滑剂(如硬脂酸、硬脂酸镁)、硫酸钙、植物油(如豆油、芝麻油、花生油、橄榄油等)、多元醇(如丙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇等)、乳化剂、润湿剂、着色剂、调味剂、稳定剂、抗氧化剂、防腐剂、无热原水等等任何类型的无毒性固体，半固体及液体的填充剂，稀释剂，包封材料及配制辅剂。

本发明药学组合物可呈固体或液体形式。一方面，载剂为微粒，以致组合物例如呈片剂或散剂形式。载剂可为液体，而组合物为例如口服糖浆、可注射液体，或适用于例如吸入投药的气雾剂。当欲口服时，药学组合物优选自固体或液体形式，其中半固体、半液体、悬浮液和凝胶形式包括在本文中视为固体或液体的形式中。对于口服固体组合物，可将药学组合物调配成散剂、颗粒剂、压缩片剂、丸剂、胶囊、咀嚼片、粉片等形式。此类固体组合物通常含有一种或多种惰性稀释剂或可食用载剂。此外，还可存在一种或多种以下物质:粘合剂，例如羧甲基纤维素、乙基纤维素、微晶纤维素、黄瓦胶或明胶；赋形剂，例如淀粉、乳糖或糊精；崩解剂，例如海藻酸、海藻酸纳、玉米淀粉等；润滑剂，例如硬脂酸镁或氢化植物油；助流剂，例如胶状二氧化硅；甜味剂，例如蔗糖或糖精；调味剂，例如薄荷、水杨酸甲酯或甜橙调味剂；和着色剂。

药物组合物可以胃肠外、脑池内、阴道内、腹膜内、局部（例如散剂，膏剂，滴剂及透皮贴剂）、直肠或颌含给药。文中所示术语“胃肠外”是指包括静脉内、肌内、腹膜内、胸骨内、皮下及关节内注射和输注在内的给药方式的模型。用于胃肠外注射的药物组合物包括药学上可接受的无菌的水、或非水溶液剂、分散体、悬混剂及乳剂，以及用来在使用前即刻重构形成无菌注射液或分散体的无菌粉末。合适的水性和非水性载体、稀释剂、溶剂或赋型剂，包括水、乙醇、多元醇（例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等）、羧甲基纤维素及其合适的混合物，植物油（例如橄榄油）和可注射的有机酯（例如油酸乙酯）。在分散体的情形中通过使用包材如卵磷脂保持所需要的粒径，以及通过使用表明活性剂，可以保持合适的流动性。

当药学组合物为胶囊形式，例如为明胶胶囊时，除上述类型的物质以外，其还可含有液体载剂，例如聚乙二醇或油。药学组合物可为液体形式，例如酊剂、糖浆、溶液、乳液或悬浮液。当口服时，优选组合物除含有本发明化合物以外，还含有甜味剂、防腐剂、染料/着色剂和风味增强剂中的一种或多种。在打算通过注射液的组合物中，可包括表面活性剂、防腐剂、润湿剂、分散剂、悬浮剂、缓冲剂、稳定剂和等渗剂中的一种或多种。

本发明药学组合物可包括改变固体或液体剂量单位的物理形式的各种物质。

固体或液体形式的本发明药学组合物可包括一种结合本发明化合物并由此帮助化合物递送的试剂。具有此能力的合适试剂包括单克隆或多克隆抗体、蛋白质或脂质体。

本发明药学组合物可利用制药领域中众所周知的方法制成。例如，可通过将本发明化合物与无菌蒸馏水组合以形成溶液，来制备欲通过注射投予的药学组合物。可添加表面活性剂，形成均匀溶液或悬浮液。表面活性剂是与本发明化合物非共价相互作用，由此促进化合物在水性递送系统中溶解或均匀悬浮的化合物。

本发明如式I所示的化合物或其药学上可接受的盐是以治疗有效量投予，所述治疗有效量将视多种因素而变化，包括所用特定化合物的活性；化合物的代谢稳定性和作用时间长度；患者的年龄、体重、一般健康状态、性别和饮食、投药模式和时间、排泄速率、药物组合、特定病症或病状的严重程度；以及承受疗法的个体。

本发明如式I所示的化合物或其药学上可接受的盐也可在投予一种或多种其它治疗剂的同时、之前或之后投予。此组合疗法包括投予含有本发明化合物和一种或多种其它活性剂的单一药学给药制剂，以及投予本发明如式I所示的化合物与各活性剂自己的单独药学给药制剂。

一种医用组合物，其由本发明如式I所示的化合物或为其互变异构体、前药、活性代谢物、水合物或药物可接受的盐，与免疫作用药、抗生素 (如青霉素类、氨基糖苷类、喹诺酮类、大环内脂类等)、抗病毒药物(如神经氨酸抑制剂、帽依懒性核酸内切酶的抑制、RNA依赖性RNA聚合酶抑制剂、M2蛋白质抑制剂等)之组合所构成。

附图说明

图1表示重复给药后CX-5461、式I化合物和溶剂对小鼠体重的影响曲线。

图2表示人源三阴性乳腺癌 MDA-MB-436模型中药物对肿瘤的抑制作用

实施方式

以下结合测试例进一步描述解释本发明，但这些实施例并非意味着限制本发明的范围。

本发明测试例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照商品制造厂商所建议的条件，未注明具体来源的试剂，为市场购买的常规试剂。

实施例1 式I化合物的制备

合成路线如下(合成路线中HX-002即为本申请所述式I化合物)：

将化合物HX-002-1 (30 g, 156.3 mmol, 1.0 eq)溶到SOCl₂ (300 mL)中，在80°C搅拌过夜。LCMS监控显示反应结束后，将反应液旋干后得到淡黄色油状物HX-002-2 (33g，100％产率)。LC-MS: 206.00 [M-3] ⁺(甲醇淬灭酰氯，MS显示化合物HX-002-1的甲酯化后产物的分子量)。¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 8.36 (dd, J = 8.2, 1.5 Hz, 1H), 7.44(dd, J = 8.3, 1.5 Hz, 1H)。

将化合物HX-002-8 (400 g, 3.2 mol, 1.0 eq)和化合物HX-002-9 (226 g,3.8mol, 1.2 eq)混合到一起，然后在氮气保护下，在120摄氏度下搅拌过夜。LCMS监控显示反应结束。将反应液冷却到室温，直接过滤。滤液用石油醚(500 mL x 12)萃取，将上层的石油醚相合并旋干得到淡黄色油状物产物HX-002-3 (600 g，85.％产率)。MS-ESI: [M+1] ⁺=222.00；¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 8.00 (m, 1H), 7.90 – 7.81 (m, 1H), 7.46 (m,1H), 7.37 (m, 1H), 4.23 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 4.16 (s, 2H), 1.28 (t, J = 7.1Hz, 3H)。

向化合物 HX-002-3 (47.0 g, 212.4 mmol, 1.0 eq.) 在 THF (400 mL) 的溶液中加入MgCl₂ (20.2 g, 212.4 mmol, 1.0 eq), 将反应液在0 °C下搅拌10分钟后加入化合物HX-002-2 (111.7g, 531.0 mmol, 2.5 eq) 的THF (700 mL)溶液，随后将反应液在0 °C下缓慢加入TEA (107.5 g, 1062.0 mmol, 5.0 eq)。反应液在N₂氛围下在室温搅拌16小时。一旦反应结束，将反应液直接过滤，滤渣用乙腈淋洗，然后用大量二氯甲烷淋洗溶解，过滤，滤液直接旋干。得到的粗产品继续用400 mL乙腈进行打浆, 过滤，滤渣即为淡黄色固体产品HX-INT1 (50 g，65%产率)。MS-ESI: [M+1] ⁺= 359.00；¹H NMR (400 MHz, CDCl₃)δ 9.53 (dd, J = 8.6, 0.9 Hz, 1H), 8.84 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.81 – 7.71 (m,1H), 7.60 – 7.50 (m, 2H), 7.47 (td, J = 7.6, 1.1 Hz, 1H), 4.51 (q, J = 7.1Hz, 2H), 1.48 (t, J = 7.1 Hz, 3H)。

向化合物 HX-002-10 (3.0 g, 15.0 mmol, 1.0 eq.) 在 DMF (45 mL) 的溶液中加入K₂CO₃ (6.2 g, 45.0 mmol, 1.0 eq.), 将反应液在50°C下搅拌10分钟后加入CD₃I(1.74 g, 12.0 mmol, 0.8 eq)，CD₃I每隔10分钟加0.2eq, 在30分钟内加完。反应液在氮气氛围下在50 °C下反应0.5小时。LC-MS监控显示反应物生成较多，终止反应进行后处理。加水淬灭，用DCM/MeOH (v/v = 8/1) 萃取 (80 mL x 5)，有机相合并浓缩，用柱层析法纯化。最终得到淡黄色油状物产物 HX-002-11 (1.72 g，53%产率)。MS-ESI: [M+1] ⁺=218.00；¹H NMR (400 MHz, DMSO-d ₆) δ 3.32 (t, J = 6.2 Hz, 4H), 2.62 (s, 4H),1.75 (s, 2H), 1.36 (s, 9H)。

将化合物 HX-002-11 (1.95 g, 9.0 mmol, 1.0 eq.) 溶解到4M HCl/dioxane(20 mL)中，将反应在室温下反应过夜。LC-MS监控显示起始原料反应完。直接将反应液旋干溶剂，并用二氯甲烷把二氧六环带干后最终得到淡黄色油状物产物 HX-002-4 (1.7 g，100%产率)。¹H NMR (400 MHz, DMSO-d ₆) δ 11.38 (s, 1H), 9.70 (s, 1H), 9.42 (s,1H), 3.68 – 3.57 (m, 2H), 3.51 – 3.24 (m, 4H), 3.17 (q, J = 12.5, 9.0 Hz,2H), 2.16 – 2.03 (m, 2H)。

向化合物 HX-INT1 (2.27 g, 6.3 mmol, 1.0 eq) 在乙腈 (30 mL) 的溶液中加入K₂CO₃ (4.4 g, 31.6 mmol, 5.0 eq)和化合物HX-002-4 (1.8 g, 9.5 mmol, 1.5eq)。将反应液在氮气氛围下加热到80 °C搅拌16小时。一旦反应结束，直接将反应液中溶剂旋干，在残余物中加水，二氯甲烷/甲醇=10:1，分液后合并有机相，将有机相旋干。残余物用乙酸乙酯打浆过夜，过滤后得到滤渣即淡黄色固体产物HX-002-5 (2.72 g，97%产率)。MS-ESI: [M+1] ⁺= 440.15；¹H NMR (400 MHz, DMSO-d ₆) δ 9.40 (d, J = 8.5 Hz, 1H),8.24 (s, 1H), 7.99 (m, 1H), 7.55 (m, 1H), 7.44 (m, 1H), 6.97 (m, 1H), 4.29(q, J = 7.0 Hz, 2H), 3.81 (s, 4H), 2.73 (s, 2H), 2.50 (s, 2H), 1.97 (s, 2H),1.29 (t, J = 7.1 Hz, 3H)。

在化合物HX-002-5 (1 g, 2.3 mmol, 1.0 eq)的THF/MeOH/H₂O (7/3/7 mL)溶液中加入LiOH.H₂O (193 mg, 4.6 mmol, 2.0 eq)；混合物在氮气保护下室温搅拌过夜。LCMS监控显示反应结束，直接拉干溶剂，冻干得到化合物HX-002-6 (1.1 g，含氢氧化锂直接用于下一步)。

MS-ESI: [M+1] ⁺= 412.40；¹H NMR (400 MHz, DMSO-d ₆) δ 9.43 (d, J = 8.5Hz, 1H), 8.38 (d, J = 9.1 Hz, 1H), 7.89 (m, 1H), 7.50 (t, J = 7.9 Hz, 1H),7.40 (t, J = 7.5 Hz, 1H), 7.01 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 3.84 (s, 4H), 2.74 (s,2H), 2.51 (s, 2H), 1.99 (s, 2H)。

在化合物HX-002-6 (1.1 g, 2.7 mmol, 1.0 eq.)的DMF (15 mL)溶液中加入HATU (1.5g, 4.1 mmol, 1.5 eq)和DIEA (1.1 g, 8.2 mmol, 3.0 eq)；将混合物在氮气保护下50 °C搅拌0.5小时。然后加入在DMF (2 mL)中溶解的HX-002-7 (504 mg, 4.1mmol, 1.5 eq.)并将混合物在氮气保护下加热到50 °C搅拌16小时；将反应液旋干，将残余物用二氯甲烷/甲醇 (v/v = 10/1) 溶解澄清。然后用水洗涤，合并有机相，将有机相旋干。残余物直接用10 mL甲醇打浆过夜，过滤得到化合物HX-002(即式I化合物) (0.995 g，淡黄色固体，两步产率84%)。

MS-ESI: [M+1] ⁺= 517.25 ；¹H NMR (400 MHz, DMSO-d ₆) δ 11.05 (d, J =5.5 Hz, 1H), 9.34 (s, 1H), 8.53 (d, J = 12.5 Hz, 2H), 8.37 (d, J = 9.0 Hz,1H), 7.99 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.63 – 7.41 (m, 2H), 7.06 (s, 1H), 4.69 (d, J= 5.5 Hz, 2H), 3.79 (s, 4H), 2.99 (s, 2H), 2.45 (s, 3H), 2.14 (s, 2H)。

实施例2、式I化合物的肿瘤细胞活性检测

A. 化合物处理

a) 化合物的母液配置

待测化合物以10mM或5mM的浓度溶于DMSO，Olaparib (奥拉帕利)以10mM溶于DMSO。

b) 化合物储存

所有溶于DMSO的化合物在常温下短期保存于干燥箱中，移入零下20度冰箱做长期保存。

c) 化合物工作浓度的配制

测试化合物从10μM开始用DMSO以3倍连续稀释10个浓度梯度，

Olaparib从10μM开始用DMSO以3倍连续稀释10个浓度梯度，

加了化合物的384孔板以1000rpm的速度离心1分钟。

B. 活性检测

a)将DLD-1 BRCA2^-/-细胞加入RPMI 1640(10%热变性的马血清和100单位/mL青霉素-链霉素)，在37℃、5% CO₂下培养于细胞培养箱。

b)将40μL DLD-1 BRCA2^-/-细胞加入384-孔板，在37℃和5% CO₂下培养过夜。

c)将待测药物在母板上配制成不同的浓度梯度，从母盘取80nL待测化合物及Olaparib加入有细胞的384-孔板，在37℃和5% CO₂下培养6天。

d)将Cell Titer Glo(每孔30μL)加入至384孔板，常温避光培养30分钟后，由酶标仪(Envision plate reader)测量。

C. 数据处理

a)用GraphPad Prism软件计算IC₅₀，并画出随浓度变化的活性曲线。

b)化合物对细胞活性的抑制由以下公式算出：

（4）测试结果：式I化合物对肿瘤细胞活性抑制的研究

通过对BRAC2^-/- DLD1细胞活性的研究发现式I化合物与比Olaparib 有更强的癌症抑制活性，IC₅₀显著低于Olaparib。

实施例3 式I化合物在肝细胞的代谢产物分析

试验方法

在乙腈/DMSO 中以 2 mM 的浓度制备测试化合物的储备溶液

通过混合下表中的成分来制备肝细胞解冻培养基。通过混合 49.5 mL WilliamsE 培养基和 0.5 mLglutaMAX 制备孵化培养基。将解冻培养基和孵育培养基置于 37°C 水浴中，然后在使用前至少加热 15 分钟。

3）取出小瓶肝细胞，确保小瓶保持低温直至解冻过程。尽快将小瓶放入 37°C 水浴中并轻轻摇动小瓶以解冻细胞。小瓶应保留在水浴中，直到所有冰晶都溶解并且不再可见。解冻完成后，用 70% 乙醇喷洒小瓶，将小瓶转移到生物安全柜中。

4）打开小瓶，将内容物倒入装有50 mL 解冻培养基的锥形管中，然后以80 g 离心6 分钟。离心完成后，吸出解冻培养基并将肝细胞重悬于足够的孵育培养基稀释为1.5×10⁶个细胞/mL。

5）使用 Cellometer^® Vision 对细胞进行计数并确定活细胞密度。用孵育培养基稀释细胞至工作细胞密度为1×10⁶个活细胞/mL。

6）将 1 µL 的 2mM 测试化合物移入 24 孔细胞培养板的孔中。

7）吸取199 μL活肝细胞到24孔细胞培养板的每个孔中，化合物终浓度为10 μM。设置不同的时间点的样品孔，包括 0、120 和 240 分钟。将盘子放回培养箱并放在轨道摇床上。在 37°C、5% CO₂ 和 95% 相对湿度下孵育，并在摇床上以 500 rpm 的速度摇动。

8）孵育后，在相应的时间点向每个孔中加入400 µL冷乙腈（0.1%甲酸），然后将培养基转移至相应的试管中。以 16,000 g 离心管 15 分钟。将 60 μL上清液等分试样与 60μL 纯水混合，用于 UHPLC -MS/MS 分析。

9）对照化合物维拉帕米包括在样品孵育法的实验中。时间点为 0 分钟和 240 分钟。剩余百分比的维拉帕米将用于计算肝细胞活性。

10）根据母体药物分子量的预测增益和损失，通过比较空白样品和考虑预期代谢物的其他样品之间的离子色谱图来鉴定代谢物。一旦检测到可能的代谢物的分子离子，就可以通过 MS/MS 对其进行分析，随后可以将母体化合物的产物离子MS/MS 谱图与代谢物结构的相应碎裂模式进行比较。显示其 m/z 偏移的特定碎片离子将用于识别分子修饰的位点。

B．代谢产物分析结果

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表格3中m/z 514.2016 (RT = 8.74 min) 是CX-5461原型峰 ([M+1]⁺)。与小鼠肝细胞孵育240分钟后，CX-5461只占所有代谢产物的82.61%，另有10.12%的成分为去甲基的代谢产物，其m/z为500.1859 (RT = 8.76 min) 。表格4中m/z 517.22088 (RT=7.95 min)是式I化合物原型峰([M+1]⁺)。与小鼠肝细胞孵育240分钟后，化合物原型占所有代谢产物的91.29%，未发现失去氘代甲基的代谢产物(m/z大约在500)。这一结果说明式I化合物与CX-5461相比，在上述肝细胞的代谢实验条件下，其含有的甲基更为稳定，不易被代谢至去甲基的产物。另外，上两个表格中差异明显的240分钟代谢产物峰面积百分比和分子量偏移表明CX-5461与式I化合物有非常不同的代谢概况。

实施例4 式I化合物在小鼠体内药代动力学研究

将试验化合物以口服(PO)及静脉注射(IV)的形式向小鼠体内给药。药物于室温下溶解。用于研究的小鼠为Balb/c nude，均为雌性，年龄为6-8周，体重为20-30克。给药之前，小鼠可以自由进食及饮水。

在适当的时间点从静脉内收集血液样品(约0.03mL/样品)。将样品置于含有抗凝剂的管中并储存在冰上直至离心。静脉注射给药后于0.083, 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 8, 24小时收集血液样品，口服给药后0.25, 0.5, 1, 2, 4, 8, 24小时收集血液样品。将血液样品在约4000rpm下在2-8℃离心5分钟。然后收集血浆样品，并在约-80℃冷冻储存直至分析。使用LC-MS/MS系统进行生物分析工作。

基于对小鼠的体内药代动力学研究，式I化合物显示出优于CX5461的DMPK特性。口服生物利用度有了显著提高（p<0.01, t-test），有利于药物口服制剂的开发，为病人提供更方便的给药方式。

实施例5 式I化合物对小鼠体重的影响

将试验化合物以口服(PO)的形式向小鼠体内给药。药物于室温下溶解。用于研究的小鼠(NOD SCID)均为雌性，年龄为6-8周。给药之前，小鼠可以自由进食及饮水。

溶剂对照：50mM NaH₂PO₄, pH4.0,每3日给药一次。CX-5461, 式I化合物每三天给药一次，剂量为：50mg/kg。如果小鼠体重下降幅度超过15%，则停药至体重恢复后再给药。所述化合物对小鼠体重的影响效果见图1。

上述实验表明，重复给药21天后CX-5461显著降低了小鼠的体重(P<0.01, t-test)，而式I化合物没有影响小鼠的体重，说明式I化合物的毒副作用小于CX-5461。

实施例6 小鼠模型中式I化合物对癌症的抑制效力

在NOD SCID小鼠中评估本发明化合物的抑癌效力。利用6-8周龄的雌性小鼠，皮下接种MDA-MB-436癌细胞形成肿瘤。肿瘤长到100-150mm³的时候进行随机分组，每组6只小鼠。给药方式为口服给药。奥拉帕利(Oaparib)每天给药一次，给药剂量为100mg/kg，共给药28天。溶剂对照组和式I化合物每三天给药一次，给药剂量为 50mg/kg, 共给药10次。

如图2所示，与对照组相比，奥拉帕利治疗组及式I化合物治疗组均显著抑制了肿瘤生长（p<0.001），奥拉帕利治疗组癌症抑制率为63.4%，式I化合物治疗组癌症抑制率为85.7%。并且式I化合物治疗组癌症抑制率显著大于奥拉帕利治疗组（p<0.001）。

实施例7 式I化合物对病毒DNA复制的抑制

取一段包含四链体DNA序列的病毒DNA作为模板，引物用荧光标记，并与模板DNA的3’端退火，TagDNA聚合酶加入体系中用荧光标记的引物合成互补链。如果DNA的合成不受抑制，将合成全长的模板拷贝。如果加入的化合物与双链DNA非特异性结合，全长产物将会减少，并形成不同长度的短链的PCR产物。如果化合物与病毒DNA序列中的四链体DNA特异结合，DNA复制将只会停止在四链体DNA区域。通过DNA电泳检测PCR产物，与溶剂对照相比分析化合物是否抑致病毒DNA的复制。

实验结果表明，抑制病毒DNA复制的IC₅₀为0.1-10uM，因此式（I）中的化合物对含有四链体DNA结构的病毒DNA的复制具有较强的阻碍作用。

实施例8 式I化合物抗病毒保护细胞活性的测定

实验采用alamarBlue®（Invitrogen）试剂盒检测药物及病毒对细胞的毒性作用。

实验步骤：将MRC-5 fibroblasts (ATCC)细胞接种于96孔细胞培养板中，细胞贴壁后备用。药物用DMEM培养基从2倍最高测试浓度起连续3倍梯度稀释8个梯度。将药物加入到细胞中，于37℃的CO₂培养箱中培养。加药培养48h后，显微镜下观察药物引起的细胞病变效应，加入alamar Blue检测细胞存活率。病毒对细胞的毒性的大小与细胞的活性呈反比，并以细胞活性来反映。实验设空白对照孔（正常细胞），病毒对照孔（病毒感染后未加药物），药物孔（正常未感染细胞加药物），病毒加药物孔（病毒感染后加药物）。

实验表明式（I）中的化合物浓度为0.1-10uM时，对于病毒感染引起的细胞活性下降具有保护作用。

实施例9 式I化合物对多发性硬化症的抑制

自身免疫性脑脊髓炎（EAE）模型的建立如下。

C57BL/6小鼠，年龄6-8周，雄性，每组6只，

给药频率：1天1次，给药周期：21天。用PBS将MOG35-55稀释，然后将稀释液与完全弗氏佐剂混合，用玻璃注射器抽打至油包水状态，制成诱导EAE的抗原乳剂。免疫当天及第2天同时给予小鼠腹腔注射百日咳毒素，诱导建立小鼠自身免疫性脑脊髓炎模型。

神经功能评分标准：

评分频率：从第11天开始，1次/天，共10天。体重测量：每周2次。

实验表明式（I）中的化合物浓度为0.1-10uM时，对于多发性硬化症的发展具有延缓作用。

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Claims

1.一种式I化合物或其药学上可接受的盐在制备治疗癌症药物中的应用，其中所述化合物结构式如下：

其中所述癌症为乳腺癌或结肠直肠癌。

2.式I化合物或其药学上可接受的盐在制备用于治疗多发性硬化症的药物中的应用，其中所述式I化合物结构式如下：

3.一种药物组合物，其包含有效量的式I化合物或其药学上可接受的盐和药学上可接受的赋形剂，其中所述式I化合物结构式如下：