EA028800B1 - Комбинация производного имидазопиридазина и митотического средства для лечения рака - Google Patents

Abstract

Настоящее изобретение относится к комбинации, содержащей ингибитор киназы Mps-1 и митотический ингибитор. Настоящее изобретение также относится к применению указанной комбинации для лечения рака, в частности рака поджелудочной железы, глиобластомы, рака яичников, немелкоклеточной карциномы легких, рака молочной железы и/или рака желудочно-кишечного тракта.

Description

Настоящее изобретение относится к комбинации, содержащей ингибитор киназы Мрк-1 и митотический ингибитор. Настоящее изобретение также относится к применению указанной комбинации для лечения рака, в частности рака поджелудочной железы, глиобластомы, рака яичников, немелкоклеточной карциномы легких, рака молочной железы и/или рака желудочно-кишечного тракта.

Предпосылки создания изобретения

Киназа Мрк-1 (монополярное веретено 1) (также известная как тирозин-треонин-киназа, ТТК) является 8ег/Тбг киназой с двойной специфичностью, которая играет ключевую роль в активации митотической контрольной точки (также известной как контрольная точка веретена, контрольная точка сборки веретена), обеспечивая таким образом правильное расхождение хромосом во время митоза [Аббеи А. е! а1., Се11, 2001, 106, 83-93]. Каждая делящаяся клетка должна обеспечить равное разделение реплицированных хромосом на две дочерние клетки. При вхождении в митоз хромосомы прикрепляются своими кинетохорами к микротрубочкам аппарата веретена. Митотическая контрольная точка является контролирующим механизмом, который остается активным до тех пор, пока присутствуют неприкрепленные кинетохоры, и предотвращает вхождение митотических клеток в анафазу и, таким образом, завершение деления клеток с неприкрепленными хромосомами [8иукегбиук 8.1 апб Корк С.к. Вюсбетюа е! Βίοрбу81са Ас!а, 2008, 1786, 24-31; Микассбю А. и 8а1топ Ε.Ό., Ыа1 Кеу Мо1 Се11 Βίο1., 2007, 8, 379-93]. После того, как все кинетохоры присоединятся правильным амфителическим, то есть биполярным, способом к митотическому веретену, контрольная точка выполняет свои функции, и клетка входит в анафазу и проходит через митоз. Контрольная митотическая точка состоит из комплексной сети основных белков, включая представителей семейств МАО (дефект задержки митоза, МАО 1-3) и Виб (почкование, неингибированное бензимидазолом, Виб 1-3), двигательный белок ΟΕΝΡ-Ε, киназа Мрк-1, а также другие компоненты, многие из них сверхэкспрессируются в пролиферирующих клетках (например, раковых клетках) и тканях [Уиап В. е! а1., Сбшса1 Сапсег Кекеагсб, 2006, 12, 405-10]. Существенная роль активности киназы Мрк-1 в передаче сигналов контрольной митотической точки была выявлена с помощью подавления малых шпилечных РНК, химической генетики, а также химических ингибиторов киназы Мрк-1 [1е11ита N. е! а1., РЬок ΟΝΕ, 2008, 3, е2415; 1опек М.Н. е! а1., Сиггеп! Вю1о§у, 2005, 15, 160-65; Оогег К.К. е! а1., Сиггеп! Вю1о§у, 2005, 15, 1070-76; 8сбтгб! М. е! а1., ЕМВО Керобк, 2005, 6, 866-72].

Существует достаточное доказательство, связывающее уменьшенную, но неполную митотическую функцию контрольной точки с анэуплоидией и онкогенезом [^еауег ВА апб С1еуе1апб Ό^, Сапсег Кекеагсб, 2007, 67, 10103-5; Кш§ К^, ВюсЫтюа е! Вюрбукюа Ас!а, 2008, 1786, 4-14]. В то же время, было признано, что полное ингибирование контрольной митотической точки приводит к серьезным нарушениям хромосомного расхождения и индукции апоптоза в опухолевых клетках [Корк Сб. е! а1., Па!иге Ке\зе\ук Сапсег, 2005, 5, 773-85; 8сбтгб! М апб Мебета К.Н., Се11 Сус1е, 2006, 5, 159-63; 8сбтгб! М. апб Вакбапк Н., лек-во КекШапсе Ирба!ек, 2007, 10, 162-81].

Основываясь на этих открытиях, Мрк-1 рассматривали как одну из наиболее перспективных мишеней для лекарственных препаратов для лечения рака.

В уровне техники были раскрыты различные соединения, проявляющие ингибирующий эффект на киназу Мрк-1. В заявке \7О 2010/124826 А1 раскрыты замещенные соединения имидазохиноксалина в качестве ингибиторов киназы Мрк-1. В заявке \7О 2011/026579 А1 раскрыты замещенные аминохиноксалины в качестве ингибиторов киназы Мрк-1. В \7О 2011/063908 А1, \7О 2011/064328 А1, а также в \7О 2011/063907 А1 раскрыты производные триазолопиридина в качестве ингибиторов киназы Мрк-1.

В заявке \7О 2011/013729 А1 описаны конденсированные производные имидазола в качестве ингибиторов киназы Мрк-1. В числе раскрытых конденсированных производных имидазола также присутствуют имидазо[1,2-б]пиридазины.

В числе других заявка \7О 2012/032031 А1 относится к имидазо[1,2-б]пиридазинам в качестве ингибиторов киназы Мрк-1.

Тем не менее, в приведенном выше уровне техники конкретно не описаны соединения имидазопиридазина, которые описаны и определены в настоящей заявке, и которые в дальнейшем указаны как соединения в соответствии с настоящим изобретением, или их фармакологическая активность и стабильность.

Было обнаружено, что указанные соединения в соответствии с настоящим изобретением обладают поразительными и выгодными свойствами. Соединения в соответствии с настоящим изобретением неожиданным образом проявляют превосходный общий профиль в отношении связанной с Мрк-1 активности в функциональном анализе (Анализ контрольной точки сборки веретена деления), антипролиферативной активности (Анализ пролиферации с клетками Неба), метаболической стабильности (метаболической стабильности в гепатоцитах крыс ш У1бо) и потенциала межлекарственного взаимодействия (ингибирование фермента печени СУР3А4), как будет описано далее.

Установленные противомитотические лекарственные средства, такие как алкалоиды барвинка, таксаны или эпотилоны активируют КТСВ (8АС) или посредством стабилизации или дестабилизации динамических свойств микротрубочек, что приводит к митотической задержке.

Эта задержка предотвращает разделение сестринских хроматид с образованием двух дочерних клеток. Длительная задержка в митозе вталкивает клетку или в митотический выход без цитокинеза, или в

- 1 028800 митотическую катастрофу, ведущую к гибели клеток. В отличие от этого, ингибиторы Мр§-1 индуцируют инактивацию КТСВ, что ускоряет развитие клеток вследствие митоза, приводящее к серьезному неправильному расхождению хромосом и, в конечном счёте, к гибели клеток. Подавление Мр§-1 приводит к повреждению клеток для задержки митоза в ответ на антимитотические лекарственные средства. Примечательно, что комбинация интерферирующих микротрубочки средств и ингибирование Мр§-1 даже увеличивает погрешности хромосомного расхождения и клеточной гибели (АЪпеи А., МадпадЫПаиНи Ь., Кайаиа 1.А., Ре1ег М., Са§1го А., У1дпегоп 8., Ьогеа Т., С1еуе1аий О.А.. ЬаЪЪе 1.С. Мр§1 представляет собой ассоциированную с кинетохором киназу, жизненно важную для митотической контрольной точки позвоночных животных. Се11 2001; 106: 83-93, 81иске У.М., 8й1)е Н.Н., Агиаий Ь., Νί«« Е.А. е1 а1. Киназа Мр§1 человека необходима для контрольной точки сборки веретена, но не для дупликации центросом. ЕМВО I 2002; 21:1723-1732).

Поэтому, совокупное увеличение ошибок хромосомного расхождения, вызванное комбинацией антимитотических средств с ингибированием КТСВ 8АС является эффективной стратегией для выборочного уничтожения опухолевых клеток.

Краткое изложение сущности изобретения

Настоящее изобретение включает в себя комбинацию, содержащую: соединение А, выбранное из:

У-циклопропил-4-{6-[1-(3-фтор-4-метоксифенил)этенил]-8-[(3,3,3трифторпропил)амино]имидазо[1,2-6]пиридазин-3-ил}-2-метилбензамид,

У-циклопропил-4-{6-[дифтор(3-фтор-4-метоксифенил)метил]-8-[(3,3,3трифторпропил)амино]имидазо[1,2-6]пиридазин-3-ил}-2-метилбензамид, (7?5)-А-циклопропил-4-{6-[(3-фтор-2-гидроксифенил)(гидрокси)метил]-8[(3,3,3-трифторпропил)амино]имидазо[1,2-6]пиридазин-3-ил}-2-метилбензамид, (7?)-А-циклопропил-4-{6-[(3-фтор-2-гидроксифенил)(гидрокси)метил]-8[(3,3,3-трифторпропил)амино]имидазо[1,2-6]пиридазин-3-ил}-2-метилбензамид, (5')-А-циклопропил-4-{6-[(3-фтор-2-гидроксифенил)(гидрокси)метил]-8[(3,3,3-трифторпропил)амино]имидазо[ 1,2-6]пиридазин-3-ил}-2-метилбензамид, (Л5)-У-циклопропил-4-{6-[1-(3-фтор-2-гидроксифенил)-1-гидроксиэтил]-8[(3,3,3-трифторпропил)амино]имидазо[1,2-6]пиридазин-3-ил}-2-метилбензамид, (7?)-А-циклопропил-4-{6-[1-(3-фтор-2-гидроксифенил)-1-гидроксиэтил]-8[(3,3,3-трифторпропил)амино]имидазо[1,2-6]пиридазин-3-ил}-2-метилбензамид, (Х)-У-циклопропил-4-{6-[1-(3-фтор-2-гидроксифенил)-1-гидроксиэтил]-8[(3,3,3-трифторпропил)амино]имидазо[ 1,2-6]пиридазин-3-ил}-2-метилбензамид, (7?5)-7\/-циклопропил-4-{6-[фтор(3-фторфенил)метил]-8-[(3,3,3трифторпропил)амино]имидазо[1,2-/?]пиридазин-3-ил}-2-метилбензамид, (7?)-А-циклопропил-4-{6-[фтор(3-фторфенил)метил]-8-[(3,3,3трифторпропил)амино]имидазо[ 1,2-6]пиридазин-3-ил} -2-метилбензамид, (5)-У-циклопропил-4-[6-[фтор(3-фторфенил)метил]-8-[(3,3,3трифторпропил)амино]имидазо[1,2-6]пиридазин-3-ил} -2-метилбензамид, А-циклопропил-4-{6-[дифтор(3-фторфенил)метил]-8-[(3,3,3трифторпропил)амино]имидазо[1,2-6]пиридазин-3-ил} -2-метилбензамид, А-циклопропил-4-{6-(3-метоксибензоил)-8-[(3,3,3трифторпропил)амино]имидазо[1,2-6]пиридазин-3-ил}-2-метилбензамид,

А-циклопропил-4- {6- [ 1 -(3 -метоксифенил)винил]-8-[(3,3,3трифторпропил)амино]имидазо[1,2-6]пиридазин-3-ил}-2-метилбензамид, А-циклопропил-4-{6-(4-метоксибензоил)-8-[(3,3,3трифторпропил)амино]имидазо [ 1,2-Ь] пиридазин-3 -ил} -2-метилбензамид, У-циклопропил-4-{6-[1-(4-метоксифенил)винил]-8-[(3,3,3трифторпропил)амино]имидазо[1,2-6]пиридазин-3-ил}-2-метилбензамид, У-циклопропил-4-{6-[(2,5-дифторфенил)(гидрокси)метил]-8-[(3,3,3трифторпропил)амино]имидазо[1,2-6]пиридазин-3-ил} -2-метилбензамид, .У-циклопропил-4-{6-(2,5-дифторбензоил)-8-[(3,3,3трифторпропил)амино]имидазо[1,2-6]пиридазин-3-ил} -2-метилбензамид,

У-циклопропил-4-{6-(3-фтор-4-метоксибензоил)-8-[(3,3,3трифторпропил)амино]имидазо[1,2-6]пиридазин-3-ил}-2-метилбензамид,

А-циклопропил-4-{6-(2,3-дифторбензоил)-8-[(3,3,3трифторпропил)амино]ими дазо[ 1,2-6]пиридазин-3 -ил} -2-метилбензамид,

У-циклопропил-4-{6-[1-(2,3-дифторфенил)винил]-8-[(3,3,3трифторпропил)амино]имидазо[1,2-6]пиридазин-3-ил}-2-метилбензамид,

- 2 028800

Х-циклопропил-4-{6-[дифтор(4-метоксифенил)метил]-8-[(3,3,3трифторпропил)амино]имидазо[1,2-/>]пиридазин-3-ил}-2-метилбензамид,

А-циклопропил-4-{6-[1-(2,3-дифторфенил)циклопропил]-8-[(3,3,3трифторпропил)амино]имидазо[1,2-/?]пиридазин-3-ил}-2-метилбензамид,

7У-циклопропил-4-{6-[(2,3-дифторфенил)(дифтор)метил]-8-[(3,3,3трифторпропил)амино]имидазо[1,2-5]пиридазин-3-ил}-2-метилбензамид,

А-циклопропил-4-{6-[1-(2,5-дифторфенил)винил]-8-[(3,3,3трифторпропил)амино]имидазо[1,2-0]пиридазин-3-ил}-2-метилбензамид,

Л^г-циклопропил-4-{6-[1-(2,5-дифторфенил)циклопропил]-8-[(3,3,3трифторпропил)амино]имидазо[1,2-0]пиридазин-3-ил}-2-метилбензамид,

Х-циклопропил-4-{6-[(2,5-дифторфенил)(дифтор)метил]-8-[(3,3,3трифторпропил)амино]имидазо[1,2-й]пиридазин-3-ил}-2-метилбензамид,

Л^г-циклопропил-4-{6-[1-(5-фтор-2-гидроксифенил)этенил]-8-[(3,3,3трифторпропил)амино]имидазо[1,2-0]пиридазин-3-ил}-2-метилбензамид,

А-циклопропил-4-{6-[1-(5-фтор-2-гидроксифенил)циклопропил]-8-[(3,3,3трифторпропил)амино]имидазо[1,2-0]пиридазин-3-ил}-2-метилбензамид,

Х-циклопропил-4-{6-(3-фтор-4-метоксифенокси)-8-[(оксетан-3илметил)амино]имидазо[1,2-/>]пиридазин-3-ил}-2-метилбензамид,

А-циклопропил-4-{6-(2,3-дифтор-4-метоксифенокси)-8-[(3,3,3трифторпропил)амино]имидазо[1,2-0]пиридазин-3-ил}-2-метилбензамид, и

Х-циклопропил-4-{6-(2,3-дифтор-4-метоксифенокси)-8-[(тетрагидро-2Нпиран-4-илметил)амино]имидазо[1,2-6]пиридазин~3-ил}-2-метилбензамид, или их Ν-оксид, гидрат, сольват или соль, или их смесь;

и один или большее количество митотических ингибиторов.

Кроме того, настоящее изобретение относится к определенной выше комбинации, для применения в лечении или профилактике рака, в частности рака поджелудочной железы, глиобластомы, рака яичников, немелкоклеточной карциномы легких, рака молочной железы и/или рака желудочно-кишечного тракта.

Кроме того, настоящее изобретение относится к применению определенной выше комбинации, для профилактики или лечения рака, в особенности рака поджелудочной железы, глиобластомы, рака яичников, немелкоклеточной карциномы легких, рака молочной железы и/или рака желудочно-кишечного тракта.

Настоящее изобретение кроме того относится к применению определенной выше комбинации, для приготовления лекарственного средства для профилактики или лечения рака, в частности рака поджелудочной железы, глиобластомы, рака яичников, немелкоклеточной карциномы легких, рака молочной железы и/или рака желудочно-кишечного тракта.

Подробное описание изобретения

В соответствии с первым аспектом настоящее изобретение относится к комбинации, содержащей ингибитор киназы Мр8-1 и один или большее количество митотических ингибиторов.

Ингибитор киназы Мр8-1 выбран из группы, которая включает /У-циклопропил-4-{6-[1-(3-фтор-4-метоксифенил)этенил]-8-[(3,3,3трифторпропил)амино]имидазо[1,2-0]пиридазин-3-ил}-2-метилбензамид, /У-циклопропил-4-{6-[дифтор(3-фтор-4-метоксифенил)метил]-8-[(3,3,3трифторпропил)амино]имидазо[1,2-/?]пиридазин-3-ил}-2-метилбензамид, (7?5')-А-циклопропил-4-{6-[(3-фтор-2-гидроксифенил)(гидрокси)метил]-8[(3,3,3-трифторпропил)амино]имидазо[1,2-0]пиридазин-3-ил}-2-метилбензамид, (7?)-/У-циклопропил-4-{6-[(3-фтор-2-гидроксифенил)(гидрокси)метил]-8[(3,3,3-трифторпропил)амино]имидазо[1,2-й]пиридазин-3-ил}-2-метилбензамид, (5’)-А-циклопропил-4-{6-[(3-фтор-2-гидроксифенил)(гидрокси)метил]-8[(3,3,3-трифторпропил)амино]имидазо[1,2-й]пиридазин-3-ил}-2-метилбензамид, (7?5')-/У-циклопропил-4-{6-[1-(3-фтор-2-гидроксифенил)-1-гидроксиэтил]-8[(3,3,3-трифторпропил)амино]имидазо[1,2-£]пиридазин-3-ил}-2-метилбензамид, (7?)-/У-циклопропил-4- {6-[ 1 -(З-фтор-2-гидроксифенил)-1 -гидроксиэтил]-8[(3,3,3-трифторпропил)амино]имидазо[1,2-6]пиридазин-3-ил}-2-метилбензамид, (5')-Л^/-циклопропил-4-{6-[1-(3-фтор-2-гидроксифенил)-1-гидроксиэтил]-8[(3,3,3-трифторпропил)амино]имидазо[1,2-6]пиридазин-3-ил}-2-метилбензамид, (7?5’)-А-циклопропил-4-{6-[фтор(3-фторфенил)метил]-8-[(3,3,3трифторпропил)амино]имидазо[1,2-0]пиридазин-3-ил}-2-метилбензамид, (/г)-Л^-циклопропил-4-{6-[фтор(3-фторфенил)метил]-8-[(3,3,3трифторпропил)амино]имидазо[1,2-6]пиридазин-3-ил}-2-метилбензамид,

- 3 028800 (5')-А-циклопропил-4-{6-[фтор(3-фторфенил)метил]-8-[(3,3.3трифторпропил)амино]имидазо[1,2-0]пиридазин-3-ил}-2-метилбензамид,

А^/-циклопропил-4-{6-[дифтор(3-фторфенил)метил]-8-[(3,3,3трифторпропил)амино]имидазо[1,2-0]пиридазин-3-ил}-2-метилбензамид,

А-циклопропил-4-{6-(3-метоксибензоил)-8-[(3,3,3трифторпропил)амино]имидазо[1,2-0]пиридазин-3-ил}-2-метилбензамид,

А-циклопропил-4-{6-[1-(3-метоксифенил)винил]-8-[(3,3,3трифторпропил)амино]имидазо[1,2-6]пиридазин-3-ил} -2-метилбензамид,

А-циклопропил-4-{6-(4-метоксибензоил)-8-[(3,3,3трифторпропил)амино]имидазо[1,2-0]пиридазин-3-ил}-2-метилбензамид,

Х-циклопропил-4-{6-[1-(4-метоксифенил)винил]-8-[(3,3,3трифторпропил)амино]имидазо[1,2-/>]пиридазин-3-ил} -2-метилбензамид,

А-циклопропил-4-{6-[(2,5-дифторфенил)(гидрокси)метил]-8-[(3,3,3трифторпропил)амино]имидазо[1,2-0]пиридазин-3-ил}-2-метилбензамид,

А-циклопропил-4-{6-(2,5-дифторбензоил)-8-[(3,3,3трифторпропил)амино]имидазо[1,2-0]пиридазин-3-ил}-2-метилбензамид,

А-циклопропил-4-{6-(3-фтор-4-метоксибензоил)-8-[(3,3,3трифторпропил)амино]имидазо[ 1,2-0]пиридазин-3-ил } -2-метилбензамид,

Л'-циклопропил-4-{6-(2,3-дифторбензоил)-8-[(3,3,3трифторпропил)амино]имидазо[1,2-й]пиридазин-3-ил} -2-метилбензамид,

А-циклопропил-4-{6-[1-(2,3-дифторфенил)винил]-8-[(3,3,3трифторпропил)амино]имидазо[1,2-6]пиридазин-3-ил} -2-метилбензамид,

А-циклопропил-4-{6-[дифтор(4-метоксифенил)метил]-8-[(3,3,3трифторпропил)амино]имидазо[1,2-0]пиридазин-3-ил}-2-метилбензамид,

А-циклопропил-4-{6-[1-(2,3-дифторфенил)циклопропил]-8-[(3,3,3трифторпропил)амино]имидазо[1,2-6]пиридазин-3-ил} -2-метилбензамид,

А-циклопропил-4-{6-[(2,3-дифторфенил)(дифтор)метил]-8-[(3,3,3трифторпропил)амино]имидазо[1,2-0]пиридазин-3-ил}-2-метилбензамид,

А-циклопропил-4-{6-[1-(2,5-дифторфенил)винил]-8-[(3,3,3трифторпропил)амино]имидазо[1,2-0]пиридазин-3-ил}-2-метилбензамид,

А-циклопропил-4-{6-[1-(2,5-дифторфенил)циклопропил]-8-[(3,3,3трифторпропил)амино]имидазо[1,2-/?]пиридазин-3-ил}-2-метилбензамид,

А-циклопропил-4-{6-[(2,5-дифторфенил)(дифтор)метил]-8-[(3,3,3трифторпропил)амино]имидазо[1,2-6]пиридазин-3-ил}-2-метилбензамид, Л^г-циклопропил-4-{6-[1-(5-фтор-2-гидроксифенил)этенил]-8-[(3,3,3трифторпропил)амино]имидазо[1,2-0]пиридазин-3-ил}-2-метилбензамид,

А-циклопропил-4-{6-[1-(5-фтор-2-гидроксифенил)циклопропил]-8-[(3,3,3трифторпропил)амино]имидазо[1,2-0]пиридазин-3-ил}-2-метилбензамид, ?/-циклопропил-4-{6-(3-фтор-4-метоксифенокси)-8-[(оксетан-3илметил)амино]имидазо[1,2-А]пиридазин-3-ил}-2-метилбензамид, /У-циклопропил-4-{6-(2,3-дифтор-4-метоксифенокси)-8-[(3,3,3трифторпропил)амино]имидазо[1,2-&]пиридазин-3-ил}-2-метилбензамид, и Л5циклопропил-4-{6-(2,3-дифтор-4-метоксифенокси)-8-[(тетрагидро-2#пиран-4-илметил)амино]имидазо[ 1,2-ό] пирид азин-3-ил}-2-метилбензамид, или их Ν-оксид, гидрат, сольват или соль, или их смесь.

В предпочтительном варианте осуществления ингибитор киназы Мр§-1 выбран из группы, которая включает

А-ц_Иклопропил-4-{6-[1-(5-фтор-2-гидроксифенил)циклопропил]-8-[(3,3,3трифторпропил)амино]имидазо[1,2-0]пиридазин-3-ил}-2-метилбензамид,

А-циклопропил-4-{6-(3-фтор-4-метоксифенокси)-8-[(оксетан-3илметил)амино]имидазо[1,2-й]пиридазин-3-ил}-2-метилбензамид,

А-циклопропил-4-{6-(2,3-дифтор-4-метоксифенокси)-8-[(3,3,3трифторпропил)амино]имидазо[ 1,2-6]пиридазин-3-ил}-2-метилбензамид, и

А-циклопропил-4-{6-(2,3-дифтор-4-метоксифенокси)-8-[(тетрагидро-277пиран-4-илметил)амино]имидазо[1,2-й]пиридазин-3-ил} -2-метилбензамид, или их Ν-оксид, гидрат, сольват или соль, или их смесь.

- 4 028800

В другом предпочтительном варианте осуществления ингибитор киназы Μρδ-1 представляет собой Л'-циклопропил-4-{6-[1-(5-фтор-2-гидроксифенил)циклопропил]-8-| (3,3,3трифторпропил)амино]имидазо[1,2-0]пиридазин-3-ил}-2-метилбензамид, или их Ν-оксид, гидрат, сольват или соль.

В другом предпочтительном варианте осуществления ингибитор киназы Μρδ-1 представляет собой А-циклопропил-4-{6-(3-фтор-4-метоксифенокси)-8-[(оксетан-3илметил)амино]имидазо[1,2-0]пиридазин-3-ил}-2-метилбензамид, или их Ν-оксид, гидрат, сольват или соль.

В другом предпочтительном варианте осуществления ингибитор киназы Μρδ-1 представляет собой У-циклопропил-4-{6-(2,3-дифтор-4-метоксифенокси)-8-[(3,3,3трифторпропил)амино]имидазо[1,2-0]пиридазин-3-ил}-2-метилбензамид, или их Ν-оксид, гидрат, сольват или соль.

В другом предпочтительном варианте осуществления, ингибитор киназы Μρδ-1 представляет собой А-циклопропил-4-{6-(2,3-дифтор-4-метоксифенокси)-8-[(тетрагидро-2Япиран-4-илметил)амино]имидазо[1,2-0]пиридазин-3-ил}-2-метилбензамид, или их Ν-оксид, гидрат, сольват или соль.

Ингибитор киназы Μρδ-1 может находиться в виде гидрата или в виде сольвата, причем ингибитор киназы Μρδ-1 содержит полярные растворители, в частности воду, метанол или этанол, например, в качестве структурного элемента кристаллической решетки соединения. Количество полярных растворителей, в частности воды, может находиться в стехиометрическом или нестехиометрическом соотношении. В случае стехиометрических сольватов, соответственно возможны, например, гидрат, геми-, (полу-), моно-, полтора-, ди-, три-, тетра-, пента- и т.д. сольваты или гидраты. Настоящее изобретение включает все такие гидраты или сольваты.

Кроме того, ингибитор киназы Μρδ-1 может находиться в свободной форме, например, в виде свободного основания, или в виде свободной кислоты, или в виде цвиттер-иона, или может находиться в виде соли. Указанная соль может представлять собой любую соль, или органическую или неорганическую соль присоединения, в частности любую фармацевтически приемлемую органическую или неорганическую соль присоединения, обычно применяемую в фармацевтике.

Термин фармацевтически приемлемая соль относится к относительно нетоксической, неорганической или органической соли присоединения кислоты ингибитора киназы Μρδ-1. Например, см. 3.Μ. Вегде, е! а1. РЬагшасеийса1 ЗаИя, I. РЬагш. Зсг 1977, 66, 1-19.

Кроме того, ингибитор киназы Μρδ-1 может находиться в виде Ν-оксида, который определен так, что по меньшей мере один атом азота соединения является окисленным. Настоящее изобретение включает все такие возможные Ν-оксиды.

К тому же, настоящее изобретение включает все возможные кристаллические формы или полиморфы ингибитора киназы Μρδ-1, или в виде одного полиморфа, или в виде смеси более, чем одного полиморфа, в любом соотношении.

Таким образом, настоящее изобретение также относится к пригодным формам ингибитора киназы Μρδ-1, как описано в настоящей заявке, таким как метаболиты, гидраты, сольваты, пролекарства, соли, в частности фармацевтически приемлемые соли и продукты совместного осаждения.

Ингибитор киназы Μρδ-1 и любая применимая форма ингибитора киназы Μρδ-1, как описано в настоящей заявке, также относится к соединению А.

Кроме того, комбинация в соответствии с изобретением содержит один или большее количество митотических ингибиторов.

В дальнейшем митотический ингибитор также обозначается как соединение В.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения, митотический ингибитор представляет собой алкалоид барвинка, включая винбластин, винкристин, виндезин, винорелбин, дезоксивинкаминол, винкаминол, винбурнин, винкамин, винеридин и винбурнин.

В более предпочтительном варианте осуществления митотический ингибитор выбран из группы, которая включает винбластин, винкристин, виндезин и винорелбин.

В еще более предпочтительном варианте осуществления митотический ингибитор представляет собой винорелбин.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения митотический ингибитор представляет собой таксан, включая доцетаксел, паклитаксел и их аналоги.

Таксаны известны из уровня техники и включают, например, паклитаксел, доцетаксел и т.п.

Паклитаксел (2а,4а,53,73,10в,13а)-4,10-бис-(ацетилокси)-13-{[(2К,3З)-3-(бензоиламино)-2-гидрокси-3-фенилпропаноил]окси}-1,7-дигидрокси-9-оксо-5,20-эпокситакс-11-ен-2-ил бензоат; торговые названия Таксол, Анзатакс, Паксен.

- 5 028800

Доцетаксел

1,7в,10в-тригидрокси-9-оксо-5в,20-эпокситакс-11-ен-2а,4,13а-триил-4-ацетат 2-бензоат 13{(2Р,38)-3-[(трет-бутоксикарбонил)амино]-2-гидрокси-3-фенилпропаноат}; торговое название Таксотер.

Режимы лечения рака на основе таксана широко применяют в лечении рака яичников, рака молочной железы, немелкоклеточной и мелкоклеточной карциномы легких, рака головы и шеи, рака пищевода, рака предстательной железы, рака мочевого пузыря и связанной со СПИДом саркомы Капоши. Таксаны, которые включают паклитаксел, доцетаксел и их аналоги, представляют собой ингибиторы образования микротрубочек, которые ингибируют структуры микротрубочек внутри клетки и в итоге вызывают гибель клеток. В частности, таксаны, такие как паклитаксел связывают и стабилизируют микротрубочки, вызывают задержку клеток в митозе и приводят к цитостатическим или цитотоксическим ответам (Е. Сйи, с1 а1., еб Сапсег СйетоШегару Игид Мапиа1 (2010) 1опе8 апб ВагИебе РиЪШЬещ.

Также отдают предпочтение другим таксанам, которые были одобрены Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и лекарственных средств США (РИА) или их зарубежными партнерами, для применения в способах и комбинациях в соответствии с настоящим изобретением. Другие таксаны, которые можно применять в настоящем изобретении, представляют собой описанные, например, в 10ΐ1ι ИС1-ЕОРТС 8утро5шт оп №\ν Игидк ίη Сапсег Тйегару, Амстердам, стр. 100, № 382 и 383 (1ип. 16-19, 1998); и патентах США № 4814470, 5721268, 5714513, 5739362, 5728850, 5728725, 5710287, 5637484, 5629433, 5580899, 5549830, 5523219, 5281727, 5939567, 5703117, 5480639, 5250683,

5700669, 5665576, 5618538, 5279953, 5243045, 5654447, 5527702, 5415869, 5279949, 5739016, 5698582,

5478736, 5227400, 5516676, 5489601, 5908759, 5760251, 5578739, 5547981, 5547866, 5344775, 5338872,

5717115, 5620875, 5284865, 5284864, 5254703, 5202448, 5723634, 5654448, 5466834, 5430160, 5407816,

5283253, 5719177, 5670663, 5616330, 5561055, 5449790, 5405972, 5380916, 5912263, 8808113, 5703247,

5618952, 5367086, 5200534, 5763628, 5705508, 5622986, 5476954, 5475120, 5412116, 5916783, 5879929,

5861515, 5795909, 5760252, 5637732, 5614645, 5599820, 5310672, РЕ 34277, № патентов США 5877205, 5808102, 5766635, 5760219, 5750561, 5637723, 5475011, 5256801, 5900367, 5869680, 5728687, 5565478,

5411984, 5334732, 5919815, 5912264, 5773464, 5670673, 5635531, 5508447, 5919816, 5908835, 5902822,

5880131, 5861302, 5850032, 5824701, 5817867, 5811292, 5763477, 5756776, 5686623, 5646176, 5621121,

5616739, 5602272, 5587489, 5567614, 5498738, 5438072, 5403858, 5356928, 5274137, 5019504, 5917062,

5892063, 5840930, 5840900, 5821263, 5756301, 5750738, 5750562, 5726318, 5714512, 5686298, 5684168,

5681970, 5679807, 5648505, 5641803, 5606083, 5599942, 5420337, 5407674, 5399726, 5322779, 4924011,

5939566, 5939561, 5935955, 5919455, 5854278, 5854178, 5840929, 5840748, 5821363, 5817321, 5814658,

5807888, 5792877, 5780653, 5770745, 5767282, 5739359, 5726346, 5717103, 5710099, 5698712, 5683715,

5677462, 5670653, 5665761, 5654328, 5643575, 5621001, 5608102, 5606068, 5587493, 5580998, 5580997,

5576450, 5574156, 5571917, 5556878, 5550261, 5539103, 5532388, 5470866, 5453520, 5384399, 5364947,

5350866, 5336684, 5296506, 5290957, 5274124, 5264591, 5250722, 5229526, 5175315, 5136060, 5015744,

4924012, 6118011, 6114365, 6107332, 6072060, 6066749, 6066747, 6051724, 6051600, 6048990, 6040330,

6030818, 6028205, 6025516, 6025385, 6018073, 6017935, 6011056, 6005138, 6005138, 6005120, 6002023,

5998656, 5994576, 5981564, 5977386, 5977163, 5965739, 5955489, 5939567, 5939566, 5919815, 5912264,

5912263, 5908835 и 5902822, описания которых в их полном объеме включены в данную заявку путем ссылки.

Другие соединения, которые можно применять в изобретении, представляют собой соединения, имеющие механизм действия таксана. Соединения, действующие по механизму таксана, охватывают соединения, обладающие способностью оказывать влияние на эффекты, стабилизирующие микротрубочки и цитотоксическую активность против быстро пролиферирующих клеток, таких как опухолевые клетки или других гиперпролиферативных клеточных заболеваний. Такие соединения включают, например, соединения эпотилона, такие как, например, эпотилон А, В, С, Ό, Е и Р и их производные. Предпочтение также отдают другим соединениям, действующим по механизму таксана (например, соединения эпотилона), которые были одобрены РИА или их зарубежными партнерами, для применения в способах и комбинациях в соответствии с настоящим изобретением. Соединения эпотилона и их производные известны в уровне техники и описаны, например, в патентах США № 6121029, 6117659, 6096757, 6043372, 5969145 и 5886026; и \\'О 97/19086, \\'О 98/08849, \\'О 98/22461, \\'О 98/25929, \\'О 98/38192, \\'О 99/01124, \\'О 99/02514, \\'О 99/03848, \\'О 99/07692, \\'О 99/27890, и \\'О 99/28324, описания которых в их полном объеме включены в данную заявку путем ссылки.

В предпочтительном варианте осуществления, таксан представляет собой паклитаксел. В другом предпочтительном варианте осуществления таксан представляет собой доцетаксел.

Комбинация в соответствии с настоящим изобретением может содержать одно или большее количество других фармацевтических средств. Кроме того, в предпочтительном варианте осуществления комбинация в соответствии с настоящим изобретением содержит цисплатин.

Кроме того, настоящее изобретение относится к набору, содержащему комбинацию из компонента А: один или большее количество ингибиторов киназы Мр8-1, как описано выше, или их

- 6 028800 физиологически приемлемую соль, сольват или гидрат; и компонента В: один или большее количество митотических ингибиторов, включая доцетаксел, паклитаксел, винбластин, винкристин, виндезин и винорелбин;

и, необязательно, один или большее количество фармацевтических средств С;

в котором по выбору один или оба из указанных компонентов А и В находятся в виде фармацевтического состава, который уже готов к применению для введения одновременно, параллельно, отдельно или последовательно.

Один или оба из компонентов А и В любой из комбинаций в соответствии с настоящим изобретением могут присутствовать в применимой форме, такой как фармацевтически приемлемые соли, продукты совместного осаждения, метаболиты, гидраты, сольваты и пролекарства всех соединений из примеров.

Компоненты можно вводить независимо друг от друга путем перорального, внутривенного введения, местных, локальных устройств, внутрибрюшинного или назального введения.

Ингибитор киназы Мрз-1 предпочтительно вводят перорально. Таксан предпочтительно вводят внутривенно. Алкалоид барвинка предпочтительно вводят внутривенно.

Компоненты А и/или В обычно вводят в виде фармацевтической композиции, которая содержит фармацевтически приемлемый носитель и фармацевтически эффективное количество соединения А и/или соединение В в соответствии с настоящим изобретением.

Для приготовления таких композиций в соответствующих лекарственных формах можно использовать обычные методики. Составные части и методики включают в себя описанные в нижеследующих процитированных литературных источниках, каждый из которых включен в настоящую заявку путем ссылки: Рощей, М.Р. с1 а1., Сотрепбшт οί Εχοίρίοη® ίοΓ Рагеп1ега1 Рогти1айои8 ΡΌΆ 1оигпа1 οί РйагтасеиОса1 8с1епсе & Тесйпо1оду 1998, 52(5), 238-311; §1глск1еу, КО. Рагеп1ега1 Рогти1айои8 οί 8та11 Мо1еси1е Тйегареийск Магке1еб ίη 1йе ипПеб §1а1е8 (1999)-Рай-1 РОЛ 1оита1 οί РНагтасеиОса1 8с1епсе & Тесйио1оду 1999, 53(6), 324-349; и №та, 8. е1 а1, ΕχείρκηΙδ апб Тйе1г Изе ίη 1п)ес1аЫе Ргобис18 РОЛ .Гоита1 οί Рйагтасеибса1 Баепсе & Тесйпо1оду 1997, 51(4), 166-171.

Комбинации в соответствии с настоящим изобретением можно применять для лечения или профилактики рака.

В предпочтительном варианте осуществления, комбинации в соответствии с настоящим изобретением применяют для лечения рака поджелудочной железы.

В другом предпочтительном варианте осуществления комбинации, предлагаемые в настоящем изобретении, применяют для лечения глиобластомы.

В другом предпочтительном варианте осуществления комбинации, предлагаемые в настоящем изобретении, применяют для лечения немелкоклеточной карциномы легких.

В другом предпочтительном варианте осуществления комбинации, предлагаемые в настоящем изобретении, применяют для лечения рака яичников.

В другом предпочтительном варианте осуществления комбинации, предлагаемые в настоящем изобретении, применяют для лечения рака желудочно-кишечного тракта.

В другом предпочтительном варианте осуществления комбинации, предлагаемые в настоящем изобретении, применяют для лечения рака молочной железы.

Комбинации в соответствии с настоящим изобретением могут быть использованы для подавления, блокирования, уменьшения, снижения и т.д. клеточной пролиферации и/или клеточного деления, и/или вызывать апоптоз.

Термин лечение или терапия, как указано в данном документе, используют традиционно, например, для ведения или ухода за пациентом с целью борьбы, облегчения, уменьшения, ослабления, улучшения и т.п. состояния, заболевания или нарушения, такого как карцинома.

Лечение или профилактика включает: введение млекопитающему, которое в этом нуждается, включая человека, количества соединения А и количества соединения В, которые предлагаются в настоящем изобретении, или его фармацевтически приемлемой соли, изомера, полиморфа, метаболита, гидрата, сольвата или сложного эфира и т.д., эффективного для лечения нарушения.

Немелкоклеточная карцинома легких (НМККЛ) представляет собой любой тип эпителиального рака легких, которая отличается от мелкоклеточной карциномы легких (МККЛ). Как класс, НМККЛ являются относительно невосприимчивыми к химиотерапии, в отличие от мелкоклеточной карциномы легких. При возможности, в первую очередь их лечат путем хирургической резекции с лечебной целью, несмотря на то, что в последнее время все чаще применяют химиотерапию как до (неоадъювантная химиотерапия), так и после (адъювантная химиотерапия) оперативного вмешательства.

Наиболее распространенные типы НМКЛ представляют собой плоскоклеточную карциному, крупноклеточную карциному аденокарциному, но существует и несколько других типов, которые встречаются реже, и все типы могут возникать в необычных гистологических вариантов и в виде комбинаций типов смешанных клеток (Ыоп-ктай се11 1ипд сапсег 1геа1теп1 - №Шопа1 Сапсег 1п5О1Ше; взято 2008-10-19; 1Ш|у/Л\\\\\.с;111сегуо\/СЛ\С1ЛТО1бС8/1бХМННЛТ\1ГХ|7\О\-8\1Л1.1.-СН1.1.-1Л;\С./РЛТК\Т).

- 7 028800

Рак легких у никогда не куривших людей представляет собой почти повсеместную НМКЛ, значительное большинство из которых является аденокарциномой.

В сравнительно редких случаях обнаруживаются злокачественные опухоли легких, которые содержат как компоненты МКЛ, так и НМКЛ. В этих случаях, опухоли должны быть классифицированы как комбинированная мелкоклеточная карцинома легкого (к-МКЛ), и (как правило) их лечат как чистую МКЛ.

Рак молочной железы является одним из видов рака, возникающим из ткани молочной железы, наиболее часто из внутренней выстилающей ткани молочных протоков или долек, которые снабжают протоки молоком. Злокачественные новообразования, возникающие из протоков, называют протоковой карциномой, а злокачественные новообразования, возникающие из долек, называют дольковой карциномой. Рак молочной железы встречается у человека и других млекопитающих. В то время как подавляющее большинство случаев заболевания у людей возникают у женщин, рак молочной железы может также возникнуть и у мужчины. Примеры рака молочной железы включают, но не ограничиваются ними, инвазивную протоковую карциному, инвазивную дольковую карциному, протоковую карциному ίη δίίυ и дольковую карциному ίη δίΐιι.

Рак яичников представляет собой злокачественную опухоль, возникающую из яичника. Большинство (более 90%) рака яичников классифицируют как эпителиальный и, как полагают, возникает из поверхности (эпителия) яичника. Тем не менее, некоторые данные свидетельствуют о том, что источником некоторых типов рака яичников также могут быть фаллопиевы трубы. Так как яичники и трубы тесно связаны друг с другом, то полагают, что эти фаллопиевы раковые клетки могут имитировать рак яичников. Другие типы могут возникать из яйцеклеток (опухоль эмбриональных клеток) или поддерживающих клеток.

Рак желудочно-кишечного тракта, также известный как рак желудка, поражает желудок, который находится в верхней части брюшной полости и чуть ниже ребер. Желудок является частью пищеварительной системы организма. Он вырабатывает кислоты и ферменты, которые расщепляют пищу, прежде чем она перейдет в тонкий кишечник. Рак может развиться в любой части желудка и распространиться вверх к пищеводу (труба, которая соединяет рот с желудком) или вниз в тонкий кишечник.

Мультиформная глиобластома (МВГ), имеющая название по классификации ВОЗ глиобластома, является наиболее распространенной и наиболее агрессивной основной злокачественной опухолью головного мозга у людей, включающая в себя глиальные клетки.

Рак поджелудочной железы представляет собой злокачественную опухоль, возникающую из трансформированных клеток, появляющихся в тканях, которые образуют поджелудочную железу. Наиболее распространенным типом рака поджелудочной железы является аденокарцинома (опухоли, показывающие железистую структуру при световой микроскопии), возникающая в экзокринном компоненте поджелудочной железы. Меньшая часть возникает из островковых клеток, и их классифицируют как нейроэндокринные опухоли.

Доза и введение

Основываясь на стандартных лабораторных методиках, известных для оценки соединений, пригодных для лечения гиперпролиферативных нарушений и ангиогенных нарушений, с помощью стандартных тестов на токсичность и стандартных фармакологических анализов для определения лечения состояний, обозначенных выше у млекопитающих, и путем сравнения этих результатов с результатами известных лекарственных средств, которые применяют для лечения этих состояний, эффективная дозировка соединений, предлагаемых в настоящем изобретении легко может быть определена для лечения каждого целевого показания. Количество действующих веществ для введения при лечении любого из этих состояний может варьироваться в значительной степени в зависимости от таких факторов, как конкретное соединение и применяемая дозируемая единица, способ введения, период лечения, возраст и пол пациента, нуждающегося в лечении, и природа и степень состояния, которое необходимо лечить.

Общие количества действующих веществ, подлежащие введению, как правило, находятся в пределах примерно от 0,001 мг/кг до примерно 200 мг/кг массы тела в сутки, и предпочтительно примерно от 0,01 мг/кг до примерно 20 мг/кг массы тела в сутки. Клинически пригодные схемы дозирования находятся в пределах дозирования от одного - трех раз в сутки до одного приема дозы один раз каждые четыре недели. К тому же для суммарного баланса между фармакологическим эффектом и переносимостью могут быть полезными лекарственные каникулы, при которых пациент не получает дозу лекарственного средства в течение определенного периода времени. Дозируемая единица может содержать приблизительно от 0,5 мг до приблизительно 1500 мг действующего вещества, и может вводиться один или несколько раз в сутки или менее одного раза в сутки. Средняя суточная доза для введения путем инъекции, включая внутривенные, внутримышечные, подкожные и парентеральные инъекции, и при применении методик вливания предпочтительно составляет от 0,01 до 200 мг/кг общей массы тела. Средняя суточная схема ректального дозирования предпочтительно будет составлять от 0,01 до 200 мг/кг общей массы тела. Средняя суточная схема вагинального дозирования предпочтительно будет составлять от 0,01 до 200 мг/кг общей массы тела. Средняя суточная схема местного дозирования предпочтительно будет составлять от 0,1 до 200 мг, причем введение осуществляют от одного до четырех раз в сутки. Трансдермальная

- 8 028800 концентрация предпочтительно будет такой, которая необходима для поддержания суточной дозы от 0,01 до 200 мг/кг. Средняя суточная схема ингаляционного дозирования предпочтительно будет составлять от 0,01 до 100 мг/кг общей массы тела.

Конечно же, специфические начальные и продолжающиеся схемы дозирования для каждого пациента будут изменяться в соответствии с природой и тяжестью состояния, как определено специалистом, устанавливающим диагноз, активностью специфического применяемого соединения, возраста и общего состояния пациента, времени введения, пути введения, скорости выведения лекарственного средства, комбинации лекарственных средств и т.д. Необходимый режим лечения и количество доз соединения в соответствии с настоящим изобретением или его фармацевтически приемлемой соли или сложного эфира или композиции может быть установлено специалистом в данной области техники с использованием общепринятого экспериментального лечения.

Экспериментальная часть

В нижеследующей таблице перечислены сокращения, используемые в этом абзаце и в разделе примеров. Формы пиков ЯМР указаны так, как они появляются в спектрах, возможные эффекты более высокого порядка не были приняты во внимание

Сокращение	Значение
ЕЭС	1-Этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид
ДХМ	дихлорметан
ϋΙΡΕΑ	А,А-диизопропилэтиламин
ДМФА	Ν, Ν- диметилформамид
ДМСО	диметилсульфоксид
Ρύ(άρρί)012	дихлор[1,1'-бис(дифенилфосфино)ферроцен]палладий(П)
Р(оТо1)3	три-о-толилфосфин
ЯМР	спектроскопия ядерного магнитного резонанса
к.т.	комнатная температура
Ву	время удерживания в минутах
МВ	молекулярный вес
нмп	А-метилпирролидинон
оксон	пероксомоносульфат калия
СПЖХ	сверхпроизводительная жидкостная хроматография

Соединениям и промежуточным соединениям, полученным в соответствии со способами, предлагаемыми в изобретении, может потребоваться очистка. Очистка органических соединений хорошо известна специалисту в данной области техники, и может быть несколько способов очистки одного и того же соединения. В некоторых случаях очистка не нужна. В определенных случаях соединения могут быть очищены кристаллизацией. В некоторых случаях примеси могут быть вымешаны с использованием пригодного растворителя. В некоторых случаях соединения могут быть очищены с помощью хроматографии, в особенности флэш-хроматографии, с использованием, например, расфасованных картриджей с силикагелем, например, фирмы 8ерагй§, таких как 1§о1и1е® Р1а§Ь §Шеа де1 (хроматография на силикагеле) или 1§о1и1е® Р1а§Ь ΝΗ2 §Шеа де1 (аминофазная хроматография на силикагеле) в комбинации с пригодной хроматографической системой, такой как Р1а§Ьта§1ег II (8ерагй§) или системой 1§о1ега (Вкладе) и элюентами, такими как, например, градиенты гексан/этилацетат или ДХМ/метанол. В некоторых случаях соединения могут быть очищены посредством препаративной ВЭЖХ, используя, например, автоматический очиститель ^а!ег§, оснащенный детектором на диодной матрице и/или онлайновым масс-спектрометром электрораспылительной ионизации в комбинации с пригодной расфасованной колонкой с обращенной фазой и элюантами, такими как, например, градиенты воды и ацетонитрила, которые могут содержать вспомогательные вещества, такие как трифторуксусная кислота, муравьиная кислота или водный аммиак.

Аналитическую СПЖХ-МС осуществляли следующим образом.

Метод А: система: СПЖХ Лецийу (^а!ег§) с ΡΏΆ Ое1ее1ог и масс-спектрометром ^а!ег§ ΖΡ; колонка: Лецийу ВЕН С18 1.7 мкм 2.1 х 50 мм; температура: 60°С; растворитель А: Вода + 0, 1% муравьиная кислота; Растворитель В: ацетонитрил; градиент: 99% А 1% А (1,6 мин)^ 1% А (0,4 мин); поток: 0,8 мл/мин; объём введенной пробы: 1,0 мкл (0,1 мг-1 мг/мл концентрация пробы); обнаружение: ΡΏΆ диапазон сканирования 210-400 нм - фиксированный и ЭСИ (+), диапазон сканирования 170-800 т/ζ.

Общая часть

Все реакции проводили под атмосферой аргона в дегазированных растворителях, если не указано иное.

Сравнительный пример 1

ЖЦиклопропил-4-{6-(3-фтор-4-метоксибензил)-8-[(3,3,3-трифторпропил)амино]имидазо[1,2-Ь]пиридазин-3-ил}-2-метилбензамид

- 9 028800

Смесь, содержащую 300 мг (622 мкмоль) 4-{6-бром-8-[(3,3,3-трифторпропил)амино]имидазо[1,2Ъ]пиридазин-3-ил}-Х-циклопропил-2-метилбензамида, который получали в соответствии со сравнительным примером 1а, 2.0 мл тетрагидрофурана, 8.29 мл бром(3-фтор-4-метоксибензил)магния (0.75 М в тетрагидрофуране) перемешивали при 23°С в течение ночи. Перемешивание продолжали при 50°С в течение 5 ч, смесь выливали в насыщенный водный раствор хлорида аммония. Добавляли воду, и смесь экстрагировали этиловым эфиром уксусной кислоты. Органический слой промывали соляным раствором и высушивали над сульфатом натрия. После фильтрации и удаления растворителя, остаток очищали хроматографией с получением 261 мг (77%) указанного в заголовке соединения.

¹Н-ЯМР (ДМСО-б₆): δ= 0.50 (2Н), 0.65 (2Н), 2.32 (3Н), 2.56-2.72 (2Н), 2.80 (1Н), 3.53 (2Н), 3.76 (3Н), 3.96 (2Н), 6.20 (1Н), 7.04-7.12 (2Н), 7.20 (1Н), 7.30 (1Н), 7.46 (1Н), 7.92-7.98 (3Н), 8.27 (1Н) част. на млн.

Сравнительный пример 1а

4-{6-Бром-8-[(3,3,3-трифторпропил)амино]имидазо[1,2-Ъ]пиридазин-3-ил}-П-циклопропил-2метилбензамид

Смесь, содержащую 1.00 г (2.3 ммоль) 6-бром-3-йод-П-(3,3,3-трифторпропил)имидазо[1,2-Ъ]пиридазин-8-амин, который получали в соответствии со сравнительным примером 1Ъ, 976 мг Ν-циклопропил-2-метил-4-(4,4,5,5-тетраметил-1,3,2-диксаборолан-2-ил)бензамид, который получали в соответствии со сравнительным примером 1£, 564 мг (1,1,-бис-(дифенилфосфино)ферроцен)дихлорпалладий (II), 3,45 мл водного 2М раствора карбоната цезия и 15 мл тетрагидрофурана перемешивали при 45°С в течение 12 ч. Добавляли воду, и смесь экстрагировали этиловым эфиром уксусной кислоты и метанолом. Органический слой промывали соляным раствором и высушивали над сульфатом натрия. После фильтрации и удаления растворителя остаток очищали хроматографией с получением 580 мг (52%) указанного в заголовке соединения.

Сравнительный пример 1Ъ

6-Бром-3-йод-^(3,3,3-трифторпропил)имидазо[1,2-Ъ]пиридазин-8-амин

К раствору из 2.30 г (5.71 ммоль) 6,8-дибром-3-йодимидазо[1,2-Ъ]пиридазина, который получали в соответствии со сравнительным примером 1с в 40 мл Ν,Ν-диметилформамида добавляли 2.0 г 3,3,3трифторпропан-1-амина и смесь перемешивали при 40°С в течение ночи. Добавляли воду, и смесь экстрагировали дихлорметаном и метанолом. Органическую фазу промывали водой и высушивали над сульфатом натрия. После фильтрации и удаления растворителя, остаток очищали хроматографией с получением 2.0 г (81%) указанного в заголовке соединения.

Сравнительный пример 1с

6,8-Дибром-3-йодимидазо[1,2-Ъ]пиридазин

- 10 028800

Смесь, содержащую 3,64 г (10,5 ммоль) 6,8-дибромимидазо[1,2-Ь]пиридазина, который получали в соответствии со сравнительным примером 1ά, 2,8 г Ν-йодсукцинимида, 72,6 мл Ν,Ν-диметилформамида нагревали при 60°С в течение 3 ч. Добавляли 1,4 г Ν-йодсукцинимида и нагревание осуществляли в течение дополнительных 4 ч. Большую часть растворителя удаляли, добавляли воду, и смесь экстрагировали дихлорметаном. Органическую фазу промывали водой, раствором тиосульфата натрия и высушивали над сульфатом натрия. После фильтрации и удаления растворителя, остаток очищали хроматографией с получением 3,64 г (86%) указанного в заголовке соединения.

Сравнительный пример 1ά

6,8 -Дибромимидазо [ 1,2-Ь]пиридазин

Смесь из 5.0 (14.0 ммоль) 8-бром-6-хлор-3-йодимидазо[1,2-Ь]пиридазина, который получали в соответствии со сравнительным примером 1е, 30 мл раствора бромида водорода (33% в уксусной кислоте) перемешивали при 120°С в течение 1 ч при микроволновом облучении. Смесь выливали в воду и экстрагировали дихлорметаном. Органическую фазу промывали тиосульфатом натрия и раствором гидрокарбоната натрия и высушивали над сульфатом натрия. После фильтрации и удаления растворителя, остаток очищали хроматографией с получением 3.0 г (78%) указанного в заголовке соединения.

Сравнительный пример 1е

8-Бром-6-хлор-3 -йодимидазо [ 1,2-Ь] пиридазин

Смесь, содержащую 100 г (430 ммоль) 8-бром-6-хлоримидазо[1,2-Ь]пиридазина, который получали в соответствии с методикой, описанной в ϋδ 2007/78136 (ШО 2007/38314), 145 г Ν-йодсукцинимида, 5 мас.% конц. Хлористо-водородной кислоты и 1 л трихлорметана нагревали с обратным холодильником в течение 6 ч. 20 г Ν-йодсукцинимида добавляли и нагревание осуществляли в течение дополнительных 3 ч. Осадок удаляли, и фильтрат промывали 1Ν раствором гидроксида натрия, соляным раствором и высушивали над сульфатом натрия. После фильтрации и удаления растворителя добавляли диизопропиловый эфир, и остаток перемешивали при 23°С в течение ночи. Осадок отфильтровывали и высушивали с получением 66,6 г (43%) указанного в заголовке соединения.

Сравнительный пример И №Циклопропил-2-метил-4-(4,4,5,5-тетраметил-1,3,2-диксаборолан-2-ил)бензамид

К раствору из 260 г (1.02 моль) 4-бром-Л-циклопропил-2-метилбензамида, который получали в соответствии со сравнительным примером 1д в 2 л диоксана при 23°С добавляли 390 г бис-(пинаколато)дибора, 19,5 г 2-дициклогексилфосфино-2',4',6'-триизопропилбифенила, 150 г ацетата калия и 9.37 г трис-(дибензилиденацетон)дипалладия(0), и смесь нагревали с обратным холодильником в течение 6 ч. После охлаждения до 23°С, добавляли воду и этиловый эфир уксусной кислоты, и смесь перемешивали в течение 15 мин. Органическую фазу промывали водой, высушивали над сульфатом натрия, фильтровали и выпаривали. Остаток очищали хроматографией с получением 308 г (56%) указанного в заголовке соединения.

Сравнительный пример 1д

4-Бром-Л-циклопропил-2-метилбензамид

К перемешиваемому раствору из 300 г (1.4 моль) 4-бром-2-метилбензойной кислоты в 8,4 л дихлорметана при 23°С добавляли 79.6 г циклопропанамина и 320.9 г ΕΌΟ. После перемешивания в тече- 11 028800 ние ночи, раствор промывали водой и водную фазу экстрагировали дихлорметаном. Объединенные органические фазы высушивали над сульфатом натрия, фильтровали и выпаривали. Оставшееся твердое вещество растирали с диизопропиловым эфиром, фильтровали, промывали и высушивали в вакууме с получением 260 г (73%) указанного в заголовке соединения.

Сравнительный пример 2

Н-Циклопропил-4-{6-(3 -фтор-2-гидроксибензил)-8-[(3,3,3 -трифторпропил)амино]имидазо [1,2Ь]пиридазин-3 -ил} -2-метилбензамид

К раствору из 14.2 мг (26 мкмоль) Н-циклопропил-4-{6-(3-фтор-2-метоксибензил)-8-[(3,3,3-трифторпропил)амино]имидазо[1,2-Ь]пиридазин-3-ил}-2-метилбензамида, который получали в соответствии со сравнительным примером 2а в 1 мл дихлорметана добавляли 131 мкл 1М раствора трибромида бора в дихлорметане, и смесь перемешивали при 23°С в течение 1 ч. Добавляли метанол и растворители удаляли. Остаток очищали хроматографией с получением 4,9 мг (32%) указанного в заголовке соединения. СПЖХ-МС: Ву = 1.20 мин; т/ζ (Е8+) 528.5 [МН+]; требуемый МВ = 527.5.

¹Н-ЯМР (ДМСО-06): δ= 0.49 (2Н), 0.65 (2Н), 2.29 (3Н), 2.56-2.70 (2Н), 2.80 (1Н), 3.52 (2Н), 4.04 (2Н), 6.15 (1Н), 6.74 (1Н), 6.96-7.06 (2Н), 7.26 (1Н), 7.41 (1Н), 7.88-7.96 (3Н), 8.23 (1Н), 8.70 (1Н) част. на млн.

Сравнительный пример 2а

Н-Циклопропил-4-{6-(3-фтор-2-метоксибензил)-8-[(3,3,3-трифторпропил)амино]имидазо[1,2-Ь]пиридазин-3-ил} -2-метилбензамид

Смесь, содержащую 30 мг (48 мкмоль) Н-циклопропил-4-{6-[2-(3-фтор-2-метоксифенил)-1,3-дитиолан-2-ил]-8-[(3,3,3-трифторпропил)амино]имидазо[1,2-Ь]пиридазин-3-ил}-2-метилбензамида, который получали в соответствии со сравнительным примером 2Ь, 800 мкл метанола, 200 мкл тетрагидрофурана, 18.8 мг гексагидрата дихлорникеля и 15.0 мг борогидрида натрия перемешивали при 23°С в течение 2 ч. После фильтрации добавляли воду, и смесь экстрагировали этиловым эфиром уксусной кислоты. Органический слой промывали водой, и высушивали над сульфатом натрия. После фильтрации и удаления растворителя, получали 24.2 мг (93%) указанного в заголовке соединения, которое использовали без дальнейшей очистки. СПЖХ-МС: Ву = 1.30 мин; т/ζ (ЕЗ+) 542.6 [МН+]; требуемый МВ = 541.6.

Сравнительный пример 2Ь

Н-Циклопропил-4-{6-[2-(3-фтор-2-метоксифенил)-1,3-дитиолан-2-ил]-8-[(3,3,3-трифторпропил)амино]имидазо[1,2-Ь]пиридазин-3-ил}-2-метилбензамид

Смесь, содержащую 150 мг (270 мкмоль) Н-циклопропил-4-{6-(3-фтор-2-метоксибензоил)-8-[(3,3,3трифторпропил)амино]имидазо[1,2-Ь]пиридазин-3-ил}-2-метилбензамида, который получали в соответ- 12 028800 ствии со сравнительным примером 2с, 340 мкл этан-1,2-дитиола и 37,5 мкл комплекса трифторид бора уксусная кислота нагревали при 60°С в течение 16 ч. Добавляли этиловый эфир уксусной кислоты, и смесь промывали насыщенным раствором гидрокарбоната натрия, раствором гидроксида натрия (1М) и соляным раствором. Органический слой высушивали над сульфатом натрия. После фильтрации и удаления растворителя, остаток очищали хроматографией с получением 63.0 мг (37%) указанного в заголовке соединения. СПЖХ-МС: Ву = 1.37 мин; т/ζ (Е8+) 632.7 [МН+]; требуемый МВ = 631.7.

¹Н-ЯМР (ДМСО-4₆): δ= 0.44-0.51 (2Н), 0.59-0.68 (2Н), 2.58-2.72 (3Н), 2.77 (1Н), 3.13 (2Н), 3.32-3.40 (2Н), 3.42 (3Н), 3.50-3.69 (4Н), 6.71 (1Н), 7.06 (1Н), 7.17 (1Н), 7.23-7.33 (1Н), 7.53-7.60 (2Н), 7.69 (1Н), 7.83 (1Н), 8.00 (1Н), 8.19 (1Н) част. на млн.

Сравнительный пример 2с

К-Циклопропил-4-{6-(3-фтор-2-метоксибензоил)-8-[(3,3,3-трифторпропил)амино]имидазо[1,2-Ь]пиридазин-3-ил} -2-метилбензамид

Смесь, содержащую 460 мг (997 ммоль) метил 3-[4-(циклопропилкарбамоил)-3-метилфенил]-8[(3,3,3-трифторпропил)амино]имидазо[1,2-Ь]пиридазин-6-карбоксилата, который получали в соответствии со сравнительным примером 2ά, 10 мл тетрагидрофурана и 126 мг гидрохлорида Ν-метоксиметанамина охлаждали до -5°С. Добавляли 35.9 мл раствора бром(3-фтор-2-метоксифенил)магния в тетрагидрофуране (0.5 М), смесь перемешивали при 23°С в течение ночи и выливали в холодную хлористоводородную кислоту. Добавляли этиловый эфир уксусной кислоты и смесь промывали соляным раствором. Органический слой высушивали над сульфатом натрия. После фильтрации и удаления растворителя, остаток очищали хроматографией с получением 306 мг (55%) указанного в заголовке соединения. СПЖХ-МС: Ву = 1.30 мин; т/ζ (Е8+) 556.5 [МН+]; требуемый МВ = 555.5.

¹Н-ЯМР (ДМСО-άβ): δ = 0.44-0.51 (2Н), 0.59-0.70 (2Н), 2.10 (3Н), 2.64-2.83 (3Н), 3.62 (3Н), 3.72 (2Н), 6.79 (1Н), 7.00-7.06 (1Н), 7.14 (1Н), 7.26 (1Н), 7.50 (1Н), 7.54 (1Н), 7.71 (1Н), 7.82 (1Н), 7.94 (1Н), 8.22 (1Н) част. на млн.

Сравнительный пример 2ά

Метил 3 - [4-(циклопропилкарбамоил)-3-метилфенил] -8-[(3,3,3-трифторпропил)амино]имидазо [1,2Ь]пиридазин-6-карбоксилат

Смесь, содержащую 5.0 г (10.37 ммоль) 4-{6-бром-8-[(3,3,3-трифторпропил)амино]имидазо[1,2Ь]пиридазин-3-ил}-^циклопропил-2-метилбензамида, который получали в соответствии со сравнительным примером 1а, 100 мл метанола, 10 мл тетрагидрофурана, 1,7 г (1,1-бис-(дифенилфосфино)ферроцен)дихлорпалладия (II), 1.6 мл триэтиламина подвергали взаимодействию под атмосферой монооксида углерода при 100°С, 9-12 бар в течение 24 ч. После удаления растворителей, остаток очищали хроматографией с получением 3.32 г (63%) указанного в заголовке соединения. СПЖХ-МС: Ву = 1.11 мин; т/ζ (Е8+) 462.5 [МН+]; требуемый МВ = 461.5.

Сравнительный пример 3 №Циклопропил-4-{6-(3-фторбензил)-8-[(3,3,3-трифторпропил)амино]имидазо[1,2-Ь]пиридазин-3ил} -2-метилбензамид

- 13 028800

мг (75 мкмоль) Х-Циклопропил-4-{6-[2-(3-фторфенил)-1,3-дитиолан-2-ил]-8-[(3,3,3-трифторпропил)амино]имидазо[1,2-Ь]пиридазин-3-ил}-2-метилбензамида, который получали в соответствии со сравнительным примером 3 а, преобразовывали по аналогии со сравнительным примером 2а с получением после обработки и очистки 16.3 мг (42%) указанного в заголовке соединения. СПЖХ-МС: Ву = 1.30 мин; т/ζ (Е8+) 556.5 [МН+]; требуемый МВ = 555.5.

¹Н-ЯМР (ДМСО-б₆): δ = 0.50 (2Н), 0.65 (2Н), 2.32 (3Н), 2.56-2.72 (2Н), 2.80 (1Н), 3.54 (2Н), 4.05 (2Н), 6.22 (1Н), 7.03 (1Н), 7.15-7.23 (2Н), 7.26-7.38 (2Н), 7.46 (1Н), 7.91-7.99 (3Н), 8.24 (1Н) част. на млн.

Сравнительный пример 3а

Х-Циклопропил-4-{6-[2-(3-фторфенил)-1,3-дитиолан-2-ил]-8-[(3,3,3-трифторпропил)амино]имидазо[1,2-Ь]пиридазин-3-ил} -2-метилбензамид

мг (152 мкмоль) Х-Циклопропил-4-{6-(3-фторбензоил)-8-[(3,3,3-трифторпропил)амино]имидазо[1,2-Ь]пиридазин-3-ил}-2-метилбензамида, который получали в соответствии со сравнительным примером 3Ь преобразовывали по аналогии со сравнительным примером 2Ь с получением после обработки и очистки 45 мг (49%) указанного в заголовке соединения. СПЖХ-МС: Ву = 1.39 мин; т/ζ (Е8+) 602.7 [МН+]; требуемый МВ = 601.7.

¹Н-ЯМР (ДМСО-а₆): δ= 0.46-0.53 (2Н), 0.61-0.68 (2Н), 2.30 (3Н), 2.52-2.65 (2Н), 2.76-2.85 (1Н), 3.323.41 (2Н), 3.48-3.62 (4н), 6.26 (1Н), 7.06-7.13 (1Н), 7.26 (1Н), 7.34 (1Н), 7.39-7.43 (1Н), 7.48 (1Н), 7.63 (1Н), 7.91 (1Н), 8.05 (2Н), 8.25 (1Н) част. на млн.

Сравнительный пример 3Ь

Х-Циклопропил-4-{6-(3-фторбензоил)-8-[(3,3,3-трифторпропил)амино]имидазо[1,2-Ь]пиридазин-3-

К раствору из 400 мг (0.816 ммоль) 3-[4-(циклопропилкарбамоил)-3-метилфенил]-Х-метокси-Х-метил-8-[(3,3,3-трифторпропил)амино]имидазо[1,2-Ь]пиридазин-6-карбоксамида, который получали в соответствии со сравнительным примером 3с добавляли 30 мл ТГФ 12.23 мл (15 экв) бром(3-фторфенил)магния (1М раствор в ТГФ) при -20°С. Через еще 30 мин перемешивания при этой температуре, раствор добавляли по каплям к 50 мл холодного как лед 0,5 М раствора НС1 с получением после обработки и очистки 334 мг (78%) указанного в заголовке соединения. СПЖХ-МС: Ву = 1.32 мин; т/ζ (Е8+) 526.5 [МН+]; требуемый МВ = 525.5.

- 14 028800 ¹Н-ЯМР (ДМСО-4₆): δ= 0.44-0.52 (2Н), 0.59-0.69 (2Н), 2.20 (3Н), 2.62-2.84 (3Н), 3.70 (2Н), 6.74 (1Н), 7.10 (1Н), 7.24 (1Н), 7.51-7.66 (2Н), 7.79-7.96 (4Н), 8.15 (1Н), 8.23 (1Н) част. на млн.

Сравнительный пример 3с

- [4-(Циклопропилкарбамоил)-3-метилфенил] -Ν-метокси-К-метил- 8 - [(3,3,3-трифторпропил)амино]имидазо[1,2-Ь]пиридазин-6-карбоксамид

К суспензии из 6.62 г (14.34 ммоль) метил 3-[4-(циклопропилкарбамоил)-3-метилфенил]-8-[(3,3,3трифторпропил)амино]имидазо[1,2-Ь]пиридазин-6-карбоксилата, который получали в соответствии со сравнительным примером 20 и 2,10 г (21.52 ммоль) гидрохлорида Ν-метоксиметанамина (1:1) в 30 мл ТГФ по каплям добавляли 33 мл хлорида лития - хлор(пропан-2-ил)магния (1:1) (3 экв, 1.3М раствор в ТГФ) при -20°С. После 2 ч. перемешивания при этой температуре, добавляли еще 55 мл (5 экв) раствора хлорида лития - хлор(пропан-2-ил)магния (1:1). Через 40 мин. реакцию гасили добавлением 20% раствора хлорида аммиака с получением после обработки и очистки 3.8 г (55%) указанного в заголовке соединения. СПЖХ-МС: Ву = 1.05 мин; т/ζ (Е8+) 491.5 [МН+]; требуемый МВ = 490.5.

Ίί-ЯМР (ДМСО-О₆): δ= 0.44-0.53 (2Н), 0.60-0.69 (2Н), 2.35 (3Н), 2.57-2.73 (2Н), 2.81 (1Н), 3.54-3.69 (5Н), 6.36 (1Н), 7.36 (1Н), 7.81 (1Н), 7.90 (1Н), 7.95 (1Н), 8.04 (1Н), 8.28 (1Н) част. на млн.

Сравнительный пример 4

К-Циклопропил-4-{6-(3-метоксибензил)-8-((3,3,3-трифторпропил)амино]имидазо[1,2-Ь]пиридазин3-ил}-2-метилбензамид

100 мг (207 мкмоль) 4-{6-Бром-8-[(3,3,3-трифторпропил)амино]имидазо[1,2-Ь]пиридазин-3-ил}-Кциклопропил-2-метилбензамида, который получали в соответствии со сравнительным примером 1а преобразовывали по аналогии со сравнительным примером 1 с применением бром(3-метоксибензил)магния с получением после обработки и очистки 28.7 мг (25%) указанного в заголовке соединения.

Ί1-ЯМР (ДМСО-46): δ= 0.50 (2Н), 0.65 (2Н), 2.33 (3Н), 2.56-2.72 (2Н), 2.80 (1Н), 3.53 (2Н), 3.69 (3Н), 3.99 (2Н), 6.28 (1Н), 6.77 (1Н), 6.87-6.97 (2Н), 7.20 (1Н), 7.32 (1Н), 7.54 (1Н), 7.93-8.05 (3Н), 8.28 (1Н) част. на млн.

Сравнительный пример 5

К-Циклопропил-4- {6-(4-метоксибензил)-8-[(3,3,3-трифторпропил)амино] имидазо [ 1,2-Ь]пиридазин3-ил}-2-метилбензамид

- 15 028800 мг (49 мкмоль) №Циклопропил-4-{6-[2-(4-метоксифенил)-1,3-дитиолан-2-ил]-8-[(3,3,3-трифторпропил)амино]имидазо[1,2-Ъ]пиридазин-3-ил}-2-метилбензамида, который получали в соответствии со сравнительным примером 5 а преобразовывали по аналогии со сравнительным примером 2а с получением после обработки и очистки 7.9 мг (29%) указанного в заголовке соединения.

‘Н-ЯМР (ДМСО-Щ): δ= 0.50 (2Н), 0.65 (2Н), 2.33 (3Н), 2.55-2.71 (2Н), 2.80 (1Н), 3.52 (2Н), 3.68 (3Н), 3.94 (2Н), 6.16 (1Н), 6.85 (2Н), 7.25 (2Н), 7.31 (1Н), 7.43 (1Н), 7.91-8.01 (3Н), 8.27 (1Н) част. на млн.

Сравнительный пример 5а №Циклопропил-4-{6-[2-(4-метоксифенил)-1,3-дитиолан-2-ил]-8-[(3,3,3-трифторпропил)амино]имидазо [ 1,2-Ъ]пиридазин-3-ил}-2-метилбензамид

100 мг (186 мкмоль) №Циклопропил-4-{6-(4-метоксибензоил)-8-[(3,3,3-трифторпропил)амино]имидазо[1,2-Ъ]пиридазин-3-ил}-2-метилбензамида, который получали в соответствии с примером 9, преобразовывали по аналогии со сравнительным примером 2Ъ с получением после обработки и очистки 60.2 мг (53%) указанного в заголовке соединения.

Соединения в соответствии с изобретением

Соединение А1 №Циклопропил-4-{6-[1-(3-фтор-4-метоксифенил)этенил]-8-[(3,3,3-трифторпропил)амино]имидазо [ 1,2-Ъ]пиридазин-3 -ил}-2-метилбензамид

К суспензии из 386 мг бромида метил(трифенил)фосфония в 6.8 мл тетрагидрофурана при -78°С добавляли 421 мкл н-бутиллития (2.5 М в гексане). После перемешивания смеси при 0°С в течение 0,5 ч добавляли раствор из 150 мг (270 мкмоль) №циклопропил-4-{6-(3-фтор-4-мегоксибензоил)-8-[(3,3,3-трифторпропил)амино]имидазо[1,2-Ъ]пиридазин-3-ил}-2-метилбензамида, который получали в соответствии с примером промежуточного соединения 1а в 3.2 мл тетрагидрофурана и перемешивание продолжали в течение ночи. Добавляли воду, и смесь экстрагировали этиловым эфиром уксусной кислоты. Органический слой промывали насыщенным раствором хлорида аммония и высушивали над сульфатом натрия. После фильтрации и удаления растворителя остаток очищали хроматографией с получением 127 мг (81%) указанного в заголовке соединения.

‘Н-ЯМР (ДМСО-Щ): δ= 0.48 (2Н), 0.64 (2Н), 2.17 (3Н), 2.61-2.73 (2Н), 2.78 (1Н), 3.61 (2Н), 3.84 (3Н), 5.73 (1Н), 5.93 (1Н), 6.36 (1Н), 7.13-7.23 (3Н), 7.30 (1Н), 7.54 (1Н), 7.82 (1Н), 7.88 (1Н), 8.01 (1Н), 8.21 (1Н) част. на млн.

Пример промежуточного соединения 1а №Циклопропил-4-{6-(3-фтор-4-метоксибензоил)-8-[(3,3,3-трифторпропил)амино]имидазо[1,2Ъ]пиридазин-3-ил}-2-метилбензамид

- 16 028800

К раствору из 82 мкл этандиола дихлорида в 2.5 мл дихлорметана добавляли при -78°С 133 мкл диметилсульфоксида, после чего следовал раствор 262 мг (470 мкмоль) (КЗ)^-циклопропил-4-{6-[(3-фтор4-метоксифенил)(гидрокси)метил] -8-[(3,3,3-трифторпропил)амино] имидазо [ 1,2-Ь]пиридазин-3 -ил} -2метилбензамида, который получали в соответствии с примером промежуточного соединения 1Ь в 2.5 мл дихлорметана и 0.6 мл диметилсульфоксида. Через 1 ч добавляли 393 мкл триэтиламина, и смесь перемешивали при 23°С в течение 20 мин. Добавляли воду, и смесь экстрагировали дихлорметаном и метанолом (9:1). Органический слой промывали водой и высушивали над сульфатом натрия. После фильтрации и удаления растворителя остаток очищали хроматографией с получением 210 мг (80%) указанного в заголовке соединения.

Пример промежуточного соединения 1Ь (К5)^-Циклопропил-4-{6-[(3-фтор-4-метоксифенил)(гидрокси)метил]-8-[(3,3,3-трифторпропил)амино]имидазо[1,2-Ь]пиридазин-3-ил}-2-метилбензамид

К раствору из 500 мг (1.16 ммоль) ^циклопропил-4-{6-формил-8-[(3,3,3-трифторпропил)амино]имидазо[1,2-Ь]пиридазин-3-ил}-2-метилбензамида, который получали в соответствии с примером промежуточного соединения 1с в 20 мл тетрагидрофурана при 0°С добавляли раствор из бром(3-фтор-4метоксифенил)магния, свежеприготовленного из 598 мкл 4-бром-2-фтор-1-метоксибензола, 113 мг магния и 5 мл тетрагидрофурана. Через 1 ч смесь выливали в насыщенный водный раствор хлорида аммония. Добавляли воду, и смесь экстрагировали этиловым эфиром уксусной кислоты. Органический слой промывали соляным раствором и высушивали над сульфатом натрия. После фильтрации и удаления растворителя, остаток очищали хроматографией с получением 319 мг (46%) указанного в заголовке соединения.

Пример промежуточного соединения 1с ^Циклопропил-4-{6-формил-8-[(3,3,3-трифторпропил)амино]имидазо[1,2-Ь]пиридазин-3-ил}-2метилбензамид

1.60 г (3.69 ммоль) ^Циклопропил-4-{6-(гидроксиметил)-8-[(3,3,3-трифторпропил)амино]имидазо[1,2-Ь]пиридазин-3-ил}-2-метилбензамида, который получали в соответствии с примером промежуточного соединения 16 преобразовывали по аналогии с примером промежуточного соединения 1а с получением после обработки и очистки 1.50 г (94%) указанного в заголовке соединения.

Пример промежуточного соединения 16 ^Циклопропил-4-{6-(гидроксиметил)-8-[(3,3,3-трифторпропил)амино]имидазо[1,2-Ь]пиридазин-3ил} -2-метилбензамид

- 17 028800

К раствору из 2.17 г (4.70 ммоль) метил 3-[4-(циклопропилкарбамоил)-3-метилфенил]-8-[(3,3,3-трифторпропил)амино]имидазо[1,2-Ь]пиридазин-6-карбоксилата, который получали в соответствии со сравнительным примером 2ά в 220 мл тетрагидрофурана при 0°С добавляли 23.5 мл раствора гидрида диизобутилалюминия (1М в тетрагидрофуране). Через 1 ч смесь выливали в насыщенный водный раствор хлорида аммония. Добавляли воду и смесь экстрагировали этиловым эфиром уксусной кислоты и метанолом (9:1). Органический слой промывали соляным раствором и высушивали над сульфатом натрия. После фильтрации и удаления растворителя, остаток очищали хроматографией с получением 1.56 г (73%) указанного в заголовке соединения.

Соединение А2 №Циклопропил-4-{6-[дифтор(3-фтор-4-метоксифенил)метил]-8-[(3,3,3-трифторпропил)амино]имидазо[1,2-Ь]пиридазин-3-ил}-2-метилбензамид

К смеси из 32.5 мг дитетрафторбората 1-(хлорметил)-4-фтор-1,4-диазониабицикло[2.2.2]октана и 1.16 мл гидрофторида пиридина при 0°С добавляли раствор из 29 мг (46 мкмоль) ^-циклопропил-4-{6[2-(3-фтор-4-метоксифенил)-1,3-дитиолан-2-ил]-8-[(3,3,3-трифторпропил)амино]имидазо[1,2-Ь]пиридазин-3-ил}-2-метилбензамида, который получали в соответствии с примером промежуточного соединения 2а в 0.5 мл дихлорметана. Смесь перемешивали при 23°С в течение ночи и выливали в воду. Органический слой промывали водой и соляным раствором и высушивали над сульфатом натрия. После фильтрации и удаления растворителя, остаток очищали хроматографией с получением 14.6 мг (52%) указанного в заголовке соединения.

‘Н-ЯМР (ДМСО-Щ): δ= 0.49 (2Н), 0.65 (2Н), 2.23 (3Н), 2.61-2.84 (3Н), 3.68 (2Н), 3.86 (3Н), 6.58 (1Н), 7.24 (1Н), 7.31 (1Н), 7.42 (1Н), 7.50 (1Н), 7.72-7.81 (2Н), 7.97 (1Н), 8.09 (1Н), 8.27 (1Н) част. на млн.

Пример промежуточного соединения 2а №Циклопропил-4-{6-[2-(3-фтор-4-метоксифенил)-1,3-дитиолан-2-ил]-8-[(3,3,3-трифторпропил)амино]имидазо[1,2-Ь]пиридазин-3-ил}-2-метилбензамид

мг (90 мкмоль) №Циклопропил-4-{6-(3-фтор-4-метоксибензоил)-8-[(3,3,3-трифторпропил)амино]имидазо[1,2-Ь]пиридазин-3-ил}-2-метилбензамида, который получали в соответствии с примером промежуточного соединения 1а преобразовывали по аналогии со сравнительным примером 2Ь с получением после обработки и очистки 29 мг (51%) указанного в заголовке соединения.

Соединение А3 (Κδ)-Ν-Циклопропил-4- { 6-[(3-фтор-2-гидроксифенил)(гидрокси)метил]-8-[(3,3,3 -трифторпропил)амино]имидазо[1,2-Ь]пиридазин-3-ил}-2-метилбензамид

- 18 028800

Смесь из 25.0 мг (45 мкмоль) (К8)-Х-циклопропил-4-{6-[(3-фтор-2-метоксифенил)(гидрокси)метил]-8-[(3,3,3-трифторпропил)амино]имидазо [ 1,2-Ь]пиридазин-3-ил} -2-метилбензамида, который получали в соответствии с примером промежуточного соединения 3а, 25.1 мг метантиолата натрия и 900 мкл диметилсульфоксида нагревали при микроволновом облучении в течение 5 мин при 130°С. Добавляли хлористоводородную кислоту, и растворитель удаляли. Остаток очищали хроматографией с получением 8.2 мг (32%) указанного в заголовке соединения.

¹Н-ЯМР (ДМСО-йб): δ= 0.50 (2Н), 0.65 (2Н), 2.29 (3Н), 2.56-2.72 (2Н), 2.79 (1Н), 3.57 (2Н), 6.00 (1Н), 6.33 (1Н), 6.33 (1Н), 6.79 (1Н), 7.03 (1Н), 7.24 (1Н), 7.27 (1Н), 7.44 (1Н), 7.86-7.92 (2Н), 8.96 (1Н), 8.24 (1Н) част. на млн.

Пример промежуточного соединения 3 а (К8)-Х-Циклопропил-4-{6-[(3-фтор-2-метоксифенил)(гидрокси)метил]-8-[(3,3,3-трифторпропил)амино]имидазо[1,2-Ь]пиридазин-3-ил}-2-метилбензамид

500 мг (1.16 ммоль) Х-Циклопропил-4-{6-формил-8-[(3,3,3-трифторпропил)амино]имидазо[1,2Ь]пиридазин-3-ил}-2-метилбензамида, который получали в соответствии с примером промежуточного соединения 1с преобразовывали по аналогии с примером промежуточного соединения 1Ь с использованием бром(3-фтор-2-метоксифенил)магния с получением после обработки и очистки 519 мг (80%) указанного в заголовке соединения.

Соединение А4 (К8)-№Циклопропил-4-{6-[1-(3-фтор-2-гидроксифенил)-1-гидроксиэтил]-8-[(3,3,3-трифторпропил)амино]имидазо[1,2-Ь]пиридазин-3-ил}-2-метилбензамид

23.5 мг (41 мкмоль) (К8)-Х-Циклопропил-4-{6-[1-(3-фтор-2-метоксифенил)-1-гидроксиэтил]-8[(3,3,3-трифторпропил)амино]имидазо[1,2-Ь]пиридазин-3-ил}-2-метилбензамида, который получали в соответствии с примером промежуточного соединения 4а преобразовывали по аналогии с примером 3 с получением после обработки и очистки 9.5 мг (39%) указанного в заголовке соединения.

¹Н-ЯМР (ДМСО-а₆): δ= 0.50 (2Н), 0.65 (2Н), 1.91 (3Н), 2.32 (3Н), 2.52-2.65 (2Н), 2.80 (1Н), 3.49 (2Н), 6.22 (1Н), 6.69 (1Н), 7.00 (1Н), 7.18 (1Н), 7.28 (1Н), 7.35 (1Н), 7.93 (1Н), 7.96-8.02 (2Н), 8.25 (1Н), 8.59 (1Н) част. на млн.

Пример промежуточного соединения 4а (К8)-Х-Циклопропил-4-{6-[1-(3-фтор-2-метоксифенил)-1-гидроксиэтил]-8-[(3,3,3-трифторпропил)амино]имидазо[1,2-Ь]пиридазин-3-ил}-2-метилбензамид

К раствору из 50 мг (90 мкмоль) Х-циклопропил-4-{6-(3-фтор-2-метоксибензоил)-8-[(3,3,3-трифтор- 19 028800 пропил)амино]имидазо[1,2-Ь]пиридазин-3-ил}-2-метилбензамида, который получали в соответствии с примером промежуточного соединения 4Ь в 2.5 мл тетрагидрофурана при -78°С добавляли 225 мкл метиллития (2.5М в диэтиловом эфире). Смесь перемешивали при -50°С в течение 30 мин, выливали в воду и экстрагировали этиловым эфиром уксусной кислоты. Органический слой промывали насыщенным водным раствором хлорида аммония и высушивали над сульфатом натрия. После фильтрации и удаления растворителя, остаток очищали хроматографией с получением 29 мг (56%) указанного в заголовке соединения.

Пример промежуточного соединения 4Ь

Ы-Циклопропил-4-{6-(3-фтор-2-метоксибензоил)-8-[(3,3,3-трифторпропил)амино]имидазо[1,2Ь]пиридазин-3-ил}-2-метилбензамид

442 мг (793 мкмоль) (К8)-Ы-Циклопропил-4-{6-[(3-фтор-2-метоксифенил)(гидрокси) метил]-8[(3,3,3-трифторпропил)амино]имидазо[1,2-Ь]пиридазин-3-ил}-2-метилбензамида, который получали в соответствии с примером промежуточного соединения 3а преобразовывали по аналогии с примером промежуточного соединения 1а с получением после обработки и очистки 317 мг (72%) указанного в заголовке соединения.

Соединение А5 (К8)-Ы-Циклопропил-4-{6-[фтор(3-фторфенил)метил]-8-[(3,3,3-трифторпропил)амино]имидазо[1,2Ь]пиридазин-3-ил}-2-метилбензамид

мг (95 мкмоль) (К8)-Ы-Циклопропил-4-{6-[(3-фторфенил)(гидрокси)метил]-8-[(3,3,3-трифторпропил)амино]имидазо[1,2-Ь]пиридазин-3-ил}-2-метилбензамида, который получали в соответствии с примером промежуточного соединения 5а преобразовывали по аналогии с примером 2 с получением после обработки и очистки 4.3 мг (7%) указанного в заголовке соединения.

¹Н-ЯМР (ДМСО-й₆): δ= 0.50 (2Н), 0.65 (2Н), 2.31 (3Н), 2.50 (1Н), 2.61-2.74 (2Н), 2.80 (1Н), 3.63 (2Н),

6.41 (1Н), 6.68 (1Н), 7.22 (1Н), 7.29 (1Н), 7.33-7.39 (1Н), 7.46 (1Н), 7.75 (1Н), 7.87-7.90 (2Н), 8.02 (1н), 8.26 (1Н) част. на млн.

Пример промежуточного соединения 5а (К5)-Ы-Циклопропил-4-{6-[(3-фторфенил)(гидрокси)метил]-8-[(3,3,3-трифторпропил)амино]имидазо[1,2-Ь] пиридазин-3 -ил} -2-метилбензамид

К раствору из 210 мг (400 мкмоль) Ы-циклопропил-4-{6-(3-фторбензоил)-8-[(3,3,3-трифторпропил)амино]имидазо[1,2-Ь]пиридазин-3-ил}-2-метилбензамида, который получали в соответствии со

- 20 028800 сравнительным примером 3Ь в 5 мл дихлорметана добавляли при 3°С 151 мг борогидрида натрия, и перемешивание продолжали в течение 1 ч и при 23°С в течение 1 ч. Добавляли воду и органический слой промывали водой и высушивали над сульфатом натрия. После фильтрации и удаления растворителя, получали 209 мг (96%) указанного в заголовке соединения, которое использовали без дальнейшей очистки.

Соединение А6 №Циклопропил-4-{6-[дифтор(3-фторфенил)метил]-8-[(3,3,3-трифторпропил)амино]имидазо[1,2Ь] пиридазин-3-ил} -2-метилбензамид

мг (46 мкмоль) №Циклопропил-4-{6-[2-(3-фторфенил)-1,3-дитиолан-2-ил]-8-[(3,3,3-трифторпропил)амино]имидазо[1,2-Ь]пиридазин-3-ил}-2-метилбензамида, который получали в соответствии со сравнительным примером 3а преобразовывали по аналогии с получением, описанным для соединения А2 с получением после обработки и очистки 7.9 мг (31%) указанного в заголовке соединения.

'Н-ЯМР (ДМСО-46): δ= 0.49 (2Н), 0.65 (2Н), 2.24 (3Н), 2.61-2.84 (3Н), 3.70 (2Н), 6.61 (1Н), 7.23 (1Н),

7.41 (1Н), 7.46-7.53 (2Н), 7.57 (1Н), 7.74 (1Н), 7.75 (1Н), 7.97 (1Н), 8.09 (1Н), 8.24 (1Н) част. на млн.

Соединение А7 №Циклопропил-4-{6-(3-метоксибензоил)-8-[(3,3,3-трифторпропил)амино]имидазо[1,2-Ь]пиридазин3-ил} -2-метилбензамид

мг (96 мкмоль) (К8)-^Циклопропил-4-{6-[гидрокси(3-метоксифенил)метил]-8-[(3,3,3-трифторпропил)амино]имидазо[1,2-Ь]пиридазин-3-ил}-2-метилбензамида, который получали в соответствии с примером промежуточного соединения 7а преобразовывали по аналогии с примером промежуточного соединения 1а с получением после обработки и очистки 34 мг (62%) указанного в заголовке соединения.

'Н-ЯМР (ДМСО-46): δ= 0.47 (2Н), 0.64 (2Н), 2.19 (3Н), 2.62-2.82 (3Н), 3.69 (2Н), 3.76 (3Н), 6.71 (1Н), 7.23 (1Н), 7.27 (1Н), 7.48 (1Н), 7.54 (1Н), 7.61 (1Н), 7.84 (1Н), 7.89 (1Н), 7.96 (1Н), 8.15 (1Н), 8.22 (1Н) част. на млн.

Пример промежуточного соединения 7а (К8)-№Циклопропил-4-{6-[гидрокси(3-метоксифенил)метил]-8-[(3,3,3-трифторпропил)амино]имидазо [1,2-Ь] пиридазин-3-ил} -2-метилбензамид

110 мг (255 мкмоль) №Циклопропил-4-{6-формил-8-[(3,3,3-трифторпропил)амино]имидазо[1,2Ь]пиридазин-3-ил}-2-метилбензамида, который получали в соответствии с примером промежуточного соединения 1с преобразовывали по аналогии с примером промежуточного соединения 1Ь с использова- 21 028800 нием бром(3-метоксифенил)магния с получением после обработки и очистки 79 мг (55%) указанного в заголовке соединения.

Соединение А8

П-Циклопропил-4- {6-[1 -(3-метоксифенил)винил] -8-[(3,3,3-трифторпропил)амино]имидазо [1,2б] пиридазин-3 -ил} -2-метилбензамид

175 мг (326 мкмоль) П-циклопропил-4-{6-(3-метоксибензоил)-8-[(3,3,3-трифторпропил)амино]имидазо[1,2-б]пиридазин-3-ил}-2-метилбензамида, который получали в соответствии со способом получения, описанным для соединения А7 преобразовывали по аналогии со способом получения, описанным для соединения А1 с получением после обработки и очистки 96.3 мг (55%) указанного в заголовке соединения.

Ή-ЯМР (ДМСО-б₆): δ= 0.48 (2Н), 0.64 (2Н), 2.18 (3Н), 2.60-2.72 (2Н), 2.78 (1Н), 3.60 (2Н), 3.71 (3Н), 5.75 (1Н), 5.98 (1Н), 6.34 (1Н), 6.92-6.99 (3Н), 7.21 (1Н), 7.29 (1Н), 7.53 (1Н), 7.84 (1Н), 7.89 (1Н), 8.01 (1Н), 8.21 (1Н) част. на млн.

Соединение А9

П-Циклопропил-4-{6-(4-метоксибензоил)-8-[(3,3,3-трифторпропил)амино]имидазо[1,2-б]пиридазин3-ил} -2-метилбензамид

400 мг (741 мкмоль) (К8)-П-Циклопропил-4-{6-[гидрокси(4-метоксифенил)метил]-8-[(3,3,3-трифторпропил)амино]имидазо[1,2-б]пиридазин-3-ил}-2-метилбензамида, который получали в соответствии с примером промежуточного соединения 9а преобразовывали по аналогии с примером промежуточного соединения 1а с получением после обработки и очистки 264 мг (66%) указанного в заголовке соединения.

Ή-ЯМР (ДМСО-б₆): δ= 0.51 (2Н), 0.66 (2Н), 2.34 (3Н), 2.56-2.72 (2Н), 2.81 (1Н), 3.56 (2Н), 3.68 (3Н), 6.31 (1Н), 6.86 (2Н), 7.33 (1Н), 7.38 (2Н), 7.49 (1Н), 7.93-8.02 (3Н), 8.29 (1Н) част. на млн.

Пример промежуточного соединения 9а (К8)-П-Циклопропил-4- {6-[гидрокси(4-метоксифенил)метил] -8- [(3,3,3-трифторпропил)амино] имидазо [ 1,2-б] пиридазин-3-ил} -2-метилбензамид

500 мг (1.16 ммоль) П-Циклопропил-4-{6-формил-8-[(3,3,3-трифторпропил)амино]имидазо[1,2б]пиридазин-3-ил}-2-метилбензамида, который получали в соответствии с примером промежуточного соединения 1с преобразовывали по аналогии с примером промежуточного соединения 1б с использова- 22 028800 нием бром(4-метоксифенил)магния с получением после обработки и очистки 501 мг (72%) указанного в заголовке соединения.

Соединение А10 №Циклопропил-4-{6-[1-(4-метоксифенил)винил]-8-[(3,3,3-трифторпропил)амино]имидазо[1,2Ь]пиридазин-3-ил}-2-метилбензамид

мг (136 мкмоль) №Циклопропил-4-{6-(4-метоксибензоил)-8-[(3,3,3-трифторпропил)амино]имидазо[1,2-Ь]пиридазин-3-ил}-2-метилбензамида, который получали в соответствии со способом получения, описанным для соединения А9 преобразовывали по аналогии со способом получения, описанным для соединения А1 с получением после обработки и очистки 36.1 мг (45%) указанного в заголовке соединения.

¹Н-ЯМР (ДМСО-а₆): δ= 0.47 (2Н), 0.63 (2Н), 2.17 (3Н), 2.60-2.72 (2Н), 2.78 (1Н), 3.60 (2Н), 3.76 (3Н), 5.66 (1Н), 5.85 (1Н), 6.32 (1Н), 6.93 (2Н), 7.22 (1Н), 7.35 (2Н), 7.52 (1Н), 7.84 (1Н), 7.89 (1Н), 8.00 (1Н), 8.21 (1Н) част. на млн.

Соединение А11 (К8)-К-Цнклопропнл-4-{6-[(2,5-днфторфеннл)(гндроксн)метнл]-8-[(3,3,3-трнфторпропнл)амнно]имидазо[1,2-Ь]пиридазин-3-ил} -2-метилбензамид

400 мг (927 мкмоль) №Цнклопропнл-4-{6-формнл-8-[(3,3,3-трнфторпропнл)амнно]нмндазо[1,2Ь]пиридазин-3-ил}-2-метилбензамида, который получали в соответствии с примером промежуточного соединения 1с преобразовывали по аналогии с примером промежуточного соединения 1Ь с нспользованием бром(2,5-дифторфенил)магния с получением после обработки и очистки 326 мг (64%) указанного в заголовке соединения.

¹Н-ЯМР (ДМСО-а₆): δ= 0.49 (2Н), 0.65 (2Н), 2.27 (3Н), 2.58-2.74 (2Н), 2.79 (1Н), 3.60 (2Н), 5.94 (1Н),

6.41 (1Н), 6.54 (1Н), 7.12-7.27 (3Н), 7.44 (1Н), 7.57 (1н), 7.82 (1Н), 7.88 (1Н), 7.99 (1Н), 8.26 (1Н) част. на млн.

Соединение А12 №Цнклопропнл-4-{6-(2,5-днфторбензонл)-8-[(3,3,3-трнфторпропнл)амнно]нмндазо[1,2-Ь]пнрндазнн-3-нл} -2-метнлбензамнд

300 мг (550 мкмоль) (К8)-№Цнклопропнл-4-{6-[(2,5-днфторфеннл)(гндроксн)метнл]-8-[(3,3,3-трн- 23 028800 фторпропил)амино]имидазо[1,2-Ъ]пиридазин-3-ил}-2-метилбензамида, который получали в соответствии со способом, описанным для соединения А11, преобразовывали по аналогии с примером промежуточного соединения 1а с получением после обработки и очистки 82 мг (27%) указанного в заголовке соединения.

‘Н-ЯМР (ДМСО-б.,1: δ= 0.48 (2Н), 0.64 (2Н), 2.14 (3Н), 2.63-2.82 (3Н), 3.71 (2Н), 6.79 (1Н), 7.18 (1Н), 7.46 (1Н), 7.55 (1Н), 7.65 (1Н), 7.73 (1Н), 7.81 (1Н), 7.99 (1Н), 8.18 (1Н), 8.23 (1Н) част. на млн.

Соединение А13 ^Циклопропил-4- {6-(3 -фтор-4-метоксибензоил)-8-[(3,3,3-трифторпропил)амино] имидазо [1,2-Ъ] пиридазин-3 -ил } -2-метилбензамид

262 мг (470 мкмоль) ^Циклопропил-4-{6-[(3-фтор-4-метоксифенил)(гидрокси)метил]-8-[(3,3,3-трифторпропил)амино]имидазо[1,2-Ъ]пиридазин-3-ил}-2-метилбензамида, который получали в соответствии с примером промежуточного соединения 1Ъ преобразовывали по аналогии с примером промежуточного соединения 1а с получением после обработки и очистки 210 мг (80%) указанного в заголовке соединения.

‘Н-ЯМР (ДМСО-б.,1: δ= 0.48 (2Н), 0.64 (2Н), 2.24 (3Н), 2.64-2.75 (2Н), 2.78 (1Н), 3.68 (2Н), 3.94 (3Н), 6.67 (1Н), 7.28 (1Н), 7.34 (1Н), 7.85 (1Н), 7.89 (1Н), 7.93-7.99 (3Н), 8.13 (1Н), 8.24 (1Н) част. на млн.

Соединение А14 ^Циклопропил-4-{6-(2,3-дифторбензоил)-8-[(3,3,3-трифторпропил)амино]имидазо[1,2-Ъ]пиридазин-3 -ил } -2-метилбензамид

296 мг (543 мкмоль) ^Циклопропил-4-{6-[(2,3-дифторфенил)(гидрокси)метил]-8-[(3,3,3-трифторпропил)амино]имидазо[1,2-Ъ]пиридазин-3-ил}-2-метилбензамида, который получали в соответствии с примером промежуточного соединения 14а преобразовывали по аналогии с примером промежуточного соединения 1а с получением после обработки и очистки 165 мг (56%) указанного в заголовке соединения.

‘Н-ЯМР (ДМСО-б.,): δ= 0.47 (2Н), 0.64 (2Н), 2.13 (3Н), 2.63-2.82 (3Н), 3.71 (2Н), 6.80 (1Н), 7.17 (1Н), 7.40 (1Н), 7.55 (1Н), 7.68-7.84 (3Н), 8.04 (1Н), 8.19 (1Н), 8.26 (1Н) част. на млн.

Пример промежуточного соединения 14а

N-Циклопропил-4- {6-[(2,3-дифторфенил)(гидрокси)метил] -8-[(3,3,3-трифторпропил)амино] имидазо [ 1,2-Ъ] пиридазин-3 -ил } -2-метилбензамид

- 24 028800

400 мг (927 мкмоль) ^Циклопропил-4-{6-формил-8-[(3,3,3-трифторпропил)амино]имидазо[1,2Ь]пиридазин-3-ил}-2-метилбензамида, который получали в соответствии с примером промежуточного соединения 1с преобразовывали по аналогии с примером промежуточного соединения 1Ь с использованием бром(2,3-дифторфенил)магния с получением после обработки и очистки 326 мг (64%) указанного в заголовке соединения.

Соединение А15 ^Циклопропил-4-{6-[1-(2,3-дифторфенил)винил]-8-[(3,3,3-трифторпропил)амино]имидазо[1,2Ь] пиридазин-3 -ил} -2-метилбензамид

мг (138 мкмоль) ^Циклопропил-4-{6-(2,3-дифторбензоил)-8-[(3,3,3-трифторпропил)амино]имидазо[1,2-Ь]пиридазин-3-ил}-2-метилбензамид который получали в соответствии со способом получения, описанным для соединения А14 преобразовывали по аналогии со способом получения, описанным для соединения А1 с получением после обработки и очистки 67.2 мг (83%) указанного в заголовке соединения.

Л-ЯМР (ДМСО-46): δ= 0.50 (2Н), 0.66 (2Н), 2.14 (3Η), 2.68-2.83 (3Η), 3.69 (2Н), 5.81 (1Η), 6.47 (1Н), 6.65 (1Н), 7.14 (1Н), 7.22-7.32 (2Н), 7.51 (1Н), 7.58 (1Н), 7.69 (1Н), 7.75 (1Η), 8.03 (1Н), 8.24 (1Н) част. на млн.

Соединение А16 ^Циклопропил-4- {6-[дифтор(4-метоксифенил)метил] -8-[(3,3,3-трифторпропил)амино]имидазо [ 1,2Ь] пиридазин-3 -ил} -2-метилбензамид

мг (49 мкмоль) ^Циклопропил-4-{6-[2-(4-метоксифенил)-1,3-дитиолан-2-ил]-8-[(3,3,3-трифторпропил)амино]имидазо[1,2-Ь]пиридазин-3-ил}-2-метилбензамида, который получали в соответствии со сравнительным примером 5а преобразовывали по аналогии с соединением А2 с получением после обработки и очистки 6.0 мг (21%) указанного в заголовке соединения.

Л-ЯМР (ДМСО-46): δ= 0.49 (2Н), 0.65 (2Н), 2.23 (3Η), 2.61-2.84 (3Η), 3.67 (2Н), 3.77 (3Η), 6.55 (1Н), 7.04 (2Н), 7.24 (1Η), 7.55 (2Н), 7.78 (2Н), 7.94 (1Η), 8.09 (1Н), 8.26 (1Н) част. на млн.

Соединение А17 ^Циклопропил-4- {6-[1 -(2,3-дифторфенил)циклопропил]-8-[(3,3,3-трифторпропил)амино] имидазо [ 1,2-Ь]пиридазин-3-ил}-2-метилбензамид

- 25 028800

Смесь, содержащую 68.3 мг [йод(диметил)оксидо-лямбда⁶-сульфанил]метана, 12.3 мг гидрида натрия (60%) и 0.82 мл диметилсульфоксида перемешивали при 60°С в течение 1,5 ч. Добавляли раствор из 21 мг (39 мкмоль) №циклопропил-4-{6-[1-(2,3-дифторфенил)винил]-8-[(3,3,3-трифторпропил)амино]имидазо[1,2-Ь]пиридазин-3-ил}-2-метилбензамида, который получали в соответствии с примером 15 в 0.43 мл диметилсульфоксида и перемешивание продолжали при 130°С при микроволновом облучении в течение 1,5 ч. Добавляли воду, и смесь экстрагировали этиловым эфиром уксусной кислоты. Органический слой промывали соляным раствором и высушивали над сульфатом натрия. После фильтрации и удаления растворителя остаток очищали хроматографией с получением 9.8 мг (41%) указанного в заголовке соединения.

Н-ЯМР (ДМСО-б₆): δ= 0.49 (2Н), 0.65 (2Н), 1.36 (2Н), 1.65 (2Н), 2.24 (3Н), 2.50-2.67 (2Н), 2.80 (1Н), 3.52 (2Н), 5.73 (1Н), 7.16 (1Н), 7.22 (1Н), 7.30 (1Н), 7.34-7.49 (2Н), 7.74 (1Н), 7.79 (1Н), 7.96 (1Н), 8.26 (1Н) част. на млн.

Соединение А18 №Циклопропил-4-{6-[(2,3-дифторфенил)(дифтор)метил]-8-[(3,3,3-трифторпропил)амино]имидазо[1,2-Ь] пиридазин-3 -ил } -2-метилбензамид

мг (34 мкмоль) №циклопропил-4-{6-[2-(2,3-дифторфенил)-1,3-дитиолан-2-ил]-8-[(3,3,3-трифторпропил)амино]имидазо[1,2-Ь]пиридазин-3-ил}-2-метилбензамида, который получали в соответствии с примером промежуточного соединения 18а преобразовывали по аналогии с соединением А2 с получением после обработки и очистки 7.8 мг (41%) указанного в заголовке соединения.

Н-ЯМР (ДМСО-б₆): δ= 0.48 (2Н), 0.64 (2Н), 2.15 (3Н), 2.62-2.82 (3Н), 3.71 (2Н), 6.66 (1Н), 7.14 (1Н), 7.43 (1Н), 7.56 (1Н), 7.61 (1Н), 7.65 (1Н), 7.75 (1Н), 8.07 (1Н), 8.11 (1Н), 8.26 (1Н) част. на млн.

Пример промежуточного соединения 18а №Циклопропил-4-{6-[2-(2,3-дифторфенил)-1,3-дитиолан-2-ил]-8-[(3,3,3-трифторпропил)амино]имидазо[1,2-Ь]пиридазин-3-ил}-2-метилбензамид

мг (92 мкмоль) №Циклопропил-4-{6-(2,3-дифторбензоил)-8-[(3,3,3-трифторпропил)амино]имидазо[1,2-Ь]пиридазин-3-ил}-2-метилбензамид, который получали в соответствии со способом получения, описанным для соединения А14 преобразовывали по аналогии со сравнительным примером 2Ь с получением после обработки и очистки 23.6 мг (41%) указанного в заголовке соединения.

Соединение А19 №Циклопропил-4-{6-[1-(2,5-дифторфенил)винил]-8-[(3,3,3-трифторпропил)амино]имидазо[1,2Ь]пиридазин-3 -ил} -2-метилбензамид

- 26 028800

150 мг (276 мкмоль) ^Циклопропил-4-{6-(2,5-дифторбензоил)-8-[(3,3,3-трифторпропил)амино]имидазо[‘,2-Ь]пиридазин-3-ил}-2-метилбензамид который получали в соответствии со способом получения, описанным для соединения А12 преобразовывали по аналогии с соединением А1 с получением после обработки и очистки 96.2 мг (61%) указанного в заголовке соединения.

'Н-ЯМР (ДМСО-4₆): δ= 0.47 (2Н), 0.64 (2Н), 2.12 (3Н), 2.62-2.81 (3Н), 3.66 (2Н), 5.78 (1Н), 6.42 (1Н), 6.61 (1Н), 7.12 (1Н), 7.23-7.35 (3Н), 7.56 (1Н), 7.67 (1Н), 7.75 (1Н), 8.01 (1Н), 8.23 (1Н) част. на млн.

Соединение А20 ^Циклопропил-4-{6-[‘-(2,5-дифторфенил)циклопропил]-8-[(3,3,3-трифторпропил)амино]имидазо[1,2-Ь]пиридазин-3-ил}-2-метилбензамид

мг (55 мкмоль) ^Циклопропил-4-{6-[‘-(2,5-дифторфенил)винил]-8-[(3,3,3-трифторпропил)амино]имидазо[1,2-Ь)]пиридазин-3-ил}-2-метилбензамид который получали в соответствии со способом получения, описанным для соединения А19 преобразовывали по аналогии с соединением А17 с получением после обработки и очистки 9.9 мг (31%) указанного в заголовке соединения.

‘Н-ЯМР (ДМСО-06): δ= 0.50 (2Н), 0.65 (2Н), 1.36 (2Н), 1.63 (2Н), 2.26 (3Н), 2.52-2.64 (2Н), 2.80 (1Н), 3.52 (2Н), 5.75 (1Н), 7.16-7.26 (3Н), 7.35 (1Н), 7.40 (1Н) 7.75 (1Н), 7.81 (1Н), 7.95 (1Н), 8.23 (1Н) част. на млн.

Соединение А21 ^Циклопропил-4-{6-[(2,5-дифторфенил)(дифтор)метил]-8-[(3,3,3-трифторпронил)амино]имидазо[‘ ,2-Ь]пиридазин-3-ил}-2-метилбензамид

мг (77 мкмоль) ^Циклопропил-4-{6-[2-(2,5-дифторфенил)-‘,3-дитиолан-2-ил]-8-[(3,3,3-трифторпропил)амино]имидазо[‘,2-Ь]пиридазин-3-ил}-2-метилбензамида, который получали в соответствии с примером промежуточного соединения 2‘а преобразовывали по аналогии со сравнительным примером 2Ь с получением после обработки и очистки ‘7.3 мг (38%) указанного в заголовке соединения.

‘Н-ЯМР (ДМСО-06): δ= 0.48 (2Н), 0.65 (2Н), 2.16 (3Н), 2.64-2.82 (3Н), 3.71 (2Н), 6.65 (1Н), 7.16 (1Н), 7.46 (1Н), 7.56 (1Н), 7.60-7.65 (2Н), 7.67 (1Н), 8.03 (1Н), 8.11 (1Н), 8.23 (1Н) част. на млн.

Пример промежуточного соединения 2‘а ^Циклопропил-4-{6-[2-(2,5-дифторфенил)-‘,3-дитиолан-2-ил]-8-[(3,3,3-трифторпропил)амино]имидазо[‘,2-Ь]пиридазин-3-ил}-2-метилбензамид

‘00 мг (‘84 мкмоль) ^Циклопропил-4-{6-(2,5-дифторбензоил)-8-[(3,3,3-трифторпропил)ами- 27 028800 но]имидазо[1,2-Ь]пиридазин-3-ил}-2-метилбензамид который получали в соответствии со способом получения, описанным для соединения А12 преобразовывали по аналогии со сравнительным примером 2Ь с получением после обработки и очистки 54 мг (47%) указанного в заголовке соединения.

Соединение А22

Х-Циклопропил-4-{6-[1-(5-фтор-2-гидроксифенил)этенил]-8-[(3,3,3-трифторпропил)амино]имидазо [ 1,2-Ь]пиридазин-3 -ил} -2-метилбензамид

Смесь из 27.0 мг (49 мкмоль) Шциклопропил-4-{6-[1-(5-фтор-2-метоксифенил)этенил]-8-[(3,3,3трифторпропил)амино]имидазо[1,2-Ь]пиридазин-3-ил}-2-метилбензамида, который получали в соответствии с примером промежуточного соединения 22а, 85.5 мг трибромборана и 2000 мкл ДХМ перемешивали при охлаждении льдом в течение 30 мин. и получали, после обработки и очистки, 5.7 мг (22%) указанного в заголовке соединения.

‘Н-ЯМР (ДМСО-06): δ= 0.44-0.52 (2Н), 0.64 (2Н), 2.15 (3Н), 2.59-2.73 (2Н), 2.78 (1Н), 3.61 (2Н), 5.59 (1Н), 6.17 (1Н), 6.41 (1Н), 6.79 (1Н), 7.00 (2Н), 7.15 (1Н), 7.41 (1Н), 7.71-7.78 (1Н), 7.84 (1Н), 7.98 (1Н), 8.20 (1Н), 9.21 (1Н) част. на млн.

Пример промежуточного соединения 22а

Х-Циклопропил-4-{6-[1-(5-фтор-2-метоксифенил)этенил]-8-[(3,3,3-трифторпропил)амино]ими-

1740 мг (1.16 ммоль) Х-Циклопропил-4-{6-(5-фтор-2-метоксибензоил)-8-[(3,3,3-трифторпропил)амино]имидазо[1,2-Ь]пиридазин-3-ил}-2-метилбензамида, который получали в соответствии с примером промежуточного соединения 22Ь преобразовывали по аналогии с соединением А1с получением после обработки 1270 мг (73%) указанного в заголовке соединения.

¹Н-ЯМР (ДМСОШ): δ= 0.43-0.52 (2Н), 0.59-0.69 (2Н), 2.14 (3Н), 2.57-2.73 (2Н), 2.73-2.84 (1Н), 3.50 (3Н), 3.56-3.67 (2Н), 5.59 (1Н), 6.25 (1Н), 6.45 (1Н), 6.98-7.16 (3Н), 7.19 (1Н), 7.46 (1Н), 7.71 (1Н), 7.78 (1Н), 8.00 (1Н), 8.23 (1Н) част. на млн.

Пример промежуточного соединения 22Ь

Х-Циклопропил-4-{6-(5-фтор-2-метоксибензоил)-8-[(3,3,3-трифторпропил)амино]имидазо[1,2-Ь]пиридазин-3-ил}-2-метилбензамид

2000 мг (4.078 ммоль) 3-[4-(Циклопропилкарбамоил)-3-метилфенил]-Х-метокси-Шметил-8-[(3,3,3трифторпропил)амино]имидазо[1,2-Ь]пиридазин-6-карбоксамид который получали в соответствии со

- 28 028800 сравнительным примером 3с преобразовывали по аналогии со сравнительным примером 3Ь с использованием бром(5-фтор-2-метоксифенил)магния с получением после обработки 1740 мг (77%) указанного в заголовке соединения.

¹Н-ЯМР (ДМСО-6₆): δ= 0.43-0.51 (2Н), 0.60-0.69 (2Н), 2.13 (3Н), 2.62-2.83 (4Н), 3.60 (3Н), 3.70 (2Н), 6.75 (1Н), 7.15 (1Н), 7.21 (1Н), 7.33-7.46 (2Н), 7.72 (1Н), 7.80 (1Н), 7.92 (1Н), 8.18 (1Н), 8.25 (1Н) част. на млн.

Соединение А23 №Циклопропил-4-{6-[1-(5-фтор-2-гидроксифенил)циклопропил]-8-[(3,3,3-трифторпропил)амино]имидазо[1,2-Ь]пиридазин-3-ил} -2-метилбензамид

Смесь из 584 мг (907 мкмоль) 4-(6-{1-[2-(бензилокси)-5-фторфенил]циклопропил}-8-[(3,3,3-трифторпропил)амино]имидазо[1,2-Ь]пиридазин-3-ил)-Л-циклопропил-2-метилбензамида, который получали в соответствии с примером промежуточного соединения 23а и 50 мг Р6/С в 50 мл этанол7НОАС 8:2 перемешивали при к.т. под атмосферой водорода при 1 атм. В течение 8 дней и получали, после обработки 68 мг (14%) указанного в заголовке соединения.

¹Н-ЯМР (ДМСО-6₆): δ= 0.47-0.58 (2Н), 0.63-0.72 (2Н), 1.21-1.29 (2Н), 1.55-1.63 (2Н), 2.51-2.65 (3Н),

2.82 (1Н), 3.46 (2Н), 5.75 (1Н), 6.81 (1Н), 6.93-7.03 (1Н), 7.11 (1Н), 7.27 (1Н), 7.37 (1Н), 7.85-8.01 (3Н),

8.30 (1Н), 9.33 (1Н) част. на млн.

Пример промежуточного соединения 23 а

4-(6-{1-[2-(Бензилокси)-5-фторфенил]циклопропил}-8-[(3,3,3-трифторпропил)амино]имидазо[1,2Ь]пиридазин-3-ил)-Л-циклопропил-2-метилбензамид

2060 мг сырого (3.27 ммоль) 4-(6-{1-[2-(Бензилокси)-5-фторфенил]этенил}-8-[(3,3,3-трифторпропил)амино]имидазо[1,2-Ь]пиридазин-3-ил)-Л-циклопропил-2-метилбензамида, который получали в соответствии с примером промежуточного соединения 23Ь преобразовывали по аналогии с соединением А17 с получением после обработки и очистки 692 мг (33%) указанного в заголовке соединения.

Ή-ЯМР (ДМСО-66): δ= 0.49-0.57 (2Н), 0.64-0.73 (2Н), 1.26-1.33 (2Н), 1.58-1.66 (2Н), 2.31 (3Н), 2.422.55 (2Н), 2.83 (1Н), 3.41 (2Н), 4.98 (2Н), 5.72 (1Н), 6.97-7.04 (2Н), 7.05-7.11 (4Н), 7.14 (1Н), 7.25-7.30 (2Н), 7.32 (1Н), 7.83-7.88 (1Н), 7.92 (1Н), 7.96 (1Н), 8.26 (1Н) част. на млн.

Пример промежуточного соединения 23Ь

4-(6- {1-[2-(Бензилокси)-5-фторфенил]бут-3-ен-1 -ил}-8-[(3,3,3-трифторпропил)амино]имидазо[1,2Ь]пиридазин-3-ил)-Л-циклопропил-2-метилбензамид

- 29 028800

14.06 г (22.26 ммоль) 4-{6-[2-(Бензилокси)-5-фторбензоил]-8-[(3,3,3-трифторпропил)амино]имидазо[1,2-Ь]пиридазин-3-ил}-К-циклопропил-2-метилбензамида, который получали в соответствии с примером промежуточного соединения 23 с преобразовывали по аналогии с соединением А1 с получением после обработки 21.83 г (150%) сырого соединения, указанного в заголовке, которое использовали без последующей очистки в следующей стадии.

¹Н-ЯМР (ДМСО-ф): δ= 0.46-0.54 (2Н), 0.62-0.70 (2Н), 2.14 (3Н), 2.52-2.68 (2Н), 2.74-2.87 (1Н), 3.59 (2Н), 4.84 (2Н), 5.65 (1Н), 6.16 (1Н), 6.39 (1Н), 6.77 (2Н), 6.93 (2Н), 7.02-7.29 (5Н), 7.43 (1Н), 7.74 (1Н),

7.82 (1Н), 8.03 (1Н), 8.21 (1Н) част. на млн.

Пример промежуточного соединения 23 с

4-{6-[2-(Бензилокси)-5-фторбензоил]-8-[(3,3,3-трифторпропил)амино]имидазо[1,2-Ь]пиридазин-3ил}-К-циклопропил-2-метилбензамид р р

Р .....

ΝΗ

N

N ,Ν-.^

О N

О %' ΗΝ

15.96 г (32.54 ммоль) 3-[4-(Циклопропилкарбамоил)-3-метилфенил]-К-метокси-К-метил-8-[(3,3,3трифторпропил)амино]имидазо[1,2-Ь] пиридазин-6-карбоксамид который получали в соответствии со сравнительным примером 3с в 300 мл ТГФ преобразовывали по аналогии со сравнительным примером 3Ь с использованием свежеприготовленного раствора из [2-(бензилокси)-5-фторфенил](бром)магния (231 ммоль в 200 мл ТГФ) с получением после обработки 13.26 г (64,5%) указанного в заголовке соединения.

¹Н-ЯМР (ДМСО-ф): δ= 0.47-0.56 (2Н), 0.62-0.71 (2Н), 2.12 (3Н), 2.67 (2Н), 2.80 (1Н), 3.68 (2Н), 4.96 (2Н), 6.68 (1Н), 6.83 (2Н), 6.97 (2Н), 7.07 (1Н), 7.18 (1Н), 7.32 (1Н), 7.40-7.50 (2Н), 7.73 (1Н), 7.81 (1Н), 7.88 (1Н), 8.20 (1Н), 8.24 (1Н) част. на млн.

Пример промежуточного соединения 23ά [2-(бензилокси)-5-фторфенил](бром)магния

О

К перемешиваемой суспензии из 5.62 г (231 ммоль) магния в 100 мл ТГФ добавляли при к.т. под атмосферой аргона на кристалле йода и по каплям 40 мл раствора из 64.95 г (231 ммоль) 1-(бензилокси)2-бром-4-фторбензола в 100 мл ТГФ. Смесь нагревали до 60°С до обесцвечивания и оставшийся раствор из 1-(бензилокси)-2-бром-4-фторбензола добавляли по каплям при поддержании температуры на 50°С.

После охлаждения до к.т., раствор Гриньяра непосредственно применяли для примера промежуточного соединения 23с.

Соединение А24

К-циклопропил-4-{6-[1-(3-фторфенил)этенил]-8-[(3,3,3-трифторпропил)амино]имидазо[1,2-Ь]пиридазин-3-ил}-2-метилбензамид

- 30 028800

80.0 мг (152 мкмоль) П-Циклопропил-4-{6-(3-фторбензоил)-8-[(3,3,3-трифторпропил)амино]имидазо[1,2-б]пиридазин-3-ил}-2-метилбензамида, который получали в соответствии со сравнительным примером 3б преобразовывали по аналогии со способом получения, описанным для соединения А1 с получением после обработки и очистки 27 мг (33.7%) указанного в заголовке соединения.

Ή-ЯМР (ДМСО-б6): δ= 0.44-0.51 (2Н), 0.60-0.66 (2Н), 2.16 (3Н), 2.59-2.72 (2Н), 2.77 (1Н), 3.62 (2Н), 5.81 (1Н), 6.06 (1Н), 6.41 (1Н), 7.15-7.23 (2Н), 7.23-7.30 (2Н), 7.38-7.47 (1Н), 7.55 (1Н), 7.77-7.83 (1Н), 7.85 (1Н), 8.01 (1Н), 8.20 (1Н) част. на млн.

Соединение А25

N-Циклопропил-4-{6-[ 1 -(3-фторфенил)циклопропил]-8- [(3,3,3-трифторпропил)амино]имидазо [1,2б]пиридазин-3 -ил} -2-метилбензамид

27.0 мг (52 мкмоль) П-Циклопропил-4-{6-[1-(3-фторфенил)этенил]-8-[(3,3,3-трифторпропил)амино]имидазо[1,2-б]пиридазин-3-ил}-2-метилбензамид который получали в соответствии со способом получения, описанным для соединения А23 преобразовывали по аналогии с соединением А1 с получением после обработки и очистки 9 мг (32%) указанного в заголовке соединения.

’Н-ЯМР (ДМСО-б6): δ= 0.47-0.53 (2Н), 0.61-0.69 (2Н), 1.32-1.38 (2Н), 1.54-1.59 (2Н), 2.32 (3Н), 2.57 (2Н), 2.80 (1Н), 3.51 (2Н), 5.99 (1Н), 7.03-7.11 (1Н), 7.14-7.23 (2Н), 7.27-7.40 (2Н), 7.51 (1Н), 7.84-7.91 (2н), 8.08 (1Н), 8.26 (1Н) част. на млн.

Соединение А26

П-Циклопропил-4-{6-(3-фтор-4-метоксифенокси)-8-[(оксетан-3-илметил)амино]имидазо[1,2-б]пиридазин-3-ил} -2-метилбензамид

Раствор из 128 мг (900 мкмоль) 3-фтор-4-метоксифенола в 2 мл диметилсульфоксида обрабатывали посредством 36 мг (900 мкмоль) гидрида натрия и перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч. После этого 68 мг (150 мкмоль) добавляли 4-{6-бром-8-[(оксетан-3-илметил)амино]имидазо[1,2б]пиридазин-3-ил}-П-циклопропил-2-метилбензамид, который получали в соответствии с примером промежуточного соединения 26а, и смесь нагревали в течение 1 ч. при 130°С и в течение ночи при 120°С с получением после ВЭЖХ очистки 17 мг (20%) указанного в заголовке соединения.

Ή-ЯМР (ДМСО-б6): δ= 0.43-0.50 (2Н), 0.59-0.68 (2Н), 2.11 (3Н), 2.77 (1Н), 3.35 (1Н), 3.61 (2Н), 3.83 (3Н), 4.34 (2Н), 4.63 (2Н), 6.09 (1Н), 7.02-7.09 (1Н), 7.13-7.25 (2Н), 7.30 (1Н), 7.61-7.68 (1Н), 7.77 (1Н),

7.83 (1Н), 7.91 (1Н), 8.22 (1Н) част. на млн.

- 31 028800

Пример промежуточного соединения 26а

4-{6-Бром-8-[(оксетан-3-илметил)амино]имидазо[1,2-Ъ]пиридазин-3-ил}-№циклопропил-2-метилбензамид

К суспензии из 3000 мг (6677 мкмоль) 4-[6-бром-8-(метилсульфонил)имидазо[1,2-Ъ]пиридазин-3ил]-№циклопропил-2-метилбензамид, который получали в соответствии с примером промежуточного соединения 26Ъ в 150 мл ТГФ добавляли 873 мг (1002 мкмоль) 1-(оксетан-3-ил)метанамин и 2589 мг (2003 мкмоль) ΌΙΡΕΑ и смесь нагревали в течение 72 ч при 60°С. После дополнительного добавления 100 мг 1-(оксетан-3-ил)метанамина и нагревания в течение 8 ч. при 60°С, растворитель удаляли в вакууме и остаток ресуспендировали в этиловом эфире уксусной кислоты и промывали водой. Образовавшийся осадок отфильтровывали с получением 0.99 г (33%) указанного в заголовке соединения. Оставшуюся водную фазу реэкстрагировали посредством ДХМ, и объединенные органические фазы выпаривали. Остаток растирали с ТГФ при 75°С с получением еще 1.65 г (53%) указанного в заголовке соединения.

‘Н-ЯМР (ДМСО-Щ): δ= 0.46-0.53 (2Н), 0.61-0.69 (2Н), 2.35 (3Н), 2.75-2.85 (1Н), 3.25 (1Н), 3.54-3.69 (2Н), 4.31 (2Н), 4.62 (2Н), 6.45 (1Н), 7.36 (1Н), 7.84 (1Н), 7.90 (1Н). 7.94 (1Н), 8.12 (111). 8.30 (111) част. на млн.

Пример промежуточного соединения 26Ъ

4-[6-Бром-8-(метилсульфонил)имидазо [ 1,2-Ъ]пиридазин-3 -ил] -Ν-циклопропил-2-метилбензамид

К раствору из 12.5 г (28.75 ммоль) 4-[6-бром-8-(метилсульфанил)имидазо[1,2-Ъ]пиридазин-3-ил]-№ циклопропил-2-метилбензамид, который получали в соответствии с примером промежуточного соединения 26с в 400 мл ДМФА добавляли 53.03 г (86.26 ммоль) гидросульфат калия сульфат (гидропероксисульфонил)оксиданид (5:1:1:2), и смесь перемешивали в течение ночи при к.т. с получением, после водной обработки, 8.6 г (60%) указанного в заголовке соединения (примесь представляет собой 4-[6-бром-8(метилсульфинил)имидазо[1,2-Ъ]пиридазин-3-ил]-№циклопропил-2-метилбензамид).

СПЖХ-МС: Ву = 0.98 мин; т/ζ (Ε8+) 450.3 [МН+]; требуемый МВ = 449.3.

Пример промежуточного соединения 26с

4-[6-Бром-8-(метилсульфанил)имидазо [ 1,2-Ъ]пиридазин-3-ил] -Ν-циклопропил-2-метилбензамид

Смесь, содержащую 55.69 г (150 ммоль) 6-бром-3-йод-8-(метилсульфанил)имидазо[1,2-Ъ]пиридазина, который получали в соответствии с примером промежуточного соединения 26ά, 68 г (225 ммоль) ^циклопропил-2-метил-4-(4,4,5,5-тетраметил-1,3,2-диксаборолан-2-ил)бензамид, который получали в соответствии с примером промежуточного соединения 26д, 11 г (15 ммоль) (1,1-бис-(дифенилфосфи- 32 028800 но)ферроцен)дихлорпалладий (II), 450 мл водного 1М раствора карбоната калия и 632 мл тетрагидрофурана перемешивали при 60°С в течение 12 ч с получением, после водной обработки, 130 г сырого продукта. Остаток растирали с ДХМ с получением 15.15 г (24%) указанного в заголовке соединения. Фильтрат очищали хроматографией с получением еще 2.65 г (3%) указанного в заголовке соединения.

’Н-ЯМР (ДМСО-4₆): δ= 0.47-0.54 (2Н), 0.62-0.71 (2Н), 2.36 (3Н), 2.63 (3Н), 2.77-2.85 (1Н), 7.17 (1Н), 7.40 (1Н), 7.85 (1Н), 7.90 (1Н), 8.12 (1Н), 8.31 (1Н) част. на млн.

Пример промежуточного соединения 26ά 6-Бром-3-йод-8-(метилсульфанил)имидазо[1,2-Ь]пиридазин

К раствору из 174 г (432 ммоль) 6,8-дибром-3-йодимидазо[1,2-Ь]пиридазина, который получали в соответствии с примером промежуточного соединения 26е в 3.8 л диоксана, добавляли 30.28 г (432 ммоль) метантиолата натрия, и смесь перемешивали при 60°С в течение 5 дней. Кроме того, добавляли 25 г метантиолата натрия, и смесь перемешивали при 80°С в течение 2 ч. После охлаждения, раствор выливали в 4 л воды. Воду и водную фазу экстрагировали этиловым эфиром уксусной кислоты. Органическую фазу промывали водой, высушивали над сульфатом натрия, фильтровали и выпаривали с получением 102 г (64%) указанного в заголовке соединения.

’Н-ЯМР (ДМСО-б₆): δ= 6.79 (1Н), 7.67 (1Н)част. на млн.

Пример промежуточного соединения 26е

6,8-Дибром-3-йодимидазо [ 1,2-Ь] пиридазин

К смеси, содержащей 156 г (563 ммоль) 6,8-дибромимидазо[1,2-Ь]пиридазина, который получали в соответствии с примером промежуточного соединения 26£, 190 г (1637 ммоль) Ν-йодсукцинимида и 1.3 л хлороформа добавляли 5.5 мл НС1 конц. и суспензию нагревали при 70°С в течение ночи. Осадок отфильтровывали и растирали с диизопропиловым эфиром с получением 119 г (52%) указанного в заголовке соединения.

’Н-ЯМР (ДМСО-06): δ= 7.92 (1Н), 8.00 (1Н) част. на млн.

Пример промежуточного соединения 26£

6,8-Дибромимидазо[1,2-Ь]пиридазин

Смесь, содержащую 235 г (931 ммоль) 4,6-дибромпиридазин-3-амин который получали в соответствии с примером промежуточного соединения 26д, 421 мл (2792 ммоль) 2-бром-1,1-диэтоксиэтана, 2.93 л воды и 227 мл ТГФ нагревали при 125°С в течение ч и при к.т. в течение ночи. Раствор нейтрализовали посредством добавления твердого ΝαΙ 1СО₃, осадок отфильтровывали, промывали водой и высушивали с получением 156 г (80%) указанного в заголовке соединения в виде коричневатого твердого вещества.

’Н-ЯМР (ДМСО-а₆): δ= 7.81 (1Н), 8.40 (1Н) част. на млн.

Пример промежуточного соединения 26д

6,8-Дибромимидазо[1,2-Ь]пиридазин

Вг

К смеси, содержащей 285 г (1638 ммоль) 6-бромпиридазин-3-амина, который получали в соответствии с примером промежуточного соединения 26Н,275 г (3276 ммоль) №НСО₃ и 2815 мл МеОН добавляли по каплям 85 мл (1638 ммоль) брома при к.т. и ее перемешивали при к.т. в течение ночи. После дополнительного добавления 34 мл (655 ммоль) брома и 55 г (655 ммоль) №НСО₃, смесь снова перемешивали в течение ночи. Растворитель сокращали до прибл. 1000 мл, и смесь выливали в 5 л воды. Осадок отфильтровывали, промывали водой и высушивали с получением 411 г (99%) указанного в заголовке соединения.

’Н-ЯМР (СОС1₃): δ= 6.14 (1Н), 9.92 (2Н) част. на млн.

Пример промежуточного соединения 26Н

6-Бромпиридазин-3 -амин

- 33 028800

Раствор из 250 г (1.05 моль) 3,6-дибромпиридазина в 1.2 л 25% водного аммония нагревали до 100°С при 11.7 бар в течение ночи в автоклаве. После охлаждения, осадок отфильтровывали, промывали водой и высушивали с получением 137 г (75%) указанного в заголовке соединения.

¹Н-ЯМР (ДМСО-4₆): δ= 6.58 (1Н), 6.69 (2Н), 7.41 (1Н) част. на млн.

Пример промежуточного соединения 26ΐ №Циклопропил-2-метил-4-(4,4,5,5-тетраметил-1,3,2-диксаборолан-2-ил)бензамид

К раствору из 260 г (1.02 моль) 4-бром-№циклопропил-2-метилбензамида, который получали в соответствии с примером промежуточного соединения 26) в 2 л диоксана при 23°С добавляли 390 г бис(пинаколато)дибора, 19.5 г 2-дициклогексилфосфино-2',4',6'-триизопропилбифенила, 150 г ацетата калия и 9.37 г трис-(дибензилиденацетон)дипалладия(0), и смесь нагревали с обратным холодильником в течение 6 ч. После охлаждения до 23°С, добавляли воду и этиловый эфир уксусной кислоты, и смесь перемешивали в течение 15 мин. Органическую фазу промывали водой, высушивали над сульфатом натрия, фильтровали и выпаривали. Остаток очищали хроматографией с получением 308 г (56%) указанного в заголовке соединения.

¹Н-ЯМР (300 МГц, СПСЬ): δ = 0.59 (2Н), 0.85 (2Н), 1.33 (6Н), 2.41 (3Н), 2.87 (1Н), 5.94 (1Н), 7.28 (1Н), 7.60 (1Н), 7.63 (1Н) част. на млн.

Пример промежуточного соединения 26)

4-Бром-№циклопропил-2-метилбензамид

К перемешиваемому раствору из 300 г (1.4 моль) 4-бром-2-метилбензойной кислоты в 8.4 л дихлорметана при 23°С добавляли 79.6 г циклопропанамина и 320.9 г ЕБС. После перемешивания в течение ночи, раствор промывали водой и водную фазу экстрагировали дихлорметаном. Объединенные органические фазы высушивали над сульфатом натрия, фильтровали и выпаривали. Оставшееся твердое вещество растирали с диизопропиловым эфиром, фильтровали, промывали и высушивали в вакууме с получением 260 г (73%) указанного в заголовке соединения.

Соединение А27 №Циклопропил-4-{6-(2,3-дифтор-4-метоксифенокси)-8-[(3,3,3-трифторпропил)амино]имидазо[1,2Ь]пиридазин-3-ил}-2-метилбензамид

Раствор из 31.9 г (199 ммоль) 2,3-дифтор-4-метоксифенола в 450 мл диметилсульфоксида обрабатывали посредством 7.96 г (199 ммоль) гидрида натрия и перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч. После этого добавляли 16 г (33.2 ммоль) 4-{6-бром-8-[(3,3,3-трифторпропил)амино]имидазо[1,2-Ь]пиридазин-3-ил}-№циклопропил-2-метилбензамида, который получали в соответствии с примером промежуточного соединения 27а, и смесь нагревали в течение ночи при 130°С. После охлаждения, добавляли 300 мл этилового эфира уксусной кислоты, и органическую фазу промывали водой. После выпаривания органической фазы, остаток растирали с 200 мл этанола с получением 12.05 г (65%) указанного в заголовке соединения.

¹Н-ЯМР (ДМСО-46): δ= 0.47-0.53 (2Н), 0.62-0.70 (2Н), 2.11 (3Н), 2.72 (2Н), 2.80 (1Н), 3.64 (2Н), 3.92 (3Н), 6.22 (1Н), 7.12 (1Н), 7.18 (1Н), 7.27 (1Н), 7.63 (1Н), 7.72 (1Н), 7.75-7.81 (1Н), 7.97 (1Н), 8.24 (1Н) част. на млн.

Пример промежуточного соединения 27а

4- { 6-Бром-8-[(3,3,3-трифторпропил)амино]имидазо [ 1,2-Ь]пиридазин-3 -ил} -№циклопропил-2-ме- 34 028800 тилбензамид

Смесь, содержащую 127 г (292 ммоль) 6-бром-3-йод-К-(3,3,3-трифторпропил)имидазо[1,2-Ь]пиридазин-8-амина, который получали в соответствии с примером промежуточного соединения 27Ь, 95.93 г (438 ммоль) [4-(циклопропилкарбамоил)-3-метилфенил]бороновой кислоты, которую получали в соответствии с примером промежуточного соединения 27с, 23.8 г (29 ммоль) (1,1-бис-(дифенилфосфино)ферроцен)дихлорпалладия (II), 438 мл водного 1М раствора карбоната калия и 973 мл тетрагидрофурана перемешивали при 80°С в течение 8 ч и помимо этого 6 дней при 60°С. Этиловый эфир уксусной кислоты добавляли к отделенной органической фазе, и смесь промывали водой. После фильтрации над ЛЬЕОХ, органическую фазу выпаривали, и остаток растирали с 200 мл этанол с получением 71.2 г (51%) указанного в заголовке соединения.

'Н-ЯМР (ДМСО-ф,): δ= 0.48-0.58 (2Н), 0.63-0.73 (2Н), 2.38 (3Н), 2.68 (2Н), 2.83 (1Н), 3.61 (2Н), 6.49 (1Н), 7.40 (1Н), 7.87 (1Н), 7.93 (1Н), 7.96-8.04 (2Н), 8.32 (1Н) част. на млн. Пример промежуточного соединения 27Ь

6-Бром-3 -йод-Х-(3,3,3-трифторпропил)имидазо [ 1,2-Ь] пиридазин-8-амин

К раствору из 119 г 295 ммоль) 6,8-дибром-3-йодимидазо[1,2-Ь]пиридазина, который получали в соответствии с примером промежуточного соединения 26е в 800 мл ТГФ добавляли 66.8 г (590.8 ммоль) 3,3,3-трифторпропан-1-амина, и смесь перемешивали при 80°с в течение 2 ч. и при 50°С в течение ночи. Раствор выпаривали, добавляли 600 мл этилового эфира уксусной кислоты, и смесь промывали водой. Органическую фазу высушивали и выпаривали с получением 127 г (99%) указанного в заголовке соединения.

¹Н-ЯМР (ДМСО-а₆): δ = 2.63 (2Н), 3.55 (2Н), 6.43 (1Н), 7.59 (1Н), 7.89-7.98 (1Н) част. на млн.

Пример промежуточного соединения 27с [4-(Циклопропилкарбамоил)-3-метилфенил]бороновая кислота

К раствору из Х-циклопропил-2-метил-4-(4,4,5,5-гетраметил-1,3,2-диксаборолан-2-ил)бензамида (20.2 г , 67.13 моль), который получали в соответствии с примером промежуточного соединения 26Ϊ в ацетоне (300 мл) при к.т. добавляли периодат натрия (43.1 г, 201.40 моль) и ацетат аммония (134.26 моль, 134 мл 1М водный раствор), и смесь перемешивали в течение 3 ч. Еще добавляли воду (120 мл), и смесь перемешивали при 40°С в течение еще 2 ч. После добавления 4 н. НС1 (32 мл), органическую фазу удаляли в вакууме, и остаток экстрагировали этиловым эфиром уксусной кислоты. Органическую фазу промывали нас. раствором хлорида натрия, фильтровали через фильтр ШНаИпап и выпаривали. Остаток повторно растворяли в толуоле и выпаривали (два раза) с получением 14.59 г (94.3%) [4-(циклопропилкарбамоил)-3-метилфенил]бороновой кислоты: ¹Н-ЯМР (300 МГц, 0₆-ДМСО): δ =8.21 (1Н), 8.04 (2Н), 7.56 (2Н), 7.17 (1Н), 2.77 (1Н), 2.25 (3Н), 0.62 (2Н), 0.47 (2Н) част. на млн.

- 35 028800

Соединение А28 №Циклопропил-4-{6-(2,3-дифтор-4-метоксифенокси)-8-[(тетрагидро-2Н-пиран-4-илметил)амино]имидазо[1,2-Ъ]пиридазин-3-ил}-2-метилбензамид

К раствору из 52 мг (0,1 ммоль) №циклопропил-4-[6-(2,3-дифтор-4-метоксифенокси)-8-(метилсульфонил)имидазо[1,2-Ъ]пиридазин-3-ил]-2-метилбензамида, который получали в соответствии с примером промежуточного соединения 28а в НМП (2 мл) при к.т. добавляли 1-(тетрагидро-2Н-пиран-4ил)метанамин (35 мг, 0.3 ммоль) и ΌΙΡΕΑ (0.3 ммоль, 51 мкл), и смесь перемешивали при 110°С в течение 72 ч. с получением после ВЭЖХ очистки 26.9 мг (47%) указанного в заголовке соединения ‘Н-ЯМР (ДМСО-66): δ= 0.43-0.50 (2Н), 0.58-0.69 (2Н), 1.22 (2Н), 1.62 (2Н), 1.86-2.02 (1Н), 2.04-2.11 (3Н), 2.77 (1Н), 3.19-3.30 (4Н), 3.82 (2Н), 3.89 (3Н), 6.16 (1Н), 7.03-7.13 (1Н), 7.15 (1Н), 7.20-7.30 (1Н), 7.57-7.63 (1Н), 7.69 (1Н), 7.80 (1Н), 7.93 (1Н), 8.24 (1Н) част. на млн.

Пример промежуточного соединения 28а №Циклопропил-4-[6-(2,3-дифтор-4-метоксифенокси)-8-(метилсульфонил)имидазо[1,2-Ъ]пиридазин-

986 мг (1986 мкмоль) №Циклопропил-4-[6-(2,3-дифтор-4-метоксифенокси)-8-(метилсульфанил)имидазо [ 1 ,2-Ъ]пиридазин-3 -ил] -2-метилбензамида, который получали в соответствии с примером промежуточного соединения 28Ъ преобразовывали по аналогии с примером промежуточного соединения 26Ъ с получением после обработки 1040 мг (99%) указанного в заголовке соединения.

‘Н-ЯМР (ДМСО-66): δ= 0.44-0.51 (2Н), 0.61-0.69 (2Н), 2.11 (3Н), 2.73-2.84 (1Н), 3.66 (3Н), 3.91 (3Н), 7.13-7.21 (1Н), 7.23 (1Н), 7.33-7.42 (1Н), 7.64-7.70 (3Н), 8.30 (1Н), 8.40 (1Н) част. на млн.

Пример промежуточного соединения 28Ъ №Циклопропил-4-[6-(2,3-дафтор-4-метоксифенокси)-8-(метилсульфанил)имидазо[1,2-Ъ]пиридазин3 -ил] -2 -метилбензамид

3.1 г (7428 мкмоль) 4-[6-Бром-8-(метилсульфанил)имидазо[1,2-Ъ]пиридазин-3-ил]-№циклопропил2-метилбензамида, который получали в соответствии с примером промежуточного соединения 26Ъ преобразовывали по аналогии с соединением А27 с использованием 2,3-дифтор-4-метоксифенол с получением после обработки и очистки 1010 мг (27%) указанного в заголовке соединения.

‘Н-ЯМР (ДМСО-б₆): δ= 0.44-0.50 (2Н), 0.59-0.70 (2Н), 2.09 (3Н), 2.67 (3Н), 2.73-2.83 (1Н), 3.90 (3Н), 7.06 (1Н), 7.14 (1Н), 7.19 (1Н), 7.31 (1Н), 7.58-7.65 (1Н), 7.67 (1Н), 8.09 (1Н), 8.26 (1Н) част. на млн.

Исследование пролиферации

Культивируемые опухолевые клетки (МСР7, клетки гормонально-зависимой карциномы молочной железы человека, АТСС НТВ22; N0-1146(0 клетки немелкоклеточной карциномы легких человека,

- 36 028800

АТСС НТВ-177; Όυ 145, клетки гормонально-зависимой карциномы предстательной железы человека, АТСС НТВ-81; ^Ьа-МаТц, клетки рака шейки матки человека, ЕРО-СтЬИ. Вет1ш; Ηе^а-МаТи-А^К, клетки рака шейки матки человека, резистентные к множеству лекарственным средствам, ЕРО-СтЬК Берлин; ^Ьа клетки рака шейки матки человека, АТСС ССЬ-2; В16Р10 клетки меланомы мышей, АТСС СКЬ-6475) высевали плотностью 5000 клеток/лунку (МСР7, Όυ145, Ηе^а-МаТи-А^К), 3000 клеток/лунку (ΝΟ-Η460, Ηе^а-МаТи, ВеЕ-а), или 1000 клеток/лунку (В16Р10) в 96-луночный мультититрационный планшет в 200 мкл их соответствующей питательной среды, дополненной 10% фетальной бычьей сывороткой. Через 24 ч в одном планшете (планшет нулевой точки) клетки окрашивали кристаллическим фиолетовым (см. ниже), тогда как среду других планшетов заменяли свежей культуральной средой (200 мкл), к которой добавляли исследуемые вещества в различных концентрациях (0 мкМ, в также в пределах 0,01-30 мкМ; конечная концентрация растворителя диметилсульфоксид составляла 0,5%). Клетки инкубировали в течение 4 дней в присутствии исследуемых веществ. Пролиферацию клеток определяли окрашиванием клеток кристаллическим фиолетовым: клетки фиксировали посредством добавления 20 мкл/точку измерения 11% раствора глутарового альдегида в течение 15 мин при комнатной температуре. После трех циклов промывания фиксированных клеток водой, планшеты высушивали при комнатной температуре. Клетки окрашивали посредством добавления 100 мкл/точку измерения 0,1% раствора кристаллического фиолетового (рН 3,0). После трех циклов промывания водой окрашенных клеток, планшеты высушивали при комнатной температуре. Краситель растворяли посредством добавления 100 мкл/точку измерения 10% раствора уксусной кислоты. Экстинкцию определяли при помощи фотометрии с длиной волны 595 нМ. Изменение количества клеток рассчитывали в процентах посредством нормализации измеренных значений к значениям экстинкции планшета нулевой точки (= 0%) и экстинкции необработанных (0 мкМ) клеток (= 100%). Значения 1С50 определяли с помощью 4-параметрической подгонки, с использованием собственного программного обеспечения компании.

Исследование киназы Мрз-1

Киназа Мрз-1 человека фосфорилирует биотинилированный субстратный пептид. Обнаружение фосфорилированного продукта достигают при помощи резонансного переноса энергии флуоресценции с временным разрешением (ТК-РКЕТ) от меченного европием анти-фосфо-Серин/Треонин антитела в качестве донора на меченный стрептавидином аллофикоцианин с поперечными связями (§А-ХЬеп1) в качестве акцептора. Соединения исследовали относительно их ингибирования киназной активности.

Использовали Ν-концевую С8Т-меченную полноразмерную рекомбинантную киназу Мрз-1 человека (приобретенную у 1пуйтодеп, Карслруэ, Германия, кат. № РУ4071). В качестве субстрата для киназной реакции применяли биотинилированный пептид с аминокислотной последовательностью ΡνΌΡΌΌΑΌΙТЕ1ЬС (С-конец в амидной форме, приобретенный у ВюзуйЪап СтЬК Берлин).

Для исследования 50 нл 100-кратно концентрированного раствора исследуемого соединения в ДМСО пипетировали в 384-луночный низкообъемный микротитрационный планшет черного цвета (Стешет Вю-Опе, Фрикенхаузен, Германия), добавляли 2 мкл раствора Мрз-1 в буфере для анализа [0,1 мМ натрий-орто-ванадат, 10 мМ МдС1₂, 2 мМ ОТТ, 25 мМ Мерез рΗ 7,7, 0,05% БСА, 0,001% ΡΕιίΌπία Р127], и смесь инкубировали в течение 15 мин. при 22°С, чтобы обеспечить предварительное связывание исследуемых соединений с Мрз-1 до начала киназной реакции. После этого начинали киназную реакцию посредством добавления 3 мкл раствора 16,7 аденозин-три-фосфата (АТФ, 16,7 мкМ => конечная конц. в 5 мкл анализируемого объема составляет 10 мкМ) и пептидного субстрата (1,67 мкМ => конечная конц. в 5 мкл анализируемого объема составляет 1 мкМ) в буфере для анализа, и полученную смесь инкубировали в течение реакционного времени 60 мин. при 22°С. Концентрацию Мрз-1 в анализе доводили для активности ферментативной партии и выбирали соответствующую для проведения анализа в линейном диапазоне, типичные концентрации фермента находились в пределах прибл. 1 нМ (конечная конц. в 5 мкл анализируемого объема). Реакцию останавливали посредством добавления 3 мкл раствора проявляющих реагентов ЧТКР (100 мМ Через рН 7,4, 0,1% БСА, 40 мМ ЕЧТА, 140 нМ Стрептавидин-ХЬеп! [# 61С8ТХЬВ, фирмы С1з Вют1етпа1юпа1, Магсои1е, Франция], 1,5 нМ анти-фосфо(8ет/ТЬт)-европийантитело [#ΑΌ0180, Ρе^к^пЕ1те^ ЬА§, Родгау-Югесхайм, Германия].

Полученную смесь инкубировали 1 ч при 22°С для обеспечения связывания фосфорилированного пептида с анти-фосфо (8ег/ТНт)-европий-антителом. Затем устанавливали количество фосфорилированного субстрата посредством измерения резонансного переноса энергии от меченного европием антифосфо(8ет/ТНт) антитела на Стрептавидин-ХЬеп!. Для этого измеряли эмиссию флуоресценции при 620 нм и 665 нм после возбуждения при 350 нм в считывающем устройстве У1е\у1и\ ТК-РКЕТ (ТегктЕНпег ЬА§, КобдаиЧидезкепч Германия). Нормализованное соотношение с контрольной поправкой (У1е\\'1и\ конкретное считывание данных, схожее с традиционным соотношением эмиссии при 665 нм и при 622 нм, в котором холостые и Еи-донорные перекрестные помехи отнимали от сигнала при 665 нм до вычисления соотношения) принимали за измеренное количество фосфорилированного субстрата. Данные нормализовали (ферментативная реакция без ингибитора = 0% ингибирования, все другие исследуемые компоненты, но без фермента = 100% ингибирования). Исследуемые соединения тестировали на одном и том же микротитрационном планшете в 10 различных концентрациях в пределах от 20 мкМ до 1 нМ (20 мкМ, 6,7 мкМ, 2,2 мкМ, 0,74 мкМ, 0,25 мкМ, 82 нМ, 27 нМ, 9,2 нМ, 3,1 нМ и 1 нМ, перед анализом готовили

- 37 028800 серийные разведения на уровне 100-кратной конц. маточных растворов при помощи серийных 1:3 разведений) в дублированных значениях для каждой концентрации и значения 1С50 рассчитывали с помощью подгонки по 4-м параметрам, используя программное обеспечение для внутреннего использования.

Таблица 1

Изучение контрольной точки сборки веретена

Контрольная точка сборки веретена обеспечивает правильное расхождение хромосом при митозе. При вхождении в митоз, хромосомы начинают конденсироваться, что сопровождается фосфорилированием гистона Н3 на серине 10. Дефосфорилирование гистона Н3 на серине 10 начинается в анафазе и заканчивается в ранней телофазе. Следовательно, фосфорилирование гистона Н3 на серине 10 можно использовать в качестве маркера клеток в митозе. Нокодазол представляет собой вещество, дестабилизирующее микротрубочки. Таким образом, нокодазол вмешивается в динамику микротрубочек и мобилизует контрольную точку сборки веретена. Клетки задерживаются в митозе на О2/М переходе и проявляют фосфорилированный гистон Н3 на серине 10. Ингибирование контрольной точки сборки веретена с помощью ингибиторов Мрз-1 аннулирует блокировку митоза в присутствии нокодазола, и клетки завершают митоз преждевременно. Это изменение обнаруживают путем уменьшения клеток с фосфорилированием гистона Н3 на серине 10. Это снижение используют в качестве маркера для определения способности соединений, предлагаемых в настоящем изобретении, вызывать митотический прорыв.

Культивируемые клетки клеточной линии опухоли шейки матки НеЬа человека (АТСС ССБ-2) высевали плотностью 2500 клеток/лунку в 384-луночный микротитрационный планшет на в 20 мкл среды Дульбекко (без фенолового красного, без пирувата натрия, с 1000 мг/мл глюкозы, с пиридоксином), дополненной 1% (об./об.) глутамина, 1% (об./об.) пенициллина, 1% (об./об.) стрептомицина и 10% (об./об.) фетальной бычьей сыворотки. После инкубации в течение ночи при 37°С, к клеткам добавляли 10 мкл/лунку нокодазола в конечной концентрации 0,1 мкг/мл. После инкубации в течение 24 ч, клетки задерживались на О2/М фазе прохождения клеточного цикла. Исследуемые соединения, солюбилизированные в диметилсульфоксиде (ДМСО), добавляли в различных концентрациях (0 мкМ, а также в пределах 0,005 мкМ - 10 мкМ; конечная концентрация растворителя ДМСО составляла 0,5% (об./об.)). Клетки инкубировали в течение 4 ч при 37°С в присутствии исследуемых соединений. После этого клетки фиксировали в 4% (об./об.) параформальдегиде в забуференном фосфатом физиологическом растворе (ФБР) при 4°С в течение ночи, затем пермеабилизировали в 0,1% (об./об.) Тгйоп X™ 100 в ФБР при комнатной температуре в течение 20 мин. и блокировали в 0,5% (об./об.) бычьем сывороточном альбумине (БСА) в ФБР при комнатной температуре в течение 15 мин. После промывания посредством ФБР, к клеткам добавляли 20 мкл/лунку раствора антитела (анти-фосфо-гистон Н3 клон 3Н10, Р!ТС; ир§1а!е, кат. № 16-222;

- 38 028800

1:200 разведение), которые инкубировали в течение 2 ч при комнатной температуре. После этого клетки промывали посредством ФБР и к клеткам добавляли 20 мкл/лунку раствора красителя НОЕСН8Т 33342 (5 мкг/мл) и клетки инкубировали 12 мин при комнатной температуре в темноте. Клетки промывали посредством ФБР, затем покрывали ФБР и хранили при 4°С до анализа. Изображения получали с помощью считывающего устройства Регкш Е1тег ОРЕКА™ Шдй-СоШеШ Лиа1у818 геабег. Изображения анализировали с помощью программного обеспечения для анализа изображений Ме1аХрге88™ от Мо1еси1аг беуюех. используя прикладной модуль Се11 Сус1е. В этом анализе измеряли и метку НОЕСН8Т 33342, и фосфорилированный гистон Н3 на серине 10. НОЕСН8Т 33342 метили ДНК и использовали для подсчета количества клеток. С помощью окрашивания фосфорилированного пистона Н3 на серине 10 определяли количества митотических клеток. Ингибирование Мр8-1 снижает количество митотических клеток в присутствии нокодазола, указывая на неправильное прохождение митоза. Необработанные данные анализа в дальнейшем анализировали с помощью логистического регрессивного анализа для 4-х параметров, чтобы определить значения 1С50 для каждого исследуемого соединения.

Исследование метаболической стабильности ίη νίίτο в гепатоцитах крыс (включая вычисление ίη νίνο печеночного клиренса крови (КЛ))

Гепатоциты крыс Нап ШЩаг выделяли при помощи метода 2-стадийной перфузии. После перфузии печень осторожно удаляли из крысы: капсулу печени вскрывали и гепатоциты аккуратно вытряхивали в чашу Петри с холодным как лед ШМЕ. Полученную суспензию клеток фильтровали сквозь стерильный газ в 50 мл пробирках фирмы Ра1соп и центрифугировали при 50 х д в течение 3 мин. при комнатной температуре. Сгусток клеток ресуспендировали в 30 мл ШМЕ и центрифугировали через градиент Регсо11 градиент для 2 раз при 100 х д. Гепатоциты промывали еще раз средой Уильямаса Е (ШМЕ) и ресуспендировали в среде, содержащей 5% ФТС. Жизнеспособность клеток определяли посредством вытеснения трипанового синего.

Для анализа метаболической стабильности клетки печени распределяли в ШМЕ, содержащей 5% ФТС, в стеклянных пробирках плотностью 1.0 х 10⁶ живые клетки/мл. Исследуемое соединение добавляли до конечной концентрации в 1 мкМ. Во время инкубации суспензии гепатоцитов непрерывно встряхивали и аликвоты собирали в 2, 8, 16, 30, 45 и 90 мин, к которым непосредственно добавляли равные объемы холодного метанола. Образцы замораживали при -20° С в течение ночи, после чего центрифугировали в течение 15 мин при 3000 об./мин., и надосадочную жидкость анализировали с помощью ВЭЖХсистемы ЛдЛей: 1200 с обнаружением ЖХМС/МС.

Полувыведение исследуемого соединения определяли из графика концентрация-время. Из полувыведения рассчитывали собственный клиренс. Вместе с дополнительными параметрами кровоток через печень, количество клеток печени ίη νί\Ό и ίη уйго. Подсчитывали печеночный ίη νί\Ό клиренс крови (КЛ) и максимальную пероральную биодоступность (Е_макс). Применяли следующие значения параметров: кровоток через печень - 4.2 л/ч/кг крысы; удельный вес печени - 32 г /кг вес тела крысы; клетки печени ίη щто- 1.1 х 10⁸ клеток/г печени, клетки печени ίη уйго - 0.5 х 10⁶/мл.

Определение ингибирующего потенциала на СУР3А4 человека

Потенциал исследуемого соединения действовать в качестве конкурентного ингибитора СУР3А4 оценивали в анализе ίη νίΐΐΌ, с использованием микросом печени человека и эталонного субстрата мидазолам. Исследуемое соединение растворяли в ацетонитриле. Для анализа применяли микросомальный препарат печени (пул МПЧ).

Маточный раствор исследуемого соединения добавляли к фосфатному буферу, содержащему ЕИТА, ΝΑΟί, глюкозо-6-фосфат, и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу. Эту смесь последовательно разбавляли на Сег1е:Й5 ШобсЛа^о!·! (Тесащ СгабкЕеш, ЕКО). После предварительного нагрева инициировали реакцию посредством добавления смеси из маркерного субстрата (мидазолам). В заключение, инкубационные смеси содержали микросомы печени человека с концентрацией белка в 60 мкг/мл, НАЭРНвоспроизводящую систему (1 сМ УАЭР, 5.0 мМ глюкозо- 6-фосфат, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу (1.5 ед./мл), 1.0 мМ ЕИТА, исследуемое соединение в 6 разных концентрациях, 2.5 мкМ мидазолама в качестве маркерного субстрата, и фосфатный буфер (50 мМ, рН 7.4) в общем объеме 200 мкл. Инкубацию осуществляли на Оеме^ ШогкЛайог! (Тесащ Сгаккеш, ЕКО) в 96-луночных планшетах (микротитрационный планшет, 96-луночный планшет) при 37°С. Маточный раствор маркерного субстрата приготавливали в воде (мидазолам 10 мМ). Кетоконазол применяли в качестве положительного контроля для ингибитора прямого действия. Эталонные образцы (субстрат, но без ингибитора) инкубировали в шести параллельных опытах и содержали одинаковое количество растворителя, как и исследуемые инкубации. Реакции останавливали посредством добавления 100 мкл ацетонитрила, содержащего внутренний стандарт. Осажденные белки удаляли центрифугированием луночного планшета, надосадочные жидкости анализировали с помощью ЖХ-МС/МС.

Опосредованную СУР3А4 метаболическую активность в присутствии исследуемого соединения выражали как процентные соотношения соответствующих эталонных значений. Сигмообразная кривая была согласована с данными для подсчета параметра ферментативного ингибирования 1С50 с использованием нелинейного регрессионного анализа методом наименьших квадратов участка процентного кон- 39 028800 троля активности по сравнению с концентрацией испытуемого ингибитора. Наблюдая менее 50% ингибирование, данные не были экстраполированы; следовательно, 1С50 были представлены как составляющие больше, чем самая высокая концентрация применяемого испытуемого соединения.

Соединения А26, А27 и А28 характеризуются: активностью в анализе контрольной точки сборки веретена < 1.0 нМ, активностью в анализе на пролиферацию с клетками НеЬа < 25 нМ, метаболической стабильностью ΐη νΐΐΓΟ в гепатоцитах крыс Е_макс > 39%, и ингибированием фермента печени СУР3А4 > 5 мкМ.

В табл. 2, 3, 4, 5 и 6 сравнивают метаболическую стабильность ΐη νΐΐΓΟ в гепатоцитах крыс, выраженную как печеночный клиренс крови ΐη νίνο (ЮТ) и максимальную пероральную биодосупность (Е_макс) для трех наборов соединений.

Таблица 2

Таблица 3

Таблица 4

	ΝΗ 0 ь	ΝΗ 1 ν'ν1 0 ь	ΝΗ Ρ-\χ4,'Ν-/ 0 ь	А'1'	У
Пример	Сравнительный пример 3	Соединение А5	Соединение А6	Соединение А24	Соединение А25
Рмакс [%]	43	49	70	48	52
К Л [л/ч/кг]	2.4	2.1	1.3	2.2	2.0

- 40 028800

Таблица 5

Таблица 6

В табл. 7 представлен перечень печеночного ίπ у1уо клиренса крови и максимальной пероральной биодоступности дополнительных соединений.

Таблица 7

Пример	рмакс [%]	КЛ [л/ч/кг]
А11	45	2.3
А12	67	1.4
А14	51	2.1
А15	53	2.0
А17	50	2.1
А18	76	1.0
А22	28	3.0
А23	40	2.5

Противоопухолевая эффективность т У1уо ингибиторов киназы Мрк-1 в соответствии с настоящим изобретением в комбинации с Паклитакселом в модели А2780с1к рака яичников человека у бестимусных мышей

Действие комбинированного лечения ингибитора киназы Мрк-1 в соответствии с настоящим изобретением и Паклитаксела изучали в адаптационной устойчивой к цисплатину и устойчивой к Паклитакселу ксенотрансплантатной модели А2780с1к. Соединение А27 вводили перорально в дозах, близких к оптимальным (40% и 60% от МПД) в комбинации в схеме приёма препарата с перерывами дважды в сутки (2 дня приема/ 5 дней перерыв). Паклитаксел вводили внутривенно один раз в неделю в его соответствующей МПД (максимально переносимой дозе), несмотря на то, что дозу снижали с 19 после инокуляции опухоли до 75% от МПД, из-за неожиданного высокого ответа на Паклитаксел. Вес тела животного и размер опухоли определяли три раза в неделю. Лечение всех групп начинали при размере опухоли в 29 мм², на 6 день после инокуляции опухолевых клеток. Для комбинированного лечения соединение А27 и Паклитаксел вводят в один и тот же день в течение промежутка времени 4 ч. Контрольных животных и группу с монотерапией Соединением А27 лечили в течение 15 дней. Животных, которым вводили Паклитаксел в качестве монотерапии и группы с комбинированным лечением Паклитаксел/Соединение А27 лечили в течение 33 дней. В конце исследования после одного конечного лечения отбирали пробы плазмы и опухолей для РК анализа и определяли конечный вес опухоли.

При монотерапии соединением А27 не достигали или достигали слабой эффективности через 15 дней лечения при квазиоптимальной (40 и 60% МПД) дозе с 2 или 3 мг/кг дважды в сутки в течение 2

- 41 028800 дней приема / 5 дней перерыва перорально, добиваясь Л/К_вес в 0.98 или 0.88 и соответственно относительной Л/К_{площадь} в 1.00 или 0.90 (табл. 8).

Как с монотерапией Паклитакселом при его МПД/75% МПД (20/15 мг/кг), который вводили 1 день приема/ 6 дней перерыв внутривенно, так и с комбинированной терапией паклитакселом с соединением А27, в дозе при 40 и 60% от его МПД с 2 мг/кг и 3 мг/кг дважды в сутки перорально (через рот, через ротовую полость, орально)) в течение 2 дней приема/ 5 дней перерыва, достигали сравнительно статистически значительного уменьшения размера опухоли по сравнению с контрольной группой, которая принимала лекарственную основу, после 15 дней лечения, показывая относительную Л/Кплощадь между 0.04 и 0.07. Монотерапию Паклитакселом и лечение групп, с комбинированной терапией Паклитаксел/Соединение А27 проводили в течение еще 18 дней. После 33 дней лечения статистически значительного улучшения монотерапией Паклитакселом эффективности достигали в группе комбинированного лечения с Паклитаксел/Соединение А27 3 мг/кг дважды в сутки перорально 2 дня приема/ 5 дней перерыва. Несмотря на то что прогрессирование заболевания наблюдали в обеих группах с монотерапией Паклитакселом и с комбинированным лечением Паклитаксел/Соединение А27, явную задержку роста опухоли при комбинированном лечении по сравнению с монотерапией Паклитакселом наблюдали в Α2780οίδ опухоли яичников (табл. 8).

В группе с прерывающейся монотерапией при 3 мг/кг дважды в сутки происходила промежуточная потеря веса тела. В группе прерывающегося комбинированного лечения с 3 мг/кг дважды в сутки Паклитаксела проявлялась токсичность на 10 и 12 дни (гибель 2 из 10). В общем, переносимость лечения была приемлемой (табл. 8).

В итоге, данное исследование показывает кооперативный эффект ингибитора киназы Мр§-1 Соединения А27 и Паклитаксела в модели Α2780οίδ с по сути резистентной к Паклитакселу карциномой яичников, добиваясь значительного замедления роста опухоли по сравнению с монотерапией Паклитакселом.

Таблица 8. Противоопухолевая эффективность ингибитора киназы Мр§-1 в комбинации с Паклитакселом у Α2780οίδ ксенотрансплантатных бестимусных мышей

Ксенотрансплантатная модель А2780С18 рака яичников у человека
Соединение	Доза и режим	Л/Ка площадь	л/ка вес	Макс, потеря веса тела6 (%)	Фатальная токсичность
Основа ИЭГ400 / Этанол / δοϊυίοΐ 70:5:25 + кремофор 5 % / Этанол 5 % / солян. раствор 90 %	10 мл/кг 2ОС 2 прием/5 перерыв перорально + 10 мл/кг ОС 1 прием/6 перерыв внутривенно	1.00	1.00		0/10
Соединение А27	2 мг/кг 2ОС 2 прием/5 перерыв перорально	1.00	0.98	-5.2	0/10
Соединение А27	3 мг/кг 2ОС 2 прием/5 перерыв перорально	0.90	0.88	-11.1	0/10
Паклитаксел	20/15 (ά 19) мг/кг ОС 2 прием/6 перерыв внутривенно	0.06#	-	-0.7	0/10
Соединение А27 + Паклитаксел	2 мг/кг 2ОС 2 прием/5 перерыв перорально + 20/15 (άΐ9) мг/кг ОС 1 прием/6 перерыв внутривенно	0.04#	-	-4.1	0/10
Соединение А27 + Паклитаксел	3 мг/кг 2ОС 2 прием/5 перерыв перорально + 20/15 (¢119) мг/кг ОС 1 прием/6 перерыв внутривенно	0.07#,##		-8.6	2/10

# Р<0.05 (по сравнению с группой, принимающей лекарственную основу в день окончания лечения группы с лекарственной основой) ## Р<0.05 (по сравнению с группой, принимающей Паклитаксел в конце исследования)

а) Л/К= лечение/контрольное соотношение, рассчитанное из относительной средней площади опухоли при контрольном прекращении дозы [(площадь опухоли группы лечения при прекращении дозы) - (площадь опухоли группы лечения в день до первого лечения)] или средний конечный вес опухоли.

б) потеря веса тела: максимальная средняя потеря веса, выраженная как процент начального веса животного. Потерю веса больше чем на 20% рассматривают как токсическую.

ОС = один раз в сутки

2ОС = 2 раза в сутки

ПЭГ 400 = полиэтиленгликоль со средним молекулярным весом 400 кремофор = полиэтоксилированное касторовое масло

- 42 028800

Противоопухолевая эффективность ίη νίνο ннгнбнторов кнназы Мр8-1 в соответствии с настоящим изобретением в комбинации с Паклитакселом в N0-41299 модели НМККЛ человека у бестнмусных мышей

Эффективность комбинированной терапнн ннгнбнтора кнназы Мр8-1 в соответствии с настоящим изобретением н паклитаксела нсследовалн в ксенотрансплантатной модели NСI-Н1299 по сутн резистентной к таксану карциномы легкнх человека (НМККЛ) у бестнмусных мышей. Соединение А27 применяли перорально прн квазноптнмальных дозах (40% н 60% от МПД) в комбинации в режиме прнема дважды в суткн с перерывами (2 дня прнема/ 5 дней перерыв). Паклитаксел применяли внутривенно один раз в неделю в его соответствующей МПД, несмотря на то, что дозу снижали с 24 дня после ннокуляцнн опухоли на 75% от МПД, нз-за неожиданно высокого ответа на паклитаксел. Вещества приготавливали в оптимальных лекарственных основах для получения растворов. Вес тела животного н размер опухоли определяли трн раза в неделю. Лечение всех групп начинали прн размере опухоли в 30 мм², на 8 день после ннокуляцнн опухолевых клеток. Для комбинированного лечения Соединение А27 н паклитаксел применяли в тот же самый день в пределах временного промежутка в 4 ч. Контрольных животных н группы с монотерапней Соединением А27 лечнлн в течение 22 дней. Животных с монотерапней паклитакселом н группы с комбинированным лечением паклнтаксел/Соеднненне А27 лечнлн в течение 36 дней. В конце исследования после одного конечного лечения отбирали пробы плазмы н опухолей для РК анализа н определяли конечный вес опухоли.

При монотерапии соединением А27 не достигали или достигали слабой эффективности через 22 дня при квазиоптимальной (40% и 60% МПД) дозе с 2 мг/кг или 3 мг/кг дважды в сутки в течение 2 дней прнема / 5 дней перерыва перорально, добиваясь Л/К_вес в 1.18 нлн 0.74 н соответственно относительной Л/К_{площадь} в 0.99 нлн 0.75 (табл. 9).

Как с монотерапней паклитакселом прн его МПД/75% МПД (20/15 мг/кг) прнеме в режиме 1 день приема/ 6 дней перерыва внутривенно, так и с комбинированной терапией паклитакселом с соединением А27, в дозе при 40% и 60% от его МПД с 2 мг/кг и 3 мг/кг дважды в сутки перорально в течение 2 дней приема/ 5 дней перерыва, достигали статистически существенного уменьшения размера опухоли, по сравнению с контрольной группой, которую лечили лекарственной основой через 22 дня лечения, показывая для одного паклитаксела относительную Л/К_{площадь} 0,13 н соответственно для комбинации паклнтаксел с соединением А27 при 2 мг/кг или 3 мг/кг дважды в сутки перорально в течение дней приема/ 5 дней перерыва относительную Л/К_{площадь} 0.01 н -0.03. Группу с монотерапней паклитакселом н группу с комбинированной терапией паклнтаксел/соеднненне А27 лечнлн в течение еще 14 дней. После 36 дней лечения статистически значительного улучшения от монотерапии паклитакселом достигали эффективности в группе с комбинированным лечением Паклитаксел/Соединение А27 3 мг/кг дважды в сутки перорально 2 дней прнема/ 5 дней перерыва. Прогрессирование наблюдали в группе с монотерапней паклнтакселом, принимая во внимание, что группы с комбинированным лечением Паклитаксел/Соединение А27 показывали явные признаки стабилизации болезни посредством индукции стагнации роста опухоли, в особенности в группе с приемом Паклитаксел/Соединение А27 3 мг/кг дважды в сутки перорально 2 дней прнема/ 5 дней перерыва, в N0-41299 опухолевых клетках НМККЛ (табл. 9).

В группах с комбинированным прерывающимся лечением паклитакселом при 2 мг/кг и 3 мг/кг дважды в сутки токсичность возникала на 14 день (гибель 2 из 10) и 11, 14 и 15 дни (гибель 3 из 10) соответственно. В общем, переносимость лечения была приемлемой (табл. 9).

В итоге, исследование показывает кооперативный эффект ннгнбнтора кнназы Мр8-1 Соединения А27 н паклитаксела в по сутн резистентной к паклитакселу НМККЛ модели ΝΟ-41299. добиваясь значительного улучшения эффективности монотерапнн паклитакселом, вызывая стабилизацию заболевания.

- 43 028800

Таблица 9. Противоопухолевая эффективность ингибитора киназы Мр§-1 в комбинации с паклитакселом в ксенотрансплантатах N0-41299 у бестимусных мышей

Ксенострансплантатная 1ЧС1-Н1299 модель НМККЛ человека
Соединение	Доза и режим	Л/Ка площадь	л/ка масса	Макс. Потеря массы тела6 (%)	Фатальная токсичность
Основа ПЭГ400 / Этанол / 8о1и1о1 70:5:25 + кремофор 5 % / Этанол 5 % /солян. раствор 90 %	10 мл/кг 2ОС 2 прием/5 перерыв перорально + 10 мл/кг ОС 1 прием/6 перерыв внутривенно	1.00	1.00	-0.6	0/10
Соединение А27	2 мг/кг 2ОС 2 прием/5 перерыв перорально	0.98	1.18	-5.5	0/10
Соединение А27	3 мг/кг 2ОС 2 прием/5 перерыв перорально	0.64	0.74	-15.5	0/10
Паклитаксел	20/15 (419) мг/кг ОС 2 прием/6 перерыв внутривенно	0,13#	- I	-1.9	0/10
Соединение А27 + Паклитаксел	2 мг/кг 2ОС 2 прием/5 перерыв перорально + 20/15 (419) мг/кг ОС 1 прием/6 перерыв внутривенно	0.01#	-	-5.0	2/10
Соединение А27 + Паклитаксел	3 мг/кг 2ОС 2 прием/5 перерыв перорально + 20/15 (419) мг/кг ОС 1 прием/6 перерыв внутривенно	-0.03°	-	-9.9	3/10

# Р<0.05 (по сравнению с группой, принимающей лекарственную основу в день окончания лечения группы с лекарственной основой) ^## Р<0.05 (по сравнению с группой, принимающей Паклитаксел в конце исследования) а) Л/К= лечение/ контрольное соотношение, рассчитанное из относительной средней площади опухоли при контрольном прекращении дозы [(площадь опухоли группы лечения при прекращении дозы) - (площадь опухоли группы лечения в день до первого лечения)] или средний конечный вес опухоли.

б) потеря веса тела: максимальная средняя потеря веса, выраженная как процент начального веса животного. Потерю веса больше чем на 20% рассматривают как токсическую.

Противоопухолевая эффективность ΐπ νινο ингибитора киназы Мр§-1 в комбинации с Доцетакселом в ΝΟ-41299 модели НМККЛ человека у бестимусных мышей

Эффективность комбинированного лечения ингибитором киназы Мр§-1 доцетакселом, другим активирующим КТСВ, дестабилизирующим микротрубочки, противомитотическим средством, применяемым в качестве стандартного лечения у пациентов с НМККЛ, исследовали в ксенотрансплантатной модели у бестимусных мышей ΝΟ-41299 по существу резистентной к таксану карциномы легких человека (НМККЛ).

Ингибитор киназы Мр§-1 применяли перорально в квазиоптимальных дозах (80% от МПД) в оптимизированном дважды в сутки прерывистом (2 дней приема/ 5 дней перерыва) режиме приема в комбинации с доцетакселом. Доцетаксел применяли внутривенно один раз в неделю в его соответствующей МПД. Вещества приготавливали в оптимальных лекарственных основах для получения растворов. Вес тела животного и размер опухоли определяли два раза в неделю. Лечение всех групп начинали при размере опухоли в 28 мм², на 10 день после инокуляции опухолевых клеток. Для комбинированного лечения ингибитор киназы Мр§-1 и доцетаксел применяли в тот же самый день в пределах временного промежутка в 4 ч. Контрольных животных и группу с монотерапией Мр8-ингибитором лечили в течение 20 дней. Животных с монотерапией доцетакселом и группы с комбинированным лечением доцетаксел/ ингибитор киназы Мрз-1 лечили в течение 42 дней. В конце исследования после одного конечного лечения отбирали пробы плазмы и опухолей для РК анализа и определяли конечный вес опухоли.

Противоопухолевая эффективность ΐπ νινο ингибитора киназы Мр§-1 в комбинации с паклитакселом в модели МЭА-МВ 231 трижды негативного рака молочной железы человека у бестимусных мышей

Эффективность комбинированного лечения ингибитором киназы Мр§-1 и паклитакселом исследовали в ксенотрансплантатной модели у бестимусных мышей МИА-МВ 231 трижды негативного рака человека (отсутствие экспрессии Нег2/пеи, прогестеронового рецептора, эстрогенового рецептора).

Ингибитор киназы Мр§-1 применяли перорально в квазиоптимальных дозах (40% от МПД) в оптимизированном дважды в сутки прерывистом (2 дня приема/ 5 дней перерыва) режиме приема в комбинации с паклитакселом. Паклитаксел применяли внутривенно один раз в неделю в его соответствующей МПД. Вещества приготавливали в оптимальных лекарственных основах для получения растворов. Вес

- 44 028800 тела животного и размер опухоли определяли три раза в неделю. Лечение всех групп начинали при размере опухоли в 27 мм², на 24 день после инокуляции опухолевых клеток. Для комбинированного лечения ингибитор киназы Мр8-1 и паклитаксел применяли в тот же самый день в пределах временного промежутка в 4 ч. Контрольных животных и группу с монотерапией (только ингибитор киназы Мр8-1) лечили в течение 28 дней. Животных с монотерапией паклитакселом и группы с комбинированным лечением паклитаксел/ингибитор киназы Мр8-1 лечили в течение 50 дней. В конце исследования после одного конечного лечения отбирали пробы плазмы и опухолей для ΡΚ анализа и определяли конечный вес опухоли.

Комбинация ингибитора киназы Мр8-1 с паклитакселом в модели МКШ рака желудочно-кишечного тракта человека

Эффективность комбинированного лечения Соединения А27 с паклитакселом можно исследовать в чувствительной к таксану модели МКЫ1 карциномы желудка человека у бестимусных мышей. Соединение А27 можно вводить перорально в 2ОС прерывистом (2 дня приема / 5 дней перерыв) режиме приема до соответствующей МПД при лечении одним средством и в дозе 40% от МПД одного средства в комбинации. Паклитаксел можно вводить внутривенно Ο\ν (один раз в неделю (имеется в виду курс лечения 1 день приема / 6 дней перерыва)) в его соответствующей МПД. Лечение всех групп можно начинать на 7 день после инокуляции опухолевых клеток. Для комбинированного лечения, Соединение А27 и паклитаксел можно вводить в тот же самый день в течение промежутка времени в 4 ч. Контрольных животных и группы с лечением Соединением А27 в качестве единственного средства можно лечить в течение 40 дней. Животных с лечением паклитакселом в качестве единственного средства и группы комбинированного лечения с

Соединением А27 с паклитакселом можно лечить в течение 78 дней. Лечение контрольной группы с приемом лекарственной основы и группы с Соединением А27 в качестве единственного средства должно быть прекращено до достижения максимума площади опухоли из-за связанной с опухолью МКШ кахексией, вызванной критической потерей веса тела и токсичностью.

В итоге, данное исследование должно показать кооперативный эффект ингибитора киназы Мр§-1 и паклитаксела в модели МКШ с чувствительной к паклитакселу карциномой желудка.

Комбинация ингибитора киназы Мр§-1 с винкристином в модели М1аРаСа2 опухоли поджелудочной железы человека

Эффективность и переносимость ингибитора киназы Мр§-1 Соединения А27 в комбинации с Паклитакселом можно оценить в модели М1аРаСа2 опухоли поджелудочной железы человека, ксенотрансплантированной в бестимусных мышей.

Клетки М1аРаСа2, полученные из клеточной культуры могут быть имплантированы подкожно в паховую область самок бестимусных мышей. Лечение может быть начато, когда опухоль достигла размера 30-40 мм². Площадь опухоли можно определить при помощи измерений кронциркулем два раза в неделю. Группы лечения могут получать:

1) лекарственная основа, ПЭГ400/Этанол/8о1и1о1 (70:5:25), дважды в сут. 2 прием/5 перерыв перорально,

2) соединение А27, 0.45 мг/кг дважды в сут. 2 прием/5 перерыв перорально,

3) соединение А27, 0.6 мг/кг дважды в сут. 2 прием/5 перерыв перорально,

4) паклитаксел, 24.0 мг/кг внутривенно один раз в сут. 1 прием/6 перерыв,

5) соединение А27, 0.45 мг/кг дважды в сут. 2 прием/5 перерыв перорально+ Паклитаксел, 24.0 мг/кг внутривенно один раз в сут. 1 прием/6 перерыв,

6) соединение А27, 0.6 мг/кг дважды в сут. 2 прием/5 перерыв перорально+ Паклитаксел, 24.0 мг/кг внутривенно один раз в сут. 1 прием/6 перерыв.

В итоге, могут быть продемонстрированы значительные улучшения ингибирования роста опухоли при помощи комбинации Паклитаксела в МПД с низкой дозой Соединения А27 при хорошей переносимости по сравнению с монотерапией Паклитакселом в модели опухоли поджелудочной железы М1аРаСа2, наполовину чувствительной к Таксану.

Комбинация ингибитора киназы Мр§-1 с винкристином в модели И87 МС глиобластомы человека

Зависящие от дозы, ингибирующие опухоль эффекты Соединения А27 отдельно или в комбинации с винкристином можно исследовать в модели И87 МС глиобластомы человека, ксенотрансплантированной в бестимусных мышей.

Исследование предназначено для определения ответа данной модели глиобластомы на лечение при помощи исследуемого Соединения А27 и винкристина, и то и другой в фиксированной дозе, и винкристина в комбинации с двумя разными дозами, обе из которых являются ниже, чем доза Соединения А27, применяемого в курсе лечения в ходе монотерапии. Размер глиобластомы может быть использован в качестве параметра считывания для ответа.

Культуры клеток, полученные от ксенотрансплантата человека И87 МС, могут быть вызваны путем трансплантации опухолевых клеток в левое полушарие головного мозга мыши. Лечение может быть осуществлено в ходе трех циклов между 3 и 19 днями. Мышей можно умертвить на 24 день, головной мозг извлечь и подвергнуть шоковой заморозке в 2 метилбутане. Размер опухоли может быть определен

- 45 028800 как мера для ингибирования роста опухоли из криосрезов после окрашивания.

В итоге, комбинация Соединения А27 с винкристином приводит к значительному ингибированию роста опухоли в человеческом ксенотрансплантате мыши И87- ΜΟ, которая должна быть лучше, чем лечение только единственными лекарственными препаратами. Лечение может сопровождаться тяжелой желудочно-кишечной токсичностью, которая, скорее всего, вызвана непереносимостью лекарственной основы.

Claims (14)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Комбинация для лечения рака, содержащая соединение А, выбранное из ^циклопропил-4-{6-[1 -(3 -фтор-4-метоксифенил)этенил] -8-[(3,3,3-трифторпропил)амино]имидазо [ 1,2-Ь]пиридазин-3 -ил}-2-метилбензамида, ^циклопропил-4-{6-[дифтор-(3-фтор-4-метоксифенил)метил]-8-[(3,3,3-трифторпропил)амино]имидазо [ 1,2-Ь]пиридазин-3 -ил} -2-метилбензамида, (КЗ)-^циклопропил-4-{6-[(3-фтор-2-гидроксифенил)(гидрокси)метил]-8-[(3,3,3-трифторпропил)амино]имидазо [ 1,2-Ь]пиридазин-3 -ил}-2-метилбензамида, (К)-^циклопропил-4-{6-[(3-фтор-2-гидроксифенил)(гидрокси)метил]-8-[(3,3,3-трифторпропил)амино]имидазо[1,2-Ь]пиридазин-3-ил}-2-метилбензамида, (З)^-циклопропил-4-{6-[(3-фтор-2-гидроксифенил)(гидрокси)метил]-8-[(3,3,3-трифторпропил)амино]имидазо[1,2-Ь]пиридазин-3-ил}-2-метилбензамида, (КЗ)-^циклопропил-4-{6-[1-(3-фтор-2-гидроксифенил)-1-гидроксиэтил]-8-[(3,3,3-трифторпропил)амино]имидазо[1,2-Ь]пиридазин-3-ил}-2-метилбензамида, (К)-^циклопропил-4-{6-[1-(3-фтор-2-гидроксифенил)-1-гидроксиэтил]-8-[(3,3,3-трифторпропил)амино]имидазо[1,2-Ь]пиридазин-3-ил}-2-метилбензамида, (З)^-циклопропил-4-{6-[1-(3-фтор-2-гидроксифенил)-1-гидроксиэтил]-8-[(3,3,3-трифторпропил)амино]имидазо[1,2-Ь]пиридазин-3-ил}-2-метилбензамида, (КЗ)-^циклопропил-4-{6-[фтор-(3-фторфенил)метил]-8-[(3,3,3-трифторпропил)амино]имидазо[1,2Ь]пиридазин-3-ил}-2-метилбензамида, (К)-^циклопропил-4-{6-[фтор-(3-фторфенил)метил]-8-[(3,3,3-трифторпропил)амино]имидазо[1,2Ь]пиридазин-3-ил}-2-метилбензамида, (З)^-циклопропил-4-{6-[фтор-(3-фторфенил)метил]-8-[(3,3,3-трифторпропил)амино]имидазо[1,2Ь]пиридазин-3-ил}-2-метилбензамида, ^циклопропил-4-{6-[дифтор-(3 -фторфенил)метил] -8-[(3,3,3-трифторпропил)амино]имидазо [1,2Ь]пиридазин-3-ил}-2-метилбензамида, ^циклопропил-4-{6-(3-метоксибензоил)-8-[(3,3,3-трифторпропил)амино]имидазо[1,2-Ь]пиридазин3-ил}-2-метилбензамида, ^циклопропил-4-{6-[1-(3-метоксифенил)винил]-8-[(3,3,3-трифторпропил)амино]имидазо[1,2-Ь]пиридазин-3 -ил} -2-метилбензамида, ^циклопропил-4-{6-(4-метоксибензоил)-8-[(3,3,3-трифторпропил)амино]имидазо[1,2-Ь]пиридазин3 -ил } -2 -метилбензамида, ^циклопропил-4-{6-[1-(4-метоксифенил)винил]-8-[(3,3,3-трифторпропил)амино]имидазо[1,2-Ь]пиридазин-3 -ил} -2-метилбензамида, ^циклопропил-4-{6-[(2,5-дифторфенил)(гидрокси)метил]-8-[(3,3,3-трифторпропил)амино]имидазо [ 1,2-Ь]пиридазин-3 -ил}-2-метилбензамида, ^циклопропил-4-{6-(2,5-дифторбензоил)-8-[(3,3,3-трифторпропил)амино]имидазо[1,2-Ь]пиридазин-3 -ил} -2 -метилбензамида, ^циклопропил-4-{6-(3-фтор-4-метоксибензоил)-8-[(3,3,3-трифторпропил)амино]имидазо[1,2-Ь]пиридазин-3 -ил} -2-метилбензамида, ^циклопропил-4-{6-(2,3-дифторбензоил)-8-[(3,3,3-трифторпропил)амино]имидазо[1,2-Ь]пиридазин-3 -ил} -2 -метилбензамида, ^циклопропил-4-{6-[1-(2,3-дифторфенил)винил]-8-[(3,3,3-трифторпропил)амино]имидазо[1,2Ь ] пиридазин-3 -ил}-2 -метилбензамида, ^циклопропил-4-{6-[дифтор-(4-метоксифенил)метил]-8-[(3,3,3-трифторпропил)амино]имидазо [ 1,2-Ь]пиридазин-3 -ил}-2-метилбензамида, ^циклопропил-4-{6-[1 -(2,3-дифторфенил)циклопропил] -8-[(3,3,3-трифторпропил)амино]имидазо [ 1,2-Ь]пиридазин-3 -ил}-2-метилбензамида, ^циклопропил-4-{6-[(2,3-дифторфенил)(дифтор)метил]-8-[(3,3,3-трифторпропил)амино]имидазо [ 1,2-Ь]пиридазин-3 -ил}-2-метилбензамида, ^циклопропил-4-{6-[1-(2,5-дифторфенил)винил]-8-[(3,3,3-трифторпропил)амино]имидазо[1,2Ь ] пиридазин-3 -ил}-2 -метилбензамида, ^циклопропил-4-{6-[1-(2,5-дифторфенил)циклопропил]-8-[(3,3,3-трифторпропил)амино]имида- 46 028800 зо [ 1,2-Ь]пиридазин-3 -ил}-2-метилбензамида,

   М-циклопропил-4-{6-[(2,5-дифторфенил)(дифтор)метил]-8-[(3,3,3-трифторпропил)амино]имидазо [ 1,2-Ь]пиридазин-3 -ил}-2-метилбензамида,

   М-циклопропил-4-{6-[1-(5-фтор-2-гидроксифенил)этенил]-8-[(3,3,3-трифторпропил)амино]имидазо [ 1,2-Ь]пиридазин-3 -ил}-2-метилбензамида,

   М-циклопропил-4-{6-[1 -(5-фтор-2-гидроксифенил)циклопропил] -8-[(3,3,3-трифторпропил)амино] имидазо [1,2-Ь]пиридазин-3 -ил} -2 -метилбензамида,

   М-циклопропил-4-{6-(3-фтор-4-метоксифенокси)-8-[(оксетан-3-илметил)амино]имидазо[1,2-Ь]пиридазин-3 -ил} -2-метилбензамида,

   Ы-циклопропил-4-{6-(2,3-дифтор-4-метоксифенокси)-8-[(3,3,3-трифторпропил)амино]имидазо[1,2Ь]пиридазин-3-ил}-2-метилбензамида и

   Ы-циклопропил-4-{6-(2,3-дифтор-4-метоксифенокси)-8-[(тетрагидро-2Н-пиран-4-илметил)амино] имидазо [1,2-Ь] пиридазин-3 -ил} -2 -метилбензамида или их Ν-оксида, гидрата, сольвата или соли, и митотический ингибитор, выбранный из доцетаксела и паклитаксела.
2. 2. Комбинация по п.1, в которой соединение А выбрано из ^циклопропил-4-{6-[1 -(5-фтор-2-гидроксифенил)циклопропил] -8-[(3,3,3-трифторпропил)амино] имидазо [1,2-Ь] пиридазин-3 -ил} -2 -метилбензамида, ^циклопропил-4-{6-(3-фтор-4-метоксифенокси)-8-[(оксетан-3-илметил)амино]имидазо[1,2-Ь]пиридазин-3 -ил} -2-метилбензамида, ^циклопропил-4-{6-(2,3-дифтор-4-метоксифенокси)-8-[(3,3,3-трифторпропил)амино]имидазо[1,2Ь ] пиридазин-3 -ил}-2 -метилбензамида и ^циклопропил-4-{6-(2,3-дифтор-4-метоксифенокси)-8-[(тетрагидро-2Н-пиран-4-илметил)амино] имидазо [1,2-Ь] пиридазин-3 -ил} -2 -метилбензамида или их Ν-оксида, гидрата, сольвата или соли, или их смеси.
3. 3. Комбинация по п.1 или 2, в которой соединение А представляет собой ^циклопропил-4-{6-[1-(5фтор-2-гидроксифенил)циклопропил] -8-[(3,3,3-трифторпропил)амино]имидазо [ 1,2-Ь]пиридазин-3 -ил} -2метилбензамид или его Ν-оксид, гидрат, сольват или соль.
4. 4. Комбинация по п.1 или 2, в которой соединение А представляет собой ^циклопропил-4-{6-(3фтор-4-метоксифенокси)-8-[(оксетан-3-илметил)амино]имидазо[1,2-Ь]пиридазин-3-ил}-2-метилбензамид или его Ν-оксид, гидрат, сольват или соль.
5. 5. Комбинация по п.1 или 2, в которой соединение А представляет собой ^циклопропил-4-{6-(2,3дифтор-4-метоксифенокси)-8-[(3,3,3-трифторпропил)амино]имидазо [ 1,2-Ь]пиридазин-3 -ил} -2-метилбензамид или его Ν-оксид, гидрат, сольват или соль.
6. 6. Комбинация по п.1 или 2, в которой соединение А представляет собой ^циклопропил-4-{6-(2,3дифтор-4-метоксифенокси)-8-[(тетрагидро-2Н-пиран-4-илметил)амино]имидазо[1,2-Ь]пиридазин-3-ил}2-метилбензамид или его Ν-оксид, гидрат, сольват или соль.
7. 7. Комбинация по любому из пп.1-6, дополнительно содержащая цисплатин.
8. 8. Комбинация по любому из пп.1-7, предназначенная для лечения или профилактики рака поджелудочной железы, глиобластомы, рака яичников, немелкоклеточной карциномы легких, рака молочной железы и/или рака желудочно-кишечного тракта.
9. 9. Применение комбинации по любому из пп.1-7 для приготовления лекарственного средства для лечения или профилактики рака поджелудочной железы, глиобластомы, рака яичников, немелкоклеточной карциномы легких, рака молочной железы и/или рака желудочно-кишечного тракта.
10. 10. Способ лечения или профилактики рака поджелудочной железы, глиобластомы, рака яичников, немелкоклеточной карциномы легких, рака молочной железы и/или рака желудочно-кишечного тракта у субъекта, включающий в себя введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества комбинации по любому из пп.1-7.
11. 11. Набор, содержащий комбинацию для лечения рака, содержащую компонент А, который представляет собой соединение А, как оно определено в п.1; и компонент В, который представляет собой митотический ингибитор, выбранный из доцетаксела и паклитаксела.
12. 12. Набор по п.11, который также содержит одно или большее количество дополнительных фармацевтических средств С.
13. 13. Набор по п.12, в котором необязательное фармацевтическое средство С представляет собой цисплатин.
14. 14. Набор по п.11, в котором необязательно все или любой из указанных компонентов А и В находятся в виде фармацевтического состава, который уже готов к применению для введения одновременно, параллельно, отдельно или последовательно.