ES2473597T3 - Derivados de 2-indolil imidazo[4,5-d]fenantrolina y su uso en el tratamiento del cáncer - Google Patents

Abstract

Un compuesto de fórmula (I):**Fórmula** o una sal del mismo. en la que: R1, R3, R4, R5, y R7 son hidrógeno R2 es halógeno, y . R6 es alquilo C1-C4.

Description

Derivados de 2-indolil imidazo[4,5-d]fenantrolina y su uso en el tratamiento del cáncer

Campo de la invención

La presente invención se refiere al campo de las terapias del cáncer y, en particular, al uso de derivados de 2-indolil imidazo[4,5-d]fenantrolina en el tratamiento del cáncer.

Antecedentes de la invención

Se han desarrollado quelantes de metales para el tratamiento de enfermedades causadas por sobrecarga de metales. Más recientemente, sin embargo, los compuestos capaces de quelar hierro se est�n estudiando como potenciales terapias anticancerosas, ya que el hierro tiene un papel importante en los sitios activos de una amplia gama de proteínas implicadas en el metabolismo energético, la respiración y la síntesis de ADN. Una de estas proteínas, la ribonucle�tido reductasa (RR), es una proteína que contiene hierro que es esencial para la conversión de ribonucle�tidos en desoxirribonucle�tidos para la síntesis de ADN y, por lo tanto, un objetivo para las terapias contra el cáncer. Muchos quelantes de hierro son potentes inhibidores de la RR debido a su capacidad para unirse a hierro (Richardson, D. R. (2002) Crit Rev Oncol Hematol 42(3): 267-81.). Por ejemplo, el quelante de hierro deferoxamina (DFO), que se ha aprobado cl�nicamente para el tratamiento de enfermedades de sobrecarga de hierro, incluyendo la

�-talasemia (Buss, J. L., B. T. Greene, J. Turner, F. M. Torti and S. V. Torti (2004) Curr Top Med Chem 4(15): 1623-35), también se ha demostrado que es un inhibidor de la RR. Además, se ha demostrado que algunos tumores agresivos son sensibles a la quelaci�n del hierro por la DFO. Sin embargo, el uso de la DFO sin embargo, es costoso, requiere una prolongación de la administración subcutánea y el compuesto presenta una semivida corta. Además de la DFO, otros quelantes del hierro con actividad antiproliferativa se encuentran en desarrollo, incluyendo Triapina (actualmente en fase II), 311, tachpiridina, y O-Trensox (Richardson, ant.). No obstante, la triapine puede tener una utilidad limitada como terapia contra el cáncer, ya que presenta una baja solubilidad en agua.

La patente de EE.UU. 6.589.966 describe una nueva familia de quelantes de metales caracterizados como compuestos químicos hexadentados, que se unen al hierro y que tienen actividad antiproliferativa contra las células tumorales. Además, la solicitud de patente de EE.UU. 2002/0119955 describe compuestos adicionales basadas en 3-AP (estructuralmente relacionado con Triapina) que pueden exhibir una utilidad terapéutica adecuada en el tratamiento de neoplasias, incluyendo el cáncer.

La quelaci�n de cinc también puede ser un importante, pero relativamente inexplorado, determinante de los efectos biológicos de los quelantes de hierro. Por ejemplo, el quelante del hierro tacpiridina, que se encuentra en investigación precl�nica como potencial agente contra el cáncer, quela el cinc además del hierro, y esto puede desempeñar un papel en su citotoxicidad (Zhao, R., et al. (2004) Biochem Pharmacol 67(9): 1677-88.). El cinc tiene funciones catalíticas y estructurales en cientos de enzimas dependientes de cinc y motivos en dedo de cinc de proteínas implicadas en la interacción ADN-proteína o proteína-proteína. En consecuencia, la deficiencia, as� como la sobrecarga de cinc, causan una amplia variedad de alteraciones en el metabolismo de los mamíferos. Depletion of zinc in vitro has been shown to cause apoptosis (McCabe, M. J., Jr., S. A. Jiang and S. Orrenius (1993) Lab Invest 69(1): 101-10), para disminuir significativamente la proliferaci�n celular de las células de carcinoma de colon HT-29 (Kindermann, B., F. Doring, M. Pfaffl y H. Daniel (2004) J Nutr 134(1): 57-62), y para alterar la progresión del ciclo celular (Chen, X., et al. X., et al. (2001) J Biol Chem 276(32): 30423-8.).

Como alternativa, otros quelantes de metales pueden ejercer efectos antineopl�sicos a través de la formación de complejos de quelato citot�xicos Esto ocurre predominantemente con los metales activos en r�dox, hierro y cobre. Por ejemplo, las bleomicinas son una familia de antibióticos glucopept�dicos con actividad antitumoral. Se utilizan cl�nicamente en la quimioterapia de combinación contra linfomas, carcinomas de células escamosas y tumores de células germinales. Contienen un dominio de unión a ADN y un dominio de unión a metal, que se une a Fe (II) o Cu (I). La presencia de oxígeno y un reductor conduce a la escisión del ADN a través de la formación de radicales intermedios (Chen, J. and J. Stubbe (2005) Nat Rev Cancer 5(2): 102-12). La triapina quelante del hierro, que inhibe la RR a través de la quelaci�n del hierro, también puede dañar la RR y otras moléculas vitales mediante la generación de radicales libres tras la formación del complejo de hierro (Chaston, T. B., et al. (2003) Clin Cancer Res 9( 1): 402-14). El uso de conjugados de bleomicina dirigiendo un compuesto a un tumor del cuerpo se describe en la patente de EE.UU. N�

4.758.421.

La citotoxicidad del quelante de metales, 10-fenantrolina (OP) se ha atribuido a su capacidad para funcionar tanto como quelante como de tipo quelato. Como un quelante, se ha demostrado que combina con cinc o hierro y, por lo tanto, inhibe las enzimas que requieren cinc o hierro para su actividad. Como alternativa, se ha informado que los complejos de quelatos de 1,10-fenantrolina con iones met�licos divalentes son citot�xicos (Shulman, A. y G. A. Laycock (1977) Chem Biol Interact 16(1): 89-99.) y el quelato de cobre estimula la degradación del ADN (Downey, K. M., B. G. Que y A. G. So (1980). Biochem Biophys Res Commun 93(1): 264-70). ). Los complejos de cobre-OP pueden unirse no covalentemente a la ranura menor del ADN y catalizar la escisión de la cadena sencilla de los ácidos nucleicos en presencia de peróxido de hidrógeno y un reductor (Sigman,, D. S., et al. (1979) J Biol Chem 254(24): 12269-72).

Los complejos de cobre-OP se utilizan frecuentemente como nucleasas químicas y se han generado agentes de 5 escisión de ADN de alta especificidad mediante la unión a las proteínas de unión a ADN específicas desecuencia (Pan,

C. Q., R. Landgraf and D. S. Sigman (1994) Mol Microbiol 12(3): 335-42.). OP también se usa ampliamente como inhibidor de metaloproteasas de la matriz (Spring-man E. B., et al. (1995) Biochemistry 34(48): y se ha demostrado que inhiben la síntesis de los anclajes de glicofosfatidilinositol ((Mann, K. J. and D. Sevlever (2001) Biochemistry 40(5): 1205-13) mediante quelaci�n de cinc.

La alteración de la regulaci�n de los genes supresores de tumores se ha implicado en el desarrollo de cáncer, pero el papel exacto de estos genes supresores de tumores en el desarrollo de cáncer todavía no est� claro. La familia de genes del factor de tipo Kr�ppel (KLF) es una familia de factores de transcripción que contienen dedo de cinc conservado evolutivamente que tienen diversos papeles reguladores en el crecimiento, proliferaci�n diferenciación y 15 embriog�nesis de las células (Ghaleb, A. M., et al. (2005) Cell Res 15(2): 92-6). ). Los KLF pueden funcionar como activadores de la transcripción o como represores o como ambos, dependiendo de su interacción con los coactivadores o los correpresores a través de determinados dominios en el extremo amino, los promotores a los que se unen y el contexto celular de su función (Kaczynski, J., T. Cook y R. Urrutia (2003) Genome Biol 4(2): 206). Se piensa que varios miembros de la familia de KLF son supresores tumorales y est�n implicados en la carcinog�nesis. Por ejemplo, se encuentra regulaci�n por disminución de KLF4 en cáncer de colon (Dang DT, et al. (2000) FEBS Lett,

476: 203-7) and down-regulation of KLF5 and KLF10 occurs in breast cancer (Chen C, et al. (2002) Oncogene, 21: 6567-72). Subramaniam M, et al. (1998) J Cell Biochem, 68: 226-36). También se ha sugerido que KLF6 es un candidato al gen supresor tumoral en la localización cromos�mica 10p15 y se observan frecuentes mutaciones en el adenocarcinoma de pr�stata. Además, Además, también se ha mostrado que KLF6 transactiva WAF1, que codifica un

25 inhibidor de quinasa dependiente de ciclina del ciclo celular a través de una vía independiente de p53 (Narla G, et al. (2001) Science, 294: 2563-6).

La alteración de a regulaci�n de KLF4 se ha relacionado con otros c�nceres distintos al cáncer de colon tanto in vitro and in vivo, lo que sugiere que KLF4 puede tener un efecto supresor tumoral. En el cáncer colorrectal, el nivel de ARNm de KLF4 se reduce en comparación con tejidos equivalentes normales (Dang et al. ( (2000), citado anteriormente), y la reexpresi�n de KLF4 en una línea celular de cáncer colorrectal tiene como resultado una disminución de la tumorigeneicidad (Dang D. T., et al. (2003) Oncogene 22(22): 3424-30). A similar down-regulation and growth suppressive effect of KLF4 has also been described in bladder cancer (Ohnishi, S., et al. (2003) Biochem Biophys Res Commun 308(2): 251-6.), Gastric cancer (Wei, D., et al. (2005) Cancer Res 65(7): 2746-54.). Cáncer de

35 esófago (Wang, N., et al. (2002). World J Gastroenterol 8(6): 966-70), y leucemia de linfocitos T del adulto (Yasunaga, J., et al. (2004). Cancer Res 64(17): 6002-9). En contraste con el efecto supresor tumoral de KLF4, se ha notificado un incremento de la expresión de KLF4 durante la progresión del cáncer de mama (Foster, K. W., et al. (2000). Cancer Res 60(22): 6488-95.) y carcinoma de células escamosas de la cavidad oral (Foster, K. W., et al (1999). Cell Growth Differ 10(6): 423-34.). Además, Se ha considerado al KLF4 como marcador de un fenotipo agresivo en el carcinoma de mama ductal infiltrante en estadio temprano (Pandya, A. Y., et al. A. Y., et al. (2004). Clin Cancer Res 10(8): 2709-19.). Por tanto, mientras que el KLF4 es probable que desempeñe un papel supresor tumoral en los c�nceres gastrointestinales y la leucemia, el papel del KLF4 en el desarrollo de otros tipos de cáncer todavía no est� claro.

La expresión de KLF4 est� regulada negativamente por el cinc. Los estudios sobre el efecto de la depleci�n del cinc

45 sobre la expresión g�nica en células HT-29 de carcinoma de colon usando matrices de oligonucle�tidos humanos mostraron que la expresión del gen de KLF4 era una de los más reguladas por aumento de entre los 10.000 genes diana analizados. se ha postulado la hipótesis por tanto, de que KLF4 puede ser un vínculo directo entre el estado del cinc celular y la inhibición del crecimiento (Kindermann, B., F. Doring, M. Pfaffl and H. Daniel (2004). J Nutr 134(1): 57-62.). En un estudio posterior se descubrió que la expresión de KLF4 aumentaba en células que sobreexpresan el factor de transcripción de metales 1 (MTF-1) (Kindermann, B., F. Doring, J. Budczies and H. Daniel (2005). Biochem Cell Biol 83(2): 221-9.). MTF-1 es un activador de la transcripción sensible a cinc que tiene seis dedos de cinc, que se une a elementos respondedores a metales (MRE) de los genes diana y el promotor de KLF4 también tiene 3 MRE. Normalmente, MTF-1 est� regulado por aumento en las células deficientes en cinc y se ha observado un incremento de la expresión de MTF-1 en las células HT-20 deficientes en cinc (Kindermann et al. 2004, citado anteriormente). Por

55 lo tanto, Por tanto, la respuesta al cinc de KLF4 en HT-29 est� mediada por, al menos en parte, el MTF-1 (Kindermann et al. 2005, citado anteriormente). La expresión de KLF4 est� asociada principalmente con un estado diferenciado terminalmente de las células epiteliales en órganos tales como intestino, piel y timo (Kaczynski et al. piel y timo (Kaczynski et al. 2003, citado anteriormente).

Como se ha descrito en lo que antecede, la 1,10-phenanthroline (OP) es un quelante de metales bien conocido. En recientes estudios se han investigado derivados de 1,10-fenantrolina y su capacidad para quelar varios metales. Por ejemplo, Chao et al., han sintetizado 1,3-bis([1,, 10]) fenantrolina-[5,6-d]imidazol-2-il)benceno (mbpibH2) y sus complejos de (bpy)2Ru2+ y han estudiado sus propiedades electroqu�micas y espectroscópicas (Polyhedron, , 2000, 1975-1983). Liu et al., prepararon complejos de rutenio con 2-(2-hidroxifenil)imidazo[4,5-f][1,10]fenantrolina (HPIP) y 65 estudiaron el comportamiento de unión de estos complejos al ADN de timo de ternero (JBIC, 2000, 5, 119-128). 2000, 5, 119-128). De un modo similar, Xu et al., han descrito la síntesis de prepararon complejos de

2-(4-metilfenil)imidazol[4,5-f]1,10-fenantrolina y sus complejos de ru(II) y la unión de los complejos preparados al ADN de timo de ternero (New J. Chem., . 2003, 27, 1255-1263).

La solicitud de patente internacional n� PCT/IB04/052433 (WO 2005/047266) describe una amplia clase de

5 compuestos de imidazol 2,4,5-trisustituidos, incluidos algunos compuestos sustituidos de 1,10-fenantrolina,, y su uso en el tratamiento del cáncer. El documento US 2004/0176601 divulga derivados de Benzimidazo [4,5-f] isoquinolinona como inhibidores de Jok.

Esta información básica se proporciona con el fin de proporcionar información conocida que el solicitante cree que

10 tiene una posible importancia en la presente invención. No necesariamente se pretende admitir, ni interpretar, que toda la información precedente constituye la técnica anterior contra la presente invención.

Sumario de la invención

15 Un objeto de la presente invención es proporcionar derivados de 2-indolil imidazo[4,5-d]fenantrolina y usos de los mismos en el tratamiento del cáncer. De acuerdo con un aspecto de la presente invención se proporciona un compuesto que tiene la de fórmula estructural (I) , o una sal del mismo para uso, en la inhibición de la proliferaci�n de las células cancerosas:

20 en la que: R1, R3, R4, R5 y R7 son hidrógeno, R2 es halógeno, y R6 es alquilo C1-C4 De acuerdo con otro aspecto de la presente invención se proporciona un compuesto que tiene la de fórmula estructural 25 (I) , o una sal del mismo para uso en la inducción de la apoptosis en una célula cancerosa. De acuerdo con otro aspecto de la presente invención se proporciona un compuesto que tiene la de fórmula estructural

(I) , o una sal del mismo para uso en la quelaci�n de iones de metales de transición en una célula. 30 De acuerdo con otro aspecto de la presente invención se proporciona un compuesto que tiene la de fórmula estructural

(I) , o una sal del mismo para uso en el incremento de la expresión de un factor de tipo Kr�ppel (KLF4) en una célula de cáncer y/o en un tumor.

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención se proporciona un compuesto que tiene la de fórmula estructural 35 (I) , o una sal del mismo en la preparación de un medicamento para el tratamiento de cáncer.

Breve descripción de los dibujos

Estas y otras características de la invención ser�n más evidentes en la siguiente descripción detallada en la que se 40 hace referencia a las figuras adjuntas, en las que: los compuestos no cubiertos por la fórmula (I) de la reivindicación 1

son ejemplos de referencia.

La Figura 1 representa los valores promedio y medio de GI50 para la proliferaci�n del compuesto 2 y el compuesto 3 en una serie de líneas de células cancerosas in vitro.

La Figura 2 presenta el efecto del compuesto 3 sobre la proliferaci�n de una serie de líneas de células cancerosas in vitro.

La Figura 3 representa el efecto de iones met�licos sobre la capacidad del compuesto 3 y el compuesto 13 para inhibir el crecimiento de células HT29 in vitro.

La Figura 4 representa el efecto de iones de cobre sobre la capacidad del compuesto 3 para inhibir el crecimiento de células HT29 in vitro.

10 La Figura 5 representa el efecto de iones de cobre sobre la capacidad del compuesto 3 para inhibir el crecimiento de células HT29 in vitro. (A) Efecto de los iones de cinc; (A) Efecto de los iones de cobre; (C) Efecto de los iones de hierro (II); (D) Efecto de los iones de hierro; (E) Efecto de los iones de magnesio; ; y (F) Efecto de los iones de calcios.

15 La Figura 6 representa el efecto de iones de cobre o de cinc sobre la capacidad del compuesto 5 (A) y del compuesto 7 (B) para inhibir el crecimiento de células HT29 in vitro.

La Figura 7 representa el efecto del compuesto 3 sobre la expresión del ARNm del gen de la metalotione�na en 20 células HT29 in vitro.

La Figura 8 representa el efecto del compuesto 3 sobre la expresión del ARNm de KLF4 en células HT29 in vitro.

La Figura 9 representa el efecto del compuesto 3 sobre la expresión del ARNm de KLF4 en células HT29 in vitro. 25 La Figura 10 representa el efecto del compuesto 3 sobre la expresión del ARNm de KLF4 en células HT29 in vitro.

La Figura 11 representa la capacidad del compuesto 3 para bloquear la progresión del ciclo celular en células HT29

(A) y en células CCRF-CEM (B) in vitro.

30 La Figura 12 presenta la capacidad del compuesto 3 para inducir la apoptosis en células CCRF-CEM in vitro.

La Figura 13 representa la capacidad del compuesto 3 para disminuir el tamaño del tumo (A) y el peso del tumor (B) en un modelo de xenoinjerto de adenicarcinoma de colon.

35 La Figura 14 representa la capacidad del compuesto 3 para disminuir el tamaño del tumo (A) y el peso del tumor (B) en un modelo de xenoinjerto de carcinoma de pulmón macroc�tico.

La Figura 15 representa la de los compuestos 3, 5, y 7 para disminuir el tamaño del tumo (A) y el peso del tumor (B), 40 e n un modelo de xenoinjerto de adenocarcinoma de colon.

La Figura 16 representa la de los compuestos 3, 5, y 7 para disminuir el tamaño del tumo (A) y el peso del tumor (B) en un modelo de xenoinjerto de carcinoma de pulmón.

La Figura 17 representa el efecto del compuesto 3 sobre los niveles de ARNm de KLF4 n vivo en tumores de un modelo de xenoinjerto de adenocarcinoma de colon. La Figura 18 representa el efecto del compuesto 3 sobre los niveles de ARNm de KLF4 n vivo en tumores de un modelo de xenoinjerto de adenocarcinoma de colon.

5 La Figura 19 representa el efecto del compuesto 3 sobre la expresión del ARNm de KLF4 en células HT29 in vivo. en tumores de un modelo de xenoinjerto de adenocarcinoma de colon (A).

La Figura 20 representa una comparación del efecto del compuesto 3 sobre los niveles de KLF4, p21, y ciclina D1 10 en un modelo de xenoinjerto de adenocarcinoma de colon.

La Figura 21 representa la localización subcelular del compuesto 3 en células HT-29 in vitro. (A) Células tratadas con el compuesto 3 durante 5 minutos; (B) y (C) células tratadas durante 4 horas. Para (A) y (B), las imágenes de contraste de interferencia diferencial se superpusieron con imágenes fluorescentes. (B) y (C) son las mismas

15 imágenes.

La Figura 22 representa la capacidad de los compuestos 3 y 13 para escindir el ADN (A) en ausencia de iones; (B) en presencia de iones de cobre, cinc o hierro (II); y (C) en presencia de varias cantidades de cobre.

La Figura 24 representa el desarrollo de compuestos de Fórmula I.

La Figura 25 representa la capacidad de los compuestos 3 y 7 para inhibir el crecimiento tumoral en un modelo de xenoinjerto de carcinoma de pulmón macroc�tico (A) y en un modelo de xenoinjerto de adenocarcinoma de colon (B), la capacidad del compuesto 7 para inhibir el crecimiento tumoral en un modelo de xenoinjerto de carcinoma de pulmón macroc�tico (C) y la capacidad de los compuestos 7, 63, 64, 69, 72, 73, 74, 18 y 78 para inhibir el

La Figura 26 representa el efecto de suplementos de iones met�licos sobre la inhibición del crecimiento celular mediada por el compuesto 3, Zn+2, Cu+2 y Fe+2 (A) y Fe+3, Ca+2 y Mg+2 (B). La Figura 27 representa el análisis del ciclo celular en células HT-29 tratadas con el compuesto 3 (A) y el compuesto 7 (B).

5 La Figura 28 representa la propiedad de quelaci�n de metales del compuesto 3 y el compuesto 7 in vitro en presencia de ZnCl2 (A), CuCl2 (B) y FeCl2 (C).

10 Figura 29 representa los cambios en la expresión de genes sensibles a metales del gen sensible a cinc de la metalotione�na 1A (A), el transportador de cobre 1 sensible a cobre (B) y el receptor 1 de la transferina sensible a hierro (C) en células HT-29 tratadas con el compuesto 3, el compuesto 7 o los respectivos quelantes específicos de metales.

15 La Figura 30 representa secuencias de ADN de unión a MTF-1 en el promotor del gen de la ciclina D1 (A) y los niveles de expresión de MTF-1 y ciclona D1 en tejido de xenoinjerto de cáncer de colon HT-29 tratado con el compuesto 3 (B) y el compuesto 7 (C).

La Figura 31 representa la expresión de MTF-1 (A) y de ciclina D1 (B) , medida mediante RT-PCR después del 20 tratamiento con el compuesto 3 en células HT-29 , y la expresión de MTF-1 (C) y de ciclina D1 (D) después de la inactivaci�n del gen de MTF-1 por ARNsi.

La Figura 32 representa los sitios de unión del factor de transcripción en el promotor del gen de KF4 (A) y las actividades de unión al ADN de Sp1 (B) y KLF4 (C) en células HT-29 tratadas con el compuesto 3.

25 La Figura 33 representa los sitios de unión del factor de transcripción en el promotor del gen de la ciclina D1 (A) y la unión in vivo de KLF4 ySp1 al promotor de la ciclina D1 después del tratamiento con el compuesto 3 en células HT-29 mediante ensayo de inmunoprecipitaci�n con cromatina (B).

La Figura 33 representa el efecto del compuesto 3 y la inactivaci�n del gen de KLF4 por el ARNsi en células HT-29 30 sobre la expresión g�nica medida mediante RT-PCR (A) y sobre la proliferaci�n celular (B).

La Figura 35 representa la de los compuestos 7, 41, 42, 50, 52, 53, 54, 55 y 4 para inhibir el crecimiento de células tumorales en el modelo de xenoinjerto de carcinoma de pulmón macroc�tico.

La Figura 36 representa la capacidad del compuesto 3 para quelar los iones de cinc in vitro usando el pigmento 5 Zinquin sensible a cinc.

La Figura 37 representa la capacidad del compuesto 3 para quelar los iones de cinc in vitro en células HT-29 precargadas con ZnCl2 (A) o sin precarga de ZnCl2 (B) (iones end�genos de cinc).

10 La Figura 38 representa el efecto del compuesto 3 sobre la expresión del gen sensible a metales el gen sensible a cinc de la metalotione�na 1A en células HT-29 in vitro en el tiempo (A) y tras el tratamiento con suplemento de cinc (B).

La Figura 39 representa el efecto del compuesto 3 sobre la expresión del KLF4 supresor tumoral sensible a metales 15 en células HT-29 in vitro en el tiempo (A) y tras el tratamiento con suplemento de cinc (B).

La Figura 40 representa el efecto del compuesto 3 sobre la expresión de del factor de transcripción de unión al elemento respondedor a metales (MRE) en células HT29 in vitro en el tiempo.

20 La Figura 41 es el efecto de la inactivaci�n del gen de MTF-1 mediante tratamiento con ARNsi en células HT-29 in vitro sobre la expresión de MTF-1, KLF5 y KLF4 (A) y el efecto del tratamiento con el compuesto 3 sobre la expresión de KLF5 en células HT-29 in vitro en el tiempo (B).

La Figura 42 representa el efecto del compuesto 3 sobre la expresión de la proteína reguladora del ciclo celular p21 25 en células HT-29 in vitro en el tiempo, los niveles de ARNm (A) y los niveles proteicos (B).

La Figura 43 representa el efecto del compuesto 3 sobre la expresión de los niveles de ARNm de la ciclina D1 en células HT-29 (A) y los niveles proteicos (B).

30 La Figura 44 representa el efecto del compuesto 3 sobre la expresión de un gen supresor tumoral, la proteína temprana de la respuesta de crecimiento (EGR-1) en células HT-29 in vitro en el tiempo (A) y tras el tratamiento con suplemento de cinc (B).

La Figura 45 representa el efecto del compuesto 3 y el compuesto 7 sobre los niveles de expresión de MT1A, 35 MTF-1, KLF4, KLF5, p21, ciclina D1 y Erg-1 en células HT-29 in vitro.

La Figura 46 representa el efecto in vivo del compuesto 3 sobre los niveles de KLF4 y ciclina D1 en un modelo de xenoinjerto de adenocarcinoma de colon HT-29 en ratones.

40 La Figura 47 representa la capacidad del compuesto 3 para quelar cinc a partir de la proteína de almacenamiento de cinc metalotione�na 1 (MT-1) in vitro.

La Figura 48 representa la inactivaci�n de la actividad de unión al ADN de la MTF-1 activada por cinc tras el tratamiento con el compuesto 3 in vitro (A) y la inactivaci�n de la actividad de unión al ADN de MTF-1 mediante el compuesto 3 en células HT-29 in vitro (B).

La Figura 49 representa la capacidad del compuesto 3 para disminuir la actividad de unión al ADN de la MTF-1 en células HT-29 a la región promotora de la ciclina D1 mediante ensayo de inmunoprecipitaci�n de cromatina (ChIP).

La Figura 50 representa el efecto del compuesto 3 y el suplemento de cinc sobre la expresión de ciclina D1 en células HT-29 in vitro (A) y el efecto del compuesto 3 sobre los niveles proteicos de la ciclina D1 y otras ciclinas (B).

La Figura 51 representa el efecto del compuesto 3 y el suplemento de cinc sobre los niveles de expresión de MTF-1 (A), el efecto del suplemento de cinc sobre la expresión de ciclina D1 (B) y el efecto del suplemento de cinc y la inactivaci�n del gen de MTF-1 mediante ARNsi sobre la expresión de ciclina D1 (C) en células HT-29 in vitro.

La Figura 52 representa el efecto del compuesto 3 y la inactivaci�n del gen de MTF-1 mediante ARNsi sobre la expresión de KLF4 en células HT29 in vitro.

La Figura 53 representa la comparación de los niveles de expresión g�nica de KLF4, en células de cáncer H-460 in vitro (A) y el efecto del compuesto 3 y el compuesto 7 sobre la expresión de KLF4, KLF2 y KLF6 in H-460 en células cancerosas H-460 in vitro (B).

La Figura 54 representa la capacidad del compuesto 3 para disminuir el tamaño del tumor (A) en un modelo de xenoinjerto de adenocarcinoma de colon y el efecto sobre los niveles de ARNm de MTF-1, ciclina D1 in vivo en tumores de un modelo de xenoinjerto de adenocarcinoma de colon (B).

La Figura 55 representa el efecto del compuestos 3, el compuesto 7 y el suplemento de cinc sobre los niveles de ARNm en células HT-29 in vitro para MT1A (A), MTF-1 (B), ciclina D1 (C) y KLF4 (D).

La Figura 56 representa la propiedad de quelaci�n de metales del compuesto 3 y el compuesto 64 in vitro en presencia de ZnCl2 (A) CuCl2 (B) y FeCl2 (C).

La Figura 57 representa el efecto del compuestos 3, el compuesto 64 y el suplemento de cinc sobre los niveles de ARNm en células HT-29 in vitro para MT1A (A), MTF-1 (B), ciclina D1 (C) y KLF4 (D).

Descripci�n detallada de la invención

La presente invención se refiere a compuestos de 2-indolil imidazo[4,5-d]fenantrolina de fórmula I. Los compuestos de fórmula I, como se demuestra en el presente documento, son capaces de quelaci�n intracelular de metales de transición y de ejercer efectos antiproliferativos en una o más células de cáncer, que son citost�ticos y/o citot�xicos. De acuerdo con lo anterior, una realización de la presente invención proporciona el uso de compuestos de fórmula I para inhibir la proliferaci�n de las células cancerosas. La presente invención proporciona además procedimientos y usos de compuestos de fórmula I en el tratamiento del cáncer.

La inducción de la muerte celular programada (apoptosis) es un abordaje útil para el tratamiento del cáncer. Como se demuestra en el presente documento, en una realización de la presente invención, l los compuestos de fórmula I son capaces de inducir apoptosis en células de cáncer y, por tanto, pueden ejercer un efecto citot�xico. De acuerdo con lo anterior, la presente invención proporciona además procedimientos y usos de los compuestos de fórmula I para la inducción de apoptosis en células cancerosas. En otra realización, se proporciona el uso de compuestos de fórmula I para la inducción de apoptosis para el tratamiento de varias leucemias.

En otra realización de la presente invención, los compuestos de fórmula I son capaces de inhibir de forma selectiva la proliferaci�n de una o más células de cáncer de pr�stata, células de cáncer de colon, células de cáncer de pulmón macroc�tico y células de leucemia. En esta realización, por tanto, la presente invención proporciona el uso de compuestos de fórmula I para inhibir la de forma selectiva la proliferaci�n de una o más células de cáncer de pr�stata, células de cáncer de colon, células de cáncer de pulmón macroc�tico y células de leucemia. La capacidad de los compuestos de fórmula I para inhibir de forma selectiva la proliferaci�n de una o más células de cáncer de pr�stata, células de cáncer de colon, células de cáncer de pulmón macroc�tico y células de leucemia proporciona adicionalmente procedimientos y usos de los compuestos de fórmula I para tratar un cáncer seleccionado del grupo de cáncer de pr�stata, cáncer de colon, células de cáncer de pulmón macroc�tico y células de leucemia.

Tal como se ha señalado anteriormente, los compuestos de fórmula I son capaces de quelar iones de metales de transición en un ambiente celular. De acuerdo con lo anterior, la presente invención proporciona además procedimientos y usos de los compuestos de fórmula I para quelar iones de metales de transición in vivo o in vitro. En una realización de la presente invención, los compuestos de fórmula I son capaces de alterar la expresión de genes que est�n regulados por metales de transición en células de cáncer mediante quelaci�n de metales de transición. Por ejemplo, en una realización, los compuestos de fórmula I son capaces de aumentar la expresión de un gen supresor tumoral regulado por metales de transición en células de cáncer. La función de los genes supresores tumorales a menudo se asocia con la regulaci�n de la proliferaci�n celular y, por tanto, aumentando la expresión de un gen supresor tumoral regulado por metales de transición, que funciona para regular la proliferaci�n celular, los compuestos de fórmula I son capaces de inhibir la proliferaci�n de las células cancerosas. En una realización específica, los

5 compuestos de fórmula I son capaces de aumentar la expresión de del gen supresor tumoral regulado por cinc, KLF4 y, por tanto, sin útiles en la inhibición de la proliferaci�n de células cancerosas en las que KLF4 actúa como supresor tumoral, incluyendo, pero sin limitación, cáncer de vejiga, c�nceres del tracto gastrointestinal y varias leucemias.

La presente invención proporciona además complejos de quelatos met�licos de compuestos de fórmula I, por ejemplo 10 complejos de cobre de compuestos de fórmula I y el uso de estos complejos en el tratamiento del cáncer.

La presente invención también contempla compuestos de fórmula I en el tratamiento de enfermedades o trastornos en los que existe la necesidad de quelar metales de transición, as� como en varias situaciones no terapéuticas en las que se requiere quelaci�n de metales de transición.

Definiciones

A no ser que se defina otra cosa, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que el que entiende comúnmente una persona normalmente experta en la técnica a la cual

20 pertenece la presente invención.

Los términos se definen del siguiente modo:

“Inhibición selectiva” como se usa en el presente documento con referencia a la actividad antic�ncer de los

25 compuestos de Fórmula I, en una realización de la invención, se puede determinar usando un panel de líneas celulares de cáncer que comprende al menos 50 de las 60 líneas de células de cáncer utilizadas en el Programa de Desarrollo de Terapéuticas del NCI / NIH in vitro (que se muestra en la Tabla 1 a continuación), en el que el panel comprende las líneas celulares de cáncer de pr�stata de la lista y por lo menos 4 líneas celulares de cada uno de los otros tipos de cáncer indicados. Se dice que un compuesto muestra inhibición selectiva de un cáncer

30 seleccionado (es decir, cáncer de pr�stata, cáncer de colon, cáncer de pulmón macroc�tico y / o leucemia) cuando el compuesto inhibe la proliferaci�n de las líneas celulares del cáncer seleccionado con un promedio del GI50 al menos un 10% más bajo que el promedio de GI50 para la inhibición de las líneas celulares de cada uno de cáncer de mama, cáncer del SNC, melanoma, cáncer de ovarios y cáncer renal.

35 Tabla 1: Líneas celulares de cáncer usadas en el Programa de Desarrollo de Terapéuticas del NCI / NIH in vitro

Tipo de cáncer

Línea celular

Mama

MCF7 NCI/ADR-RESMDA-MB-231/ATCCHS 578T MDA-MB-435 MDA-N BT-549 T-47D

SNC

SF-268 SF-295 SF-539 SNB-19 SNB-75 U251

Colon

COLO 205 HCC-2998HCT-116 HCT-15 HT29 KM12 SW-620

Leucemia

CCRF-CEMHL-60(TB)K-562 MOLT-4 RPMI-8226 SR

Melanoma

LOX IMVI MALME-3MM14 SK-MEL-2 SK-MEL-28 SK-MEL-5 UACC-257 UACC-62

De pulmón macroc�tico

A549/ATCC EKVX HOP-62 HOP-92 NCI-H226 NCI-H23 NCI-H322M NCI-H460 NCI-H522

De ovarios

IGR-OV1 OVCAR-3 OVCAR-4 OVCAR-5 OVCAR-8 SK-OV-3

Tipo de cáncer

Línea celular

Pr�stata

PC-3 DU-145

786-0).

RXF 393

Renal

A498ACHN SN12C TK-10

CAKI-1

UO-31

La expresión “regulado por disminución” como se usa en el presente documento con respecto a la expresión de un gen supresor de tumores de metales de transición en las células cancerosas, significa que el gen no se sobreexpresa en 5 las células cancerosas, es decir, que las células exhiben un nivel reducido o sustancialmente el mismo nivel de expresión del gen en comparación con las células normales. A modo de ejemplo, las células de cáncer de colon exhiben una expresión reducida del gen KLF4 en comparación con las células de colon normales, mientras que las células de cáncer de pr�stata presentan el mismo nivel de expresión de KLF4 cuando se compara con las células de cáncer de pr�stata normales, pero el nivel de expresión es menor que en las células de cáncer de mama, q que

10 sobreexpresan KLF4.

El término “halógeno” se refiere a átomos flúor, bromo, cloro, y yodo.

El término “hidroxilo" se refiere al grupo -OH. 15 El término “tiol" o "mercapto" se refiere al grupo-SH y -S(O)0-2.

La expresión "alquilo inferior" se refiere a un grupo alquilo de cadena lineal o ramificada, o cíclico, de uno a ocho átomos de carbono.

20 La expresión "alquilo inferior sustituido" se refiere a alquilo inferior como se acaba de describir que incluye uno o más grupos tales como hidroxilo, tiol, alquiltiol, halógeno, alcoxi, amino, amido, carboxilo, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, heterociclo, heterociclo sustituido, cicloheteroalquilo, cicloheteroalquilo sustituido, acilo, arilo, arilo sustituido; ariloxi, hetarilo , hetarilo sustituido, aralquilo, heteroaralquilo, alquilalquenilo, alquilalquinilo,

25 alquilcicloalquilo, alquilcicloheteroalquilo, nitro, ciano. Estos grupos pueden estar unidos a cualquier átomo de carbono del resto alquilo inferior.

La expresión “alquenilo inferior" se refiere a un hidrocarburo de cadena lineal o ramificada de dos a ocho átomos de carbono que tienen al menos un doble enlace carbono - carbono.

30 La expresión "alquenio inferior sustituido" se refiere a alquenilo inferior como se acaba de describir que incluye uno o más grupos tales como hidroxilo, tiol, alquiltiol, halógeno, alcoxi, amino, amido, carboxilo, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, heterociclo, heterociclo sustituido, cicloheteroalquilo, cicloheteroalquilo sustituido, acilo, arilo, arilo sustituido; ariloxi, hetarilo , hetarilo sustituido, aralquilo, heteroaralquilo, alquilo, alquenilo, alquinilo, alquilalquenilo,

35 alquilalquinilo, alquilcicloalquilo, alquilcicloheteroalquilo, nitro, ciano. Estos grupos pueden estar unidos a cualquier átomo de carbono para producir un compuesto estable.

La expresión “alquinilo inferior" se refiere a un hidrocarburo de cadena lineal o ramificada de dos a ocho átomos de carbono que tienen al menos un triple enlace carbono - carbono.

40 La expresión "alquinilo inferior sustituido" se refiere a alquenilo inferior como se acaba de describir que incluye uno o más grupos tales como hidroxilo, tiol, alquiltiol, halógeno, alcoxi, amino, amido, carboxilo, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, heterociclo, heterociclo sustituido, cicloheteroalquilo, cicloheteroalquilo sustituido, acilo, arilo, arilo sustituido; ariloxi, hetarilo , hetarilo sustituido, aralquilo, heteroaralquilo, alquilo, alquenilo, alquinilo, alquilalquenilo,

45 alquilalquinilo, alquilcicloalquilo, alquilcicloheteroalquilo, nitro, ciano. Estos grupos pueden estar unidos a cualquier átomo de carbono para producir un compuesto estable.

El término “alcoxi” se refiere al grupo-OR, en el que R es alquilo inferior, alquilo inferior sustituido, acilo, arilo, arilo sustituido; aralquilo, aralquilo sustituido, heteroalquilo, heteroarilalquilo, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, 50 cicloheteroalquilo, o cicloheteroalquilo sustituido como se define a continuación.

El término “alquiltio" indica al grupo SR, -S(O)n=1-2 -R, en el que R es alquilo inferior, alquilo inferior sustituido, arilo, arilo sustituido; aralquilo o aralquilo sustituido como se define a continuación.

55 El término "acilo" se refiere a grupos-C (O) R, en los que R es hidrógeno, alquilo inferior, alquilo inferior sustituido, arilo, arilo sustituido;

El término “ariloxi” se refiere a grupos -OAr, en los que Ar es un arilo, arilo sustituido; heteroarilo, o grupo heteroarilo sustituido tal como se define a continuación.

El término “amino” se refiere al grupo NRR', en el que R y R' pueden ser independientemente hidrógeno, alquilo inferior, alquilo inferior sustituido, arilo, arilo sustituido; hetarilo , cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, o hetarilo sustituido tal como se define a continuación o acilo.

El término "amido" se refiere al grupo C (O) NRR ', en el que R y R' pueden ser independientemente hidrógeno, alquilo inferior, alquilo inferior sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, arilo, arilo sustituido; hetarilo , hetarilo sustituido tal como se define a continuación.

El término “carboxilo" se refiere al grupo C(O)OR, en el que R puede ser independientemente hidrógeno, alquilo inferior, alquilo inferior sustituido, arilo, arilo sustituido; hetarilo , shetarilo sustituido y similares tal como se ha definido.

Los términos "arilo" o "Ar" se refieren a un grupo carboc�clico aromático que tiene al menos un anillo aromático (por ejemplo, fenilo o bifenilo) o múltiples anillos condensados, en los que al menos un anillo es aromático, (p. ej., 1,2,3,4-tetrahidronaftilo, naftilo, antrilo, o fenantrilo, 9-fluorenilo, etc).

El término "arilo sustituido" se refiere a arilo opcionalmente sustituido con uno o más grupos funcionales, (p. ej., halógeno, hidroxilo, tiol, alquilo inferior, alquilo inferior sustituido, trifluorometilo, alquenilo inferior, alquenilo inferior sustituido alquinilo inferior, alquinilo inferior sustituido, alquilalquenilo, alquilalquinilo, alcoxi, alquiltio, acilo, ariloxi, amino, amido, carboxilo, arilo, arilo sustituido; heterociclo, heterociclo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, heteroalquilo, heteroalquilo sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, alquilcicloalquilo, alquilcicloheteroalquilo, nitro, sulfamido, ciano o-N = CRR ', en el que R y R' se seleccionan independientemente de H, alquilo, alquilo sustituido, arilo, arilo sustituido; heterociclo, heterociclo sustituido, heteroarilo o heteroarilo sustituido.

El término "heterociclo" se refiere a un grupo carboc�clico saturado, insaturado o aromático que tiene un solo anillo (por ejemplo, morfolino, piridilo o furilo) o múltiples anillos condensados (por ejemplo, naftpiridilo, quinoxalilo, quinolinilo, indolizinilo, indanilo o benzo [b] tienilo) y que tiene al menos un hetero�tomo, tal como N, O o S. dentro del anillo.

El término "heterociclo sustituido" se refiere a un heterociclo opcionalmente sustituido con halógeno, hidroxilo, tiol, alquilo inferior, alquilo inferior sustituido, trifluorometilo, alquenilo inferior, alquenilo inferior sustituido alquinilo inferior, alquinilo inferior sustituido, alquilalquenilo, alquilalquinilo, alcoxi, alquiltio, acilo, ariloxi, amino, amido, carboxilo, arilo, arilo sustituido; heterociclo, heterociclo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, heteroalquilo, heteroalquilo sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, alquilcicloalquilo, alquilcicloheteroalquilo, nitro, , ciano o sulfamido y similares.

Los términos "heteroarilo" o "hetarilo" se refieren a un heterociclo en el que al menos un anillo heteroc�clico es aromático.

El término "heteroarilo sustituido" se refiere a un heterociclo opcionalmente mono o poli sustituido con uno o más grupos funcionales, (p. ej., halógeno, hidroxilo, tiol, alquilo inferior, alquilo inferior sustituido, trifluorometilo, alquenilo inferior, alquenilo inferior sustituido alquinilo inferior, alquinilo inferior sustituido, alquilalquenilo, alquilalquinilo, alcoxi, alquiltio, acilo, ariloxi, amino, amido, carboxilo, arilo, arilo sustituido; heterociclo, heterociclo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, heteroalquilo, heteroalquilo sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, alquilcicloalquilo, alquilcicloheteroalquilo, nitro, , ciano o sulfamido y similares.

El término "cicloalquilo" se refiere a un grupo alquilo cíclico o polic�clico que contiene de 3 a 15 carbonos. Para los grupos polic�clicos, éstos pueden ser anillos múltiples condensados en los que uno de los anillos distales puede ser aromático (por ejemplo, tetrahidronaftaleno, etc.).

El término "cicloalquilo sustituido" se refiere a un grupo cicloalquilo que comprende uno o más sustituyentes con, por ejemplo, halógeno, hidroxilo, tiol, alquilo inferior, alquilo inferior sustituido, trifluorometilo, alquenilo inferior, alquenilo inferior sustituido alquinilo inferior, alquinilo inferior sustituido, alquilalquenilo, alquilalquinilo, alcoxi, alquiltio, acilo, ariloxi, amino, amido, carboxilo, arilo, arilo sustituido; heterociclo, heteroarilo, heterociclo sustituido, heteroalquilo, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, alquilcicloalquilo, alquilcicloheteroalquilo, nitro, ciano o sulfamido y similares.

Los términos "terapia" y "tratamiento", como se usa indistintamente en el presente documento, , se refieren a una intervención realizada con la intención de aliviar los síntomas asociados con, la prevención del desarrollo de , o alterar la patología de, una enfermedad, trastorno o afección. Por tanto, los términos terapia y tratamiento términos se usan en el sentido más amplio, e incluyen prevención (profilaxis), moderación, gestión, reducción o curación de una enfermedad, trastorno o afección en varias etapas. La prevención o reducción de la progresión de una enfermedad, trastorno o afección est�n abarcadas por estos términos. También abarca estos términos una intervención que resulta en una alteración de la fisiología y / o bioquímica de un sujeto vivo. Los sujetos que necesiten la terapia / tratamiento incluyen aquellos que ya tienen la enfermedad, trastorno o afección, as� como aquellos propensos a, o en riesgo de desarrollar, la enfermedad, trastorno o afección, y aquellos en los que la enfermedad, trastorno o condición se ha de evitar. La aplicación terapéutica de los compuestos de la invención, por tanto, se refiere a una terapia o tratamiento, como se define en el presente documento.

Los términos “sujeto” o “paciente" como se usa en el presente documento, se refieren a un animal que necesite el 5 tratamiento, incluyendo seres humanos y otros mamíferos.

La administración de los compuestos de la invención "en combinación con" uno o más agentes terapéuticos adicionales, se pretende que incluya la administración simultánea (concurrente) y la administración consecutiva. La administración consecutiva se pretende que abarque varias órdenes de la administración del agente terapéutico (s) y

10 el compuesto (s) de la invención al sujeto.

La expresión "terapia adyuvante," tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a un tratamiento que se añade para aumentar la eficacia de un tratamiento primario. En el cáncer, la terapia adyuvante se refiere generalmente a la quimioterapia, terapia hormonal o terapia de radiación después de la cirugía (terapia primaria) para aumentar la

15 probabilidad de matar todas las células cancerosas.

La expresión "terapia neoadyuvante," tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a un tratamiento que se da antes de que el tratamiento primario. Ejemplos de terapia neoadyuvante incluyen quimioterapia, terapia de radiación, y la terapia hormonal.

20 Como se usa en el presente documento, el término “aproximadamente" se refiere a una variación de + / -10 % del valor nominal. Debe entenderse que tal variación se incluye siempre en cualquier valor dado proporcionado en el presente documento, se haga o no referencia específica al mismo.

25 I. Compuestos de 2-Indolil imidazo[4,5-d]fenantrolina

o sales de los mismos. en la que: R1, R3, R4, R5 y R7 son H, es halógeno; y R6 es alquilo C1-C4

5 La presente invención incluye varias sales de los compuestos definidos por la Fórmula I, incluyendo sales farmac�uticamente aceptables. Los compuestos según la presente invención pueden poseer grupos funcionales suficientemente ácidos, suficientemente básicos o ambos grupos funcionales, y, de acuerdo con esto reaccionar con un número de bases orgánicas e inorgánicas, y ácidos orgánicos e inorgánicos, para formar sales farmac�uticamente

10 aceptables.

La expresión “sal farmac�uticamente aceptable” como se usa en el presente documento se refiere a una sal de un compuesto de Fórmula I, que es sustancialmente no tóxico para los organismos vivos. Las sales farmac�uticamente aceptables típicas incluyen las sales preparadas mediante la reacción del compuesto de la presente invención con un

15 mineral farmac�uticamente aceptable o ácido orgánico o una base orgánica o inorgánica. Tales sales se conocen como sales de adición de ácido y de adición de base.

Los ácidos de uso habitual para formar sales de adición de ácido son ácidos inorgánicos, tales como ácido clorhídrico, ácido bromh�drico, ácido yodh�drico, ácido sulfúrico, ácido fosf�rico, y similares, y ácidos orgánicos, tales como ácido 20 p-toluenosulf�nico, ácido metanosulf�nico, ácido ox�lico, ácido p-bromofenil-sulf�nico, ácido carbónico, ácido succ�nico, ácido cítrico, ácido benzoico, ácido acético, y similares. Ejemplos de sales ácidas adecuadas incluyen sulfato, pirosulfato, bisulfato, sulfito, fosfato, monohidrogenofosfato, dihidrogenofosfato, metafosfato, pirofosfato, bromuro, yoduro, acetato, propionato, decanoato, caprilato, acrilato, formiato, clorhidrato, diclorhidrato, isobutirato, caproato, heptanoato, propiolato, oxalato, malonato, succinato, suberato, sebacato, fumarato, maleato,

25 butino-1,4-dioato, hexino-1,6-dioato, benzoato, clorobenzoato, metilbenzoato, hidroxibenzoato metoxibenzoato, ftalato, xilenosulfonato, fenilacetato, fenilpropionato, fenilbutirato, citrato, lactato, gamma-hidroxibutirato, glucolato, tartrato, metanosulfonato propanosulfonato, naftaleno-1-sulfonato, naftaleno-2-sulfonato mandelato y similares.

Las sales de adición de ácido farmac�uticamente aceptables preferidas son las formadas con ácidos minerales tales como ácido clorhídrico y ácido bromh�drico, y especialmente las formadas con ácidos orgánicos tales como ácido maleico y ácido metanosulf�nico.

5 Las sales de grupos amina pueden comprender también sales de amonio cuaternario en las que el nitrógeno del amino porta un grupo orgánico adecuado tal como un alquilo, alquenilo inferior, alquenilo inferior sustituido alquinilo inferior, alquinilo inferior sustituido, o un resto aralquilo.

Sales de adición de bases incluyen las derivadas de bases inorgánicas, stales como amoniaco o hidr�xidos de metales

10 alcalinos o alcalino térreos, carbonatos, bicarbonatos, y similares. Por tanto, dichas bases útiles en la preparación de las sales de la presente invención incluyen hidróxido sádico, hidróxido pot�sico, hidróxido am�nico, carbonato pot�sico, carbonato sádico, bicarbonato sádico, bicarbonato pot�sico, hidróxido cálcico, carbonato cálcico, y similares.

Un experto en la técnica entender� que el contraion particular que forma una parte de cualquier sal de la presente

15 invención normalmente no es de naturaleza crítica, siempre y cuando la sal como un todo sea farmacol�gicamente aceptable y siempre que el contraion no contribuya a calidades no deseadas para la sal como un todo. La presente invención abarca además los solvatos farmac�uticamente aceptables de un compuesto de Fórmula I. Muchos de los compuestos de Fórmula I pueden combinarse con disolventes tales como agua, metanol, etanol y acetonitrilo para formar solvatos farmac�uticamente aceptables tales como el hidrato correspondiente, metanolato, etanolato y

20 acetonitrilato.

Los compuestos de la presente invención pueden tener múltiples centros asimétricos (quirales). Como consecuencia de estos centros quirales, los compuestos de la presente invención se producen como racematos, mezclas de enanti�meros y como enanti�meros individuales, as� como diastere�meros y mezclas de diastere�meros. Todas las

25 formas asimétricas, isómeros individuales y combinaciones de los mismos entran dentro del ámbito de la presente invención.

Un experto en la técnica entender� fácilmente que si la estereoqu�mica de un compuesto de Fórmula I es crítico para su actividad, as�, la estereoqu�mica relativa del compuesto se estableció temprano durante la síntesis para evitar

30 problemas de separación de estereois�meros posteriores. Además la manipulación de la molécula ser� entonces emplear procedimientos estereoespec�ficos a fin de mantener la quiralidad deseada.

II. Preparación de los compuestos de fórmula I

35 Como se conoce en la técnica, los compuestos de la presente invención se pueden preparar por un número de técnicas estándar. Los compuestos de Fórmula I, por tanto, se pueden preparar mediante varios métodos sintéticos, por ejemplo, como describen (Grimmett, M.R., Comprehensive Heterocyclic Chemistry: The Structure, Reaction, Synthesis and Uses of Heterocyclic Compounds, A. R. Katrizky y C. W. Rees, eds., Vol. 5, Pergamon Press. Oxford, 1984, pp. 457-498; (Grimmett, M. R., Imidazole and Benzimidazole Synthesis, Academic Press, San Diego CA, 1997).

40 En una realización de la presente invención, los compuestos de fórmula I se preparan mediante síntesis en solución o en fase sólida, mediante reacción de una diona de Fórmula II con el aldeh�do (III) en presencia de acetato de amonio en ácido acético (véase, por ejemplo, Krieg et al., Naturforsch. 1967, 22b, 132; Sarshar et al., Tetrahedron Lett. 1996, 37, 835-838). Bian et al., Synthetic communications 2003, 33, 3477-3482). Hong Xu et al., J. Chem. Soc., Dalton

45 Trans., 2003, 11, 2260-2268). Hong Xu et al., Inorg. Chem. Commun., 2003, 6, 766-768). Bian et al., Polyhedron 2002,

Los compuestos de fórmula (II) y (III) est�n disponibles comercialmente o se pueden preparar usando procedimientos

50 estándar conocidos por un experto en la técnica relevante. Los compuestos de Fórmula (II) se pueden preparar mediante varios métodos sintéticos, por ejemplo, como describen Fischer et. al (J. Am. Chem. Soc. 1961, 83, 4208-4210). Guijarro et al. (J. Am. Chem. Soc. 1999, 121, 4155-4157). Chi et. al. (Synth. Comm. 1994, 2415). 2119-2122) y Armesto et. al. (Synthesis, 1988, 799-801). Yamada et. al. (Bull. Soc Chem. Jpn., 1990, 63, (9), 2710-2712). Hiort et. al.(J. Am. Chem Soc. 1993,115, 3448-3454). y Tetrahedron Letters 2004, 4533). 6361-6363). Los

55 compuestos de fórmula (III) se pueden preparar mediante métodos sintéticos generales descritos por Vilsmeier et. al. (Chem. Ber. 1958, 91, 850-861 and Synthesis 1985, 8, 641-645). Por ejemplo, los compuestos de fórmula (III) se pueden preparar haciendo reaccionar un compuesto de fórmula (IV) con POCl3en dimetilformamida (DMF) como se muestra a continuación:

5 La separación y purificación de los productos (1) se basa generalmente en su propiedad para formar sales solubles en agua. Después de que el medio de reacción se diluye con agua, las impurezas se extraen de la solución obtenida con un disolvente no polar, la capa acuosa se basifica y la imidazo [4,5-d] fenantrolina (1) separada se filtra y se recristaliza en un disolvente adecuado.

10 Análisis de los compuestos de fórmula I

Como se ha descrito en lo que antecede, los compuestos de Fórmula I contemplados para uso en los métodos de la presente invención son capaces de quelar metales de transición y de inhibir la proliferaci�n de células cancerosas. Además, en una realización de la presente invención, los compuestos de fórmula I son capaces de aumentar la

15 expresión de un gen supresor tumoral regulado por metales de transición, tal como KLF4, en células de cáncer. En una realización adicional de la presente invención, los compuestos de fórmula I inducen apoptosis en las células cancerosas y ejercen un efecto citot�xico sobre las células cancerosas.

La capacidad de un compuesto de Fórmula I candidato para quelar metales de transición e inhibir la proliferaci�n

20 celular neopl�sica in vitro e in vivo puede analizarse utilizando técnicas estándar conocidas. De un modo similar, la capacidad de los compuestos para aumentar la expresión de un gen supresor de tumores y / o inducir apoptosis en células de cáncer se puede analizar usando técnicas estándar. Ejemplos de métodos de análisis de los compuestos candidatos de Fórmula I se proporcionan a continuación y en los ejemplos incluidos en el presente documento. Un experto en la técnica entender� que otros métodos de análisis de los compuestos son conocidos en la técnica y

25 también son adecuados para el ensayo de compuestos candidatos.

Los compuestos de Fórmula I que demuestran actividad inhibidora pueden analizarse además in vitro y / o in vivo en combinación con varios agentes quimioterap�uticos conocidos para evaluar su uso potencial en terapias de combinación.

30 Complejos de quelato met�lico de los compuestos de Fórmula I también se contemplan en la presente invención. Tales complejos de quelatos también pueden analizarse usando los métodos descritos a continuación.

a. Capacidad de quelaci�n de metales

35 De acuerdo con la presente invención, los compuestos de fórmula I son capaces de quelar iones de metales de transición en un ambiente celular. En una realización, los compuestos de fórmula I son capaces de quelar iones de hierro, cinc, cobre, rutenio y cobalto. En una realización adicional, los compuestos de fórmula I son capaces de quelar metales de transición de la primera fila. En una realización adicional, los compuestos de fórmula I son capaces de

40 quelar iones de hierro, cinc y cobre. En otra realización de la presente invención, los compuestos de fórmula I son capaces de quelar iones de cinc, En otra realización, los compuestos de fórmula I son capaces de quelar iones de cobre.

Las propiedades quelantes de metales de los compuestos de Fórmula I se pueden determinar usando diversas

45 técnicas conocidas en la materia, incluyendo, entre otros, cristalografía de rayos X, espectroscopia RMN, espectroscopIa de fluorescencia, espectroscopia de absorción atómica (AAS), espectroscopIa de resonancia paramagn�tica de electrones, cromatograf�a de líquidos de alta resolución (HPLC), cromatograf�a de líquidos combinada con espectrometr�a de masas y valoraciones potenciom�tricas.

50 Por ejemplo, el ácido perac�tico (PAA) se descompone rápidamente en presencia de iones de metales tales como manganeso, hierro o cobre. La eficacia de un compuesto quelante para estabilizar soluciones de PAA en presencia de iones met�licos se puede evaluar para determinar la capacidad quelante de metal del compuesto. Brevemente, se puede preparar una solución de agua que contiene iones met�licos y se a�adi� a la solución la cantidad apropiada de un compuesto candidato de Fórmula I, seguido de ajuste del pH y la temperatura. A la estabilidad de las soluciones de

55 PAA que contienen los compuestos de Fórmula I le puede seguir la valoración yodom�trica. Otras pruebas para determinar la capacidad de quelaci�n de metales pueden incluir, por ejemplo, , la medición de iones de metal no quelados en una solución que contiene iones met�licos y un compuesto quelante, con un electrodo selectivo de iones

de metal. Brevemente, una solución que contiene un metal se valora con una solución que contiene un compuesto quelante seguido de la medición con un electrodo selectivo de metales para determinar la cantidad de iones met�licos no quelados, proporcionando de ese modo una indicación de la capacidad quelante de metales de los compuestos de Fórmula I.

La propiedad de quelaci�n de metales de los compuestos de Fórmula I también puede evaluarse espectrofotom�tricamente utilizando el ensayo de unión a metales de 4-(2-piridilazo) resorcinol (PAR) in vitro. El PAR es un colorante disponible comercialmente que se comporta como un ligando terdentato o bidentado para formar complejos coloreados solubles o insolubles con cationes de Mg, Al, Ca, Sr, Ba, Sc, Ti, V, Cr, Mn, Fe, Co, Ni, Cu, Zn, Ga, Y, Zr, Nb, Ru, Rh, Pd, Ag, Cd, In, Sn, Hf, Ta, Os, Ir, Pt, Au, Hg, Tl, Pb, Bi, Th, U, Np y los lant�nidos a valores de pH específicos, con una absorbancia máxima a aproximadamente 500 nm. Para determinar la propiedad de metal-quelaci�n de los compuestos de Fórmula I, los complejos de iones met�licos-PAR resultantes que se forman en presencia de iones met�licos, se pueden medir espectrofotom�tricamente a aproximadamente 500 nm y se puede realizar una comparación entre complejos de iones de metal-PAR que se forman en las muestras que contienen compuestos de fórmula I y las muestras de control, por ejemplo en muestras que contienen un quelante y / o muestras conocidas que no contiene los compuestos de Fórmula I, pero que contiene un vehículo de control.

La capacidad de los compuestos de Fórmula I para quelar metales de transición en un entorno celular se puede evaluar usando métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, mediante la medición de conjuntos quelables de cinc, hierro o cobre intracelular en presencia y ausencia de un compuesto candidato usando indicadores fluorescentes específicos, como zinquin o Phen Green SK (véase, por ejemplo, Zalewski et al., Biochem J. 1993, 296 (Pt 2), 403-8). y Petrat et al., Biol Chem. 2002, 383(3-4), 489-502). Además, la capacidad quelante de metales de los compuestos de Fórmula I en un entorno celular se puede evaluar en varias muestras biológicas, tales como extractos celulares, células aisladas, tejidos, o fluidos corporales, mediante la medición de conjuntos quelables de iones met�licos intracelulares métodos tales como la utilización de cromatograf�a de líquidos de alta resolución (HPLC), detección espectrofotom�trica, resonancia de esp�n electrónico (ESR) o espectroscopia de absorción atómica, como se ha descrito, por ejemplo, en Gower et al., Anal. Biochem. 1989, 180, 126-130). Ollinger and Roberg, J. Biol. Chem. 1997, 272, 23707-23711). Flatmark y Tangeras, Proteins of Iron Metabolism, Brown, Aisen, Fielding, y Crichton, eds. (New York, EE.UU.: Grune y Stratton), 1976, pp. 349-358; Kozlov et al., Free Radic. Biol. Med. 1992, 13, 9-16). Cammack y Cooper, Methods Enzymol. 1993, 227, 353-384. Yegorov et al., Free Radic. Biol. Med. 1993, 15, 565-574). Cairo et al.,

J. Biol. Chem. 1995, 270, 700-703). y Nielsen et al., Int. J.Biochem. 1993, 25, 223-232.

La capacidad quelante de metales de los compuestos de Fórmula I en un entorno celular se puede evaluar indirectamente mediante la evaluación del crecimiento celular, cambios en la expresión de los genes asociados con la regulaci�n de metales, citotoxicidad, ensayos enzim�ticos, u otros criterios de valoración mensurables que son conocidos en la técnica, en presencia del compuesto candidato y variando las concentraciones de los iones met�licos. Por ejemplo, la capacidad de quelaci�n de metales de los compuestos de Fórmula I se puede evaluar en células cultivadas o en animales enteros mediante la manipulación de conjuntos de metales celular y la medición de cambios en el crecimiento celular en presencia y ausencia del compuesto candidato.

Alternativamente, o además de medir los cambios en el crecimiento celular, los cambios en la expresión g�nica de los genes regulados por metales o proteínas reguladoras de metales, tales como metalotione�na, o el factor de transcripción 1 de metales puede determinarse utilizando protocolos estándar conocidos en la técnica. Como se conoce en la técnica, la expresión de proteínas metalotione�na (MT) est� estrechamente regulada por las concentraciones intracelulares de cinc. La unión del cinc al factor de transcripción de metales (MTF-1) permite que la MTF-1 se una a los elementos de respuesta a metal (MRE) en el promotor de MT, que a su vez inicia la transcripción del gen de la MT. Por consiguiente, la capacidad de los compuestos de Fórmula I para modular la expresión de MT o MTF-1 puede determinarse como una indicación de la capacidad de quelantes de metales de los compuestos. Otros genes regulados por metales conocidos en la técnica incluyen,, por ejemplo, los genes que codifican las proteínas reguladoras de hierro (IRP), ferritina, o receptor de la transferrina, que est�n regulados por los niveles de hierro (véase, por ejemplo, Eisenstein y Blemings, J. Nutr. 1998, 128(12):2295-2295; y Martini et al., J. Nutr. 2002, 132(4):693-696; y el gen que codifica la proteína transportadora de cinc 1, que est�n regulada por los niveles de cinc (véase, por ejemplo, Kindermann et al., J. Nutr. 2004, 134(1):57-62; y Langmade et al., J. Biol. Chem. 2000, 275(44):34803-24809).

B. Estudios in vitro

i) Inhibición de la proliferaci�n de células cancerosas

Los compuestos candidatos de Fórmula I se pueden ensayar inicialmente in vitro para determinar su capacidad para inhibir la proliferaci�n de las células de cáncer utilizando técnicas estándar.

En general, la capacidad de un compuesto candidato de Fórmula I para inhibir la proliferaci�n de las células cancerosas puede analizarse del siguiente modo. Las células de una línea celular de cáncer de ensayo específica se cultivan a una densidad adecuada (por ejemplo, aproximadamente 1 x 104) y se añaden varias concentraciones del compuesto candidato. Después de un tiempo de incubaci�n apropiado (típicamente entre aproximadamente 48 a 74 horas), la supervivencia celular se evalúa, por ejemplo, mediante el ensayo de la escisión de la sal de tetrazolio (o la

sal de tetrazolio modificada) o mediante el uso de la prueba de reducción de resazurina (véase Fields y Lancaster (1993) Am. Biotechnol. Lab. 11:48-50; O'Brien et al., (2000) Eur J. Biochem. 267:5421-5426 y la patente de EE.UU. N� 5.501.959), el ensayo de sulforodamina (Rubinstein et al., (1990) J. Natl. Cancer Inst. 82:113 -118), el ensayo con colorante rojo neutro (Kitano et al., (1991) Euro. J. Clin. Investg. 21:53-58; West et al., (1992) J. Investigative Derm. 99:95-100) o el ensayo de XTT. La inhibición de la proliferaci�n celular se determina por comparación de la supervivencia celular en el cultivo tratado con la supervivencia celular en uno o más cultivos control, por ejemplo, los cultivos no tratados previamente con el compuesto candidato, los pre-tratados con un vehículo control y / o los pre-tratados con un compuesto control (típicamente una terapéutico conocido).

Otros ensayos conocidos en la técnica que miden la actividad metabólica (por ejemplo, ensayos basados en tetrazolio) también se pueden usar para evaluar el efecto de los compuestos candidatos sobre la proliferaci�n celular, dado que las células en proliferaci�n tienden a ser metab�licamente más activas que las células en reposo.

Los compuestos candidatos también pueden analizarse in vitro para determinar su capacidad para inhibir el crecimiento independiente de anclaje de las células tumorales. En la técnica se sabe que el crecimiento independiente de anclaje es un buen indicador de la tumorigenicidad. En general, el crecimiento independiente de anclaje se evalúa mediante siembra de las células de una línea celular de cáncer adecuada en agar blando y la determinación del número de colonias formadas después de un periodo de incubaci�n apropiado. El crecimiento de las células tratadas con el compuesto candidato puede compararse con el de las células tratadas con un control apropiado (tal como se ha descrito anteriormente).

Una amplia variedad de líneas celulares de cáncer adecuadas para el ensayo de los compuestos de fórmula I est�n disponibles comercialmente, por ejemplo en la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC; Manassas, VA) suministra en la actualidad más de 700 líneas celulares de cáncer humano y el Depósito de tumores DCTD (NCI en Frederick, MD) suministra una variedad de líneas celulares de mamíferos, incluyendo las líneas celulares de cáncer humano utilizadas en el cribado del NCI / NIH.

Ejemplos de líneas de células de cáncer humano adecuadas contra las que se pueden analizar los compuestos de Fórmula I incluyen, entre otras, las líneas celulares de cáncer de vejiga HT-1376, HT-1197, y Hs 195.T; adenocarcinoma de y carcinoma colon y colorrectal tales como CaCo, COLO320, HCT-116 LoVo, NCI-H498, NCI-H548 y SNU-C2B; la línea celular de cáncer duodenal HuTu 80; las líneas celulares de adenocarcinoma y carcinoma gástrico Hs 740.T, AGS, Hs 746T, NCI-N87, NCI- SNU-1 and RF-48; líneas celulares de cáncer de pulmón macroc�tico NCI-H661 y NCI-H1581; líneas celulares de adenocarcinoma y carcinoma de pr�stata MDA PCa 2b, LNCaP-FGC y 22Rv1; líneas celulares de linfoma de Burkitt (no Hodgkin), líneas celulares Raji, Namalwa y HS Sultan; línea celular de linfoma histioc�tico U-937; línea celular de la leucemia linfobl�stica aguda (LLA-T) de células Jurkat, , línea celular de linfoma de células T Karpas 299; línea celular de leucemia de células plasm�ticas L-363; y líneas celulares de adenocarcinoma y carcinoma rectal NCI-H630 y SW837. Las líneas celulares de cáncer resistentes a los medicamentos también pueden usarse para determinar la capacidad de los compuestos de la presente invención para inhibir el crecimiento y / o proliferaci�n de células neopl�sicas resistentes a un fármaco o a múltiples fármacos.

La selectividad neopl�sica diferencial de los compuestos candidatos de fórmula I también se puede analizar, es decir la capacidad del compuesto para demostrar un cierto nivel de acción selectiva hacia las células neopl�sicas (o cáncer) en comparación con las células normales en proliferaci�n. Un método ejemplar de la evaluación de la sensibilidad diferencial entre las células normales y de cáncer para un compuesto lo ha descrito Vassilev et al. (Anti-Cancer Drug Design (2001) 16:7). Este método implica la comparación de los valores de CI90, es decir la concentración molar de un compuesto de ensayo requerida para causar un 90% de inhibición del crecimiento de células de crecimiento exponencial. Por tanto, Por lo tanto, los valores de CI90, para los compuestos candidatos pueden evaluarse en varias líneas celulares de cáncer (tales como las descritos anteriormente) y las células normales (tales como las células HUVEC y / o WI38) y se compararon. Los valores de CI90se pueden medir utilizando una variedad de técnicas estándar como se conocen en la técnica. La selectividad de las células cancerosas se calcula como una relación entre el promedio de la CI90 para todas las líneas celulares normales y el promedio de CI90 para todas las líneas celulares de cáncer. Los compuestos con una relación de CI90 (normal / cáncer) de > 4 se consideran selectivos para las células cancerosas (L.T. Vassilev et al., Anti-cancer Drug Design, 2001, 16: 7-17).

En una realización de la presente invención, los compuestos de Fórmula I inhiben selectivamente la proliferaci�n de una o más de las células de leucemia, células de cáncer de pr�stata, células de cáncer de pulmón macroc�tico y células de cáncer de colon. La selectividad de los compuestos candidatos se evalúa utilizando líneas celulares de cáncer humano utilizados en el Programa de Medicamentos del NCI / NIH Terapéutico in vitro. Las líneas de células de cáncer que se usan en este cribado se muestran en la Tabla 1 ant.

De acuerdo con esta forma de realización de la presente invención, un compuesto muestra inhibición selectiva de un cáncer seleccionado (es decir, cáncer de pr�stata, cáncer de colon, cáncer de pulmón macroc�tico y / o leucemia) cuando el compuesto inhibe la proliferaci�n de las líneas celulares del cáncer seleccionado con un promedio del GI50 al menos un 10% más bajo que el promedio de GI50 para la inhibición de las líneas celulares de cada uno de cáncer de mama, cáncer del SNC, melanoma, cáncer de ovarios y cáncer renal. En una realización, el GI50 promedio para las células del cáncer de pr�stata, células de cáncer de colon, células de cáncer de pulmón macroc�tico y / o células de

leucemia es al menos un 15% más bajo que el promedio del GI50 para la inhibición de las líneas celulares de cada uno de cáncer de mama, cáncer del SNC, melanoma, cáncer de ovarios y cáncer renal. En otra realización, el GI50 promedio para las células del cáncer de pr�stata, células de cáncer de colon, células de cáncer de pulmón macroc�tico y / o células de leucemia es al menos un 20% más bajo que el promedio del GI50 para la inhibición de las líneas celulares de cada uno de cáncer de mama, cáncer del SNC, melanoma, cáncer de ovarios y cáncer renal.

M�todos para calcular elGI50 son conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Boyd, M. R., et al. En Cytotoxic Anticancer Drugs: Models and Concepts for Drug Discovery and Development; Vleriote, F. A.; Corbett, T. H.; Baker, L. H., Eds.; Kluwer Academic: Hingham, MA, 1992 y Monks, A.; et al. (1991) JNCI, J. Natl. Cancer Inst. 83, 757-766). pp 11-34). Como se describe en la técnica, el GI50 es un cambio de nombre del valor de la CI50 (la concentración que provoca la inhibición del crecimiento del 50%) que hace hincapié en la corrección en el cálculo del GI50 para el recuento

y en la que: la densidad óptica del ensayo después de un período de 48 h de exposición al fármaco de ensayo es T, la densidad óptica a tiempo cero es T0, y la densidad óptica control es C.

Por ejemplo, la siguiente metodología, que emplea actualmente el NCI, se puede utilizar para evaluar el GI50 de un compuesto candidato de Fórmula I en las líneas celulares de cáncer seleccionadas Brevemente, las suspensiones de células se diluyen (5000-40.000 células por pocillo) y 100 μl de la suspensión celular diluida se añaden a placas de microtitulaci�n de 96 pocillos. A los inoculados se les permite un periodo de preincubaci�n de 24 horas a 37 �C para su estabilizaci�n. Las diluciones al doble de la concentración de ensayo prevista del compuesto candidato se añaden a tiempo cero en alícuotas de100 μl a los pocillos de la placa de microtitulaci�n. Los compuestos de ensayo generalmente se evalúan a cinco diluciones de 10 veces. En las pruebas de rutina, la concentración más alta de pocillo normalmente es 10E-4 M, pero se puede ajustar dependiendo del compuesto se est�+ analizando Las células se incuban con el compuesto de ensayo durante 48 horas en atmósfera del 5% de CO2y una humedad del 100%. Las células se analizan después usando el ensayo de sulforrodamina B (véase, por ejemplo, Skehan, P., et al. (1990) JNCI, J. Nntl. Cancer Inst. 82, 1107-1112). y Chen, S. F., et al. (1990) Proc. Am. Assoc. Cancer Res. 31, A2644) usando un lector de placas que puede usarse para leer las densidades ópticas.

ii) Capacidad para aumentar la expresión de genes supresores tumorales reguladas por metales de transición

De acuerdo con una realización de la presente invención, los compuestos de fórmula I aumentan la expresión de un gen supresor tumoral regulado por metales de transición en células de cáncer. En otra realización, los compuestos de Fórmula I aumentan la expresión del gen supresor de tumores en células de cáncer en el que la expresión del gen supresor de tumores est� regulada por disminución. La expresión aumentada o regulada por aumento de un gen supresor de tumores regulado por metales de transición en células de cáncer se puede determinar como un porcentaje del aumento en la expresión del gen en las células tratadas en comparación con las células no tratadas. En una realización, los compuestos de Fórmula I aumentan la expresión de un gen supresor tumoral regulado por metales de transición en aproximadamente un 10%. En otra realización, los compuestos de Fórmula I aumentan la expresión de un gen supresor tumoral regulado por metales de transición en aproximadamente un 20%. En otras realizaciones, los compuestos de Fórmula I aumentan la expresión de un gen supresor tumoral regulado por metales de transición en aproximadamente un 25%. 50%, 75% o 100%.

El aumento o la regulaci�n por aumento de la expresión de un gen supresor de tumores regulado por metales de transición en células de cáncer también se puede determinar como una "multiplicación" o regulaci�n por aumento de la expresión del gen en las células cancerosas, en el que la expresión de genes en las células cancerosas no tratadas se presenta como "1" y la respectiva “multiplicación” en la expresión g�nica en las células cancerosas tratadas se presenta con relación a la respectiva expresión g�nica en las células cancerosas no tratadas. En una realización de la presente invención, los compuestos de Fórmula I pueden aumentar o regular por aumento la expresión de un gen supresor tumoral regulado por metales de transición en aproximadamente 1,5 veces. En otra realización, los compuestos de Fórmula I pueden aumentar la expresión de un gen supresor tumoral regulado por metales de transición en aproximadamente 2,0 veces.

En otra realización de la invención, el gen supresor de tumores regulado por metales de transición es KLF4. La capacidad de los compuestos candidatos para modular la expresión de los genes supresores de tumores, tales como KLF-4, se puede evaluar midiendo los cambios en los niveles de ARNm o proteína deKLF4. Métodos de la realización de estos ensayos se conocen en la técnica.

Por ejemplo, el compuesto candidato se puede introducir en una línea celular de cáncer seleccionada y la cantidad de ARNm transcrito a partir del gen supresor de tumor de interés se puede medir por técnicas estándar tales como análisis de transferencia de tipo Northern, RT-PCR, y similares. Alternativamente, la cantidad de proteína supresora de tumores producida por la célula se puede medir mediante técnicas estándar tales como análisis de transferencia de tipo Western. La cantidad de ARNm o proteína producida en una célula tratada con el compuesto candidato puede compararse a continuación con la cantidad producida en las células control y proporcionarán una indicación de cómo el

compuesto ha inhibido la expresión del gen supresor de tumores con éxito. Las células de control adecuadas incluyen, por ejemplo, células no tratadas y / o células tratadas con un compuesto de control.

Alternativamente, los compuestos candidatos pueden cribarse según su capacidad de aumentar la expresión g�nica en una línea celular de cáncer seleccionada usando métodos estándar para la expresión de múltiples genes de selección ("perfil de expresión"). Tales métodos son bien conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, análisis en micromatriz: tales como ensayos de micromatrices de alta densidad que contienen 10 veces más (por ejemplo, 119.000) genes humanos para identificar grupos funcionales adecuados de los genes cuya expresión se ve afectada por el compuesto.

Por lo general, el perfil de expresión hace uso de micromatrices prefabricadas de secuencias cortas de ADN u oligonucle�tidos. Métodos de construcción de micromatrices se conocen bien en la técnica (véase, por ejemplo, Ausubel, et al. Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc, NY. (1y actualizaciones)]. Como alternativa, las micromatrices pueden ser adaptadas por ejemplo, para incluir secuencias correspondientes a genes supresores de tumores conocidos. Las micromatrices prefabricadas también est�n disponibles comercialmente para muchos organismos, incluyendo, por ejemplo, GeneChip� (Affimetrix, Santa Clara, CA), Atlas™ (BD Biosciences-CLONTECH, Palo Alto, CA), GEM Microarrays, GeneJet™ array y LifeSeq� (Incyte Genomics, Palo Alto, CA), MICROMAX™ Human cDNA Microarray Systems (PerkinElmer Life Sciences, Boston, Mass.) y ResGen™ GeneFilters� (Invitrogen, Huntsville, Ala.). Para el análisis de la expresión, se aísla el ARN de las células tratadas con el compuesto candidato y a partir de las células control. En caso necesario el ARN se puede amplificar mediante técnicas convencionales para asegurar una cantidad suficiente para el análisis. El ARN se hibrida después con la micromatriz en condiciones adecuadas y se realiza un análisis de rutina de la micromatriz por los esc�neres disponibles en el mercado y el software para identificar los genes cuya expresión est� alterada en las células tratadas con respecto a las células de control. Un experto en la técnica puede determinar fácilmente las condiciones de hibridación adecuadas usando técnicas estándar. Después de la identificación de dichos otros genes,, la cuantificación del ARNm y los respectivos niveles de proteína también se pueden evaluar para determinar la medida del efecto del compuesto sobre los genes objeto de la investigación.

iii) Inducción de la apoptosis

De acuerdo con otra forma de realización de la presente invención, los compuestos de fórmula I son capaces de inducir apoptosis en células cancerosas. Métodos de evaluación de la capacidad de los compuestos candidatos para inducir apoptosis son conocidos en la técnica (véase,, por ejemplo, Current Protocols in Cell Biology, (2000 y actualizaciones,

K. Morgan, ed., J. Wiley & Sons, Nueva York, NY) e incluyen, por ejemplo, análisis de la fragmentación del ADN, citometr�a de flujo en combinación con la tinción de anexina con V-FITC y yoduro de propidio, marcaje con fluorocromo de las rorutas de la cadena de ADN mediante la desoxinucleotidil transferasa terminal (ensayo TdT) y análisis por citometr�a de flujo, detección por citometr�a de flujo o detección in situ con inmunocitoqu�mica utilizando ensayo de marcaje en muesca terminal con dUTP mediado por la desoxinucleotidil transferasa terminal (TdT) (TUNEL), detección con inmunohistoqu�mica o citometr�a de flujo de escisión proteol�tica o prote�lisis de la poli (ADP-ribosa) polimerasa (PARP), y / o detección de la activación de las cisteinil - proteasas de ácido asp�rtico (caspasas).

Por ejemplo, el efecto de los compuestos de Fórmula I sobre la apoptosis puede evaluarse mediante la incubaci�n de las células con el compuesto candidato durante un período de tiempo, seguido de análisis de citometr�a utilizando el método de anexinaV-FITC-yoduro de propidio. La entrada en la apoptosis conduce a la translocaci�n de la fosfatidilserina desde la cara interna hacia el lado extracelular de la membrana plasm�tica. La anexina V, una proteína que se une con alta afinidad a la fosfatidilserina, se puede utilizar para detectar esta alteración de la membrana inducida por apoptosis. El colorante de unión a ADN, yoduro de propidio (PI), entra fácilmente y tiñe las células no viables, pero no puede atravesar la membrana de las células viables. Por lo tanto, las células que se tiñen con anexina V sólo se consideran en la apoptosis temprana, mientras que las células teñidas con tanto con anexina V y PI se considera que est�n en apoptosis tardía. Las células teñidas con PI sólo se consideran no viables, mientras que la ausencia de tinción indica células viables.

Los ensayos para investigar los posibles mecanismos de acción de los compuestos se pueden realizar si se desea con el fin de proporcionar información útil para determinar qué aspectos del crecimiento de tumores afectan a los compuestos. Este tipo de información puede ayudar a determinar los tipos de cáncer que se beneficiarán del tratamiento con los compuestos. Ejemplos de dichos ensayos incluyen, entre otros, análisis del ciclo celular (por ejemplo, empleando técnicas de citometr�a de flujo), ensayos anti-angiog�nesis (por ejemplo, varios ensayos de Matrigel, incluyendo ensayos de formación del cordón Matrigel y el análisis inmunohistoqu�mico.

C. Ensayo in vivo

La capacidad de los compuestos candidatos para inhibir el crecimiento tumoral, la proliferaci�n y / o la metástasis in vivo se puede determinarse en un modelo animal apropiado utilizando técnicas estándar conocidas en la técnica (véase, por ejemplo, Enna, et al. Current Protocols in Pharmacology, J. Wiley & Sons, Inc., Nueva York, NY). Exemplary protocols are provided below and in the Examples.

Por ejemplo, la actividad in vivo de los compuestos candidatos también se puede probar usando el ensayo de la fibra hueca (Hollingshead, M., et al. (1995) Life Sciences 57:131-141; y Decker et al., Eur. J. of Cancer 40: 821-826 (2004)). En este ensayo, las células que crecen en fibras huecas (fluoruro de polivinilideno, PVDF), se implantan en diversos compartimentos del cuerpo de los ratones. Un panel estándar de 12 líneas de células tumorales puede usarse para el cribado en fibra hueca de compuestos candidatos que han presentado actividad in vitro. Estas líneas celulares pueden incluir NCI-H23, NCI-H522 MDA-MB-231, MDA-MB-435 SW-620 COLO 205 LOX-IMVI, UACC-62 OVCAR-3 OVCAR-5 U251 y SF-295. Además, se pueden utilizar líneas alternativas, tales como las descritas en la sección in vitro anterior, para pruebas especializadas de compuestos. Las líneas celulares se cultivan de acuerdo con protocolos estándar, las fibras se preparan mediante el lavado las células en las fibras de PVDF y sellado de ellos a intervalos de 2 cm. Las muestras generadas a partir de estos sellos se colocan en medio de cultivo de tejidos y se incubaron a 37 �C en 5% de CO2 durante de 24 a 48 horas antes de la implantación. Un total de 3 líneas tumorales diferentes se preparan para cada experimento de manera que cada ratón recibe 3 implantes inhaperitoneales (1 de cada línea tumoral) y 3 implantes subcutáneos (1 de cada línea tumoral). El día de la implantación, las muestras de cada preparación de línea de células tumorales se cuantifican para la masa de células viables mediante, por ejemplo, un ensayo MTT de punto final estable, de modo que se conoce el tiempo de la masa de células cero. Los ratones se tratan con agentes experimentales a partir del día 3 o 4 después de la implantación de la fibra y continuando diariamente durante 4 días. Cada agente se administra por inyección intraperitoneal a 2 niveles de dosis. Las fibras se recogen de los ratones en el día siguiente del cuatro tratamiento con el compuesto y se sometieron a ensayo MTT de punto final estable. La densidad óptica de cada muestra se determin� espectrofotom�tricamente a 540 nm y se calcula la media de cada grupo de tratamiento. El crecimiento neto por ciento para cada línea celular en cada grupo de tratamiento se calcula y se compara con el crecimiento neto por ciento en los controles tratados con vehículo. Una reducción del 50% o superior en el porcentaje del crecimiento neto en las muestras tratadas en comparación con las muestras de control de vehículo se considera un resultado positivo Cada resultado positivo se le da una puntuación de 2 y todas las puntuaciones se suman para un compuesto dado. La puntuación máxima posible para un agente es 96 (12 líneas celulares X 2 X 2 sitios niveles de dosis X 2 [puntuación])

Un compuesto candidato que somete inicialmente a detección selectiva en el ensayo de fibra hueca puede analizarse después en un modelo de xenotrasplante si tiene una puntuación combinada i.p. + s.c. de 20 o mayor, una puntuación

s.c. de 8 o mayor, o produce la muerte de células de cualquier línea celular a cualquier nivel de dosis evaluado. Este sistema de puntuación ha sido validado por los estadísticos DCTDC en CTEP para que represente un nivel de detección previsto para los agentes actuales "estándar" como activos.

Alternativamente, los compuestos de Fórmula I se pueden probar directamente en modelos de xenoinjertos. Los modelos de xenoinjerto, en los que un tumor humano se ha implantado en un animal, son un modelo estándar en el que evaluar la actividad anticancerosa de un compuesto candidato. Ejemplos de modelos de xenoinjerto de cáncer humano incluyen entre otros, xenoinjertos de tumores sólidos humanos implantados mediante inyección subcutánea o implantación y utilizados en ensayos de crecimiento de tumor; isoinjertos de tumores sólidos humanos implantados mediante inyección almohadilla de grasa y usados en ensayos de crecimiento del tumor; xenoinjertos de tumores humanos sólidos ortot�picos, implantados directamente en el tejido relevante y utilizados en ensayos de crecimiento tumoral; modelos de enfermedad diseminada para los tumores sólidos o leucemias, a través de inyección intravenosa, utilizado en ensayos de supervivencia; modelos experimentales de linfoma y leucemia en ratones, utilizados en ensayos de supervivencia; y modelos experimentales de metástasis pulmonar en ratones. Además de las células de tumores humanos implantados, los modelos de xenoinjerto pueden comprender además leucocitos de sangre periférica humanos transplantados, que permiten la evaluación de la respuesta inmunol�gica contra el cáncer. En diversos modelos de xenoinjerto, las células de tumores humanos implantados o trasplantados pueden ser células tumorales primarias o células tumorales derivadas de una línea celular.

Existen varias opciones animal huésped para los modelos de xenoinjerto, que incluyen, entre otros, el uso de ratones inmunodeficientes combinados graves (SCID), ratones desnudos atómicos, ratas atómicas. Los ratones no obesos diabéticos / inmunodeficientes graves combinados (NOD / SCID) representan otro animal huésped que se puede utilizar en diversos modelos de trasplante de xenoinjerto, por ejemplo, para el injerto de las células de cáncer hematol�gicas, tales como células de leucemia y / o de linfoma.

Alternativamente, murine cancer models can be used for screening anti-tumour compounds. Ejemplos de modelos de cáncer murino apropiados se conocen en la técnica e incluyen, entre otros, modelos de implantación en los que las células cancerosas murinas se implantan mediante inyección intravenosa, subcutánea, en la almohadilla de grasa u ortot�pica; modelos de metástasis murina; modelos de ratones transg�nicos y los modelos de ratones defectivos. The effect of the candidate compound can also be assessed on spontaneous tumours in normal mice.

Por ejemplo, los compuestos candidatos pueden analizarse in vivo en tumores sólidos utilizando ratones a los que se haya injertados subcut�neamente o inyectado de 30 a 60 mg de un fragmento de tumor, o un número apropiado de células tumorales (por ejemplo, aproximadamente de 106 a 107) el día 0. Los animales portadores de tumores se mezclan antes de ser sometidos a los diversos tratamientos y controles. En el caso del tratamiento de tumores avanzados, se permite el desarrollo de los tumores hasta el tamaño deseado, eliminándose a los animales con tumores desarrollados insuficientemente. Los animales elegidos se distribuyen aleatoriamente para someterlos a los tratamientos y controles. Los animales no portadores de tumores también pueden ser sometidos a los mismos tratamientos que los animales portadores de tumores para poder disociar el efecto tóxico del efecto específico sobre el tumor. La quimioterapia generalmente comienza entre 3 y 22 días después del injerto, dependiendo del tipo de tumor, y los animales se observan cada día. Los compuestos candidatos pueden administrarse a los animales, por ejemplo, mediante infusión en bolo. Los diferentes grupos de animales se pesan cerca de 3 o 4 veces a la semana hasta que se

5 alcance la máxima pérdida de peso, después de lo cual los grupos se pesan por lo menos una vez a la semana hasta el final del ensayo.

Los tumores se miden aproximadamente 2 o 3 veces a la semana hasta que el tumor alcanza un tamaño y / o peso predeterminado, o hasta que haya transcurrido un período de tiempo predeterminado, o hasta que el animal muere (si

10 esto ocurre antes de que llegue al tumor del tamaño / peso predeterminado). Los animales se sacrifican a continuación y se evalúa la histología de tejido, el tamaño y / o la proliferaci�n del tumor.

El efecto de los compuestos candidatos sobre tumores resistentes a los fármacos puede evaluarse in vivo mediante la utilización de una célula de cáncer resistente a uno o a varios fármacos en los experimentos de xenoinjertos.

15 Para el estudio del efecto de los compuestos candidatos en los tumores hematol�gicos, tales como linfomas o leucemias, se injerta o inyecta en los animales un número particular de células, y la actividad antitumoral se determina por el aumento del tiempo de supervivencia de la los ratones tratados respecto a los controles. La evaluación de la carga de enfermedad en modelos de xenoinjerto de leucemia también se puede realizar mediante la medición de

20 varios indicadores de la leucemia, tales como marcadores de superficie celular o la expresión de genes específicos de leucemia, usando citometr�a de flujo o reacción en cadena de la polimerasa (PCR) a partir de muestras de sangre en serie.

Para el estudio del efecto de los compuestos candidatos en la metástasis celular, las células tumorales se tratan

25 típicamente con el compuesto ex vivo y luego se inyecta en un animal de ensayo adecuado. La propagación de las células tumorales desde el sitio de inyección se monitoriza a continuación, durante un período de tiempo adecuado.

La capacidad de los compuestos candidatos para actuar en combinación con, o para sensibilizar a un tumor a los de, otro agente quimioterap�utico también puede analizarse en los modelos anteriores. En este caso, los animales de

30 ensayo se tratarían tanto con el agente quimioterap�utico como con el compuesto candidato de Fórmula I. Los animales control podían incluir animales tratados con el agente quimioterap�uticos solos, animales tratados con el compuesto candidato solo y / o animales no tratados.

Los efectos tóxicos in vivo de los compuestos de Fórmula I pueden evaluarse mediante técnicas estándar, por ejemplo,

35 mediante la medición de su efecto sobre el peso corporal de los animales durante el tratamiento y mediante la realización de perfiles hematol�gicos y análisis de enzimas hepáticas después de que el animal ha sido sacrificado (ensayos de supervivencia).

Tabla 2: Ejemplos de modelos in vivo de cáncer humano 5

MODELO DE CÁNCER

TIPO DE CÉLULA

Ensayo de crecimiento tumoral

Pr�stata (PC-3, DU145)

Xenoinjertos de tumores sólidos humanos en ratones (inyección subcutánea)

Mama (MDA-MB-231, MVB-9) Colon (HT-29)

Pulm�n (NCI-H460, NCI-H209) De páncreas (ASPC-1, SU86.86) De páncreas: resistente a fármacos (BxPC-3) De piel (A2058, C8161) Cervical (SIHA, HeLa-S3) Cervical: resistente a fármacos (HeLa resistente a S3-HU) De hígado (HepG2) De cerebro (U87-MG) Renal (Caki-1, A498 De ovarios (SK-OV-3) De vejiga urinaria (T24)

Ensayo de crecimiento tumoral isoinjertos de tumores sólidos humanos en ratones (inyección en la almohadilla de grasa)

De mama resistente a fármacos (MDA-CDDP-S4, MDA-MB435-To.1)

Ensayo de supervivencia Modelo experimental de linfoma y leucemia en ratones

Humano: Linfoma de Burkitt (no Hodgkin) (Raji Namalwa, HS Sultan), linfoma histioc�tico (U-937), leucemia miel�gena crónica (K-562), leucemia linfobl�stica aguda (LLA-T) (Jurkat, CEM, MOLT-4), linfoma de linfocitos T (Karpas 299), leucemia de células plasm�ticas (L-363) Murino: eritroleucemia (inducida por retrovirus de CB7 Friend), leucemia linfoc�tica (L1210), linfoma (P388)

Adem�s, si se desea, el efecto del compuesto de Fórmula I sobre el nivel de expresión de un gen supresor de tumores regulado por metales de transición se puede evaluar en el tumor de los animales de ensayo midiendo, por ejemplo, los cambios en los niveles de ARNm o proteicos del supresor tumoral . Métodos de la realización de estos ensayos se conocen en la técnica como se ha descrito anteriormente.

Si se desea, una o más pruebas de inmunohistoqu�mica estándar también pueden llevarse a cabo en tejidos aislados de los animales de ensayo con el fin de determinar los efectos del compuesto sobre el crecimiento, diferenciación, apoptosis y/o angiog�nesis. Ejemplos de dichos ensayos incluyen, entre otros, el uso de anticuerpos específicos (por ejemplo, anticuerpos contra Ki-67 para evaluar la proliferaci�n, CD31para evaluar la angiog�nesis, NK1.1 como una indicación de la presencia de células NK, F4/80 como una indicación de la presencia de macr�fagos) y los ensayos de TUNEL para determinar la apoptosis.

D. Ensayos de toxicidad

Los compuestos de Fórmula I también se pueden someter a ensayos de toxicidad si se desea. Los ensayos de toxicidad de los medicamentos potenciales son bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Hayes, A.W., ed., (1994), Principles and Methods of Toxicology, 3� ed., Raven Press, NY. Maines, M., ed., Current Protocols in Toxicology, John Wiley & Sons, Inc., NY).

Los ensayos de toxicidad de un compuesto de fórmula I se pueden realizar usando líneas de células de mamífero (véase, por ejemplo, Ekwall, B., Ann. N.Y. Acad. Sci., (1983) 407:64-77). La selección de una línea celular apropiada es dependiente de la aplicación potencial del compuesto candidato y la puede determinar fácilmente un experto en la técnica. Por ejemplo, estos ensayos incluyen el tratamiento de fibroblastos primarios humanos in vitro con los compuestos de Fórmula I en la presencia de un vehículo comercial Las células se analizan en diferentes puntos de tiempo después del tratamiento para determinar su viabilidad usando un ensayo de viabilidad estándar, tales como el ensayo de exclusión con azul trip�n, ensayos XTT o MTT. Las células también pueden analizarse para determinar su capacidad para sintetizar ADN, por ejemplo, usando un ensayo de incorporación de timidina, y para cambios en la dinámica del ciclo celular, por ejemplo, utilizando un ensayo estándar de clasificación de células en combinación con un clasificador de células fluorocit�metro (FACS).

Los ensayos de toxicidad in vivo se pueden realizar por metodología estándar, por ejemplo, mediante la inyección de concentraciones variables del compuesto candidato en un modelo animal apropiado. El compuesto puede inyectarse una vez, o la administración puede repetirse durante varios días. Los efectos tóxicos del compuesto se pueden evaluar durante un período de tiempo apropiado monitorizando la mortalidad, cambios en el comportamiento, aspecto, y el peso corporal de los animales. Después de la finalización del período de evaluación, los animales se pueden sacrificar y determinar el aspecto y el peso de los órganos relevantes. En caso necesario se pueden realizar evaluaciones adicionales de, por ejemplo, los perfiles hematol�gicos, la histología, y análisis de enzimas hepáticas. También se puede obtener una indicación de la toxicidad de un compuesto durante los ensayos in vivo del compuesto.

La genotoxicidad de los compuestos de Fórmula I se puede evaluar in vitro, en caso necesario, utilizando técnicas estándar, tales como el ensayo de Ames o el cribado de la actividad mutag�nica. el ensayo de linfoma de ratón para determinar la capacidad de un artículo de ensayo para inducir la mutación de genes en una línea celular de mamífero, ensayos in vitro de aberración cromos�mica utilizando, por ejemplo, células de ovario de h�mster chino (CHO) para determinar cualquier reordenamiento del ADN o daños inducidos por el artículo de ensayo Otros ensayos incluyen el ensayo de crom�tidas hermanas, que determina cualquier intercambio entre los brazos de un cromosoma inducido por el artículo de ensayo y ensayos in vitro de micron�cleos de ratón para determinar cualquier daño a los cromosomas o al huso mit�tico. La genotoxicidad de los compuestos de Fórmula I también puede evaluarse in vivo, si es necesario, utilizando el ensayo de intercambio de crom�tidas hermanas, in vivo, iensayo de micron�cleos n vivo, o el ensayo de aberración cromos�mica in vivo. Los protocolos para estos y otros ensayos convencionales son conocidos en la técnica, por ejemplo, véase OECD Guidelines for the Testing of Chemicals and protocols developed by the ISO.

IV. Usos de los Compuestos de Fórmula I

Los compuestos de fórmula I se pueden usar para tratar, estabilizar o prevenir el cáncer en un sujeto. En este contexto, los compuestos pueden ejercer un efecto citot�xico o citost�tico que resulta en una reducción del tamaño de un tumor, la ralentizaci�n o la prevención de un aumento en el tamaño de un tumor, un aumento en el tiempo de supervivencia libre de enfermedad entre la desaparición o la eliminación de un tumor y su reaparición, la prevención de una ocurrencia inicial o posterior de un tumor (por ejemplo metástasis), un aumento en el tiempo hasta la progresión, la reducción de uno o más de los síntomas adversos asociados con un tumor, o un aumento en la el tiempo de supervivencia global de un sujeto que tiene cáncer. De acuerdo con una realización de la presente invención, los compuestos de Fórmula I ejercen un efecto citot�xico sobre las células cancerosas a través de la inducción de la apoptosis en las células cancerosas.

Ejemplos de tumores incluyen, entre otros, neoplasias hematol�gicas, incluyendo leucemias mielomas y linfomas; carcinomas, incluyendo adenocarcinomas y carcinomas de células escamosas; melanomas y sarcomas. carcinomas y sarcomas también se denominan con frecuencia "tumores sólidos." Ejemplos de tumores sólidos habituales incluyen entre otros, cáncer de cerebro, de mama cuello de útero, colon, de cabeza y cuello, de ri��n, pulmón, de ovario, páncreas, pr�stata, de estómago y de útero, cáncer de pulmón macroc�tico y cáncer colorrectal. Varias formas de linfoma también pueden resultar en la formación de un tumor sólido y, por tanto, también se consideran a menudo tumores sólidos.

Una realización de la presente invención proporciona compuestos de la Fórmula I para uso en el tratamiento de uno o más de cáncer de pr�stata, cáncer de pulmón no microc�tico, cáncer de colon y leucemia. Además, De acuerdo con una realización de la presente invención, los compuestos de fórmula I se pueden utilizar en el tratamiento de un cáncer para aumentar la expresión de un gen supresor regulado por metales de transición en células cancerosas. En una realización específica, los compuestos de fórmula I se pueden usar para tratar, estabilizar o prevenir un cáncer en el que el gen supresor tumoral regulado por metales KLF4 funciona como un supresor de tumores, incluyendo c�nceres del tracto gastrointestinal (GI), cáncer de vejiga y leucemia. Los c�nceres del tracto gastrointestinal (estómago) incluyen c�nceres esof�gicos, c�nceres de intestino delgado, c�nceres de duodeno, c�nceres de colon; c�nceres colorrectales, c�nceres rectales y c�nceres anales.

En una realización, la presente invención proporciona un compuesto de fórmula I para uso para aumentar la expresión de un gen supresor tumoral regulado por metales de transición en células de cáncer. En otra realización, la invención proporciona un compuesto de fórmula I para uso para aumentar la expresión del gen supresor tumoral KLF4.

Los c�nceres que pueden tratarse de acuerdo con una realización de la presente invención, por lo tanto, incluyen, entre otros, leucemias; adenocarcinomas y carcinomas, incluyendo los carcinomas de células escamosas. Los carcinomas también se denominan con frecuencia "tumores sólidos", como se ha descrito anteriormente. y ejemplos de tumores sólidos habituales que se pueden tratar de acuerdo con la presente invención incluyen, entre otros, cáncer anal, cáncer de vejiga, cáncer de colon, cáncer colorrectal, cáncer de duodeno, cáncer gástrico (de estómago), cáncer de pulmón (macroc�tico), cáncer de esófago, cáncer de pr�stata, cáncer rectal y cáncer de intestino delgado. De acuerdo con lo anterior, una realización de la presente invención proporciona el uso de compuestos de fórmula I en el tratamiento de un cáncer seleccionado de entre el grupo de leucemia, cáncer de vejiga, cáncer de pulmón (macroc�tico), cáncer de pr�stata y un cáncer de la tracto GI, en el que los c�nceres del tracto GI incluyen, entre otros, cáncer anal, cáncer de colon, cáncer colorrectal, cáncer de duodeno, cáncer gástrico (de estómago), cáncer esof�gico, cáncer rectal y cáncer de intestino delgado.

El término "leucemia" se refiere, en términos generales, a las enfermedades malignas progresivas de los órganos que forman la sangre. La leucemia se caracteriza típicamente por una proliferaci�n y desarrollo distorsionados de los leucocitos y sus precursores en la sangre y la médula ósea, pero también puede referirse a enfermedades malignas de otras células de la sangre tales como eritroleucemia, que afecta a los glóbulos rojos inmaduros. La leucemia se clasifica generalmente cl�nicamente sobre la base de (1) la duración y el carácter de la enfermedad, aguda o crónica;

(2) el tipo de célula implicada - mieloide (miel�gena), linfoide (linf�gena), o monoc�tica, y (3) el aumento o la falta de aumento en el número de células anormales en la sangre leuc�mica o aleuc�mica (subleuc�mica). La leucemia incluye, por ejemplo, leucemia no linfoc�tica aguda, leucemia linfoc�tica crónica, leucemia granuloc�tica aguda, leucemia granuloc�tica crónica, leucemia promieloc�tica aguda, leucemia de células T adultas, leucemia aleuc�mica, leucemia aleucocit�mica, leucemia bas�fila, leucemia de blastocistos, leucemia bovina, leucemia mieloc�tica crónica, leucemia cutis, leucemia embrionaria, leucemia eosinof�lica, leucemia de Gross leucemia de células pilosas, leucemia hemobl�stica, leucemia hemocitobl�stica, leucemia histioc�tica, leucemia de células madre, leucemia monoc�tica aguda, leucemia leucop�nica, leucemia linfática, leucemia linfobl�stica, leucemia linfoc�tica, leucemia linf�gena, leucemia linfoide, leucemia de células linfosarcoma, leucemia mastoc�tica, leucemia megacarioc�tica, leucemia micromielobl�stica, leucemia monoc�tica , leucemia mielobl�stica, leucemia mieloc�tica, leucemia granuloc�tica mieloide, leucemia mielomonoc�tica, leucemia de Naegeli, leucemia de células plasm�ticas, leucemia plasmac�tica, leucemia promieloc�tica, leucemia de células de Rieder, leucemia de Schilling, leucemia de células madre, leucemia subleuc�mica, y leucemia de células indiferenciadas.

El término "carcinoma" se refiere a un nuevo crecimiento maligno compuesto de células epiteliales que tienden a infiltrarse en los tejidos circundantes y dan lugar a metástasis. El término "carcinoma" abarca también los adenocarcinomas. Los adenocarcinomas son carcinomas que se originan en las células que hacen que los órganos que tienen propiedades glandulares (de secreción) o que se originan en las células que revisten las vísceras huecas, stales como el tracto gastrointestinal o el epitelio bronquial,, , e incluyen los adenocarcinomas de pulmón y de pr�stata.

De acuerdo con la presente invención, los compuestos de acuerdo con la Fórmula I se pueden utilizar para tratar varias etapas y grados del desarrollo y progresión de las células de cáncer, tumor y / o el cáncer. La presente invención, por tanto, contempla las combinaciones para su uso en el tratamiento de c�nceres en fase inicial, incluyendo principios de neoplasias que pueden ser pequeñas, de crecimiento lento, localizadas y / o no agresivas, por ejemplo, con la intención de curar la enfermedad o provocar la regresión de la cáncer, as� como en el tratamiento de la fase intermedia y en el tratamiento de los c�nceres en etapa tardía, incluyendo neoplasias avanzadas y/o metast�sicas y/o agresivas, por ejemplo, para retardar la progresión de la enfermedad, para reducir la metástasis o para aumentar la supervivencia

del paciente. De un modo similar, las combinaciones se pueden usar en el tratamiento de c�nceres de bajo grado, c�nceres de grado intermedio y de alto grado.

La presente invención también contempla que los compuestos se pueden utilizar en el tratamiento de c�nceres indolentes, c�nceres recurrentes, incluidos los c�nceres localmente recurrentes, recurrentes a distancia y / o refractarios (es decir,. c�nceres que no han respondido al tratamiento), c�nceres metast�sicos, c�nceres localmente avanzados y cáncer agresivos. Por tanto, un cáncer "avanzado" incluye el cáncer localmente avanzado y cáncer metast�sico y se refiere a la enfermedad manifiesta en un paciente, en el que dicha enfermedad manifiesta no es susceptible de curarse mediante las modalidades locales de tratamiento, como la cirugía o la radioterapia. El término "cáncer metast�sico" se refiere al cáncer que se ha diseminado de una parte del cuerpo a otra. Los c�nceres avanzados también pueden ser resecables, es decir, que se han diseminado a los tejidos circundantes y no pueden ser extirparse quirúrgicamente.

Un experto en la técnica apreciar� que muchas de estas categorías pueden superponerse, por ejemplo, c�nceres agresivos son típicamente también metast�sico. "El cáncer agresivo", como se usa en el presente documento, se refiere a un cáncer de rápido crecimiento. Un experto en la técnica apreciar� que algunos c�nceres, como el cáncer de mama o cáncer de pr�stata, el término "cáncer agresivo" se referirán a un cáncer avanzado que ha recurrido en aproximadamente los dos tercios anteriores de la gama de tiempos de recaída para un determinado cáncer. mientras que para otros tipos de cáncer, como el carcinoma de pulmón de células pequeñas (CPCP) casi todos los casos presentes en rápido crecimiento c�nceres que se consideran agresivos. Por tanto, el término puede cubrir una subsecci�n de un cierto tipo de cáncer o puede abarcar todos los demás tipos de cáncer.

Los compuestos también pueden usarse para tratar c�nceres resistentes a fármacos, incluyendo tumores resistentes a múltiples fármacos. Como se conoce en la técnica, la resistencia de las células cancerosas a la quimioterapia es uno de los problemas centrales en el tratamiento del cáncer.

Ciertos tipos de cáncer, como el de pr�stata, pueden tratarse mediante la terapia hormonal, es decir, con hormonas o medicamentos antihormonales que retrasan o detienen el crecimiento de ciertos tipos de cáncer al bloquear las hormonas naturales del cuerpo. Estos c�nceres pueden desarrollar resistencia, o ser intrínsecamente resistentes, a la terapia hormonal. La presente invención contempla además el uso de los compuestos en el tratamiento de tales c�nceres o "resistentes .a hormonas" o "refractarios a hormonas".

La presente invención también contempla los compuestos como "agentes sensibilizantes," que inhiben selectivamente el crecimiento de células cancerosas. En este caso, el compuesto por s� solo no tiene un efecto citot�xico sobre la célula de cáncer, pero proporciona un medio de debilitar las células cancerosas, y facilitar mejor el beneficio obtenido de la aplicación de agentes terapéuticos contra el cáncer convencionales, o para potenciar de otra manera dicha terapéutica.

Por tanto, la presente invención contempla la administración a un sujeto de una cantidad terapéuticamente eficaz de uno o más compuestos junto con uno o más agentes terapéuticos contra el cáncer. El compuesto (s) se puede administrar antes, durante o después del tratamiento con el agente terapéutico contra el cáncer. Un "agente terapéutico contra el cáncer" es un compuesto, composición o tratamiento que previene o retrasa el crecimiento y / o metástasis de las células cancerosas. Tales agentes terapéuticos contra el cáncer incluyen, entre otros, tratamiento con fármacos quimioterap�uticos, radiación, terapia g�nica, manipulación hormonal, inmunoterapia y terapia con oligonucle�tido antisentido. Ejemplos de fármacos quimioterap�uticos útiles incluyen entre otros, hidroxiurea, busulf�n, cisplatino, carboplatino, clorambucilo, melfalano, ciclofosfamida ifosfamida danorubicina, doxorrubicina, epirubicina, mitoxantrona, vincristina, vinblastina, Navelbine� (vinorelbina), etop�sido, tenip�sido, paclitaxel, docetaxel, gemcitabina, citosina, arabin�sido, bleomicina, neocarcinostatina, suramin, taxol, mitomicina C y similares. Los compuestos de la invención también son adecuados para su uso con terapias de combinación estándar empleando dos o más agentes quimioterap�uticos. Debe entenderse que la terapéutica antic�ncer para uso en la presente invención también incluye nuevos compuestos o tratamientos desarrollados en el futuro.

Los compuestos de Fórmula I también son adecuados para su uso en una variedad de aplicaciones en las que se desea la quelaci�n de un metal de transición, por ejemplo, en aplicaciones terapéuticas. La quelaci�n de metales es relevante para el tratamiento de la intoxicación por metales, toxicidad de metales, exceso de metales exceso en el cuerpo, tales como lsobrecarga de hierro asociada con trastornos genéticos y / o anemias dependientes de transfusión, infección por un microorganismo, enfermedades o trastornos mediados por el sistema inmunol�gico, enfermedades o trastornos de la piel, enfermedades o trastornos neurol�gicos, enfermedades o trastornos cardiovasculares, enfermedades o trastornos relacionados con el envejecimiento, o enfermedades o trastornos genéticos, En una realización de la presente invención, los compuestos de fórmula I se pueden usar en aplicaciones terapéuticas, por ejemplo, para quelar iones met�licos in vivo, para el tratamiento de enfermedades o trastornos distintos de cáncer.

Los compuestos de Fórmula I también se pueden usar en productos o procesos en los que se desea la quelaci�n de un metal de transición, por ejemplo, para prevenir o controlar el escalado, la degradación química, la decoloración, la precipitación el crecimiento microbiano la inestabilidad de la emulsión la característica de rancios y/u otros problemas

asociados con iones met�licos indeseados, tales como malos olores, malos sabores, turbidez, pérdida de claridad, deterioro de la textura, formación de cristales, cambios de viscosidad, la oxidación. El uso de quelantes en estas situaciones puede ayudar a mejorar la calidad del producto, el atractivo para el consumidor, la vida útil o de valor, mejorar la eficiencia de procesamiento, disminuir el tiempo muerto del equipo, reducir los costos de procesamiento. 5 Por tanto, la presente invención contempla el uso de los compuestos de Fórmula I para la quelaci�n de iones met�licos en diversas aplicaciones, incluyendo, entre otras, productos alimenticios y bebidas, productos de limpieza, productos de cuidado personal, productos farmacéuticos, aplicaciones de diagnóstico, aplicaciones de pulpa y papel, aplicaciones de tratamiento de aguas aplicaciones metalúrgicas, aplicaciones textiles, productos y aplicaciones agrícolas, aplicaciones de procesamiento de caucho, aplicaciones de la fotografía, tinta de impresión, aplicaciones de

10 campos petroleros aplicaciones de minería, endulzamiento de gas, aplicaciones de construcción, aplicaciones electrónicas eliminación y prevención de incrustaciones.

V. Composiciones Farmacéuticas

15 Los compuestos de la presente invención se formulan típicamente antes de la administración. La presente invención proporciona además composiciones farmacéuticas que comprenden uno o más compuestos de fórmula I y un vehículo farmac�uticamente aceptable, diluyente, o excipiente. Las composiciones farmacéuticas se preparan mediante procedimientos conocidos usando ingredientes bien conocidos y fácilmente disponibles. Las composiciones farmacéuticas que comprenden uno o más compuestos de Fórmula I en combinación con uno o más agentes

20 quimioterap�uticos conocidos contra el cáncer también se contemplan en la presente invención.

Los compuestos de la fórmula general I o composiciones farmacéuticas que comprenden los compuestos se pueden administrar por vía oral, típica, parenteral mediante inhalaci�n o pulverización o rectal en formulaciones monodosis que contienen vehículos adyuvantes y transportadores no tóxicos farmac�uticamente aceptables convencionales. En 25 el curso habitual de la terapia, el compuesto activo se incorpora en un vehículo aceptable para formar una composición para administración típica en el área afectada, tales como cremas o lociones hidrófobas o hidrófilas, o en una forma adecuada para administración oral, rectal o parenteral, tales como jarabes, elixires, comprimidos, trociscos, pastillas, cápsulas duras o blandas, píldoras, supositorios, suspensiones oleosas o acuosas, polvos o gránulos dispersables, emulsiones, inyectables, o soluciones. El término parenteral, como se usa en el presente documento, incluye

30 inyecciones subcutáneas, intrad�rmicas, intraarticulares, intravenosas intramusculares, intravasculares, intraesternales, intratecales o técnicas de infusión.

La presente invención también proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden uno o más de los compuestos de fórmula I y un vehículo, t al como una vesícula de membrana artificial (que incluye un liposoma micelas

35 de lípidos y similares), micropart�culas o microc�psulas.

Las composiciones destinadas para uso oral se pueden preparar en formas de dosificación en unidades sólidas o fluidos. La forma de dosificación de unidades fluidas se pueden preparar de acuerdo con cualquier procedimiento conocido en la técnica para fabricad composiciones farmacéuticas y dichas composiciones pueden contener uno o 40 más agentes seleccionados del grupo que consiste en agentes edulcorantes, agentes aromatizantes, agentes colorantes y agentes de conservación con el fin de proporcionar preparaciones farmac�uticamente aceptables y agradables al gusto. Un elixir se prepara usando un vehículo hidroalcoh�lico etanol) con edulcorantes adecuados, tales como azúcar y sacarina, junto con un agente aromático saborizante. Las suspensiones se pueden preparar con un vehículo acuoso con la ayuda de un agente de suspensión, tal como goma arábiga, goma tragacanto, metilcelulosa

45 y similares.

Las formulaciones sólidas, tales como comprimidos, contienen el ingrediente activo mezclado con excipientes farmac�uticamente aceptables no tóxicos, que son adecuados para fabricar comprimidos. Estos excipientes pueden ser, por ejemplo, diluyentes inertes, tales como carbonato cálcico, carbonato sádico, lactosa, fosfato cálcico y fosfato 50 sádico: agentes de granulación y disgregantes, por ejemplo, almidón de maíz, o ácido alg�nico.: agentes aglutinantes, por ejemplo almidón, gelatina o goma arábiga, y agentes lubricantes, por ejemplo estearato de magnesio ácido esteárico o talco, y otros ingredientes convencionales tales como fosfato dic�lcico, silicato de magnesio aluminio, sulfato de calcio, almidón, lactosa, metiilcelulosa, y materiales funcionalmente similares. Los comprimidos pueden estar sin recubrir o pueden recubrirse mediante técnicas que se conoce que retrasan la disgregaci�n y absorción en el

55 tracto gastrointestinal y, de este modo, proporcionan una acción sostenida durante un periodo de tiempo largo. Por ejemplo, se puede emplear un material de retraso de tiempo tal como monoestearato de glicerilo o diestearato de glicerilo.

Las formulaciones de uso oral se pueden presentar como cápsulas de gelatina dura en las que el ingrediente activo se

60 mezcla con un diluyente sólido inerte, por ejemplo, carbonato cálcico, fosfato cálcico o caolín, o como cápsulas de gelatina blanda en las que el ingrediente activo se mezcla con agua o un medio oleoso, por ejemplo aceite de cacahuetes, parafina líquida o aceite de oliva. Las cápsulas de gelatina blanda se preparan mediante encapsulaci�n en máquina de una suspensión espesa del compuesto con un aceite vegetal aceptable, vaselina líquida ligera u otro aceite inerte.

Las suspensiones acuosas contienen materiales activos mezclados con excipientes adecuados para la fabricación de suspensiones acuosa. Dichos excipientes son agentes se suspensión, por ejemplo, carboximetilcelulosa sádica, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, alginato sádico, polivinilpirrolidona, goma de tragacanto y goma arábiga.; agentes de dispersi�n o humectación pueden ser una fosfatida natural, por ejemplo, lecitina, o productos de condensación de un óxido de alquileno con ácidos grasos, por ejemplo estearato de polioxietileno, o productos de condensación de óxido de etileno con alcoholes alif�ticos de cadena larga, por ejemplo heptadecaetilen-oxicetanol, o productos de condensación de óxido de etileno con ésteres parciales derivados de ácidos grasos y un hexitol tal como monooleato de polioxietilensorbitol, o productos de condensación de óxido de etileno con ésteres parciales derivados de ácidos grasos y un hexitol, por ejemplo monooleato de polioxietilensorbitan,. Las suspensiones acuosas pueden también contener uno o más conservantes, por ejemplo etilo, o n-propilo, p-hidroxibenzoato uno o más agentes colorantes, uno o más agentes aromatizantes y uno o más agentes edulcorantes, tales como sacarosa o sacarina.

Las suspensiones oleosas se pueden formular mediante suspensión de los ingredientes activos en un aceite vegetal, por ejemplo aceite de cacahuetes, aceite de oliva, aceite de sésamo, aceite de coco, o en un aceite mineral tal como parafina líquida. Las suspensiones oleosas pueden contener un agente espesante, por ejemplo cera de abeja, parafina dura o alcohol cet�lico. Se pueden añadir agentes edulcorantes, tales como los que se han indicado anteriormente y agentes edulcorantes y para proporcionar preparaciones orales agradables al gusto. Estas composiciones se pueden conservar mediante la adición de un antioxidante tal como ácido asc�rbico.

Polvos y gránulos dispersables adecuados para la preparación de una suspensión acuosa mediante la adición de agua proporcionan el ingrediente activo en mezcla con un agente de dispersi�n o humectante, gente de suspensión y uno o más conservantes. Ejemplos de agentes de dispersi�n o humectantes adecuados y agentes de suspensión son como los que ya se han mencionado en lo que antecede. También pueden estar presentes excipientes por ejemplo agentes edulcorantes, aromatizantes y conservantes adicionales.

Las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la invención pueden también estar en forma de emulsiones de aceite en agua. La fase oleosa puede ser un aceite vegetal, por ejemplo, aceite de oliva o aceite de cacahuete, o un aceite mineral, por ejemplo parafina líquida o mezclas de éstos. Agentes emulsionantes adecuados pueden ser gomas naturales, por ejemplo goma arábiga o goma tragacanto, fosfatidas naturales, por ejemplo soja, lecitina, lecitina y ésteres o ésteres parciales derivados de ácidos grasos hexitol, anh�dridos, por ejemplo monooleato de polioxietilensorbitan, ay productos de condensación de estos ésteres parciales con óxido de etileno, por ejemplo monooleato de polioxietilensorbitan. Las emulsiones puede también contener agentes edulcorantes y aromatizantes.

Las composiciones farmacéuticas pueden estar en forma de una solución acuosa u oleaginosa inyectable estéril. Esta suspensión se puede formular de acuerdo con la técnica conocida usando agentes dispersantes o humectantes adecuados y agentes de suspensión que se han mencionado anteriormente. La preparación inyectable estéril también puede ser una solución o suspensión inyectable estéril en un diluyente o disolvente no tóxico parenteralmente aceptable, por ejemplo en forma de una solución en 1,3-butanodiol Entre los vehículos y disolventes aceptables que se pueden emplear est�n agua, Rsoluci�n de Ringer y solución isot�nica de cloruro sádico. Además, convencionalmente se emplean aceites fijos estériles, en forma de un disolvente o un medio de suspensión. Para este fin se puede emplear cualquier aceite fijo suave incluyendo mono- o diglic�ridos sintéticos. Además, aceites grasos tales como ácido oleico en la preparación de sustancias inyectables. También se pueden incluir en la solución o suspensión inyectable adyuvantes, tales como anestésicos locales conservantes y agentes tampón.

El o los compuestos de la fórmula general I se pueden administrar, juntos o por separado, en forma de supositorios para administración rectal del fármaco. Estas composiciones se pueden preparar mezclando el fármaco con un excipiente no irritante adecuado que sea sólido a las temperaturas habituales pero líquido a la temperatura rectal y que por lo tanto se funda en el recto liberando el fármaco. Dichos materiales incluyen manteca de cacao y polietilenglicoles.

Otras composiciones farmacéuticas y procedimientos para preparar las composiciones farmacéuticas son bien conocidos en la técnica y se describen en, por ejemplo, "Remington: The Science and Practice of Pharmacy" (formerly 'Remingtons Pharmaceutical Sciences"); Gennaro, A.; Lippincott, Williams & Wilkins, Philidelphia, PA (2000).

VI. Administración de compuestos de fórmula I

Los compuestos de fórmula I se pueden administrar a un sujeto mediante varias vías dependiendo del cáncer que se va a tratar, por ejemplo, Los compuestos se pueden administrar por vía oral, típica, parenteral mediante inhalaci�n o pulverización o por vía rectal en formulaciones de unidades de dosificación. En una realización, los compuestos se administran sist�micamente a un sujeto, por ejemplo, mediante inyección en bolo o infusión en la corriente sanguínea de un sujeto o mediante administración oral. Cuando se usa junto con uno o más agentes quimioterap�uticos conocidos, los compuestos se pueden administrar antes, o después, de la administración de los agentes quimioterap�uticos, o se pueden administrar de forma concomitante. El uno o más agentes quimioterap�uticos pueden también administrarse sist�micamente, por ejemplo, mediante inyección en bolo, infusión, o administración oral.

Los compuestos de fórmula I se pueden usar como parte de una terapia neoadyuvante (a terapia primaria) o como parte de un régimen terapéutico adyuvante. La presente invención contempla el uso de los compuestos de fórmula I en varias etapas en el desarrollo y progresión del tumor, incluyendo en el tratamiento de neoplasias avanzadas y/o agresivas (es decir, enfermedad franca en un sujeto que no es apto para curar mediante las modalidades de tratamiento locales, tales como la cirugía o la radioterapia), enfermedad metast�sica, enfermedad localmente avanzada y/o tumores resistentes (es decir, un cáncer o tumor que no ha respondido al tratamiento).

5 "La terapia primaria" se refiere a una primera línea de tratamiento tras el diagnóstico inicial de cáncer en un sujeto. Terapias primarias de ejemplo pueden implicar cirugía, una amplia gama de quimioterapias y radioterapia. La" terapia adyuvante" se refiere a una terapia que sigue a un tratamiento primario y que se administra a sujetos en riesgo de recaída. La terapia sist�mica adyuvante generalmente se inicia poco después de la terapia primaria para retrasar la recurrencia, prolongar la supervivencia o curar un sujeto.

Se contempla que los compuestos de la invención se pueden usar solos o en combinación con uno o más de otros agentes quimioterap�uticos como parte de una terapia primaria o una terapia adyuvante. Las combinaciones de los compuestos de Fórmula I y quimioterap�uticos estándar pueden actuar para mejorar la eficacia de la quimioterapia y,

15 por tanto, se pueden utilizar para mejorar las terapias estándar contra el cáncer. Esta aplicación puede ser importante en el tratamiento de c�nceres resistentes a los medicamentos que no responden al tratamiento estándar.t Los c�nceres resistentes a los medicamentos pueden surgir, por ejemplo, de la heterogeneidad de las poblaciones de células tumorales, las alteraciones en la respuesta a la quimioterapia y un aumento de potencial maligno. Tales cambios son a menudo más pronunciados en las etapas avanzadas de la enfermedad.

La dosis que se va a administrar no est� sujeta a límites definidos, pero normalmente ser� una cantidad eficaz. Por lo general, ser� el equivalente, en una base molar de la forma libre farmacol�gicamente activa producida a partir de una formulación de dosificación tras la liberación metabólica del fármaco libre activo para lograr sus efectos farmacol�gicos y fisiológicos deseados. Las composiciones se pueden formular en una forma de dosificación unitaria. El término

25 "forma de dosificación unitaria" se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosificaciones unitarias para sujetos humanos y otros mamíferos, conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de material activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado, en asociación con un excipiente farmacéutico adecuado. Ejemplos de intervalos para el compuesto (s) en cada unidad de dosificación son de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 100 mg, o más generalmente, de aproximadamente 1,0 a aproximadamente 50 mg.

Las dosificaciones al día de los compuestos de la presente invención normalmente entrarán dentro del intervalo de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal. en dosis única o dividida. Sin embargo, se entender� que la cantidad real del compuesto (s) para administrar la determinar� un m�dico, a la luz de las circunstancias relevantes, incluyendo la afección a tratar, la ruta de administración elegida, el compuesto real

35 administrado, la edad, el peso, y la respuesta del paciente individual, y la gravedad de los síntomas del paciente. El intervalo de dosificación anterior se proporciona únicamente con fines ilustrativos y no est� destinado a limitar el alcance de la invención de ninguna manera. En algunos casos los niveles de dosificación por debajo del límite inferior del intervalo mencionado anteriormente pueden ser más que adecuados, mientras que en otros casos dosis aún mayores se pueden emplear sin causar efectos secundarios perjudiciales, por ejemplo, dividiendo primero la dosis grande en varias dosis más pequeñas para la administración durante todo el día.

VII. Ensayos cl�nicos en pacientes con cáncer

Un experto en la técnica apreciar� que tras la eficacia demostrada de un compuesto de fórmula I in vitro y en modelos

45 animales, se puede someter a estudios convencionales+ de toxicolog�a animal y farmacocin�tica según la BPC y, después, pasar a los Ensayos Cl�nicos con el fin de evaluar adicionalmente su eficacia en el tratamiento del cáncer y para obtener la autorización reguladora para el uso terapéutico. Como se conoce en la técnica, los ensayos cl�nicos progresan a través de fases de las pruebas que se identifican como las Fases I, II, III, y IV.

Inicialmente, el compuesto seleccionado de fórmula I se evaluar� en un ensayo de Fase I, que suele ser un ensayo abierto. Típicamente se utilizan ensayos de fase I para determinar el mejor modo de administración (por ejemplo, en comprimidos o por inyección), la frecuencia de administración, y la toxicidad para el compuesto. Los estudios de fase I con frecuencia incluyen ensayos de laboratorio, como análisis de sangre y biopsias, para evaluar los efectos del compuesto de Fórmula I en el cuerpo del paciente. Para un ensayo de Fase I, un pequeño grupo de pacientes con

55 cáncer son tratados con una dosis específica del compuesto de Fórmula I. Durante el ensayo, la dosis se aumenta típicamente grupo por grupo con el fin de determinar la dosis máxima tolerada (DMT) y las toxicidades limitantes de la dosis (DLT) asociadas con el compuesto. Este proceso determina una dosis apropiada para utilizar en un ensayo posterior de Fase II.

Un ensayo de fase II puede llevarse a cabo para evaluar la eficacia y seguridad de los compuestos de acuerdo con la presente invención. En los ensayos de fase II, estos compuestos se administran a grupos de pacientes, ya sea con un tipo específico de cáncer o con c�nceres asociados, utilizando la dosis que se ha encontrado que es eficaz en los ensayos de fase I.

65 Los ensayos de fase III se centran en la determinación de cómo un compuesto se compara con el tratamiento habitual,

o más ampliamente aceptado. En los ensayos de fase III, los pacientes son asignados al azar a uno de dos o más

"ramas". En un ensayo con dos ramas, por ejemplo, una rama recibir� el tratamiento estándar (grupo de control) y la otra rama recibirán tratamiento con un compuesto de acuerdo con la presente invención (grupo de investigación).

Los ensayos de fase IV se utilizan para evaluar aún más la seguridad a largo plazo y la eficacia de un compuesto. Los ensayos de fase IV son menos comunes que los de fase I, II y III de los ensayos y se llevarán a cabo después de que el compuesto se haya aprobado para su uso estándar.

A. Elegibilidad de los pacientes para los ensayos cl�nicos

Los criterios de elegibilidad del participante pueden ir de lo general (por ejemplo, edad sexo, tipo de cáncer) a específicos (por ejemplo, el tipo y número de tratamientos previos, las características del tumor, los recuentos de células sanguíneas, la función del órgano) Los criterios de elegibilidad pueden variar también con la fase de ensayo. Por ejemplo, En los ensayos de fase I y II, los criterios a menudo excluyen a los pacientes que podrían estar en riesgo por el tratamiento de investigación debido a una función orgánica anormal u otros factores. En los ensayos de Fase II y III a menudo se incluyen criterios adicionales respecto al tipo de enfermedad y el estadio, , y el número y tipo de tratamientos anteriores.

Los ensayos de cáncer de Fase I por lo general comprenden de 15 a 30 participantes para quienes otros tratamientos no han sido eficaces. Los ensayos de fase II típicamente comprenden hasta 100 participantes que ya han recibido quimioterapia, cirugía, o tratamiento de radiación, pero para quienes el tratamiento no ha sido efectivo. La participación en ensayos de fase II se limita a menudo en base al tratamiento previo recibido. Los ensayos de fase III por lo general comprenden cientos de miles de participantes. Este gran número de participantes es necesario con el fin de determinar si existen verdaderas diferencias entre la eficacia de los compuestos de acuerdo con la presente invención y el tratamiento estándar. La fase III puede comprender pacientes que van desde los recién diagnosticados con cáncer a aquellos con enfermedad extensa con el fin de cubrir el continuo de la enfermedad.

Un experto en la técnica apreciar� que los ensayos cl�nicos deben diseñarse para que sean lo más inclusivo posible sin hacer que la población de estudio sea demasiado diversa para determinar si el tratamiento podría ser tan eficaz en una población definida más estrictamente, .Cuanto más diversa sea la población incluida en el ensayo, más aplicables pueden ser los resultados a la población general, especialmente en los ensayos de fase III. La selección de participantes apropiados en cada fase de ensayo cl�nico se considera dentro de las habilidades normales de un experto en la técnica.

B. Evaluación de los pacientes antes del tratamiento

Antes del comienzo del estudio, se pueden usar varias medidas conocidas en la técnica para clasificar primero los pacientes,, por ejemplo, utilizando la escala del estado funcional del Eastern Cooperative Oncology Group (ECOG) (PS).ECOG PS . ECOG PS es un estándar ampliamente aceptado para la evaluación de la progresión de la enfermedad de un paciente medida por el deterioro funcional en el paciente, en la que ECOG PS 0 indica que no hay deterioro funcional, ECOG PS 1 y 2 indican que los pacientes tienen cada vez un mayor deterioro funcional, pero siguen siendo ambulantes y ECOG PS 3 y 4 indican la incapacidad progresiva y la falta de movilidad.

La calidad de vida general de los pacientes se puede evaluar, por ejemplo, utilizando la escala McGill Quality of Life Questionnaire (MQOL) (Cohen et al (1995) Palliative Medicine 9: 207-219). El MQOL mide los síntomas físicos; el bienestar psicológico y existencial; el soporte; y la calidad de vida en general. Para evaluar los síntomas tales como náuseas, el estado de ánimo, el apetito, el insomnio la movilidad y la fatiga de la se puede usar la Symptom Distress Scale (SDS) (SDS), desarrollada por McCorkle y Young ((1978) Cancer Nursing 1: 373-378) .

Los pacientes también pueden clasificarse de acuerdo con el tipo y / o de la etapa de su enfermedad y / o por el tamaño del tumor.

C. Control Farmacocin�tico

Para cumplir con los criterios de la Fase I, la distribución del compuesto se controla, por ejemplo, mediante el análisis químico de las muestras, como la sangre o en la orina, recogidos a intervalos regulares. Por ejemplo, se pueden tomar muestras a intervalos regulares hasta alrededor de 72 horas después del inicio de la infusión. En una realización, se toman muestras a 0, 0,33, 0,67, 1, 1,25, 1,5, 2, 4, 6, 8, 12, 24, 48 y 72 horas después del inicio de cada infusión del compuesto.

Si el análisis no se lleva a cabo inmediatamente, las muestras se pueden colocar en hielo seco después de la recogida y transporte posterior a un congelador para almacenar a -70 �C hasta que el análisis pueda llevarse a cabo. Las muestras se pueden preparar para el análisis utilizando técnicas estándar conocidas en la técnica y la cantidad de compuesto se puede determinar por ejemplo, por cromatograf�a de líquidos de alta resolución (HPLC),

Los datos farmacocin�ticos se pueden generar y analizar en colaboración con un farmac�logo cl�nico experto y se utilizan para determinar, por ejemplo, aclaramiento, la semivida y la concentración máxima en plasma.

D. Control de los resultados en los pacientes

El criterio de valoración de un ensayo cl�nico es un resultado medible que indica la eficacia de un compuesto en fase de evaluación. El criterio de valoración se estableció con anterioridad al inicio de la prueba y variar� en función del tipo y la fase del ensayo cl�nico. Ejemplos de criterios de valoración incluyen, por ejemplo, tasa de respuesta tumoral - la proporción de los participantes del ensayo cuyo tumor se redujo en tamaño por una cantidad específica, normalmente descrita como un porcentaje; supervivencia libre de enfermedad - la cantidad de tiempo que un participante sobrevive sin cáncer ni recurrencia del mismo, se suele medir en meses; la supervivencia global - la cantidad de tiempo que un participante vive, por lo general se mide desde el inicio del ensayo cl�nico hasta el momento de la muerte. Para los c�nceres avanzados y / o metast�ticos, estabilizaci�n de la enfermedad - la proporción de los participantes del ensayo cuya enfermedad se ha estabilizado, por ejemplo, cuyo tumor (s) ha dejado de crecer y / o metastatizar, se pueden utilizar como criterio de valoración Otros criterios de valoración incluyen la toxicidad y la calidad de vida.

La tasa de respuesta tumoral es un criterio de valoración t�pico en los ensayos de fase II. Sin embargo, incluso si un tratamiento reduce el tamaño del tumor de un participante y alarga el período de supervivencia libre de enfermedad, puede no alargar la supervivencia global. En dicho caso, los efectos secundarios y la no extensión de la supervivencia global podrían superar el beneficio de la supervivencia libre de enfermedad. Alternativamente, la mejora de la calidad de los participantes de la vida durante el intervalo libre de tumor puede prevalecer sobre otros factores Por tanto, debido a que las tasas de respuesta tumoral a menudo son temporales y pueden no traducirse en beneficios para la supervivencia a largo plazo para el participante, la tasa de respuesta es una medida razonable de la efectividad de un tratamiento en un ensayo de fase II, mientras que la supervivencia de los participantes y la calidad de vida se utilizan normalmente como criterios de valoración en un ensayo de Fase III.

VIII. Kits

La presente invención proporciona adicionalmente kits farmacéuticos que comprenden uno o más compuestos de fórmula I. En una realización los kits terapéuticos son para uso en el tratamiento del cáncer. Los contenidos del kit se pueden liofilizar y el kit puede contener adicionalmente un disolvente adecuado para la reconstitución de los componentes liofilizados. Los componentes individuales del kit se envasan en recipientes separados y, asociados a dichos recipientes, puede haber una nota en la forma prescrita por una agencia gubernamental que regula la fabricación, uso o venta de productos farmacéuticos o biológicos, que refleje la aprobación por el organismo de la fabricación, para su uso o venta para la administración humana o animal.

Cuando los componentes del kit se proporcionan en una o más soluciones líquidas, la solución líquida puede ser una solución acuosa, por ejemplo una solución acuosa estéril. Para el uso in vivo, los compuestos se pueden formular en una composición con jeringa farmac�uticamente aceptable. En este caso , el recipiente pueden ser en s� mismo un inhalador, jeringa, pipeta, cuentagotas ocular, u otro aparato similar, a partir del cual la formulación se puede aplicar a un área infectada del sujeto, tales como los pulmones, se inyecta en un sujeto, o incluso aplicarse a y mezclarse con los otros componentes del kit.

Los kits o envases farmacéuticos que comprenden uno o más compuestos de la presente invención en combinación con uno o más quimioterap�utico estándar para aplicaciones de terapia de combinación también se contemplan en la presente invención.

Tambi�n se ha demostrado en el presente documento que los compuestos de Fórmula I son capaces de quelar iones de metales de transición. La presente invención proporciona adicionalmente kits que contienen uno o más compuestos de Fórmula I para la quelaci�n de iones de metales de transición.

La invención se describir� a continuación con referencia a ejemplos específicos. Se entender� que los siguientes ejemplos est�n destinados a describir realizaciones de la invención y no se pretende que limiten la invención en modo alguno.

Ejemplos

PREPARACI�N DE COMPUESTOS:

Ejemplos de compuestos de fórmula (I) se han preparado de acuerdo con el esquema que se muestra a continuación:

En un procedimiento t�pico ,1 mmol (1 equiv.) de phenanthrolinequinone se sometió a reflujo con la cantidad equimolar del correspondiente aldeh�do y acetato de amonio 10 mmol (10 equiv.) en ácido acético glacial. El proceso de reacción 5 se control� mediante TLC, hasta que se consiguió el consumo completo de los reactivos. Después de finalizada la reacción, la mezcla reacción se enfri� hasta la temperatura ambiente y se diluyó en agua, las impurezas se extrajeron con diclorometano (DCM) a partir de la solución obtenida, .La capa acuosa se basific� y el precipitado separado de la 2-indolilo imidazo [4,5-d] fenantrolina se filtr� y se recristaliz� en un disolvente adecuado. Cuando sea necesario, la 2-indolil imidazo [4,5-d] fenantrolina, en la que R7 es H se trat� con R7X para dar el compuesto (I), en la que R7 es

10 distinto de H.

15 En un procedimiento experimental t�pico 11 mmol (1,1 equiv.) de POCl3 3se a�adi� gota a gota a la solución agitada magn�ticamente del indol (10 mmol, 1,0 equiv.) en 15-20 ml de dimetilformamida (DMF) a 5-10 � C. La mezcla se agit� a temperatura ambiente durante 0,5 horas y a 60 � C durante 0,5 horas, se enfri� a temperatura ambiente, se vertió sobre 100 g de hielo. La solución obtenida se basific� con NaHCO3 a pH > 7, la mezcla se agit� a 60 � C durante 1 hora, el precipitado separado se filtr� y se recristaliz� en un disolvente adecuado.

20 Los puntos de fusión se registraron usando un aparato de punto de fusión capilar MEL-TEMP, el punto de fusión est� sin corregir. La RMN de 1H se realizó en un instrumento Brucker de 500 MHz a temperatura ambiente usando un disolvente deuterado adecuado.

25 EJEMPLO 1: PREPARACIÓN DEL COMPUESTO 5

Se añadieron gota a gota 0,96 g de POCl3 a una solución de 2-metil-5-cloroindol (1,0 g) en 20 ml de DMF), a 10 �C. La 30 mezcla se agit� a 50 �C durante 1 hora, se enfri� y se diluyó con solución saturada de NaHCO3. La suspensión se calentó a 60 �C durante 15 min, se enfri�, y se filtraron los precipitados de 2-metil-5-cloroindol-3-carboxaldeh�do. Rendimiento 1,14 g (99%). Una muestra analítica se cristaliz� a partir de EtOH.

La mezcla de fenantroquinolina (0,210 g) y 5-cloroindol-3-carboxaldeh�do 2-metilo (0,203 g) se sometió a reflujo durante 1,5 horas en ácido acético (5 ml) en presencia de acetato de amonio (0,77 g). El precipitado separado de compuesto 5 se filtr�, y se lav� con AcOH, EtOH+H2O y EtOH+EtOAc. Rendimiento 0,230 g (60%).

EJEMPLO 2: PREPARACIÓN DEL COMPUESTO 7

Se añadieron gota a gota 1,69 g de POCl3 a la solución de 2-metil-5-fluoroindol (1,49 g) en 20 ml de DMF), a 10 �C. La mezcla se agit� a 50 �C durante 1 hora, se enfri� y se diluyó con solución saturada de NaHCO3. La suspensión se calentó a 60 �C durante 15 min, se enfri� y se filtraron los precipitados de 2-metil-5-fluoro-indol-3-carboxaldeh�do.

15 Rendimiento 1,14 g (99%).

La mezcla de fenantroquinolina (0,210 g) y 2-metil-5-fluoro-indol-3-carboxaldeh�do (0,177 g) se sometió a reflujo durante 1,5 horas, en ácido acético (5 ml) en presencia de acetato de amonio (0,77 g), se vertió en 1% de HCl, , se extrajo con DCM. La capa acuosa se basific� con Na2CO3, el precipitado de compuesto 7 se filtr� y se cristaliz� a partir

20 de EtOH. Rendimiento 0,19 g (52%) del producto puro.

EJEMPLO 3: ACTIVIDAD ANTIPROLIFERATIVA IN VITRO DE LOS COMPUESTOS DE FORMULA I EN CÉLULAS DE CARCINOMA DE COLON HT-29

25 La capacidad de los compuestos de Fórmula I para inhibir la proliferaci�n de células humanas de carcinoma de colon HT-29 se analizó del siguiente modo. Las células HT-29 de carcinoma de colon utilizadas en este ejemplo y los ejemplos posteriores se mantuvieron como una monocapa en un medio de crecimiento; Medio de McCoy's 5A modificado (Sigma, St. Louis, MO), suplementado conL-glutamina 2 mM (Gibco, Grand Island, NY), 10% de suero bovino fetal (FBS) (Multicell, WISENT Inc. St-Bruno, QC), antibiótico-antimic�tico (Multicell), a 37 �C en un Incubador

30 humidificado con 5% de CO2. Las células se transfirieron a placas de cultivo tisular de 150 mm y se cultivaron hasta sub-confluencia (70-80%) antes de su uso. La actividad antiproliferativa in vitro de los compuestos se evalu� mediante incubaci�n de las células con concentraciones variables de los compuestos como se muestra en la Tabla 1 durante 6-7 días. La eficacia de estos compuestos en este ensayo de proliferaci�n celular se midió en base a la capacidad de las células vivas para reducir la sal de tetrazolio XTT en compuestos de color naranja de formarán (kit de proliferaci�n

35 celular XTT II, Roche Applied Science, Montreal, QC), Los resultados de este experimento se muestran en la Tabla 3.

Tabla 3: Actividad antiproliferativa de los compuestos de Fórmula I

Compuesto R CI50 (!M) 3* 0,6

5 0,35

7 0,7

(*no forma parte de la invención

EJEMPLO 4: EFECTO DE METALES EXÍGENOS SOBRE LA CAPACIDAD DE LOS COMPUESTOS 5 Y 7 PARA 5 INHIBIR EL CRECIMIENTO DE CÉLULAS DE CÁNCER DE COLON HT29 IN VITRO

Para determinar la capacidad de los compuestos 5 y 7 para quelar metales en células se añadieron metales exígenos a las células HT-29 de forma simultánea con varias concentraciones de los compuestos 5 y 7, Brevemente, las células HT-29 se trataron con varias concentraciones de los compuestos 5 y 7, más o menos cobre ( CuSO4.5H2O 25 !M) o 10 cinc (100 !M de ZnCl2), durante 5 días. La viabilidad celular se determin� mediante un ensayo XTT. Los efectos del cobre y el cinc sobre la inhibición del crecimiento de las células HT-29 se muestran en la Figura 6A para el compuesto 5 y en la Figure 6B para el compuesto 7. De un modo similar al compuesto 3, el cinc alter� las actividades inhibidoras del crecimiento de los compuestos 5 y 7, mientras que el cobre alter� la actividad únicamente a concentraciones bajas delos compuestos 5 y 7. Los resultados indican que los compuestos 5 y 7 funcionan como quelantes de cinc y de cobre

15 y la presencia en exceso de estos metales bloquea los efectos inhibidores del crecimiento de los compuestos 5 y 7.

EJEMPLO 5: EFICACIA IN VIVO DEL COMPUESTO 3 (VÉASE LA TABLA 3) EN UN MODELO DE XENOINJERTO DE CARCINOMA DE COLON

20 La capacidad del compuesto 3 para inhibir el crecimiento del tumor de colon in vivo se analizó del siguiente modo. A ratones hembra CD-1 atómicas (7 ratones por grupo de tratamiento, 6-7 semanas) se les inyect� por vía intraperitoneal células de adenocarcinoma de colon humano HT-29 células (3 x 106 células en 0,1 ml de PBS). El tratamiento de los ratones con vehículo o 50 mg / kg / día de compuesto 3 se inici� 5 días después de la inoculación (tamaño de los tumores = 20-40 mm3) para los ciclos de 7-Día de los cinco días, seguido de un descanso de 2 días durante 5

25 semanas. El tamaño de los tumores se midió en el transcurso del experimento usando compás, y el peso de los tumores se midió después de sacrificar a los animales. El compuesto 3 fue capaz de inhibir el crecimiento tal como se mide por el tamaño del tumor y el peso, en comparación con animales de control tratados con vehículo (véase la Figura 13A y 13B)

30 EJEMPLO 6: EFICACIA IN VIVO DEL COMPUESTO 3 EN UN MODELO DE XENOINJERTO DE CARCINOMA DE PULMÓN MACROC�TICO

La capacidad de los compuestos de Fórmula I para inhibir el crecimiento del tumor de pulmón de células grandes in vivo se analizó mediante la determinación de la eficacia del compuesto 3 en un modelo de xenoinjerto tal como se 35 describe a continuación. El compuesto 3 se analizó como una formulación a base de lípidos que tiene la siguiente composición: diestearoilfosfatidilethanolamina-polietilenglicol (DSPE-PEG / 5% en moles) y fosfatidilcolina de huevo (EPC / 95% mol). La formulación se prepar� como sigue: soluciones madre del compuesto 3 y lípidos (EPC y DSPE-PEG) se prepararon en DMF. Volúmenes específicos de las soluciones madre de compuesto 3 y lípido se mezclaron a continuación con el fin de lograr una concentración final de lípidos de 25 mg / ml (EPC: DSPE-PEG = 95:5

40 (mol %) y una proporción entre el compuesto 3 y los lípidos totales de 1:10 (p/p). La mezcla se agit� durante cuatro horas. se secó s fondo en nitrógeno y se dej� durante la noche bajo vacío. Después se a�adi� solución salina con tampón HEPES (HBS 0,01 M, pH=7,4) calentado hasta 60�C con el fin de rehidratar la película seca. Las soluciones se agitaron con v�rtex, se agit� durante 48 horas a temperatura ambiente y se sonicaron durante dos horas y media. La formulación se centrifug� después a 1000 rpm durante 5 minutos para eliminar cualquier compuesto libre 3.

45 Ratones CD-1 hembra atómicas (6-7 semanas de edad, 7 ratones por grupo de tratamiento) se inyect� por vía intraperitoneal células NCI-H460i de pulmón humano (3 x 1106 células en 0,1 ml de PBS) por vía subcutánea. El tratamiento de los ratones con vehículo o compuesto 3 se inici� 5 días después de la inoculación (tamaño de los tumores = 20-40 mm3) para los ciclos de 7 días de cinco días, seguido de un descanso de 2 días durante toda la duración del experimento (35 días). Se trat� a los ratones con 80 mg / kg / día durante la primera semana, seguido de 40 mg / kg / día hasta el final del experimento. El tamaño de los tumores se midió en el transcurso del experimento usando compás, y el peso de los tumores se midió después de sacrificar a los animales. El compuesto 3 fue capaz de

5 inhibir el crecimiento del tumor de pulmón de células grandes, tal como se mide por el tamaño del tumor y el peso, en comparación con animales de control tratados con vehículo (véase la Figura 14A y 14B)

EJEMPLO 7: EFICACIA IN VIVO DEL COMPUESTO 3 5, Y 7 EN UN MODELO DE XENOINJERTO DE CARCINOMA DE COLON.

La capacidad de los compuestos 3, 5, y 7 para inhibir el crecimiento de células de carcinoma de colon in vivo se analizó en el modelo de xenoinjerto de ratón como se describe en el Ejemplo 5. Los compuestos se analizaron como formulaciones Lutrol (administrado por vía i.p.), formulaciones de micelas a base de lípidos (administradas por vía i.v.),

o formulaciones a base de agua (administradas por vía ip). Los controles del vehículo incluyen control de Lutrol (ip

15 administrado ip), e control con micelas lip�dicas (administradas i.v.), , el control con agua (administrada ip). Las formulaciones de Lutrol contenían 15% de Lutrol y 10% de DMSO. La composición de las formulaciones y la preparación de la misma fueron como se describe en el Ejemplo 6 anterior.

Los resultados (Figura 15) indican que estos compuestos eran capaces de disminuir el tamaño (Figura 15A) y el peso (Figura 15B) de los tumores derivados de células HT-29.

EJEMPLO 8: EFICACIA IN VIVO DE LOS COMPUESTOS 3 5 Y 7 EN UN MODELO DE XENOINJERTO DE CARCINOMA DE PULMÓN MACROC�TICO

25 La capacidad de los compuestos 3, 5, y 7 para inhibir el crecimiento de células de carcinoma de pulmón macroc�tico in vivo se analizó en el modelo de xenoinjerto de ratón como se describe en el Ejemplo 6. Los compuestos se analizaron como formulaciones Lutrol (administradas por vía i.p.), formulaciones de micelas a base de lípidos (administradas por vía i.v.), formulaciones a base de agua (administradas por vía ip). Los controles del vehículo incluyen control de Lutrol (ip administrado ip), e control con micelas lip�dicas (administradas i.v.), , el control con agua (administrada ip). Las formulaciones de Lutrol contenían 15% de Lutrol y 10% de DMSO. La composición de las formulaciones y la preparación de la misma fueron como se describe en el Ejemplo 6 anterior.

Los resultados (Figura 16) indican que los compuestos 3, 5, y 7 eran capaces de disminuir el tamaño (Figura 16A) y el peso (Figura 16B) de los tumores derivados de células NCI-H460.

35 EJEMPLO 9: CAPACIDAD DEL COMPUESTO 3 PARA MODULAR LA EXPRESIÓN DE KLF4 IN VIVO

La capacidad del compuesto 3 para modular la expresión de KLF4 en xenoinjerto de tumor de colon HT-29 se determin� como sigue. En grupos de 10 ratones CD-1 hembra atómicas (6-7 semanas) se inyect� en la parte inferior dorsal células de adenocarcinoma de colon humano HT-29 (3 x 106 células en 0,1 ml de PBS) por vía subcutánea. El tratamiento de los ratones con vehículo o 50 mg/kg/d del compuesto 3 se inici� 5 días después de la inoculación (tamaño de los tumores = 20-40 mm3) para ciclos de cinco días y 2 durante toda la duración del experimento (35 días). Después del período de tratamiento, se sacrificó los animales, se extirparon los tumores, y el ARN total se extrajo a partir de 30 mg de tejido tumoral utilizando RNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA). Valencia, CA), La expresión de

45 ARNm de KLF4 se analizó mediante reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real utilizando el método comparativo de CT como se describe en el Ejemplo 19. El compuesto 3 indujo la expresión de KLF4 en xenoinjertos de tumores de todos los ratones tratados con el compuesto 3 en aproximadamente 1,5 veces en comparación con xenoinjertos de tumores tratados con vehículo solo (Figura 17).

EJEMPLO 10: CAPACIDAD DEL COMPUESTO 3 PARA MODULAR LA EXPRESIÓN D EP21 IN VIVO

La capacidad del compuesto 3 para modular la expresión de p21 in vivo se determin� utilizando el modelo de xenoinjerto HT-29 de tumor de colon como se describe en el Ejemplo 5. La expresión de ARNm de p21se analizó mediante reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real utilizando el método comparativo de CT como se

55 describe en el Ejemplo 9. El compuesto 3 indujo la expresión dep21 en xenoinjertos de tumores de todos los ratones tratados con el compuesto 3 en comparación con xenoinjertos de tumores tratados con vehículo solo (Figura 18).

EJEMPLO 11: CAPACIDAD DEL COMPUESTO 3 PARA MODULAR LA EXPRESIÓN DE CICLONA D1 IN VIVO

La capacidad del compuesto 3 para modular la expresión de ciclina D1 in vivo se determin� utilizando el modelo de xenoinjerto HT-29 de tumor de colon como se describe en el Ejemplo 26. La expresión de ARNm de ciclina D1 e analizó mediante reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real como se describe en el Ejemplo 30. El compuesto 3 redujo de forma consistente la expresión de ciclina D1 en xenoinjertos de tumores de todos los ratones tratados con el compuesto 3 en comparación con xenoinjertos de tumores tratados con vehículo solo (Figura 19). Los

65 resultados de este experimento combinados con los resultados descritos para el efecto del compuesto 3 in vivo en la expresión de KLF4 y p21 tal como se describe en los Ejemplos 30 y 31 se muestran en la Figura 20.

EJEMPLO 12: ENSAYOS DE TOXICIDAD SUBAGUDA DE LOS COMPUESTOS

Para analizar la toxicidad subaguda de los compuestos de Fórmula I,, se inyect� en los ratones hembra los compuestos y se evalu� la toxicidad en base a la mortalidad, cambios en el comportamiento, aspecto y peso. Brevemente, ratones hembra ICR normales (5-6 semanas de edad,; n=33) que pesan cerca de 0,020 kg en peso corporal. se inyectaron diversos compuestos en 100 mg/kg y 50 mg / kg o con el vehículo solo (Lutrol (M68, micronizado )). En grupos de 3 ratones hembra ICR 3 se inyect� una inyección intraperitoneal (IP) de 250!l o de cada compuesto a 4,0 mg / ml dos veces al día (100 mg / kg) durante 1 semana (Grupo I); o una inyección intraperitoneal (IP) de 250!l o de cada compuesto a 2,0 mg / ml dos veces al día (50 mg / kg) durante 1 semana (Grupo II); o una inyección intraperitoneal (IP) de 250 !l de vehículo control Lutrol dos veces al día durante 1 semana (Grupo control).

Los compuestos a analizarse prepararon para proporcionar suficiente durante una semana a concentraciones de 4,0 mg / ml y 2,0 mg / ml. Brevemente, 50 mg de cada compuesto se disolvió en 1,25 ml de DMSO al 100% y se diluyó con 6,25 ml de Lutrol (30% en agua) y 5 ml de agua, para preparar una solución de compuesto 4mg/ml en 15% Lutrol en aguar. A continuación, 4 ml de cada solución preparada se diluyeron adicionalmente con 4 ml de 15% de Lutrol en agua para proporcionar la solución de 2,0 mg / ml de cada compuesto. Para la solución de control del vehículo,, se prepar� 8 ml de 15% de Lutrol en agua. Los compuestos en concentraciones de 4,0 mg / ml y 2,0 mg / ml y el control del vehículo se administraron como se ha descrito anteriormente La toxicidad se evalu� en base a la mortalidad, cambios en el comportamiento, el aspecto y el peso y se muestran en la Tabla 6.

Toxicidad subaguda

+ Toxicidad - letalidad -No tóxico

Compuesto R 100mg/Kg 50mg/Kg 3* + -

(*no forma parte de la invención

EJEMPLO 13: LOCALIZACIÓN SUBCELULAR IN VITRO DEL COMPUESTO EN CÉLULAS HT-29

La localización subcelular de los compuestos de Fórmula I en las células cancerosas se determin� como sigue. Dado que el compuesto 3 es intrínsecamente fluorescente, fue posible examinar su localización subcelular en las células cancerosas por microscopia de fluorescencia en células HT-29 de carcinoma de colon. Las células se trataron con 10

o 25 !M del compuesto 3 durante 5 minutos (Figura 21A) o 4 horas (Figura 21B y 21C), ), se lavaron una vez en PBS, se fijaron en formaldeh�do al 3,7% / PBS durante 10 minutos, se lavaron de nuevo tres veces, y se montaron con Cytoseal. Las imágenes se obtuvieron con un microscopio de fluorescencia de barrido con láser Zeiss con un rango de filtro de excitación de 360-370 nm. Los resultados se muestran en las Figuras 21A-C. Para las figuras 21A y 21B, las imágenes de contraste de interferencia diferencial se superpusieron con imágenes fluorescentes. Las figuras 21B y 21C son las mismas imágenes. El compuesto 3 entr� en la célula en los primeros 5 minutos de tratamiento. y se distribuyó uniformemente por todo el núcleo y el citoplasma, pero fue excluido de la membrana plasm�tica de las células HT-29 (Figura 21A). A las 4 horas de tratamiento, el compuesto 3 fue localizado predominantemente alrededor del exterior del núcleo (región perinuclear), pero una porción todavía se encuentra dentro del núcleo (Figura 21B y 21C).

EJEMPLO 14: CAPACIDAD DE LOS COMPUESTOS DE LA FÓRMULA I PARA ESCINDIR EL ADN IN VITRO

El compuesto 3 analizó para determinar su capacidad para escindir el ADN plasm�dico in vitro en presencia de cobre y el agente reductor ácido asc�rbico. Los experimentos se realizaron en un total de 20 !l, que contiene tampón NaH2PO4/Na2HPO4 10 mM (pH 6,7), 1 !g de ADN plasm�dico superenrollado, 100 !M de ácido asc�rbico compuesto de fármaco 25 !M (o vehículo), y 10 !M deCuSO4.5H2O. La mezcla de reacción se incub� a 37 �C durante 30 minutos, y se a�adi� 1 !l de 0,1 M EDTA para terminar la reacción. Se a�adi� tampón de carga de ADN, y las reacciones se realizaron a 80 V durante 80 minutos en un gel de agarosa al 1% que contiene bromuro de etidio. Tanto compuesto 3y el control positivo 1,10-fenantrolina (OP) fueron capaces de escindir ADN plasm�dico, convirtiendo las formas circular superenrollado y abiertas en fragmentos de ADN de bajo peso molecular. El compuesto no quelante 13, y el vehículo control DMSO, no fueron capaces de escindir el ADN (Figura 22A). Ni el compuesto 3 ni OP fueron capaces de escindir ADN en ausencia de cobre o de agente reductor

5 Para determinar si los iones, excepto los de cobre, podrían ser suficientes, también se llevaron a cabo reacciones de escisión de ADN en presencia de cinc o hierro. Las reacciones se realizaron como anteriormente, en presencia de of CuSO4.5H2O 25 !M ZnCl2, o FeCl2.4H2O. Ni el cinc ni el hierro fueron capaces de reemplazar al cobre en las reacciones de escisión con el compuesto 3 (Figura 22B). Obsérvese que el cobre solo en presencia de ácido asc�rbico

10 puede cambiar la relación de ADN superenrollado para abrir el ADN circular.

Para determinar las proporciones del compuesto de cobre en la que el compuesto 3 fue eficaz, las reacciones se realizaron como en la Figura 22A. Las proporciones de compuesto 3 y el cobre de 3:1, 2,5:1, 2:1, 1,5:1, y 1:1, como se muestra en la Figura 23 se obtuvieron mediante el mantenimiento de la concentración de Cu constante a 10 !M, y la 15 variación de la concentración de compuesto3. Las proporciones de compuesto 3 y el cobre de 1:1,5, 1:2, 1:2,5, y 1:3, se obtuvieron mediante el mantenimiento de la concentración del compuesto 3 a 10 !M, y variando la concentración de cobre. El compuesto 3 escindi� con eficiencia el ADN cuando estaba presente a una proporción superior a 1.5:1 con el cobre, y no fue capaz de escindir a proporciones de 1:1, 1:2, 12,5). Sin embargo, el compuesto 3 fue capaz de escindir en una proporción de 1:03 (Figura 22C). Estos resultados ayudan a proporcionar una indicación en cuanto a qué tipos

20 de complejos de cobre - compuesto de 3 se est�n formando, y que son más citot�xicos.

Otros compuestos de fórmula I, compuestos 5, 7, 9 y 13 también se analizaron para determinar su capacidad de escindir el ADN en una proporción de 2,5:1 con el cobre (Figura 23). Las proporciones de compuesto 3:cobre como se ha indicado además de las concentraciones de cobre en ausencia de compuesto 3 se utilizaron en el ensayo de

25 escisión de ADN como se describe anteriormente. También se demostr� que los compuestos 9 y 12 podían escindir el ADN.

EJEMPLO 15: ACTIVIDAD ANTIPROLIFERATIVA IN VITRO DE LOS COMPUESTOS DE FORMULA I EN CÉLULAS DE CARCINOMA DE COLON HT-29

30 La capacidad de los compuestos de Fórmula I para inhibir la proliferaci�n de células humanas de carcinoma de colon HT-29 se analizó como se describe en el ejemplo 3. Los resultados de este experimento se muestran en la Tabla 7.

Tabla 7: Actividad antiproliferativa de los compuestos de Fórmula I 5

R=Grupo sustituyente

Nombre CI50

!g/ml PM

3*

0,6 349,4

5

0,35 383,8

7

0,7 367,4

65

0,35 409,46

EJEMPLO 16: EFECTOS IN VITRO E IN VIVO DE LOS COMPUESTOS DE FÓRMULA I

El factor-1 de transcripción de metales (MTF-1) es un factor de transcripción expresado constitutivamente que regula los genes diana mediante la unión a elementos de respuesta de metal, después de la activación por cinc. La activación de la MTF-1 en microambiente hip�xico de células tumorales de proliferaci�n rápida, tras el estr�s oxidativo inducido por hipoxia y la liberación de cinc a partir de los depósitos intracelulares, se asocia con el desarrollo y progresión del tumor. El factor 4 de tipo Kruppel (KLF4) es un miembro de la familia de factores de transcripción Sp/KLF, w, que regula los genes diana mediante la unión a las secuencias de ADN caja GC y la caja CACCC. KLF4 es un regulador negativo del crecimiento celular por mecanismos tales como la activación de p21waf1/cip1y la supresión de la expresión de ciclina D1 contrarrestando una unión al promotor de ciclina D1 Sp1 del regulador positivo. El papel supresor tumoral de KLF4 se ha reconocido en los c�nceres de leucemia de células T, gastrointestinales, de vejiga y de pr�stata. MTF-1, Sp1 y autoregulaci�n de KLF4 son reguladores positivos cadena arriba de KLF4. Una serie de nuevas moléculas pequeñas que regulan por disminución la MTF-1 se han desarrollado y sus actividades antitumorales in vitro e in vivo se han sometido a detección. Los compuestos de Fórmula I se seleccionaron de más de

3.000 estructuras imidazol-fenantrolina por diseño estructural basado en ligando, como se muestra en la Figura 24.

An�lisis de los efectos de los compuestos de Fórmula I en la inhibición in vitro e in vivo del crecimiento celular se realizó utilizando los métodos como se describe en los ejemplos precedentes. La inhibición del crecimiento celular por el compuesto parental 3 se sometió a detección selectiva mediante el ensayo de líneas celulares del o el Instituto Nacional del Cáncer y la leucemia, el cáncer de pulmón (macroc�tico), cáncer de colon, el cáncer renal y de pr�stata fueron especialmente sensibles al compuesto 3 El GI50 promedio de todas las líneas celulares analizadas fue de 0,62 M, como se muestra en la Figura 2.

La inhibición del crecimiento celular por el compuesto 3 se sometió a detección selectiva mediante el ensayo de fibras huecas del Instituto Nacional del Cáncer. Una puntuación total de 20 o más con una puntuación subcutánea de al menos 8 de células muertas de cualquier línea celular se considera como un compuesto anticanceroso significativamente activo. El compuesto 3 exhibió una puntuación total de 32, con la puntuación subcutánea de 10 y la muerte de células positivas, como se muestra en la Tabla 5 ant.

La inhibición del crecimiento de células tumorales se observa in vitro en ensayos de proliferaci�n de células cancerosas y en ensayos de fibra hueca in vivo y en modelos de xenoinjerto de tumor en ratones, por los compuestos de Fórmula I en diferentes tipos de células de cáncer.

EJEMPLO 17: CAPACIDAD IN VITRO DE LOS COMPUESTOS DE FÓRMULA I PARA MODULAR LA INHIBICIÓN DE LA EXPRESIÓN DEL GEN KLF4 EN LÍNEAS CELULARES CANCEROSAS HUMANAS

La inhibición del crecimiento celular CI50 (!M) por los compuestos de Fórmula I se analizó en varios tipos de células cancerosas mediante el ensayo de proliferaci�n celular XTT. Se observ� una CI50 baja o submicromolar en diferentes tipos de cáncer como se muestra en la Tabla 8. Los efectos inhibitorios del crecimiento de los compuestos de Fórmula I, como se muestra a continuación para la línea celular de melanoma SK-MEL-2 fueron reproducibles por Lorus Therapeutics Inc

Los valores de CI50 para los compuestos de Fórmula I en la línea celular de cáncer de mama MDA-MB-435 fueron entre 0,2 !M y 0,6 !M como se muestra a continuación en la Tabla 8.

Los niveles de expresión g�nica de KLF4, inducida por los compuestos de Fórmula I, también se examinaron en varios tipos de células de cáncer por RT-PCR. Los cambios en KLF4 en las células tratadas con el compuesto se expresaron en relación a la expresión KLF4 en las células de control tratadas con vehículo de respectivo tipo de célula como "1".". El aumento de expresión KLF4 se observ� en diferentes tipos de cáncer, también se muestran en la tabla 8. Estudios de expresión g�nica han revelado que el patrón de la expresión g�nica para la línea celular de cáncer de mama MDA-MB-435 se asemeja más a la de las líneas celulares de melanoma que de otras líneas tumorales de mama (Ross et al. (2000) Nat Genet 24(3): 227-233). Además, los xenoinjertos de MDA-MB-435 implantados en almohadillas de grasa mamaria de ratones SCID hembra han demostrado tinción inmunohistoqu�mica consistente con origen melanoc�tico (Ellison G, Klinowska T, Westwood RF, Docter E, French T, Fox JC. (2002) Mol Pathol. 55(5): 294-299). Se puede esperar que la línea celular de cáncer de mama MDA-MB-435 funcione de manera diferente que las otras líneas celulares de cáncer de mama.

EJEMPLO 18: EFICACIA IN VIVO DE LOS COMPUESTOS DE FÓRMULA I EN MODELOS DE XENOINJERTO DE CARCINOMA DE PULMÓN MACROC�TICO Y CARCINOMA DE COLON

La inhibición del crecimiento tumoral por los compuestos de Fórmula I en modelos de xenoinjertos de ratón se muestra en la Figura 25. Los estudios de la vía de administración y de programación para el carcinoma de células no pequeñas de pulmón (H460) (Figura 25A) y adenocarcinoma de colon (HT-29) (Figura 25B), la dosis mínima efectiva para carcinoma de pulmón macroc�tico (H460) (Figura 25C) , y la eficacia de los compuestos optimizados de Fórmula I del carcinoma de pulmón macroc�ticocarcinoma (H460) (Figura 25D).

EJEMPLO 19: EFECTO DE METALES EXÍGENOS SOBRE LA CAPACIDAD DEL COMPUESTO 3 PARA INHIBIR EL CRECIMIENTO DE CÉLULAS DE CÁNCER DE COLON HT29 IN VITRO

La inhibición del crecimiento celular inducida por agotamiento de cinc se muestra en la Figura 26. Efecto de los suplementos de iones de metal en el compuesto 3 mediada por la inhibición del crecimiento celular de células HT-29 se examin� mediante ensayo de proliferaci�n celular XTT. La inhibición del crecimiento celular se invirtió completamente por el cinc solo como se muestra en la Figura 26A y 26B.

EJEMPLO 20: CAPACIDAD IN VITRO DEL COMPUESTO 3 Y EL COMPUESTO 7 PARA BLOQUEAR LAPROGRESI�N DEL CICLO CELULAR EN CÉLULAS HT-29

El análisis del ciclo celular se evalu� mediante citometr�a de flujo en células HT-29 tratadas con el compuesto 3 como se muestra en la Figura 27A y el compuesto 7 como se muestra en la Figura 27B. La detención del ciclo celular en la fase G1 / S se observ� después del tratamiento.

EJEMPLO 21: CAPACIDAD IN VITRO DE LOS COMPUESTOS DE LA FÓRMULA I PARA QUELAR METALES

La propiedad de metal-quelaci�n del compuesto 3 y el compuesto 7 se muestra en la Figura 28. El ensayo de unión a metales in vitro de 4-(2-piridilazo) resorcinol (PAR) mostr� que la unión de Zn y Cu+2 a PAR fue atenuada por el compuesto 3, lo que indica la propiedad quelante in vitro de Zn y Cu+2 del compuesto 3. Los resultados se muestran en las Figuras 28A (ZnCl2),. 28B (CuCl2) y 28C (FeCl2). El análisis In vitro de 4-(2-pyridylazo) resorcinol (PAR) unión a cinc se realizó del siguiente modo. Por triplicado en los pocillos de una placa de 96 pocillos (Sarstedt, Newton, NC), 10 mL de volumen de las concentraciones finales indicadas de ZnCl2 en Tris-HCl 0,2M, pH 7.5 se incubaron con 10 !l de 80% de acetonitrilo-20% de control de vehículo DMSO o las concentraciones finales indicadas de los compuestos de Fórmula I, disueltos en 80% de acetonitrilo-20% DMSO, durante 15 min a temperatura ambiente. Después, 80!L de volumen de PAR a la concentración final de 200 !M en Tris-HCl 0,2M, pH 7.5 se añadieron y se midió el desarrollo de color del complejo PAR-Zn2+ mediante un espectrofotómetro de varios pocillos(Bio-Tek Instruments Inc.) at 500 nm.

EJEMPLO 22: CAPACIDAD IN VITRO DEL COMPUESTO 3 PARA MODULAR LA EXPRESIÓN DE LOS GENES SENSIBLES A METALES EN CÉLULAS HT-29

Cambios en la expresión de los genes sensibles a metales en células HT-29, en comparación con los quelantes de metal específica respectivos, se examinaron mediante RT-PCR como se muestra en las figuras 29A, 29B y 29C. El efecto del tratamiento con el compuesto 3 y el compuesto 7 sobre las expresiones de una metalotione�na 1A de proteína de almacenamiento de cinc (MT1A) (Figura 29A), un transportador de cobre,, Ctrl también conocido como SLC31A1 (Figura 29B) y un transportador de hierro; receptor de transferrina 1 (TfR1) (Figura 29C) se mide y se compara con un quelante conocido de cinc TPEN, una tetramina quelante de cobre y un quelante del hierro DFO, respectivamente. A pesar dequelaci�n in vitro de Cu+2, el aumento del gen sensible al cobre después del tratamiento con el compuesto de tratamiento 3 fue transitorio Por el contrario, la disminución sostenida del gen sensible a cinc indicó depleci�n de cinc intracelular como una consecuencia significativa tras el tratamiento con el compuesto 3.

EJEMPLO 23: CAPACIDAD DE LOS COMPUESTOS DE LA FÓRMULA I PARA MODULAR LA EXPRESIÓN DE MTF-1 Y CICLINA D1 IN VIVO

La correlación entre la expresión del factor de transcripción MTF-1 y un regulador del ciclo celular ciclina D1 en tejidos de xenoinjerto de cáncer de colon HT-29 se muestra en la Figura 30. Sobre la base de la presencia de secuencias de ADN de unión MTF-1-putativas en la región promotora del gen de la Ciclina D1 (que se muestra en la Figura 30A), los niveles de expresión de MTF-1 y Ciclina D1 en los tejidos de xenoinjertos se analizaron mediante RT-PCR, usando extracto de ARN tisular. La disminución de la expresión de MTF-1 se correlacion� con la disminución de la expresión de ciclina D1 con el compuesto 3 como se muestra en la Figura 30B y el compuesto 7 como se muestra en la Figura 27B.

EJEMPLO 24: CAPACIDAD DEL COMPUESTO 3 PARA MODULAR LA EXPRESIÓN DE MTF-1 Y CICLINA D1 IN VIVO

La correlación entre MTF-1 y la expresión de genes de ciclina D1 en células HT-29 se muestra en la Figura 31. Disminuciones dependientes del tiempo de las expresiones de MTF-1 (Figura 31A) y ciclina D1 (Figura 31B) medidas

mediante RT-PCR se observaron después del tratamiento con el compuesto 3. Disminución de la expresión de ciclina D1 (Figura 31D) se observ� después de la inactivaci�n del gen de MTF-1 mediante siRNA. Los niveles de MTF-1despu�s de la inactivaci�n del gen de MTF-1 mediante siRNA se muestran en la Figura 31C

La expresión y la actividad de la MTF-1 se reducen en los compuestos de Fórmula I. La regulaci�n por disminución de la MTF-1 se correlaciona con una disminución de la expresión de ciclina D1n.

EJEMPLO 25: CAPACIDAD DEL COMPUESTO 3 PARA MODULAR LA ACTIVIDAD DE UNIÓN A KLF4 IN VITRO

La disminución de la expresión de MTF-1 d que condice a la inducción del supresor tumoral KLF4 se muestra en la Figura 32. Sobre la base de la superposición de los sitios de unión del factor de transcripción sobre la región promotora del gen KLF4 (como se muestra en la Figura 32A), la unión de MTT-1puede favorecer el incremento de la unión de otros inductores del KLF4; Sp1 y KLF4. El aumento de las actividades de unión del ADN del Sp1 (Figura 32B) y KLF4 (Figura 32C), partir de los extractos nucleares de células HT-29, se mostraron mediante el ensayo de cambio de movilidad electrofor�tica (EMSA).

El ensayo de cambio de movilidad electrofor�tica (EMSA) se realizó como sigue. Los extractos nucleares de células HT-29 (107 células en placa de cultivo de 1000 mm en cada grupo experimental) se prepararon utilizando el kit de extracción nuclear (Panomics, Redwood City, CA), Los ensayos se realizaron con los kits EMSA KLF4 y Sp1 EMSA "Gel-Shift" (Panomics), siguiendo las instrucciones del fabricante. Brevemente, se usaron 5 g de extracto nuclear para cada reacción de unión. Después de 30 min de reacción de unión, las muestras se separaron en gel de poliacrilamida 6% a 4 �C a 120 V, y se transfirieron a una membrana de naylon BrightStar™-Plus con carga positiva. Las sondas marcadas con biotina en la membrana se visualizaron utilizando el sistema de detección ECL (Panomics).

La disminución de la actividad de MTF-1 favorece la inducción de KLF4 por los reguladores positivos; autoregulaci�n de Sp1 y KLF4.

EJEMPLO 26: CAPACIDAD DEL COMPUESTO 3 PARA MODULAR LA UNIÓN DE KLF4 AL PROMOTOR DE LA CICLINA D1 IN VITRO

El aumento de expresión de KLF4, que conduce a la represión de ciclina D1 en células HT-29 se muestra en la Figura

33. Sobre la base de la superposición de los sitios de unión del factor de transcripción sobre la región promotora del gen de la ciclina D1 (Figura 33A), el aumento de la unión de un regulador negativo de KLF4 puede sustituir a la unión de Sp1 un regulador positivo. La unión In vivo de KLF4 y Sp1 al promotor de la ciclona D1 se mostr� mediante el ensayo de inmunoprecipitaci�n de la cromatina (ChIP) (Figura 33B). Se observ� un aumento de KLF4 y disminución de la unión a Sp1 después del tratamiento con el compuesto 3.

Inmunoprecipitaci�n de la cromatina (ChIP) se realizó como sigue. Los lisados celulares de células HT-29 (5,5 x 105 células en tres placas de 15 cm en el cultivo de cada grupo experimental) se prepararon en el final de los experimentos indicados, y los ensayos de chip se realizaron utilizando anticuerpos anti-KLF4 y anti-Sp1 (Santa Cruz de Biotecnolog�a Inc) y el kit de chip-ITTM ( Activo Motif, Carlsbad, CA) siguiendo las instrucciones del fabricante. Los cebadores que abarcan la región 231 a -92 del promotor de la ciclina D1; 5' cebador (5'-CGGACTACAGGGGCAA-3') [SEC ID N�:1] y el cebador 3'(5'-GCTCCAGGACTTT- GCA-3') [SEQ ID NO:2] se sintetizaron en vitrogen.

El incremento de la unión de KLF4 (un regulador negativo) al promotor de la ciclina D1 inhibe la unión de Sp1 (un regulador positivo) y reprime la expresión de ciclina D1n.

EJEMPLO 27: CAPACIDAD IN VITRO DEL COMPUESTO DE 3 PARA INHIBIR EL CRECIMIENTO CELULAR Y MODULAR LA EXPRESIÓN DE KLF4 EN CÉLULAS HT-29

La Importancia de expresión KLF4 en el crecimiento celular HT-29 se muestra en la Figura 34 .La expresión de genes KLF4 medida mediante RT-PCR mostr� una inactivaci�n eficaz del gen KLF4 mediante siRNA (Figura 34A). La proliferaci�n celular medido mediante el ensayo de XTT mostr� la pérdida de inhibición del crecimiento celular mediada por el compuesto 3 tras la inactivaci�n del gen KLF4 mediante siRNA (Figura 34B).

La transfecci�n del ARN pequeño de interferencia (ARNsi) se realizó del siguiente modo: ARNsi de MTF-1 predise�ado (ID #115734) (Ambion, Austin, TX) se utilizó para inactivar el ARNm end�geno de MTF-1. De un modo similar, el ARNsi de KLF4 predise�ado (ID #115492) (Ambion, Austin, TX) se utilizó para inactivar el ARNm end�geno de KLF4 . Un ARN inespec�fico, de doble cadena

(5'r(CUAGGGUAGACGAUGAGAG)d(TT)3') [SEC ID N� 3] y

(3'd(TT)r(GAUCCCAUCUGCUACUCUC)5') [SEC ID N:4]

se sintetizó en Qiagen (Cambridge, MA) sobre la base de la secuencia de un gen no relacionado. las células HT-29 (3 X105 células en placas de 35 mm de cultivo) se transfectaron con las concentraciones indicadas de ARNsi o control de mezcla de ARN utilizando el reactivo de transfecci�n Lipofectamine ™ 2000 (Invitrogen) siguiendo las instrucciones del fabricante, durante 6 horas Al finalizar el periodo de incubaci�n el medio de transfecci�n se complement� con un medio de crecimiento completo y las células se incubaron a 37 �C durante 24 horas antes de los experimentos indicados.

5 EJEMPLO 28: EFECTO DE LOS COMPUESTOS DE FÓRMULA I EN EL CRECIMIENTO DE CÉLULAS GRANDES HUMANO CARCINOMA PULMONAR (H460) EN CD-1 RATONES DESNUDOS

La inhibición del crecimiento tumoral por los compuestos de Fórmula I en modelos de xenoinjerto de ratón de carcinoma de pulmón de células grandes humano (H460) se llev� a cabo como se describe en los Ejemplos anteriores.

10 Los resultados se muestran en la Figura 35.

EJEMPLO 29: QUELACI�N IN VITRO DE LOS IONES DE CINC POR LOS COMPUESTOS DE FÓRMULA I

Para determinar la propiedad de quelaci�n del compuesto 3 con iones de cinc in vitro, los iones de cinc disponibles

15 libres se midieron mediante espectrofluorometr�a usando colorante Zinquin fluorescente sensible a cinc, después de la pre-incubaci�n deZnCl2 con diferentes concentraciones de compuesto 3 (Figura 36). El ZnCl2 2 !M se incubaron con concentraciones indicadas de compuesto 3, en solución salina tamponada con fosfato (PBS), seguido de la adición de Zinquin, a 10 mM de concentración final durante 30 min, la fluorescencia de Zinquin tras la unión de cinc se midió en un espectrofluor�metro Fluoroskan de luminiscencia , a una excitación de 364 nm y 485 nm de longitudes de onda de

20 emisión.

Se observ� disminución dependiente de la dosis en Zinquin de fluorescencia, lo que indica la unión de menos de iones de cinc a Zinquin como resultado de la quelaci�n del compuesto 3 quelaci�n con iones de zinc Un experimento similar con FeCl2 and CuSO4 no mostr� fluorescencia de Zinquin, lo que indica la especificidad de la fluorescencia de Zinquin

25 sólo por los iones de cinc.

EJEMPLO 30: QUELACI�N DE IONES DE CINC INTRACELULAR EN LAS CÉLULAS HT-29 IN VITRO DESPUÉS DEL TRATAMIENTO CON COMPUESTOS DE FÓRMULA I

30 Para determinar la propiedad de quelaci�n del compuesto 3 con iones de cinc las células HT-29 con o sin precargado con ZnCl2 35 !M se trataron con el compuesto 3. un conocido quelante de cinc o vehículo control (DMSO), y el cinc libre intracelular se determin� mediante la medición de la fluorescencia de Zinquin como se describe en el ejemplo anterior (Figura 37). Las células HT-29 cells (4x105 células / grupo) fueron pretratadas con 35 mM de ZnCl2 durante 20 minutos, seguido de la adición de las concentraciones indicadas del compuesto 3 o TPEN y Zinquin 10 mM durante 30

35 min a 37 �C, y se midió el recuento de fluorescencia (Figura 37A). Para la medición de la quelaci�n de iones de cinc end�genos en células HT-29, (1,5x106 células / grupo) se trataron con las concentraciones indicadas de compuesto 3 y Zinquin10 mM durante 30 min a 37 �C, y se midió el recuento de fluorescencia (Figura 37B).

La disminución dependiente de la dosis de los niveles precargados y end�genos de cinc se observaron después del 40 tratamiento con compuesto de 3 o con TPEN.

EJEMPLO 31: EFECTO DE LOS COMPUESTOS DE FÓRMULA I EN LA QUELACI�N DE CINC Y LA EXPRESIÓN DEL GEN DE LA METALOTIONE�NA 1A EN CÉLULAS HT-29 IN VITRO

45 Para confirmar la disminución en el nivel intracelular de cinc tras el tratamiento con el compuesto 3 se midió la alteración en la expresión g�nica de la metalotione�na de almacenamiento de cinc-proteína 1A (MT1A) como un marcador de estado de cinc intracelular.

Las células HT-2 9 se trataron con 1 mM del compuesto 3 durante el tiempo indicado y la expresión g�nica MT1A se

50 midió como sigue. El ARN total se extrajo mediante el método de TRIZOL y nivel de expresión g�nica se determin� por reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa con transcripción inversa (RT-PCR). La expresión g�nica de MT1A se normalizó con la expresión del gen de la �-actina en la misma muestra. El cambio en MT1A se expres� en relación con el nivel de control de MT1A DMSO en los respectivos puntos de tiempo. La disminución en la expresión g�nica de MT1A fue evidente después de 8 h de tratamiento como se muestra en la Figura 38A.

55 Para verificar que la expresión del gen MT1A refleja el nivel intracelular de cinc, las células HT-29 se trataron con 1 mM del compuesto 3. 35 !M ZnCl2 o compuesto 3 y ZnCl2 juntos durante 16 horas (Figura 38B). La expresión g�nica de MT1A se determin� mediante RT-PCR como se describe anteriormente. La expresión g�nica de MT1A se elev� en respuesta a un aumento de iones intracelulares de cinc en de ZnCl2C�lulas tratadas. La disminución en la expresión

60 de MT1A en respuesta al agotamiento intracelular de cinc, después del tratamiento con el compuesto 3 se invirtió mediante la adición de suplemento de cinc (Figura 38B).

EJEMPLO 32: EFECTO DE LOS COMPUESTOS DE FÓRMULA I EN LA QUELACI�N DE CINC Y LA EXPRESIÓN DEL FACTOR DE TIPO KRUPPEL 4 (KLF4) EN CÉLULAS HT-29 IN VITRO

El cambio en la expresión g�nica de KLF4 en el agotamiento de cinc tras el tratamiento con el compuesto 3 se determin� por RT-PCR de la siguiente manera. Las células HT-29 se trataron con 1 1 !M del compuesto 3 durante el tiempo indicado (Figura 39A) o las células HT-29 se trataron con1 !M del compuesto 3, 35 !M ZnCl2 o compuesto 3 y ZnCl2 juntos durante 16 horas (Figura 39B). El ARN total se extrajo y el nivel de la expresión g�nica se determin� por RT-PCR.

Se observ� un aumento dependiente del tiempo en KLF4 después de 4 h de tratamiento de células HT-29 con 1 !M del compuesto M 3 y el máximo aumento tuvo lugar a las 16 h oras (Figura 39A). El aumento en la expresión g�nica de KLF4 se invirtió mediante la adición de suplemento de cinc (Figura 39B), lo que indica la importancia del cambio en la expresión g�nica de KLF4 en respuesta al estado de cinc intracelular.

EJEMPLO 33: EFECTO DE LOS COMPUESTOS DE FÓRMULA I SOBRE LA EXPRESIÓN G�NICA Y LA ACTIVIDAD DE UNIÓN AL ADN DEL FACTOR DE TRANSCRIPCIÓN 1 (MTF-1) QUE SE UNE AL ELEMENTORESPONDEDOR A METALES SENSIBLE A CINC (MRE) EN CÉLULAS HT-29 IN VITRO

La expresión del gen de la MTF-1 se examin� por RT-PCR tras el tratamiento de células HT-29 con 1 !M del compuesto 3 durante el tiempo indicado La disminución en la expresión g�nica de MT1F-1 fue evidente después de 8 h de tratamiento como se muestra en la Figura 40A.

Para verificar el cambio en la actividad de MTF-1 a un tiempo de incubaci�n temprano, antes de la disminución significativa en la expresión g�nica de MTF-1, La translocaci�n nuclear de MTF-1 translocaci�n nuclear y la actividad de unión a ADN se determin� en el extracto nuclear de células HT-29 tratadas con el compuesto 3 durante 4 horas, mediante el ensayo de cambio de movilidad electrofor�tica (EMSA) del siguiente modo. Las células HT-29 se trataron con DMSO, ZnCl2 35 !M (control positivo) y 1 !M del compuesto 3 durante 4 horas. La proteína nuclear se extrajo y se incub� con MTF-1 sondas de oligonucle�tidos de unión marcados con biotina, La movilidad retardada de la sonda marcada tras la unión a MTF-1 se observ� como un cambio de banda (Figura 40B). Se observaron tres bandas de desplazamiento (flechas de bloque) en el carril 1 (DMSO), que muestra el patrón de unión al ADN constitutivo de la MTF-1. En los grupos tratados con zinc, se observaron 2 bandas de desplazamiento adicionales flechas abiertas) (Carril 3), que indica el aumento de la actividad de MTF-1 dependiente de cinc. Las bandas de desplazamiento activadas por cinc no se observaron en el grupo tratado con el compuesto 3 (carril 5), lo que indica que la actividad de MTF-1 dependiente de cinc no se increment� por el compuesto 3. Se a�adi� un exceso de sondas no marcadas en el carril de 2,4 y 6 para competir con las sondas marcadas de unión con MTF-1 en el extracto nuclear, que muestra la especificidad de las bandas de desplazamiento de MTF-1 en los carriles 1,3 y 5, respectivamente.

En comparación con las bandas de cambio de movilidad observadas en el grupo tratado con ZnCl2- control positivo no se observaron cambios significativos en el desplazamiento de la movilidad en las células tratadas con el compuesto 3, lo que confirma que la actividad de MTF-1 dependiente de cinc no se increment� por el compuesto 3.

EJEMPLO 34: CAPACIDAD IN VITRO DEL COMPUESTO 3 PARA MODULAR LA EXPRESIÓN G�NICA DEL OPONENTE DE KLF4- FACTOR DE TIPO KRUPPEL 5 (KLF5) EN CÉLULAS HT-29

KLF 4 y 5 son dos miembros estrechamente relacionados de la familia de los factores de transcripción pero KLF5 estimula la proliferaci�n celular mientras KLF4 inhibe el crecimiento celular (Ghaleb et al., (2005) Cell .Res. 15(2): 92-96). KLF 4 y 5 se unen a la secuencia consenso de ADN rico en GC similar pero exhiben actividades transcripcionales contrarias. KLF4 can puede auto-activar su propio gen mediante la unión a la región rica en GC en promotor de KLF4 mientras que KLF5 inhibe la transcripción de KLF4 mediante la unión al mismo elemento de ADN (Dang et al., (2002) Nucleic Acids Res. 30(13):2736-2741).

Para identificar la consecuencia de la disminución de la expresión / actividad de MTF-1 en relación a la inducción deKLF4, El ARNm de MTF-1se inactiv� usando el ARNsi dirifido a MTF-1-y las expresiones g�nicas de MTF-1. KLF4 y KLF5 se midieron por RT- PCR de la siguiente manera Las células HT-29 se transfectaron con 100 nM de ARNsi de MTF-1durante 6 horas, usando el reactivo Lipofectamina 2000. Después de la sustitución del medio de transfecci�n con medio de crecimiento normal y la incubaci�n durante 18 horas, el ARN total se extrajo y el nivel de la expresión g�nica se determin� por RT-PCR. Después de la inhibición de la traducción de MTF-1 mediante el uso de ARNsi específico del gen de MTF-1, se observ� disminución de la expresión del gen KLF5 mientras que la expresión KLF4 se increment� (Figura 41A).

La disminución de la expresión de genes de KLF5 después del tratamiento durante el tiempo con el compuesto 3 también se determin� como sigue, Las células HT-29 se trataron con 1 1 !M del compuesto 3 durante el tiempo indicado (Figura 41B). El ARN total se extrajo y el nivel de la expresión g�nica se determin� por RT-PCR. De acuerdo con el resultado anterior, también se detect� la disminución en la expresión de genes KLF5 en células HT-29 después del tratamiento de 4 horas con 1 !M del compuesto 3 (Figura 41B).

EJEMPLO 35: CAPACIDAD IN VITRO DEL COMPUESTO 3 PARA MODULAR LA EXPRESIÓN DEL GEB DE LA PROTEÍNA P21 REGULADORA DEL CICLO CELULAR Y DE PROTEÍNAS EN CÉLULAS HT-29

Se examinaron las expresiones de gen p21 y las proteínas después del tratamiento con el compuesto 3. La expresión

5 g�nica de p21 en células HT-29 tratadas con 1 !M del compuesto 3 se determin� en los tiempos indicados de la siguiente manera. El ARN total se extrajo y el nivel de la expresión g�nica se determin� por RT-PCR Figura 42A). El nivel de proteína p21 en el lisado total de células se midió por ELISA (Figura 42B) de la siguiente manera. Las células HT-29 se trataron con 1 !M del compuesto 3 con y sin 20 mM MG-132 (inhibidor de proteasoma) durante el tiempo indicado.

10 Se observ� aumento de la expresión del gen de p21 después de 4 h de tratamiento con el compuesto 3 mediante RT-PCR (Figura 42A) pero un aumento comparable en la expresión de la proteína p21 no se detect� mediante cualquiera de los análisis de transferencia Western (datos no presentados) o ensayo de inmunoabsorci�n ligado a enzimas (ELISA) (Figura 42B). Sin embargo, se detect� un incremento del nivel de la proteína p21 cuando las células

15 HT-29 se incubaron con el compuesto 3 en presencia de un inhibidor del proteasoma, MG-132, lo que indica que la proteína p21 se degrada rápidamente a pesar de un aumento significativo en la expresión del gen p21.

EJEMPLO 36: CAPACIDAD IN VITRO DEL COMPUESTO 3 PARA MODULAR LA EXPRESIÓN DE LA PROTEÍNA CICLINA D1 REGULADORA DEL CICLO CELULAR

20 La expresión g�nica y proteica de la ciclina D1 después del tratamiento con el compuesto 3 se determin� por RT-PCR y Western Blot como se muestra en las Figuras 43A y 43B, respectivamente, del siguiente modo. Las células HT-29 se trataron con1 mM del compuesto 3 durante el tiempo indicado. El ARN total se extrajo y el nivel de la expresión g�nica se determin� por RT-PCR. La expresión de la proteína ciclina D1 en el lisado de células HT-29 se determin� por

25 SDS-PAGE seguido por transferencia Western.

La disminución tanto de genes (Figura 43A) como de la proteína (Figura 43B) los niveles de ciclina D1 se observaron después de 8 h de tratamiento con el compuesto 3.

30 EJEMPLO 37: CAPACIDAD IN VITRO DEL COMPUESTO 3 PARA MODULAR LA EXPRESIÓN DEL GEN SUPRESOR TUMORAL RESPUESTA DE CRECIMIENTO TEMPRANO DE LA PROTEÍNA-1 (EGR-1)

Como Sp1, Egr-1 también es un factor de transcripción con dominios de unión al ADN de dedos de zinc, que reconoce las secuencias ricas en GC en la región promotora de regulaci�n del gen diana (Al-Sarraj et al., (2005) J. Cell Biochem.

35 94 (1): 153-167). Se han detectado cambios en el Egr-1 la expresión g�nica en las células HT-29 tratadas con el compuesto 3 por RT-PCR (Figura 44A) como sigue. Las células HT-29 se trataron con1 mM del compuesto 3 durante el tiempo indicado. El ARN total se extrajo y el nivel de la expresión g�nica se determin� por RT-PCR. Para determinar los efectos de suplemento de zinc, , las células HT-29 se trataron con 1 !M del compuestos 3, 35 !M ZnCl2 o compuesto 3 y ZnCl2 juntos durante 8 horas. La expresión del gen de Egr-1 se determin� por RT-PCR (Figura 44B).

40 Se observ� un aumento significativo en la expresión del gen Egr-1 tan temprano como 2 horas después del tratamiento con el compuesto 3 como se muestra en la Figura 44A y que fue reversible después de la adición de suplemento de cinc tal como se muestra en la Figura 44B.

45 EJEMPLO 38: CAPACIDAD IN VITRO DEL COMPUESTO 3 Y EL COMPUESTO 7 PARA MODULAR LA EXPRESIÓN DEL GEN EN CÉLULAS HT-29

Los patrones de expresión g�nica en respuesta al compuesto 3 y al compuesto 7 se verificaron por RT-PCR (Figura 45) de la siguiente manera. Las células HT-29 se trataron con 1 !M del compuesto 3 o el compuesto 7 durante 8 horas. 50 El ARN total se extrajo y el nivel de la expresión g�nica se determin� por RT-PCR. Se observ� un patrón de expresión similar de los genes de interés.

EJEMPLO 39: CAPACIDAD DEL COMPUESTO 3 PARA MODULAR LA EXPRESIÓN G�NICA DE KLF4 Y CICLINA D1 EN EL MODELO DE XENOINJERTO DE CÁNCER DE COLON HT29

55 Para examinar el efecto de los cambios mediados por el compuesto 3 en las expresiones de KLF4 y ciclina D1 in vivo, las expresiones de los genes respectivos en los tejidos de xenoinjerto del vehículo control (Lutrol) y los ratones transplantados con células de cáncer de colon HT.29 tratados con el compuesto 3- se analizaron mediante RT-PCR (Figura 46). Brevemente, la expresión g�nica de KLF4 y ciclina D1 en los tejidos de xenoinjerto HT-29 después de 14

60 días de tratamiento con el compuesto 3 se midió como sigue. Los ratones trasplantados por vía subcutánea con células HT-29 se trataron con vehículo control (administrados i.p.) o 100 mg / kg de compuesto 3 (administrado por vía ip) durante 14 días (n = 6 en cada grupo). El ARN total se extrajo y el nivel de la expresión g�nica se determin� por RT-PCR. La expresión g�nica de KLF4 y Ciclina D1 se normalizó con la expresión del gen de la �-actina en la misma muestra. Los cambios en KLF4 y ciclina D1 se expresaron respectoto al promedio de la expresión g�nica respectiva de

65 6 ratones control tratados con Lutrol.

De acuerdo con el patrón de expresión en líneas celulares HT-29 in vitro, se observaron el aumento de gen KLF4 y la disminución de la expresión de los genes de ciclina D1 in vivo.

EJEMPLO 40: CAPACIDAD IN VITRO DEL COMPUESTO DE 3 PARA QUELAR CINC A PARTIR DE LA PROTE�NADE ALMACENAMIENTO DE METALOTIONE�NA CONC.

El cinc intracelular existe como un conjunto l�bil unido de forma laxa de metalotione�nas proteínas de almacenamiento (MT), que almacenan hasta 7 u 8 de cinc por molécula. El conjunto de cinc l�bil dona cinc a las enzimas o factores de transcripción, que requieren unión reversible con cinc para su actividad completa (Tapiero y Tew (2003) Biomed Pharmacother 57 (9): 399-411). 399-411). La eficacia del compuesto 3 para eliminar el cinc de MT se investigó MT-1asiladas de hígado de conejo, que contiene principalmente MT-1a y MT-2e con ~ 7 de cinc por molécula en � 95% de MT se adquirió en Alexis bioquímicos (Lausen, Suiza). Se midió el contenido de cinc en MT in vitro utilizando 4 (2-piridilazo) resorcinol (PAR) ensayo colorim�trico de cinc como se describe en los Ejemplos precedentes. El cambio en la absorbancia de PAR después de la formación de complejos de iones de zinc-PAR se midió a 500 nm (Dinkova-Kostova et al., (2005) Biochemistry 44(18): 6889-6899). Para determinar la quelaci�n de cinc a partir de MT-1 por el compuesto 3 in vitro, se a�adi� MT-1 25 !M en 100 ml de volumen de 0,2 M Tris-HCl, a pH 7,5 a la placa de 96 pocillos El compuesto 3 (0,15 a 60 mM) en 80% acetonitrilo/20% de DMSO se a�adi� a MT-1 durante 15 min a temperatura ambiente. PAR (200 !M en 0,2M Tris-HCl, pH 7.5 se añadieron y se midió el desarrollo de color del complejo PAR-cinc mediante un espectrofotómetro de varios pocillos a 500 nm en la Figura 47,

Reducciones dependientes de la dosis en la absorbancia de PAR de 25 M MT se observ� después del tratamiento in vitro con dosis crecientes del compuesto 3 (figura 47), lo que demuestra la eliminación del cinc por el compuesto 3 de los conjuntos de cinc intracelular l�biles.

EJEMPLO 41: CAPACIDAD IN VITRO DEL COMPUESTO 3 PARA EFECTUAR LA ACTIVIDAD DE UNIÓN AL ADN DE MTF-1

Se investigó la eficacia del compuesto 3 para inactivar la actividad de unión al ADN del factor de transcripción de unión al elemento respondedor a etales del factor de transcripción que contiene dedos de cinc. La unión reversible del cinc a los dedos de cinc del MTF-1 se requiere para la transposición nuclear de la MTF-1 y la unión máxima de la MTF-1 al ERM (Lichtlen and Schaffner (2001) Bioessays 23(11): 1010-1017).

Las células HT-29 se trataroncon 35 mM deZnCl2 durante 4 horas y el extracto nuclear a partir de células tratadas con cinc ( MTF-1activada con cinc) se trat� con el compuesto 3 in vitro y la actividad de unión al ADN de MTF-1 a la secuencia del ERM se evalu� mediante el ensayo de cambio de movilidad electrofor�tica (EMSA) (Panomics, Redwood City, CA), La inactivaci�n de la unión del ADN a MTF-1 por el compuesto 3 in vitro se muestra en la Figura 48A.

Para examinar la inactivaci�n de MTF-1 por el compuesto 3 en las células HT.29, se trataron con el compuesto 3 durante de 1 a 4 horas y la actividad de unión al ADN de MTF-1 en el extracto nuclear se evalu� mediante EMSA. La disminución de la actividad de MT1F-1 fue evidente después de 4 h de tratamiento de las células HT-29 con el compuesto 3 (Figura 48B).

EJEMPLO 42: CAPACIDAD DEL COMPUESTO 3 PARA MODULAR LA ACTIVIDAD DE UNIÓN AL ADN DE MTF-1 EN CÉLULAS HT-29

Para examinar la disminución de la unión de MTF-1 a la región promotora del gen diana de MTF-1, el gen regulador del ciclo celular de ciclina D1, Las células HT-29 se trataron con el compuesto 3 durante 16 horas y la unión de MTF-1 al promotor de la ciclina D1 se evalu� mediante ensayo de inmunoprecipitaci�n de la cromationaChIP) (Active Motif, Carlsbad, CA), Al final de 16 h de tratamiento con el compuesto 3, las células se fijaron con formaldeh�do al 1% para reticular factores de transcripción y su cromatina objetivo. Los complejos de cromatina se cortaron y la cromatina unida a MTF-1-se bloque� usando anticuerpos frente a MTF-1 (Santacruz Biotechnology Inc.). La reticulación se invirtió y el ADN MTF-1-asociado se amplificó por reacción en cadena de la polimerasa usando los cebadores que abarcan desde la región de -231 hasta -92 del promotor de la ciclina D1. El 5' cebador (5'-CGGACTA- CAGGGGCAA-3') [SEQ ID N�:1] y el cebador en 3' (5'-GCTCCAGGACTTTGCA-3') [SEC ID N�2] se sintetizaron en vitrogen. El incremento de la unión de MTF-1 al promotor de ciclina D1 se observ� después del tratamiento con 35 !M de ZnCl2 como se muestra en la Figura 49, lo que indica que la ciclina D1 est� dirigida al gen MTF-1. La disminución de la MTF-1 de unión al promotor de ciclina D1 después del compuesto de 3 en comparación con los niveles basales de la unión a MTF-1, se observ�, lo que indicó que el compuesto 3 inhibía la activación transcripcional constitutiva del gen de la ciclina D1 por MTF-1 (Figura 49).).

EJEMPLO 43: EFECTO DE LOS COMPUESTOS DE FÓRMULA I EN LA QUELACI�N DE CINC Y LA EXPRESIÓN DEL GEN DE LA CICLINA D1 EN CÉLULAS HT-29 IN VITRO

Para identificar la vía de la regulaci�n del ciclo celular que participa en el compuesto 3-mediada por la detención del ciclo celular como se muestra en el Ejemplo 20, en particular asociado con la fase G1 / S, la expresión del regulador

clave del ciclo celular clave de la progresión de la fase G1 / S, C, ciclina D1 se analizó. La expresión del gen de ciclina D1 como se mide por RT-PCR disminuyó significativamente después del tratamiento de células HT-29 con 1 !M del compuesto 3 durante 16 horas y que se invirtió en presencia de 25 mM de ZnCl22, Lo que confirma que la disminución de la expresión de ciclina D1 fue consecuencia del agotamiento del cinc (Figura 50A). La disminución de la expresión de la proteína ciclina D1 también se confirm� por SDS-PAGE seguido por transferencia Western (Figura 50B). Además, la medición de la expresión de otros tipos de ciclina identificados disminuyó la expresión de ciclina E (Figura 50B).

EJEMPLO 44: EFECTO DE LOS COMPUESTOS DE FÓRMULA I SOBRE LA EXPRESIÓN DE MTF-1 EN CÉLULAS LHT-29 IN VITRO

Para evaluar la respuesta celular a la depleci�n de zinc, se examin� la expresión del factor de transcripción MTF-1 sensible a cinc. Se observ� una disminución significativa en la expresión g�nica de la MTF-1 (Figura 51) tal como se mide por RT-PCR después de 8 h de tratamiento de las células HT-29 con1 !M del compuesto 3 y que se recuper� por adición de suplemento de zinc, confirmando que la disminución de la expresión de MTF-1 por el compuesto 3 tratamiento fue consecuencia del agotamiento de zinc.

Las células HT-29 se trataron con ZnCl2 y la expresión de gen de Ciclina D1 se midió por RT-PCR. Los cambios en la expresión g�nica se presentaron en relación con la expresión del gen de la ciclina D1 en las células de control. Se observ� aumento de la expresión de gen Ciclina D1 después del tratamiento de las células con el zinc, como un activador de la MTF-1 (Figura 51B).

Las células HT-29 control o tratadas con ARsi de MTF-1 se trataron con o sin ZnCl2 y la expresión de gen de Ciclina D1 se midió por RT-PCR. Los cambios en la expresión g�nica se presentaron en relación con la expresión del gen de la ciclina D1 en las células de control sin la transfecci�n en el grupo de control y con respecto a la expresión del gen de la ciclina D1 en las células no específicas transfectadas con ARNsi para el grupo de la transfecci�n. El aumento dependiente de cinc en la expresión de ciclina D1 se elimin� cuando el gen de MTF-1 se inactiv� con ARNsi antes de la adición del compuesto 3 (Figura 51C).

EJEMPLO 45: CAPACIDAD IN VITRO DEL COMPUESTO 3 PARA MODULAR LA EXPRESIÓN DE KLF4 EN CÉLULAS HT-29 CON INACTIVACI�N DE MTF-1 MEDIADA POR ARNSI

Para evaluar la importancia de la disminución de la expresión de MTF-1 en la inducción de KLF4 la expresión de del gen KLF4 en respuesta al tratamiento con el compuesto 3 se midió mediante RT-PCR en células HT-29 transfectadas con ARNsi de MTF-1 A. Los cambios en la expresión g�nica de KLF4 se presentaron en relación con la expresión de KLF4 en las células transfectadas con siRNA no específicos tratados con el vehículo control. La expresión basal del gen KLF4 se redujo significativamente después de la inactivaci�n del gen de MTF-1, indicando una transcripción del gen KLF4 constitutiva dependiente de MTF-1 (Figura 52). Sin embargo, a expresión del gene KLF4 seguía aumentada tras el tratamiento con el compuesto 3 , a pesar de la inactivaci�n del gen KLF4 mediante siRNA (Figura 52). lo que sugiere activación del gel de KLF4 independiente de MTF-1 tras el tratamiento con el compuesto 3.

EJEMPLO 46: EFECTO IN VITRO DE LOS COMPUESTOS DE FÓRMULA I SOBRE LA EXPRESIÓN DE LOS GENES KLF4, KLF2 Y KLF6 EN CÉLULAS DE CÁNCER DE PULMÓN MACROC�TICO H-460

Los niveles de expresión de otros supresores tumorales potenciales;; KLF2 (pulmón-KLF) (Wang et al., (2005) Oncogene 22(24): 3878-3885) y KLF6 (Ito et al., (2004) Cancer Res 64(11): 3838-3843), evaluaron en la línea celular de carcinoma macroc�tico H-460 Las expresiones de KLF2, 4 y 6 en las células H-460 control, se midieron por RT-PCR. La expresión g�nica se present� en relación con la expresión de KLF4 como "1" (Figura 53A). La expresión de KLF4 era la más alta y sólo 0,05 y 0,3 de expresión de KLF2 y 6 se han detectado en relación a la expresión KLF4 como "1" (Figura 53A)

Las expresiones de KLF2, 4 y 6 en las células H-460 tratadas con vehículo control o con 2,5 !M del compuesto 3 o el compuesto 7, se midieron por RT-PCR. La expresión g�nica se present� con respecto a la expresión g�nica respectiva en el grupo control tratado con vehículo como "1". El tratamiento con el compuesto 3 o el compuesto 7 también mostr� un incremento de KLF4 como gen cambiado más significativamente (Figura 53B)

EJEMPLO 47: EFICACIA IN VIVO DEL COMPUESTO 3 Y LA MODULACIÓN DE LA EXPRESIÓN SOBRE MTF-1, CICLINA D1 Y KLF4 EN UN MODELO DE XENOINJERTO DE CÁNCER DE COLON

La eficacia de regresión del tumor del compuesto 3 se evalu� en ratones atómicos transplantados con células HT-29 tratadas con el compuesto 3 (Figura 54A), y se correlacionaron con las expresiones g�nicas de MTF-1, KLF4 y ciclina D1 en tejidos de xenoinjerto HT-29 (Figura 54B). En ratones CD-1 desnudos atómicos (4 por grupo) se inyect� por vía subcutánea células HT-29 (3x106c�lulas en 0,1 ml de PBS). los 5 días después de la inoculación de células tumorales, se inyect� en los ratones por vía intraperitoneal 200 !l del vehículo control o 100 mg/kg del compuesto 3 durante 5 días, seguido de 10 días de intervalo, para 2 ciclos (días 5 a 9 como una primera inyección de ciclo y días 20 a 24 como un segundo ciclo de inyección) El tamaño del tumor se midió durante el curso del tratamiento usando compás (Figura 54A). Los ratones fueron sacrificados a los 34 días después de la inoculación de células tumorales. Los tejidos tumorales se extirparon, se congelaron inmediatamente y se almacenaron a -80 �C hasta la extracción de ARN y la expresión g�nica se analizó por RT-PCR (Figura 54B). Los cambios en la expresión g�nica se presentaron en relación con el promedio de 4 ratones de control inyectados con vehículo de control Lutrol

5 Se observ� una reducción significativa en el tamaño del tumor en los ratones tratados con el compuesto 3, en comparación con los ratones de control inyectados con vehículo (Figura 54A). Análisis de la expresión g�nica en el tejido de xenoinjerto también mostr� un aumento significativo en KLF4 y una disminución de las expresiones de MTF-1 y Ciclina D1 en ratones tratados con el compuesto 3 -en comparación con el grupo de control inyectado con vehículo (Figura 54B).

EJEMPLO 48: CAPACIDAD IN VITRO DEL COMPUESTO 3 Y EL COMPUESTO 7 PARA MODULAR LA EXPRESIÓN INDE MT1A, MTF-1, CICLINA Y KLF4 EN CÉLULAS HT-29

15 La capacidad de los compuestos de Fórmula I para modular la expresión de genes de MT1A (Figura 55A) MTF-1 (Figura 55B), ciclina D1 (Figura 55C) y KLF4 (Figura 55D) se determin� por RT-PCR. Las células HT-29 se trataron con 1 !M del compuesto 3 o el compuesto 7 , 35 !M de ZnCl2, el compuesto 3 y ZnCl2 juntos o compuesto 7 y ZnCl2 juntos durante de 8 a 16 horas. La expresión g�nica respectiva se normalizó con la expresión del gen de la �-actina en la misma muestra. Los cambios en la expresión de genes se expresaron en relación con el respectivo nivel de genes de control de DMSO. Según se observ� con1 !M del compuesto 3 también se detectaron expresión disminuida de MT1A, MTF-1 y ciclina D1, y aumento de la expresión de KLF4 con el compuesto 7. Para enfatizar que los cambios de expresión g�nica fueron la consecuencia del agotamiento de cinc intracelular la disminución de MT1A (8 horas) (Figura 55A), MTF-1 (8 h) (Figura 55B) y ciclina D1 (8 h) (Figura 55C) y el incremento de KLF4 (16 h) (Figura 55D) tras el tratamiento con el compuesto 3 o el compuesto 7 se invirtió mediante la adición de suplemento con cinc.

25 Listado de secuencias

<110> Lorus Therapeutics Inc. et al.

<120> Derivados de 2-indolil imidazo[4,5-d]fenantrolina y usos de los mismos en el tratamiento del cáncer

<130> 335-173PCT

<140> N/A 35 <141> 2006-05-25

<150> 60/787.526

<151> 31/03/2006

<150> 60/710.551

<151> 22/08/2005

<150> 60/787.526

<151> 31/03/2006 45

<160> 4

<170> FastSEQ para la versión 4.0 de Windows

<210> 1

<211> 16

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

55 <220>

<223> Cebador

<400> 1

<210> 2

<211> 16

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador

<210> 3

<211> 21

<212> ARN 10 <213> Secuencia artificial

<220>

<223>Hebra sentido no específica del oligonucle�tido de ARNsi

15 <221> misc_feature

<222> (20).(21)

<223>n en las posiciones 20 y 21 son ADN (timidina)

20 <400> 3 cuaggguaga cgaugagagn n 21

<210> 4

<211> 21 25 <212> ARN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223>Hebra antisentido no específica del oligonucle�tido de ARNsi 30

<221> misc_feature

<222> (20).(21) <223>n en las posiciones 20 y 21 son ADN (timidina)

35 <400> 4 cucucaucgu cuacccuagn n 21

Claims (17)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un compuesto de fórmula (I):

   5 o una sal del mismo. en la que:

   R1, R3, R4, R5, y R7 son hidrógeno R2 es halógeno, y . R6 es alquilo C1-C4.
2. 2. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho compuesto se selecciona del grupo que consiste en
3. 3. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 2, en el que dicho compuesto es:

4. 4.

   El compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicha sal es una sal de HCl. 5

5. 5. Una composición farmacéutica que comprende el compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 y un vehículo farmac�uticamente aceptable.

6. 6.

   La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 5, en el que dicha composición es una formulación 10 liposomal o de micelas de lípidos.

7. 7. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 5 o 6, en la que dicha composición se formula para la administración intravenosa.

   15 8. El compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para uso en el tratamiento de cáncer en un sujeto que lo necesite.
8. 9. El compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para uso en la inhibición de la

   proliferaci�n de células de cáncer en un sujeto que lo necesite. 20
9. 10. El compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para uso en la inducción de la apoptosis en una célula de cáncer.
10. 11. El compuesto para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, en el que dicho cáncer es un 25 tumor sólido.,
11. 12. El compuesto para uso de acuerdo con la reivindicación 11, en el que dicho tumor sólido se selecciona del grupo de: tumor de pulmón macroc�tico, tumor de colon tumor de pr�stata, tumor de mama, y melanoma.

    30 13. El compuesto para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, en el que dicho cáncer es la leucemia.
12. 14. El compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para uso en el aumento de expresión del

    factor de tipo Kr�ppel 4 (KLF4) en una célula de cáncer. 35
13. 15. El compuesto para uso de acuerdo con la reivindicación 14, en el que dicho cáncer es la leucemia. cáncer de vejiga

    o cáncer del tracto gastrointestinal.
14. 16. El compuesto para uso de acuerdo con la reivindicación 15, en el que dicho cáncer del tracto gastrointestinal es 40 cáncer de colon o cáncer colorrectal.
15. 17. Uso de un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en quelantes de iones de metales de transición en una aplicación no terapéutica.

    45 18. El uso de acuerdo con la reivindicación 17, en el que dichos iones de metales de transición son: iones de cinc, iones de hierro o iones de cobre.
16. 19. El compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 16, en el que dicho compuesto se formula

    como una formulación liposomal o de micelas de lípidos. 50
17. 20. El compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 16 y 19, en el que dicho compuesto se formula para administración intravenosa.