CN106565713B - 2′-吡唑-1H-咪唑[4,5-f][1,10]菲罗啉衍生物及其制备方法和应用 - Google Patents
2′-吡唑-1H-咪唑[4,5-f][1,10]菲罗啉衍生物及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及2′‑吡唑‑1H‑咪唑[4,5‑f][1,10]菲罗啉衍生物及其制备方法和应用。它以不同取代的苯乙酮和盐酸氨基脲，2,4‑二硝基苯为原料，通过五步反应得到目标化合物2′‑吡唑‑1H‑咪唑[4,5‑f][1,10]菲罗啉衍生物，并将所得的目标化合物用于抗三种肿瘤细胞：非小细胞肺癌细胞株A549、人肝癌细胞株HepG2、人乳腺癌细胞株MCF‑5细胞株生长抑制和凋亡活性的应用研究中。大部分化合物能够使实验肿瘤细胞得到抑制和凋亡，尤其对A549、HepG2细胞株产生了较强的作用，特别是对A549细胞株产生了选择性毒性。这项发明对发现新的抗肿瘤小分子药物，尤其对促进菲罗啉衍生物的临床药物研发提供了重大的参考价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种2′-吡唑-1H-咪唑[4,5-f][1,10]菲罗啉衍生物的制备方法和抗肿瘤药物开发中的应用。
背景技术
癌症是一个备受关注的公共健康问题，导致了无法估量的损失，其中肺癌是最常见的致命的癌症。在男性群体中，肺癌患病病例是占全球新增癌症病例的17％，死亡病例约占全球癌症死亡病例的四分之一，肝癌也是男性群体中恶性肿瘤发病率和死亡率前五位的疾病；对女性群体，恶性肿瘤中乳腺癌发病率排在首位，而死亡率排前三位。肺癌病例中，85％的患者属于非小细胞肺癌，仅15％的患者属于小细胞肺癌，并且大部分癌症患者对临床药物产生了耐药性。在世界各地癌症死亡病例中，肺癌一直以来都是患者主要的死亡因素。虽然近几年全球医学水平逐渐提高，但是在大多数国家肺癌患者幸存率仍低于18％。目前患有晚期非小细胞肺癌的患者主要的治疗手段是化疗和放射性疗法，然而近70％的患者在享受抗癌药物治疗的同时，也承受着与药物毒性相关联的副作用的伤害。肺癌化疗法最大的拦路虎是肺癌细胞遗传性的和获得性的耐药机制的产生。在癌症治疗中出现了许多对大多数临床治疗药物产生了耐药性细胞株，例如：耐顺铂的A549(A549/DDP)细胞株,耐紫杉醇的A549(A549/Taxol)细胞株，表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)药物获得性耐药的出现也限制了其在肺癌临床治疗的应用。因此，新型的低毒高效的抗癌药物的研发迫在眉睫。
目前，肿瘤的治疗方法主要有手术治疗、放射治疗和药物治疗，很大程度上仍是以抗肿瘤药物的化学治疗为主。按照药物分子作用的生物靶标和作用机制不同，抗肿瘤药物主要分为：直接作用于DNA，破坏和干扰其结构和功能的药物；干扰DNA和核酸合成的药物；抗有丝分裂，影响蛋白质合成的药物；作用于肿瘤信号转导机制的药物。直接作用于DNA的药物主要通过直接和DNA作用，从而破坏DNA的结构和功能，使DNA在细胞增殖过程中不能发挥作用。临床上常用的直接作用于DNA的抗肿瘤药物主要有烷化剂和金属铂络合物等。烷化剂属于细胞毒类药物，在抑制和杀死肿瘤细胞的同时，对骨髓细胞、肠上皮细胞、毛发细胞和生殖细胞也产生了严重的抑制作用，产生了严重的副反应，如恶心、呕吐、骨髓抑制脱发等。金属铂络合物(顺铂)广泛应用于膀胱癌、前列腺癌、肺癌、头颈部癌、乳腺癌、恶性淋巴瘤和白血病等，但是这类化合物具有严重的肾毒性。因此，寻找选择性好、副作用小、易获得的治疗肿瘤的药物是目前当务之急。
1,10-菲罗啉既是一种广泛应用的螯合配体，也是一种重要的有机合成中间体，在药学、生命科学等领域发挥了重要作用。以菲罗啉衍生物为配体的络合物具有良好的光学性质，可作为光敏剂和光催化剂；菲罗啉和Fe2+离子的络合物可用于分光光度法测定头孢他啶的含量和测定纸浆中的铁含量；菲罗啉荧光淬灭法还可用于测定食用油中镍含量。而近年来，以菲罗啉为母体结构的分子的生物活性也获得了深入的研究。此类分子具有很好体外生物活性，除具有抗菌活性和除草性能外，更重要的是，菲罗啉衍生物可以与稀有金属离子形成的配合物，用于超分子组装分子骨架、DNA探针等，尤其是该二酮衍生物的金属配合物对于DNA的切割活性，这一结果暗示该类物质有作为抗癌新药的潜力。在抗肿瘤药物的研究方面，已经有一些具有显著作用的菲罗啉类潜在药物活性分子被发现。通过亲核取代、亲电取代、硝化和氧化反应对1,10-菲罗啉母体结构的改造可以得到许多结构新颖的分子。菲罗啉类化合物在结构上具有平面刚性的特点，有作为核酸的切断剂、嵌入剂的能力，可以与DNA形成芳香π电子堆积，相互影响，因而具有抗肿瘤活性活性。另一方面，吡唑环结构在杂环化学应用中占据着重要的地位，其衍生物具有广泛的生物活性，如：抗菌、抗病毒、抗肿瘤活性。因此，我们应用经典的药物设计原理和计算机药物分子辅助设计方法，设计、合成了一系列新型结构的2′-吡唑-1H-咪唑[4,5-f][1,10]菲罗啉衍生物，并考察它们的抗肿瘤活性，其中包括三种肿瘤细胞：非小细胞肺癌细胞株A549、人肝癌细胞株HepG2、人乳腺癌细胞株MCF-5和作为参比的人胚肺成纤维细胞株MRC-5。迄今为止，还没有本发明中的化合物及合成和应用的报导。
本发明证明2′-吡唑-1H-咪唑[4,5-f][1,10]菲罗啉衍生物能够显著地抑制三种肿瘤细胞的生长及促进其凋亡。
发明内容
基于菲罗啉衍生物结构修饰、制备及应用出现的不足和研究潜力，本发明提供了一种2′-吡唑-1H-咪唑[4,5-f][1,10]菲罗啉衍生物及其制备方法和应用。本发明考察它们的抗肿瘤活性，其中包括三种肿瘤细胞：非小细胞肺癌细胞株A549、人肝癌细胞株HepG2、人乳腺癌细胞株MCF-5和作为参比的人胚肺成纤维细胞株MRC-5。结果表明：大部分化合物对三种肿瘤细胞株产生了较强的抑制作用。这项发明对发现新的抗肿瘤小分子药物，尤其促进菲罗啉衍生物的临床药物研发具有重要价值。
所述的2′-吡唑-1H-咪唑[4,5-f][1,10]菲罗啉衍生物，其特征在于其结构式如式(Ⅰ)所示：
其中：R为分别相互独立的氢原子、C1-5烷基、卤素、氨基、羟基、烷氧基、硝基；R1为氢、甲基、苄基、2,4-二硝基苯基、苯基、N,N-二甲氨基丙基。
所述的2′-吡唑-1H-咪唑[4,5-f][1,10]菲罗啉衍生物，其特征在于R为甲基、氟、氯或溴；R1为氢、甲基、苄基、2,4-二硝基苯基或N,N-二甲氨丙基。
所述的2′-吡唑-1H-咪唑[4,5-f][1,10]菲罗啉衍生物的制备方法，其特征在于取代苯乙酮与盐酸氨基脲在乙醇、醋酸钠存在下反应生成中间体2，取代苯乙酮与2,4-二硝基苯在乙醇存在下反应生成中间体3，中间体2和中间体3分别与二取代甲酰胺在三氯氧磷作用下进行Vilsmeiere-Haack反应得到中间体4和中间体5，中间体4与R1X发生亲核取代反应得到中间体6、中间体7、中间体8，中间体4、中间体5、中间体6、中间体7、中间体8分别与1,10-菲罗啉-5,6-二酮反应得到2′-吡唑-1H-咪唑[4,5-f][1,10]菲罗啉衍生物。
所述的2′-吡唑-1H-咪唑[4,5-f][1,10]菲罗啉衍生物的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
1)以式(1)所示的取代苯乙酮与盐酸氨基脲在乙醇、醋酸钠存在下反应生成中间体2a-d，与2,4-二硝基苯在乙醇存在下反应生成中间体3a-d，中间体2a-d、中间体3a-d分别与DMF在三氯氧磷作用下进行Vilsmeiere-Haack反应得到了中间体4a-d、中间体5a-d；
2)中间体4a-d在碘化钾为催化剂，50-80℃条件下和R1X发生亲核取代反应得到中间体6a-d、中间体7a-d、中间体8a-d，R1X中的X为I或Cl；
3)将1,10-菲罗啉一水化合物与浓硫酸、浓硝酸混合液在溴化钾存在下反应生成式(9)所示的1,10-菲罗啉-5,6-二酮；
4)将步骤1)、步骤2)得到的中间体4a-d、中间体6a-d、中间体7a-d、中间体8a-d、中间体5a-d溶于冰醋酸形成溶液，再与步骤3)得到的1,10-菲罗啉-5,6-二酮及醋酸铵溶液混合，加热搅拌至90-100℃进行反应，再用氨水中和反应液，收集固体，水洗、柱层析、再纯化得到目标化合物2′-吡唑-1H-咪唑[4,5-f][1,10]菲罗啉衍生物10a-d、11a-d、12a-d、13a-d、14a-d，
其反应方程式如下：
所述的2′-吡唑-1H-咪唑[4,5-f][1,10]菲罗啉衍生物的制备方法，其特征在于步骤1)中2a-d、3a-d与三氯氧磷、DMF投料摩尔比为1：4-4.5：25.5-26，优选为1：4.3：25.8。
所述的2′-吡唑-1H-咪唑[4,5-f][1,10]菲罗啉衍生物的制备方法，其特征在于步骤2)的中间体4a-d反应前先用氢化钠于DMF中常温反应半小时，中间体4a-d与氢化钠的投料摩尔比为1：2-8-3.2，优选为1：3。
所述的2′-吡唑-1H-咪唑[4,5-f][1,10]菲罗啉衍生物的制备方法，其特征在于步骤4)中柱层析用的流动相为体积比为15:1的二氯甲烷和甲醇混合液，再纯化采用体积比为1:3的乙醇-正己烷混合体系离心进行脱色去杂。
所述的2′-吡唑-1H-咪唑[4,5-f][1,10]菲罗啉衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用。
所述的2′-吡唑-1H-咪唑[4,5-f][1,10]菲罗啉衍生物在肿瘤细胞抑制和凋亡活性的应用。
所述的应用，其特征在于肿瘤细胞为非小细胞肺癌细胞株A549、人肝癌细胞株HepG2、人乳腺癌细胞株MCF-5细胞株。
采用上述技术，本发明的成果如下：
1)本发明在1,10-菲罗啉-5,6-位并入咪唑结构，并在咪唑部分2’-位上引入1,3-二取代吡唑结构，设计合成了20个新型的带有荧光的2′-吡唑-1H-咪唑[4,5-f][1,10]菲罗啉衍生物，其制备方法简单、对设备要求低，且20个化合物收率和纯度高，其纯度高达98％以上，其结构通过核磁和质谱均得以验证；
2)本发明的1,10-菲罗啉-5,6-二酮与1,3-二取代-4-甲酰基吡唑化合物，即中间体4、中间体5、中间体6、中间体7、中间体8与醋酸铵的投料摩尔比限定为1.0：1.3：16.7，该制备方法的反应温度限定为90-100℃，避免温度低于90℃下反应，反应时间延长；高于100℃反应，反应副产物增多，且反应物易碳化，反应产率降低；
3)本发明针对该类化合物粘性较大、极性大的问题，在后处理过程中，采用柱层析与再纯化相结合的方式，将柱层析分离时包裹在产物内的部分杂质采用乙醇-正己烷混合体系(乙醇/正己烷＝1/3)离心，脱色去杂，提高了产品的纯度；
4)本发明通过应用20个新型化合物在细胞水平上对三种肿瘤细胞：非小细胞肺癌细胞株A549、人肝癌细胞株HepG2、人乳腺癌细胞株MCF-5细胞株进行了毒理活性的考察，结果表明：大部分化合物对A549、HepG2、MCF-5细胞生长产生了较好的抑制活性，其中化合物12a-d表现明显的细胞毒性。本发明测试了衡量药物诱导细胞凋亡能力的IC50值：药物诱导肿瘤细胞凋亡50％的浓度，也叫半数抑制浓度，即凋亡细胞与全部细胞数之比等于50％时所对应的浓度。
附图说明
图1为通过CCK-8方法测定人非小细胞肺癌细胞株A549在10μM化合物10a-14d存在下的细胞毒性结果，图中DMSO表示1％DMSO的细胞培养液，作为参比；Cisplatin表示10μM顺铂，作为阳性对照；
图2为通过CCK-8方法测定人非小细胞肺癌细胞株A549分别在1.25、2.5、5、10、20μM化合物12a-d存在下的细胞毒性结果，0表示1％DMSO的细胞培养液，作为参比；Cisplatin表示顺铂，作为阳性对照；
图3为通过CCK-8方法测定正常人胚肺成纤维细胞株MRC-5分别在1.25、2.5、5、10、20μM化合物12a-d存在下的细胞毒性结果，0表示1％DMSO的细胞培养液，作为参比；Cisplatin表示顺铂，作为阳性对照；
图4为通过CCK-8方法测定人肝癌细胞株HepG2在10μM化合物10a-14d存在下的细胞毒性结果，DMSO表示1％DMSO的细胞培养液，作为参比；Cisplatin表示10μM顺铂，作为阳性对照；
图5为通过CCK-8方法测定人肝癌细胞株HepG2分别在1.25、2.5、5、10、20μM化合物12a-d存在下的细胞毒性结果，0表示1％DMSO的细胞培养液，作为参比；Cisplatin表示顺铂，作为阳性对照；
图6为通过CCK-8方法测定人乳腺癌细胞株MCF-7在10μM化合物10a-14d存在下的细胞毒性结果。DMSO表示1％DMSO的细胞培养液，作为参比；Cisplatin表示10μM顺铂，作为阳性对照；
图7为通过CCK-8方法测定人乳腺癌细胞株MCF-7分别在1.25、2.5、5、10、20μM化合物12a-d存在下的细胞毒性结果，0表示1％DMSO的细胞培养液，作为参比；Cisplatin表示顺铂，作为阳性对照。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步的描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
本发明的2′-吡唑-1H-咪唑[4,5-f][1,10]菲罗啉衍生物，其特征在于其结构式如式(Ⅰ)所示：
其中，R分别相互独立的为氢原子、低级烷基(C1-5)、卤素、氨基、羟基、烷氧基、硝基，优选为甲基、氟、氯或溴；R1为氢、甲基、苄基、2,4-二硝基苯基、苯基、N,N-二甲氨基丙基，优选为氢、甲基、苄基、2,4-二硝基苯基或N,N-二甲氨丙基。
本发明实施例中的原料购买于阿拉丁试剂公司。
实施例1.2-(1-苄基-3-(4-溴苯基)-1H-吡唑-4-基)-1H-咪唑[4,5-f][1,10]菲罗琳(12c)的制备
(1)12c化学结构式：
(2)化学反应步骤：
第一步反应：将对溴苯乙酮(1.99g，10.0mmol)溶于25mL无水乙醇中，加入盐酸氨基脲(1.23g，11.0mmol)和无水醋酸钠(0.90g，11.0mmol)，于75℃反应6小时，浓缩，冷却，析出白色固体，过滤，用乙醇/水(4：1)重结晶，过滤，用少量水洗涤，干燥，得到2.30～2.36g白色固体2c，产率89.8～92.0％。
第二步反应：15.5mL DMF于冰浴条件下搅拌十分钟，缓慢向其中滴加3.1mL三氯氧磷，使温度处于5℃以下，搅拌十五分钟，分次加入化合物2c(2.0g，7.8mmol)，然后缓慢升温到65℃，TLC检测，直到反应完全。将混合物倒入碎冰中，搅拌，用5～10％氢氧化钠溶液调PH至6-7，直到白色固体析出为止，静置3小时，过滤干燥，二氯甲烷和甲醇混合液(60：1)为流动相，柱层析得到1.65～1.68g白色固体，3-(4-溴苯基)-1H-吡唑-4-甲醛(4c)[13-16]，产率84.3～86.0％；m.p.122-123℃.1H NMR(DMSO-d6,500MHz,ppm):δ 13.781(s,1H,NH),9.904(s,1H,CHO–H),8.610(br.s,1H,CH),7.831(br.s,2H,Ph-H),7.698(br.s,2H,Ph-H).
第三步反应：于圆底烧瓶中依次加入4c(0.25g，1.0mmol)、碳酸钾(0.15g，1.1mmol)、氯苄(0.14g，1.1mmol)和催化量的碘化钾，再加入10mL DMF作溶剂，50～80℃条件下搅拌6～8小时，直到反应结束。反应混合液倒入50mL水中搅拌5分钟，用乙酸乙酯萃取(3×40mL)，无水硫酸钠干燥过夜，过滤，浓缩，柱层析分离(二氯甲烷和正己烷15:1作为流动相)，得到0.29～0.30g无色的液体，1-苄基-3-(4-溴苯基)吡唑-4-甲醛(7c)，产率85.3～89.0％。1H NMR(DMSO-d6,500MHz,ppm):δ 9.890(s,1H,CHO–H),8.721(s,1H,CH),7.834-7.807(m,2H,Ph-H),7.665-7.637(m,2H,Ph-H),7.408-7.371(m,4H,Ph-H),7.352-7.321(m,1H,Ph-H),5.468(s,2H,CH2).
第四步反应：于三颈烧瓶中加入1,10-菲罗啉一水化合物(1.0g，5.0mmol)和溴化钾(1.0g，8.4mmol)，反应装置置于冰浴条件下，缓慢搅拌下滴加10mL浓硫酸和10mL浓硝酸混合液，反应温度保持在5℃下，缓慢升温至100℃，反应6小时，混合液倒入碎冰中，用5～10％氢氧化钠溶液调PH到8，用二氯甲烷萃取(3×40mL)，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，无水乙醇重结晶，得到0.85～0.89g黄色固体，1,10-菲罗啉-5,6-二酮(9)，产率80.9～85.0％；m.p.259-261℃.1H NMR(DMSO-d6,500MHz,ppm):δ8.992-8.979(dd,J1＝4.5Hz,J2＝2.0Hz,2H,CH2),8.399-8.380(dd,J1＝8.0Hz,J2＝2.0Hz,2H,CH2),7.684-7.659(dd,J1＝8.0Hz,J2＝4.5Hz,2H,CH2).
第五步反应：于50mL圆底烧瓶中依次加入9(0.1g，0.47mmol)、无水醋酸铵(0.4g，5.18mmol)、7c(0.18g，0.53mmol)和20mL冰醋酸，氮气保护下，缓慢升温至90℃，反应6小时，直至反应结束。反应混合液浓缩，加入少量浓氨水调PH至中性，过滤，干燥，柱层析(二氯甲烷和甲醇混合液15:1作为流动相)获得粗品；然后，通过采用乙醇-正己烷混合溶剂(乙醇/正己烷＝1/3)离心，脱色去杂质的方法进一步纯化得到0.21～0.22g白色固体，2-(1-苄基-3-(4-溴苯基)-1H-吡唑-4-基)-1H-咪唑[4,5-f][1,10]菲罗啉(12c)，产率84.3～87.0％；m.p.208-209℃；纯度:97.6％(HPLC).1H NMR(DMSO-d6,500MHz,ppm):δ13.565(s,1H,NH),9.032-9.020(dd,J1＝4.5Hz,J2＝2.0Hz,2H,Phenanthroline-H),8.820(br.s,1H,Phenanthroline-H),8.768(br.s,1H,Phenanthroline-H),8.525(s,1H,CH),7.952-7.925(m,2H,Ph-H),7.829-7.805(dd,J1＝8.0Hz,J2＝4.0Hz,2H,Phenanthroline-H),7.621-7.594(m,2H,Ph-H),7.440-7.413(m,4H,Ph-H),7.382-7.355(m,1H,Ph-H),5.543(s,2H,CH2).MS(ESI)calcd for C29H19BrN6:530.09,found:531.1(M+1).
实施例2.2-(3-(4-氟苯基)-1H-吡唑-4-基)-1H-咪唑[4,5-f][1,10]菲罗琳(10a)的制备
(1)10a化学结构式：
(2)化学反应步骤：
试验方法及步骤同实施例1(省去第三步反应)。经纯化后得到黄色固体纯品(10a)，收率78.8-80.9％；m.p.272-274℃，纯度:96.6％(HPLC)。1H NMR(DMSO-d6,500MHz,ppm):δ13.534(br.s,2H,NH),9.041-9.029(dd,J1＝4.5Hz,J2＝2.0Hz,2H,Phenanthroline-H),8.837-8.822(d,J1＝7.5Hz,2H,Phenanthroline-H),8.380(br.s,1H,CH),8.096-8.068(dd,J1＝8.0Hz,J2＝6.0Hz,2H,Ph-H),7.853-7.828(dd,J1＝8.0Hz,J2＝4.5Hz,2H,Phenanthroline-H),7.312(br.s,2H,Ph-H).MS(ESI)calcd for C22H13FN6:380.12,found:381.1(M+H+).
实施例3.2-(3-(4-氯苯基)-1H-吡唑-4-基)-1H-咪唑[4,5-f][1,10]菲罗琳(10b)的制备
(1)10b化学结构式：
(2)化学反应步骤：
试验方法及步骤同实施例1(省去第三步反应)。经纯化后得到黄色固体纯品(10b)，收率81.2-83.5％；m.p.285-287℃，纯度:95.8％(HPLC)。1H NMR(DMSO-d6,500MHz,ppm):δ13.551-13.531(d,J1＝10Hz,2H,NH),9.039-9.027(dd,J1＝4.0Hz,J2＝1.5Hz,2H,Phenanthroline-H),8.824(br.s,2H,Phenanthroline-H),8.486(br.s,1H,CH),8.067(br.s,2H,Ph-H),7.830(br.s,2H,Phenanthroline-H),7.622(br.s,1H,Ph-H),7.493-7.481(d,J1＝6.0Hz,1H,Ph-H).MS(ESI)calcd for C22H13ClN6:396.09,found:397.1(M+H+).
实施例4.2-(3-(4-溴苯基)-1H-吡唑-4-基)-1H-咪唑[4,5-f][1,10]菲罗琳(10c)的制备
(1)10c化学结构式：
(2)化学反应步骤：
试验方法及步骤同实施例1(省去第三步反应)。经纯化后得到黄色固体纯品(10c)，收率84.6-85.1％；m.p.279-281℃，纯度:95.2％(HPLC)。1H NMR(DMSO-d6,500MHz,ppm):δ13.722(br.s,1H,NH),13.614(br.s,1H,NH),9.052-9.041(dd,J1＝4.0Hz,J2＝1.5Hz,2H,Phenanthroline-H),8.848(br.s,2H,Phenanthroline-H),8.533(br.s,1H,CH),8.045-8.030(d,J1＝7.5Hz,2H,Ph-H),7.851-7.826(dd,J1＝8.0Hz,J2＝4.5Hz,2H,Phenanthroline-H),7.750(br.s,1H,Ph-H),7.646(br.s,1H,Ph-H).MS(ESI)calcd forC22H13BrN6:440.04,found:440.1(M+H+).
实施例5.2-(3-(p-甲苯基)-1H-吡唑-4-基)-1H-咪唑[4,5-f][1,10]菲罗琳(10d)的制备
(1)10d化学结构式：
(2)化学反应步骤：
试验方法及步骤同实施例1(省去第三步反应)。经纯化后得到黄色固体纯品(10d)，收率78.3-79.9％；m.p.264-266℃，纯度:96.1％(HPLC)。1H NMR(DMSO-d6,500MHz,ppm):δ 13.549(br.s,2H,NH),9.036(br.s,2H,Phenanthroline-H),8.846-8.832(d,J1＝6.0Hz,2H,Phenanthroline-H),8.237(br.s,1H,CH),7.887(br.s,2H,Ph-H),7.835-7.820(m,2H,Phenanthroline-H),7.268(br.s,2H,Ph-H),2.345(s,3H,CH3).MS(ESI)calcd forC23H16N6:376.14,found:377.1(M+H+).
实施例6.2-(1-甲基-3-(4-氟苯基)-1H-吡唑-4-基)-1H-咪唑[4,5-f][1,10]菲罗琳(11a)的制备
(1)11a化学结构式：
(2)化学反应步骤：
试验方法及步骤同实施例1，使用的卤代烷原料是碘甲烷。经纯化后得到白色晶体(11a)，收率85.3-87.3％；m.p.＞310℃，纯度:97.2％(HPLC)。1H NMR(DMSO-d6,500MHz,ppm):δ 13.514(br.s,1H,NH),9.034-9.022(dd,J1＝4.5Hz,J2＝2.0Hz,2H,Phenanthroline-H),8.825-8.809(d,J1＝8.0Hz,1H,Phenanthroline-H),8.779-8.763(d,J1＝8.0Hz,1H,Phenanthroline-H),8.394(s,1H,CH),8.037-7.996(m,2H,Ph-H),7.843-7.798(m,2H,Phenanthroline-H),7.268-7.220(m,2H,Ph-H),4.039(s,3H,CH3).MS(ESI)calcd for C23H15FN6:394.13found:395.2(M+H+).
实施例7.2-(1-甲基-3-(4-氯苯基)-1H-吡唑-4-基)-1H-咪唑[4,5-f][1,10]菲罗琳(11b)的制备
(1)11b化学结构式：
(2)化学反应步骤：
试验方法及步骤同实施例1，使用的卤代烷原料是碘甲烷。经纯化后得到白色晶体(11b)，收率84.7-86.3％；m.p.＞310℃，纯度:98.6％(HPLC)。1H NMR(DMSO-d6,500MHz,ppm):δ 13.526(br.s,1H,NH),9.037-9.025(dd,J1＝4.5Hz,J2＝2.0Hz,2H,Phenanthroline-H),8.835-8.821(d,J1＝7.0Hz,1H,Phenanthroline-H),8.781-8.766(d,J1＝7.5Hz,1H,Phenanthroline-H),8.409(s,1H,CH),8.032-8.004(m,2H,Ph-H),7.847-7.799(m,2H,Phenanthroline-H),7.490-7.463(m,2H,Ph-H),4.046(s,3H,CH3).MS(ESI)calcd for C23H15ClN6:410.10,found:411.1(M+H+).
实施例8.2-(1-甲基-3-(4-溴苯基)-1H-吡唑-4-基)-1H-咪唑[4,5-f][1,10]菲罗琳(11c)的制备
(1)11c化学结构式：
(2)化学反应步骤：
试验方法及步骤同实施例1，使用的卤代烷原料是碘甲烷。经纯化后得到白色晶体(11c)，收率86.4-87.9％；m.p.＞310℃，纯度:96.5％(HPLC)。1H NMR(DMSO-d6,500MHz,ppm):δ 9.014-9.010(d,J2＝2.0Hz,2H,Phenanthroline-H),8.838-8.823(d,J1＝7.5Hz,2H,Phenanthroline-H),8.498(s,1H,CH),8.022-8.006(d,J1＝8.0Hz,2H,Ph-H),7.824-7.801(m,2H,Phenanthroline-H),7.623-7.607(d,J1＝8.0Hz,2H,Ph-H),4.024(s,3H,CH3).MS(ESI)calcd for C23H15BrN6:454.05,found:455.1(M+H+).
实施例9.2-(1-甲基-3-(p-甲苯基)-1H-吡唑-4-基)-1H-咪唑[4,5-f][1,10]菲罗琳(11d)的制备
(1)11d化学结构式：
(2)化学反应步骤：
试验方法及步骤同实施例1，使用的卤代烷原料是碘甲烷。经纯化后得到白色晶体(11d)，收率81.1-83.5％；m.p.＞310℃，纯度:96.4％(HPLC)。1H NMR(DMSO-d6,500MHz,ppm):δ13.525(s,1H,NH),9.034-9.022(dd,J1＝4.5Hz,J2＝2.0Hz,2H,Phenanthroline-H),8.805-8.802(m,2H,Phenanthroline-H),8.360(s,1H,CH),7.823-7.790(m,4H,Ar-H),7.195-7.179(d,J1＝8.0Hz,2H,Ph-H),4.024(s,3H,CH3),2.309(s,3H,CH3).MS(ESI)calcdfor C24H18N6:390.16,found:391.2(M+H+).
实施例10.2-(1-苄基-3-(4-氟苯基)-1H-吡唑-4-基)-1H-咪唑[4,5-f][1,10]菲罗琳(12a)的制备
(1)12a化学结构式：
(2)化学反应步骤：
试验方法及步骤同实施例1。经纯化后得到白色晶体(12a)，收率79.6-82.1％；m.p.208-210℃，纯度:96.1％(HPLC)。1H NMR(DMSO-d6,500MHz,ppm):δ13.543(s,1H,NH),9.029-9.017(dd,J1＝4.0Hz,J2＝1.5Hz,2H,Phenanthroline-H),8.823-8.807(d,J2＝8.0Hz,1H,Phenanthroline-H),8.764-8.749(d,J2＝7.5Hz,1H,Phenanthroline-H),8.508(s,1H,CH),8.029-7.987(m,2H,Ph-H),7.817-7.804(m,2H,Phenanthroline-H),7.450-7.413(m,4H,Ph-H),7.390-7.346(m,1H,Ph-H),7.264-7.216(m,2H,Ph-H),5.539(s,2H,CH2).MS(ESI)calcd for C29H19FN6:470.17,found:471.2(M+H+).
实施例11.2-(1-苄基-3-(4-氯苯基)-1H-吡唑-4-基)-1H-咪唑[4,5-f][1,10]菲罗琳(12b)的制备
(1)12b化学结构式：
(2)化学反应步骤：
试验方法及步骤同实施例1。经纯化后得到白色晶体(12b)，收率83.7-85.2％；m.p.214-216℃，纯度:97.8％(HPLC)。1H NMR(DMSO-d6,500MHz,ppm):δ13.543(s,1H,NH),9.032-9.020(dd,J1＝4.0Hz,J2＝1.5Hz,2H,Phenanthroline-H),8.828-8.810(dd,J2＝8.0Hz,J＝1.0Hz,1H,Phenanthroline-H),8.763-8.745(dd,J1＝8.0Hz,J2＝1.0Hz,1H,Phenanthroline-H),8.521(s,1H,CH),8.012-7.985(m,2H,Ph-H),7.837-7.794(m,2H,Phenanthroline-H),7.486-7.458(m,2H,Ph-H),7.449-7.412(m,4H,Ph-H),7.390-7.346(m,1H,Ph-H),5.543(s,2H,CH2).MS(ESI)calcd for C29H19ClN6:486.14,found:487.1(M+H+).
实施例12.2-(1-苄基-3-(p-甲苯基)-1H-吡唑-4-基)-1H-咪唑[4,5-f][1,10]菲罗琳(12d)的制备
(1)12d化学结构式：
(2)化学反应步骤：
试验方法及步骤同实施例1。经纯化后得到白色晶体(12d)，收率77.3-80.2％；m.p.206-208℃，纯度:96.3％(HPLC)。1H NMR(DMSO-d6,500MHz,ppm):δ13.545(s,1H,NH),9.026-9.018(m,2H,Phenanthroline-H),8.830-8.814(d,J1＝8.0Hz,1H,Phenanthroline-H),8.766-8.750(d,J1＝8.0Hz,1H,Phenanthroline-H),8.468(s,1H,CH),7.810-7.772(m,4H,Ar-H),7.438-7.410(m,4H,Ph-H),7.376-7.342(m,1H,Ph-H),7.185-7.169(d,J1＝8.0Hz,2H,Ph-H),5.522(s,2H,CH2),2.300(s,3H,CH3).MS(ESI)calcd for C30H22N6:466.19,found:467.2(M+H+).
实施例13.2-(1-(3-二甲氨丙基)-3-(4-氟苯基)-1H-吡唑-4-基)-1H-咪唑[4,5-f][1,10]菲罗琳(13a)的制备
(1)13a化学结构式：
(2)化学反应步骤：
试验方法及步骤同实施例1，使用的卤代烷原料是3-二甲氨基氯丙烷。经纯化后得到白色晶体(13a)，收率65.3-68.2％；m.p.284-286℃，纯度:95.3％(HPLC)。1H NMR(DMSO-d6,500MHz,ppm):δ13.527(s,1H,NH),9.034-9.022(dd,J1＝4.0Hz,J2＝2.0Hz,2H,Phenanthroline-H),8.802(br.s,2H,Phenanthroline-H),8.438(s,1H,CH),8.036-8.001(m,2H,Ph-H),7.830-7.808(m,2H,Phenanthroline-H),7.269-7.222(m,2H,Ph-H),4.320-4.292(t,J1＝7.0Hz,2H,CH2),2.325-2.298(t,J1＝6.75Hz,2H,CH2),2.187(s,6H,CH3),2.085-2.030(m,2H,CH2).MS(ESI)calcd for C27H24FN7:465.21,found:466.2(M+H+).
实施例14.2-(1-(3-二甲氨丙基)-3-(4-氯苯基)-1H-吡唑-4-基)-1H-咪唑[4,5-f][1,10]菲罗琳(13b)的制备
(1)13b化学结构式：
(2)化学反应步骤：
试验方法及步骤同实施例1，使用的卤代烷原料是3-二甲氨基氯丙烷。经纯化后得到白色晶体(13b)，收率68.9-71.4％；m.p.264-265℃，纯度:96.9％(HPLC)。1H NMR(DMSO-d6,500MHz,ppm):δ13.550(s,1H,NH),9.036-9.024(dd,J1＝4.5Hz,J2＝2.0Hz,2H,Phenanthroline-H),8.807(br.s,2H,Phenanthroline-H),8.458(s,1H,CH),8.033-8.006(m,2H,Ph-H),7.825(br.s,2H,Phenanthroline-H),7.493-7.466(m,2H,Ph-H),4.327-4.299(t,J1＝7.0Hz,2H,CH2),2.334-2.307(t,J1＝6.75Hz,2H,CH2),2.193(s,6H,CH3),2.089-2.033(m,2H,CH2).MS(ESI)calcdfor C27H24ClN7:481.18,found:482.2(M+H+).
实施例15.2-(1-(3-二甲氨丙基)-3-(4-溴苯基)-1H-吡唑-4-基)-1H-咪唑[4,5-f][1,10]菲罗琳(13c)的制备
(1)13c化学结构式：
(2)化学反应步骤：
试验方法及步骤同实施例1，使用的卤代烷原料是3-二甲氨基氯丙烷。经纯化后得到白色晶体(13c)，收率69.1-71.1％；m.p.237-238℃，纯度:96.8％(HPLC)。1H NMR(DMSO-d6,500MHz,ppm):δ 13.546(s,1H,NH),9.034-9.028(dd,J1＝3.0Hz,J2＝2.0Hz,2H,Phenanthroline-H),8.833-8.818(d,J1＝4.5Hz,1H,Phenanthroline-H),8.795-8.780(d,J1＝4.5Hz,1H,Phenanthroline-H),8.459(s,1H,CH),7.966-7.949(d,J1＝8.5Hz,2H,Ph-H),7.824(br.s,2H,Phenanthroline-H),7.624-7.607(d,J1＝8.5Hz,2H,Ph-H),4.329-4.301(t,J1＝7.0Hz,2H,CH2),2.365-2.341(t,J1＝6.0Hz,2H,CH2),2.217(s,6H,CH3),2.098-2.043(m,2H,CH2).MS(ESI)calcd for C27H24BrN7:525.13,found:526.1(M+H+).
实施例16.2-(1-(3-二甲氨丙基)-3-(p-甲苯基)-1H-吡唑-4-基)-1H-咪唑[4,5-f][1,10]菲罗琳(13d)的制备
(1)13d化学结构式：
(2)化学反应步骤：
试验方法及步骤同实施例1，使用的卤代烷原料是3-二甲氨基氯丙烷。经纯化后得到白色晶体(13d)，收率62.3-65.0％；m.p.232-234℃，纯度:95.9％(HPLC)。1H NMR(DMSO-d6,500MHz,ppm):δ13.504(s,1H,NH),9.034-9.022(dd,J1＝4.5Hz,J2＝2.0Hz,2H,Phenanthroline-H),8.819-8.784(m,2H,Phenanthroline-H),8.380(s,1H,CH),7.830-7.804(m,2H,Phenanthroline-H),7.799-7.783(d,J1＝8.0Hz,2H,Ph-H),7.193-7.177(d,J1＝8.0Hz,2H,Ph-H),4.306-4.278(t,J1＝7.0Hz,2H,CH2),2.323-2.296(t,J1＝6.75Hz,5H,CH2,CH3),2.184(s,6H,CH3),2.078-2.022(m,2H,CH2).MS(ESI)calcd for C28H27N7:461.23,found:462.2(M+H+).
实施例17.2-(1-(2，4-二硝基苯基)-3-(4-氟苯基)-1H-吡唑-4-基)-1H-咪唑[4,5-f][1,10]菲罗琳(14a)的制备
(1)14a化学结构式：
(2)化学反应步骤：
试验方法及步骤类似的于实施例1，(省去第三步；第一、二步按制备5a-d路线所使用的原料)。中间体5a为已知物，按前述设计的该类分子具体合成路线被合成。目标分子经纯化后得到黄色固体(14a)，收率86.8-88.0％；m.p.＞310℃，纯度:98.6％(HPLC)。1H NMR(DMSO-d6,500MHz,ppm):δ13.917(s,1H,NH),9.243(s,1H,Ph-H),9.072-9.060(dd,J1＝4.0Hz,J2＝1.5Hz,2H,Phenanthroline-H),8.992-8.987(d,J1＝2.5Hz,1H,Ph-H),8.862(br.s,1H,Phenanthroline-H),8.827(br.s,1H,Phenanthroline-H),8.759-8.736(dd,J1＝9.0Hz,J2＝2.5Hz,1H,Ph-H),8.332-8.314(d,J1＝9.0Hz,1H,CH),7.942-9.901(m,2H,Ph-H),7.893-7.868(m,2H,Phenanthroline-H),7.340-7.292(m,2H,Ph-H).MS(ESI)calcdforC28H15FN8O4:546.12,found:547.1(M+H+).
实施例18.2-(1-(2，4-二硝基苯基)-3-(4-氯苯基)-1H-吡唑-4-基)-1H-咪唑[4,5-f][1,10]菲罗琳(14b)的制备
(1)14b化学结构式：
(2)化学反应步骤：
试验方法及步骤类似的于实施例(省去第三步；第一、二步按制备5a-d路线所使用的原料)。中间体5b为已知物，按前述设计的该类分子具体合成路线被合成。目标分子经纯化后得到黄色固体(14b)，收率88.6-88.9％；m.p.＞310℃，纯度:97.4％(HPLC)。1H NMR(DMSO-d6,500MHz,ppm):δ13.867(s,1H,NH),9.238(s,1H,Ph-H),9.058-9.050(d,J1＝4.0Hz,2H,Phenanthroline-H),8.994-8.989(d,J1＝2.5Hz,1H,Ph-H),8.868-8.853(d,J1＝7.5Hz,1H,Ph-H),8.767-8.738(m,2H,Phenanthroline-H),8.332-8.314(d,J1＝9.0Hz,1H,CH),7.899-9.882(d,J1＝8.5Hz,2H,Ph-H),7.864-7.824(m,2H,Phenanthroline-H),7.551-7.534(d,J1＝8.5Hz,2H,Ph-H).MS(ESI)calcd for C28H15ClN8O4:562.09,found:563.3(M+H+).
实施例19.2-(1-(2，4-二硝基苯基)-3-(4-溴苯基)-1H-吡唑-4-基)-1H-咪唑[4,5-f][1,10]菲罗琳(14c)的制备
(1)14c化学结构式：
(2)化学反应步骤：
试验方法及步骤类似的于实施例(省去第三步；第一、二步按制备5a-d路线所使用的原料)。中间体5c为已知物，按前述设计的该类分子具体合成路线被合成。目标分子经纯化后得到黄色固体(14c)，收率89.1-92.3％；m.p.＞310℃，纯度:97.8％(HPLC)。1H NMR(DMSO-d6,500MHz,ppm):δ13.866(s,1H,NH),9.232(s,1H,Ph-H),9.055-9.044(dd,J1＝4.0Hz,J2＝1.5Hz,2H,Phenanthroline-H),8.989-8.984(d,J1＝2.5Hz,1H,Ph-H),8.867-8.852(d,J1＝7.5Hz,1H,Ph-H),8.763-8.731(m,2H,Phenanthroline-H),8.330-8.312(d,J1＝9.0Hz,1H,CH),7.846-7.816(m,4H,Ar-H),7.861-7.664(m,2H,Ph-H).MS(ESI)calcd forC28H15BrN8O4:606.04,found:607.3(M+H+).
实施例20.2-(1-(2，4-二硝基苯基)-3-(p-甲苯基)-1H-吡唑-4-基)-1H-咪唑[4,5-f][1,10]菲罗琳(14d)的制备
(1)14d化学结构式：
(2)化学反应步骤：
试验方法及步骤类似的于实施例(省去第三步；第一、二步按制备5a-d路线所使用的原料)。中间体5d为已知物，按前述设计的该类分子具体合成路线被合成。目标分子经纯化后得到黄色固体(14d)，收率82.3-85.7％；m.p.＞310℃，纯度:97.0％(HPLC)。1H NMR(DMSO-d6,500MHz,ppm):δ13.860(s,1H,NH),9.210(s,1H,Ph-H),9.061-9.049(dd,J1＝4.5Hz,J2＝2.0Hz,2H,Phenanthroline-H),8.981-8.975(d,J1＝3.0Hz,1H,Ph-H),8.870-8.856(d,J1＝7.0Hz,1H,Ph-H),8.775-8.759(d,J1＝7.0Hz,1H,Phenanthroline-H),8.741-8.718(dd,J1＝9.0Hz,J2＝2.5Hz,1H,Phenanthroline-H),8.322-8.304(d,J1＝9.0Hz,1H,CH),7.860-7.827(m,2H,Phenanthroline-H),7.701-7.684(d,J1＝8.5Hz,2H,Ph-H),7.242-7.226(d,J1＝8.0Hz,2H,Ph-H),2.314(s,3H,CH3).MS(ESI)calcd for C29H18N8O4:542.15,found:543.2(M+H+).
实施例21.化合物诱导非小细胞肺癌细胞A549凋亡实验
(1)实验材料
所使用的主要试剂及仪器和设备如表21-1、表21-2所示：
表21-1主要试剂
| 序号 | 试剂名称 | 生产厂家 |
| 1 | RPMI 1640培养基 | Invitrogen Gibco |
| 2 | PBS(磷酸盐缓冲溶液) | Invitrogen Gibco |
| 3 | FBS(小牛血清) | Invitrogen Gibco |
| 4 | PS(青霉素-链霉素双抗) | Invitrogen Gibco |
| 5 | Hepes缓冲液 | Invitrogen Gibco |
| 6 | 0.25％Trypsin-EDTA(胰酶) | Invitrogen Gibco |
| 7 | DMSO(二甲基亚砜) | 上海生工生物工程技术有限公司 |
| 8 | L-Glutamine(L-谷氨酰胺) | Invitrogen Gibco |
表21-2主要仪器与设备
(2)实验方法
(i)肿瘤细胞的培养
肿瘤细胞的复苏：将A549细胞从-80℃冰箱取出后迅速转移至异丙醇冻存盒中，并迅速置于预热至37℃水浴中。将冻存细胞液转移至15mL离心管中，加PBS至10mL，4℃，200g离心5min。弃去PBS，加完全培养基制成10mL细胞悬液，转移至培养瓶中培养24h。
肿瘤细胞的传代：从培养箱中取出细胞培养瓶，移入超净台。弃去培养瓶中的残余培养基，加2mL PBS洗涤后，加入600-700μL胰酶消化，显微镜下观察细胞状态，消化完全后，弃掉胰酶消化液，加入2mL PBS吹打均匀，并将细胞悬液移至15mL离心管中，补加PBS至10mL，4℃，200g离心5min。弃去PBS，加完全培养基制成10mL细胞悬液，转移至培养瓶中培养24h。
肿瘤细胞冻存：预先按照FBS:DMSO＝9:1的比例配制好细胞冻存液，置于4℃冰箱备用。从培养箱中取出细胞培养瓶，弃去培养瓶中的残余培养基，加2mL PBS洗涤后，加入600-700μL胰酶消化，显微镜下观察细胞状态，消化完全后，弃掉胰酶消化液，加入2mL PBS吹打均匀，并将细胞悬液移至15mL离心管中，补加PBS至10mL，4℃，200g离心5min。弃去PBS，加1mL细胞冻存液吹打混匀并转移到细胞冻存管中，标记后放到异丙醇盒子中置于-80℃冰箱过夜后转移至细胞冻存盒。
(ii)CCK-8实验
细胞计数：将培养瓶中的贴壁细胞消化、离心后，用4mL培养基重选，取100μL细胞悬液至细胞计数板，计数后，将细胞稀释到4×104个/mL。
铺板：取96孔板，每孔加入95μL稀释好的细胞悬液，周围补加100μL PBS,CO2培养相中培养。加药：6h后，每孔加入5μL不同浓度的化合物溶液，使化合物终浓度为1.25μM,2.5μM，5μM，10μM，20μM，DMSO终含量为1％。
检测：36h后，每孔中加入10μL CCK-8试剂，0.5h后用酶标仪检测450nm下的吸光度值。
首先，本发明通过CCK-8方法测定了人非小细胞肺癌细胞株A549在10μM化合物10a-14d存在下的细胞毒性实验。以1％DMSO的细胞培养液作为参比；顺铂(Cisplatin)为阳性对照。实验结果如图1所示。图1结果表明：在10μM化合物存在下，化合物12a-d对A549细胞在实验用的所有化合物，包括阳性参比药顺铂，中的作用最强，杀死率最高。
然后，为了详细考察化合物12a-d对A549细胞的作用规律，获得IC50值(药物诱导肿瘤细胞凋亡50％的浓度)，本发明又通过CCK-8方法测定人非小细胞肺癌细胞株A549分别在1.25、2.5、5、10、20μM化合物12a-d存在下的细胞生长抑制和凋亡程度。同样以1％DMSO的细胞培养液作为参比，顺铂为阳性对照。实验结果如图2所示。图2结果表明：在1.25、2.5、5、10、20μM浓度的化合物12a-d存在下，化合物对A549细胞具有较强的生长抑制和凋亡能力，IC50值在1.48-2.75μM之间，其中化合物12c最强，IC50值为1.48μM，化合物12a-d的细胞作用能力次序为：12c＞12a＞12b＞12d(如表1所示)。
实施例22.化合物对正常人胚肺成纤维细胞株MRC-5作用的实验
为了考察化合物对肿瘤细胞的选择性作用能力，本发明选用正常人胚肺成纤维细胞株MRC-5做参比，考察药物对正常细胞的作用强度。实验材料和方法如实施例21。同样，本发明通过CCK-8方法测定分别在1.25、2.5、5、10、20μM化合物12a-d存在下的细胞毒性结果。以1％DMSO的细胞培养液作为参比，顺铂为阳性对照。实验结果如图3所示。图3结果表明：在1.25、2.5、5、10、20μM浓度的化合物12a-d存在下，化合物对MRC-5细胞具有一定的生长抑制和凋亡能力，IC50值在3.80-4.92μM之间，是肺癌细胞A549IC50值的1.8-2.6倍(如表1)，化合物具有一定的选择性。
实施例23.化合物诱导人肝癌细胞株HepG2凋亡实验
实验材料和方法如实施例21。首先，首先，本发明通过CCK-8方法测定了人肝癌细胞株HepG2在10μM化合物10a-14d存在下的细胞毒性实验。以1％DMSO的细胞培养液作为参比；顺铂(Cisplatin)为阳性对照。实验结果如图4所示。结果表明：在10μM化合物存在下，化合物12a-d对HepG2细胞在实验用的所有化合物，包括阳性参比药顺铂，中的作用最强，杀死率最高。
然后，为了详细考察化合物12a-d对HepG2细胞的作用规律，获得IC50值(药物诱导肿瘤细胞凋亡50％的浓度)，本发明又通过CCK-8方法测定人肝癌细胞株HepG2分别在1.25、2.5、5、10、20μM化合物12a-d存在下的细胞生长抑制和凋亡程度。同样以1％DMSO的细胞培养液作为参比，顺铂为阳性对照。实验结果如图5所示。结果表明：在1.25、2.5、5、10、20μM浓度的化合物12a-d存在下，化合物对HepG2细胞具有较强的生长抑制和凋亡能力，IC50值在1.49-3.56μM之间，其中化合物12c最强，IC50值为1.49μM,化合物12a-d的细胞作用能力次序为：12c＞12a＞12b＞12d(结果如表1所示)。
实施例24.化合物诱导人乳腺癌细胞株MCF-7凋亡实验
实验材料和方法如实施例22。首先，首先，本发明通过CCK-8方法测定了人乳腺癌细胞株MCF-7在10μM化合物10a-14d存在下的细胞毒性实验。以1％DMSO的细胞培养液作为参比；顺铂(Cisplatin)为阳性对照。实验结果如图6所示。图6结果表明：在10μM化合物存在下，化合物12a-d对MCF-7细胞在实验用的所有化合物，包括阳性参比药顺铂，中的作用最强，杀死率最高。
然后，为了详细考察化合物12a-d对MCF-7细胞的作用规律，获得IC50值(药物诱导肿瘤细胞凋亡50％的浓度)，本发明又通过CCK-8方法测定人乳腺癌细胞株MCF-7分别在1.25、2.5、5、10、20μM化合物12a-d存在下的细胞生长抑制和凋亡程度。同样以1％DMSO的细胞培养液作为参比，顺铂为阳性对照。实验结果如图7所示。图7结果表明：在1.25、2.5、5、10、20μM浓度的化合物12a-d存在下，化合物对MCF-7细胞具有较强的生长抑制和凋亡能力，IC50值在6.35-7.50μM之间，其中化合物12c最强，IC50值为6.35μM,化合物12a-d的细胞作用能力次序为：12c＞12d＞12b＞12a(如表1所示)。
表1.肿瘤细胞，非小细胞肺癌细胞株A549、人肝癌细胞株HepG2、人乳腺癌细胞株MCF-5和作为参比的人胚肺成纤维细胞株MRC-5在药物12a-d及作为阳性参比药顺铂(cisplatin)的存在下的IC50值(μM)。aIC50值是三次实验平均值±SD.
综合分析实施例22-24实验数据及表1的结果表明：化合物12a-d系列在实验所有的化合物包括阳性对照药顺铂在内，对实验的三种肿瘤细胞生长抑制及凋亡都具有较强的能力，其中，化合物12c最强；化合物12a-d系列对A549细胞作用能力最强，其次是HepG2细胞，最后是MCF-7细胞；化合物12a-d系列对A549细胞选择性作用也较好。
Claims (8)
1.2′-吡唑-1H-咪唑[4,5-f][1,10]菲罗啉衍生物，其特征在于其结构式如式(Ⅰ)所示：
其中：R为甲基、氟、氯或溴；R1为氢、甲基、苄基、2,4-二硝基苯基或N,N-二甲氨丙基。
2.一种根据权利要求1所述的2′-吡唑-1H-咪唑[4,5-f][1,10]菲罗啉衍生物的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
1)以式(1)所示的取代苯乙酮与盐酸氨基脲在乙醇、醋酸钠存在下反应生成中间体2a-d，与2,4-二硝基苯肼在乙醇存在下反应生成中间体3a-d，中间体2a-d、中间体3a-d分别与DMF在三氯氧磷作用下进行Vilsmeiere-Haack反应得到了中间体4a-d、中间体5a-d；
2)中间体4a-d在碘化钾为催化剂，50-80℃条件下和R1X发生亲核取代反应得到中间体6a-d、中间体7a-d、中间体8a-d，R1X中的X为I或Cl；
3)将1,10-菲罗啉一水化合物与浓硫酸、浓硝酸混合液在溴化钾存在下反应生成式(9)所示的1,10-菲罗啉-5,6-二酮；
4)将步骤1)、步骤2)得到的中间体4a-d、中间体6a-d、中间体7a-d、中间体8a-d、中间体5a-d溶于冰醋酸形成溶液，再与步骤3)得到的1,10-菲罗啉-5,6-二酮及醋酸铵溶液混合，加热搅拌至90-100℃进行反应，再用氨水中和反应液，收集固体，水洗、柱层析、再纯化得到目标化合物2′-吡唑-1H-咪唑[4,5-f][1,10]菲罗啉衍生物10a-d、11a-d、12a-d、13a-d、14a-d，
其反应方程式如下：
3.根据权利要求2所述的2′-吡唑-1H-咪唑[4,5-f][1,10]菲罗啉衍生物的制备方法，其特征在于步骤1)中2a-d、3a-d与三氯氧磷、DMF投料摩尔比为1：4-4.5：25.5-26。
4.根据权利要求2所述的2′-吡唑-1H-咪唑[4,5-f][1,10]菲罗啉衍生物的制备方法，其特征在于步骤1)中2a-d、3a-d与三氯氧磷、DMF投料摩尔比为1：4.3：25.8。
5.根据权利要求2所述的2′-吡唑-1H-咪唑[4,5-f][1,10]菲罗啉衍生物的制备方法，其特征在于步骤2)的中间体4a-d反应前先用氢化钠于DMF中常温反应半小时，中间体4a-d与氢化钠的投料摩尔比为1：2.8-3.2。
6.根据权利要求2所述的2′-吡唑-1H-咪唑[4,5-f][1,10]菲罗啉衍生物的制备方法，其特征在于步骤2)的中间体4a-d反应前先用氢化钠于DMF中常温反应半小时，中间体4a-d与氢化钠的投料摩尔比为1：3。
7.根据权利要求2所述的2′-吡唑-1H-咪唑[4,5-f][1,10]菲罗啉衍生物的制备方法，其特征在于步骤4)中柱层析用的流动相为体积比为15:1的二氯甲烷和甲醇混合液，再纯化采用体积比为1:3的乙醇-正己烷混合体系离心进行脱色去杂。
8.一种根据权利要求1所述的2′-吡唑-1H-咪唑[4,5-f][1,10]菲罗啉衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用，肿瘤细胞为非小细胞肺癌细胞株A549、人肝癌细胞株HepG2、人乳腺癌细胞株MCF-5细胞株。
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