JPH07505477A - 高感度フロースルー迅速免疫検出系 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 高感度フロースルー迅速免疫検出系 光里坐分！ 本発明は、一般に分析物の分析を実施する方法および装置に関する。具体的には 、本発明は、この分析物のための結合部位を含む新規な不溶性マトリックスを利 用する、分析物の高度に鋭敏で特異的な結合分析を実施する方法および装置に関 する。

光亙坐！量 種々の工業、研究および臨床分野で微量の有機化合物の存在または濃度を迅速に 検出する必要性は、当該技術分野では周知である。これまで多数の臨床分析が実 施されてきた。今では、食物および水の中の毒素または夾雑物の存在を検出する ために、さらに他の多くの研究、診断および品質管理分野で免疫検定が開発され ている。工程監視システムは、連邦管理局が製品の品質を厳重に管理している、 ヒトに使用する治療用物質の製造に特に重要である。この監視システムは、迅速 で、かつ得られたデータを工程パラメーターのｌ１節のためにフィードバック形 式で利用することが可能でなければならない、また、この監視システムは、種々 ０サンプルを分析するために応用が可能で、さらに容易に変更できるものでなけ ればならない、鋭敏で迅速で実施が容易で、さらに与えられた抗原の分析に容易 に応用できる検査が大いに要求されている。

高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）　、高速毛細管電気泳動（ＨＰＣＥ） 、迅速分析用免疫検定（ＲＡＩＡ）、またはこれらの組み合わせは、迅速な工程 監視に利用できる選択可能な分析用技術である。これらの技術の各々には限界が ある。クロマトグラフィーおよび電気泳動は、大きさと電荷に基づく分離によっ てサンプルを分析する。蛋白精製の初期段階では、生成物は多数の他の蛋白質の 夾雑物を含む可能性があり、全蛋白の１０％未満しか構成せず、通常の分離技術 による工程で問題の蛍白を同定することが困難になる。同様に、蛋白精製の極め て後期の段階においては、蛋白精製度は非常に高く、通常は９５％を越える。単 一生成物の濃度が高いとき、クロマトグラム、またはエレクトロフェログラムは 、必然的に単一ピークとなり、低濃度の夾雑物をこの範囲で検出することは困難 である。ここでは分離方法もまた利用を制限するものである。

さらに、クロマトグラフィーおよび電気泳動分析は、それを実施するために必要 な時間によっても制限される。通常のＨＰＬＣ分析の速度は一般に、通常のＨＰ ＬＣで使用される多孔質粒状クロマトグラフィー充填剤によって制限される０粒 子の間での移動相の物質移動はＨＰＬＣでは対流性である反面、多孔質粒子内の 移動相の物質移動は主として拡散的で、マトリックスを通過する蛋白の速度は実 質的に遅くなる。電気泳動分離の速度は、システムに用いる電圧の関数である。

しかし、熱発生は電圧の二乗で一増加する。したがって、殆どの電気泳動システ ムが耐えうる最大電圧は、用いる電圧によって生じる熱を分散することができる 速度によって制限される。

この３つの選択可能な分析技術のうち、迅速分析用免疫検定（ＲＡＩＡ）が、不 純なサンプルと実質的に純粋な生成物の両方から問題の蛋白を分離する十分な分 析力を有する唯一の技術であろう、のみならず、免疫検定は問題の蛋白との特異 的な結合反応を伴うので、該蛋白が正確に折り畳まれているか否かを決定するお およその方法を提供する。しかし、平衡反応として実施される通常の分析用免疫 検定は、殆どの検定で必要な反応時間によって制限を受ける。

免疫検定は、抗体もしくは他の特異的な結合蛋白と特異的な抗原もしくは抗体に 対するハプテン（分析物）との間の周知の反応に基づく。この原理は、結合蛋白 とそのリガンドとの間のいずれの特異的な結合反応にも応用できる。°競合的” プロトコルでは、サンプル抗原または分析物の類似体は、抗体（典型的には不溶 性支持体に固定されている）との複合体形成についてサンプル抗原と競合する。

この競合類似体は多くの場合、検出可能な成分、例えば蛍光性または放射性微量 物質で標識されているサンプル抗原の精製体である。該類似体はまた、容易に測 定できる活性（例えば着色物を生成する基質と反応する）をもつ酵素で標識する こともできる。抗体と結合した（または溶液中に残存する）標識類似体分画を測 定し、その反応中に存在するサンプル抗原（分析物）の量との関係を知る。一般 に結合物質種を定量する方が容易であることが分かっている。

この技術に対する多（のアプローチが開発されたが、これらは、主としてすＸプ ル抗原と標ｖａＭ似体の抗体への添加順序およびタイミング、並びに結合および 遊離物質種の分離方法を異にする（免疫検定の一般的考察については以下を参照 のこと、Ｂｏ　ｌ　ｔｏｎら、実験免疫学ハンドブック（Ｈａｎｄｂｏｏｋ　ｏ ｆ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｆ＋ｍｕｎｏｌｏｇｙ）、Ｄ、　Ｍ、　Ｗｅｉｒ ［、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｐｕｂｌｉｃａ−ｔｉｏｎｓ 刊、オックスフォード、１９Ｂ６ｉ１巻、２６章）。

クロマトグラフィーで多く使用されるタイプの固体支持体（例えばセファローズ ビーズ）上に抗体を固定する、固定免疫測定法（免疫吸着測定法と呼ばれる）も また知られている。このセファローズビーズをカラムに充填し、サンプルを捕捉 させ、不純物を洗い流すことができる。抗体（または固定成分）は一般に固体セ ファローズ支持体に共有結合的に付着される。また別に、例えば蛋白Ａのように 抗体と特異的可逆的に反応することができる成分を支持体の表面に包含する場合 は、抗体をこの固体支持体と可逆的に反応させることができる。固定された成分 が可逆的にこの固体支持体と結合している場合は、この結合複合物を溶出させ、 さらに類似体−抗体複合物を定量することができる。定量を行うためには、複合 体を形成したサンプル抗原と類似体複合物とを区別するために、該類似体が何ら かの方法で標識される必要がある（例えば以下を参照のこと；　Ｍａｔｔｉａｓ ｓｏｎら、ホルモンと薬剤の酵素標識免疫測定に関する国際シンポジウム（議事 録）　（Ｐｒｏｃ、　Ｉｎｔ、　５ｙｓｐ、　ｏｎ　Ｅｎｚｙ＋ｗｅ−Ｌａｂｅ ｌｌｅｄＩｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　ｏｆ　Ｈｏｒ＋＊ｏｎｅｓ　ａｎｄ　Ｄｒｕ ｇｓ）、　Ｓ、　Ｐａ１編、Ｗａｉｔｅｒ　ｄｅＧｒｕｙｔｅｒ、　（１９７８ ）、　９１ページ）。

固定成分が固体支持体に共有結合している場合は、サンプル抗原は、カラムから それを簡単に溶出させ、ＵＶ検出器で定量することによって測定することができ る。これは標識競合物の必要性を場合によって排除する。

残念ながら、サンプル抗原を溶出させるために用いられる多くの化合物（いわゆ る溶出剤）が抗原と一緒に溶出し、検出ベースラインがかなり乱され、溶出剤の 溶出波形とサンプル抗原のそれとの区別を困難になる。実際、この影響によって 、検定の感度は検出波長と使用溶出剤とに依存しつつ１００倍以上減少する。こ の系の第二の不利な点で、迅速な検定系として特に重要なことは、結合蛋白また は抗体が抗原と共に溶出してしまうことを防止するために、これらを典型的には 共有結合で固定する必要があるということである。このことは、カラムの有効期 間中に単一の抗原の測定しかできないか、または異なる抗原を用いる場合に毎回 カラムを再充填しなければならないことを意味する。

検定用プロトコルとしての通常の分析用免疫測定についてのまた別の懸念は、平 衡状態にする必要があるために多（の場合かなりの保温時間を要するということ である。実際、米国特許第４８１６４１８号および４１２８６２８号は各々、多 数のサンプルの連続自動測定用装置を開示するが、これらは、反応保温時間によ って課される制限を克服することを図っている。各々の装置においては、サンプ ルは脇で保温され、反応が平衡に達したあと定量のために引き寄せる。典型的な 測定は、実施に１０分またはそれ以上を必要とし、フィードバック分析には長過 ぎることが多くある。

第二の特異的な結合分析プロトコルは、“サンドインチ”として知られている結 合部位−分析物−標識結合部位複合体の形成を含む、この分析の最もよく知られ た形式は、酵素結合免疫吸着検定（ＥＬＩＳＡ）である、ＥＬＩＳＡでは、特異 的抗原（Ａｇ）に対する第一の抗体（Ａｂｌ）は、固体支持体上に固定され、免 疫吸着体（支持体−Ａｂｌ）を生成する。研究でもっとも広く用いられている免 疫吸着体は、ポリスチレンプレートまたはマイクロタイタブレートである。マイ クロタイタブレートは一連の凹み（ウェル）をもち、抗体はこのウェルの壁に固 定される。ＥＬＩＳＡ法は免疫吸着体と、吸着抗体抗原複合体（支持体−Ａｂｌ ：Ａｇ）を形成する抗原を含むと思われる溶液とを一緒に保温することを含む。

続いてこの吸着抗原は、酵素（Ｅ）を結合させた第二の抗体（Ａｂ２）と−緒に 保温され、支持体Ａｂｌ　：Ａｇ：Ａｂ２−Ｅ複合体または“サンドインチ”を 形成する。支持体Ａｂｌ　：Ａｇ：Ａｂ２−Ｅ複合体を続いて酵素基質と保温す る。その後、酵素と基質の反応を吸収、蛍光または他の検出手段によって定量す ることができる。抗原の定量は、生成物形成速度または一定時間に形成される全 生成物量と吸着抗原量との相関性によって実施することができる。

ＥＬＩＳＡ測定は一般に固定時間を基に実施されるが、保温時間またはその他の いずれかの可変条件を変更することなしには、わずか５０倍の濃度範囲にしか適 用できない、このことは、未知抗原濃度のサンプルがＥＬＩＳＡ系には濃すぎる がまたは薄すぎるという可能性がある問題を生じる。サンプルが濃すぎる場合は 、サンプルを分析範囲とするために多数回の希釈をしなければならない。他方サ ンプルが薄すぎる場合、より長時間の保温時間を用いなければならない。これら のアプローチは何れも時間がかかる。ＥＬＴＳＡ測定には一般に１−２４時間要 する。この分析１よ比較的時間がかかるので、有効な十分に大きな処理量をこな すために、多数の分析を並行と７で実施する必要がある。

ＥＬＩＳＡ系では表面に抗体、抗原および酵素が固定され、したがって該測定法 の酵素検定部分は異なる成分で構成されている。基質が当該表面へ移動する程度 および該表面から生成物が移動する程度は速度限定的である。これは、吸着酵素 量が高い場合特に当てはまる。基質は表面近くで消耗され、生成物は、表面にお いて反応容器の他の部分よりも高濃度で蓄積される。

これは特に抑制された生成物である酵素の場合重大な問題である。生成物抑制は 非直線的な免疫検定を引き起こすだろう。

ＥＬＩＳＡ系はまた非特異性の問題を有している。検定される溶液中の抗原の濃 度が非常に低い場合、はんの僅かのＡｂｌ結合部位がＡｇによって占められる。

この場合、少しのＡｂ２−Ｅ結合物が免疫吸着体に非特異的に吸着されることは 可能である。非特異的に吸着されるＡｂ２−Ｅ結合物もまた生成物を生じ、吸着 Ａｇ量から予想されるより高いシグナルを生じる。

ド・アルライスとウィルソンＣｄｅ　Ａｌｗｉｓ　＆　Ｗｉｌｓｏｎ）は、クロ マトグラフィー材に固定された抗体は、連続的に流れるＥＬＩＳＡ系で用いるこ とができることを報告したが、この場合、固定された酵素の反応生成物は連続的 に生成され、検出器に移送される（Ｗ、　Ｕ、　ｄｅ　Ａｌｗｉｓ　＆　Ｇ、　 Ｓ、　Ｗｉｌｓｏｎ　（１９８５）　Ａｎａｌ、　Ｃｈｅｍ、＋酊、　２７５４ −２７５６ページ）。

本発明の目的は、蛋白精製のあらゆる段階において蛋白の生成を検定するシステ ムの構成要素として用いることができ、さらに通常の免疫検定方法に代わるもの を提供しうる、迅速で定量的な分析物の検定方法および装置を提供することであ る。本発明の別の目的は、複数の異なるサンプルの分析物を検定する方法および 装置を提供することである。さらに別の目的は、通常の免疫検定および分離技術 によって生しる時間的制限を克服するための迅速な分析物サンプルの検定方法を 提供することである。

本発明のこれらおよび他の目的と特色は以下の記載、図面および請求の範囲から 明らかとなろう。

１皿夏翌１ 開示するものは、分析物の迅速なフロースルー検定用装置および方法である０選 択的に分析物に結合することができる結合部位をもつ結合蛋白が流路を形成する 硬質のマトリックス表面に固定される。このマトリックスの構造がこの装置およ び方法にいくつかの固有の特性を提供する０分析物および特定の結合測定で用い る他の試薬を含む液体サンプルは、マトリックスを通って固定された結合蛋白を 含む表面の近くに配置された水圧の掛かる全容積に対流によって送られ、拡散に 依存しない速度で結合蛋白：分析物複合体を形成させる。この結合蛋白または複 合体と結合することができる、検出可能な標識試薬が続いてこのマトリックスに 対流によって送られる。その後、結合した標識試薬の量が検出され、分析物の濃 度または存在についての分析が提供される。結合標識試薬の量は、分光光度計、 蛍光分光計、ルミネセンス検出器、または当該技術分野で既知の他の手段を用い て慣用的に検出される。結合蛋白／分析物の組み合わせは、特異的な可逆的結合 が可能な、抗体と抗原を含むいずれの受容体（レセプター）／リガンドの組み合 わせでもよい。

この装置および方法は、特異的な結合物質が既知であり、作製し、製造すること ができるいずれの物質をも検出するために用いることができる。この検定方法の 速度、融通性および高感度によって、この方法は工程監視および品質制御工程で 用いることが可能である。この方法の特に有用な応用は、体液サンプル中の種り の溶質の存在および／または濃度を測定する臨床検定にある。この場合、種々の 結合蛋白が、各分析物のためにマトリックスに含められる。

フロースルー迅速分析は、潅流が可能な高速度マトリックスを用いて実施される 。これらのマトリックスは、典型的には、通常のクロマトグラフィーマトリック スで時々用いられるものと全体の大きさが同じであるが、粒子内存孔性が高い粒 子を含む、典型的には直径が１０−２０μｍの粒子の潅流性マトリックスは、比 較的大きな平均直径の粒子内貫通孔（例えば６０００−８０００人）および、こ の大きな貫通孔から伸びるか、またはそれらをつなぐより小さな平均直径（５０ ０−１５００人）のネットワークをもっている。生じたネットワークは、粒子内 の拡散通路の長さを制限し、それによって粒子孔内の物質移動は本質的に対流に よって支配される。それによってこれらの系の移動相速度は、結合能力における 実質的な損失を生じることなく（実際、実質的に効果的な増強がみられる）、通 常のＨＰＬＣ系のそれの１０−１００倍の大きさに増加する（例えば、１０００ ｃｍ／時間）、潅流性マトリックス系の拡散通路の長さの減少は、本発明の分析 の速度を大きく高める。

潅流性輸送が可能な粒子の有孔性の増加とともに、結合蛋白の付着のために利用 できる表面積が実質的に増加する。水銀多孔度針で測定した場合、これは典型的 には、１０−２０μｍ粒子について３０から５０ｍ”／ｍｌの範囲内の水準に達 する。

潅流性マトリックス１ｍｌは、少なくともおよそ１０−２０ｍｇの結合蛋白と結 合することができる。したがって、例えば、ｌＯμｇの結合蛋白は、１ｍｌのマ トリックスの全結合蛋白付着能力の１／１０００未満を占有する。潅流性マトリ ックスによって提供されるこの極めて大きな表面積によって、分析に必要なカラ ム容積を極めて大きく減少させることができる。結合蛋白は、共有結合または非 共有結合反応によってマトリックス上に固定できる。結合蛋白は、マトリックス 表面に可逆的に結合され、融通性のある、再使用が可能な系を提供することがで きる。

潅流性マトリックス材の説明は米国特許５０１９２７０号（５月２８日発行）お よびアフィヤンら（Ａｆｅｙａｎら、（１９９０）ＬＬｍＴｅｃｈｎｏ１ｏ■Ｊ ：２０３−２０６）の論文で提供される（これらの文献は参照により本明細書に 含まれる）。潅流性マトリックス材はパーセブティフ゛バイオシステム社（Ｐｅ ｒＳｅｐｔｉｖｅ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、　Ｉｎｃ、。

ケンブリッジ、マサチューセソツ、ＵＳＡ）から市販されている。

この粒子の製造に好ましい物質は、ポリスチレンジビニルベンゼン共重合体であ る。

さらに、無孔性粒状マトリックス材も用いることができるが、この場合、個々の 粒子間の間隙による曲がりくねった回路が形成されている。そのようなマトリッ クスは、潅流性マトリ・ノクスよりはるかに小さな正味の収容量をもつだけで、 より高圧の滴下による操作が必要であるが、微量分析で用いることができ非常に 有用である。

本発明の方法および装置で有用なマトリックスは、上記に開示した充填粒子形の 他に種々の形態をとることができる。それらは、一本もしくは一束になった微小 毛細管、構造的に膜と同じ非常に浅いベッド、または互いに接触する充填粒子と 同等な三次元円筒構造を含むことができる。これらマトリックスが有するものは 共通なことは：　（１）試薬は、結合蛋白を含む活性表面の非常に近くに対流に よって送られ、さらに（２）表面積対表面近くの液体が充満する容積の比率は、 少なくともおよそ１０’ｃｍ”７ｃｍ”即ち１０’ｃｍ−衷、好ましくは１０’ ｃｍ−’である。溶質が表面の結合物質と反応することができる場合、分析物、 標識分子成分のような溶質の拡散輸送は常に必要である一方、拡散が生じなけれ ばならない距離は必然的に極めて小さい（例えば約１００００人より大きくはな い）。

マトリックスビーズの疎水性表面に持続的な親水性薄膜を生ずる被覆をもつマト リックスを用いることができる。米国特許５０３０３５２号（１９９１年７月９ 日発行（本明細書には参考文献として含まれる））に記載されているように、被 覆化合物は、ヒドロキシル、エポキシ、ハロゲン化物または他の反応性側鎖基を 含むことができる。

本発明の１つの具体例では、結合蛋白は抗体であってもよし１゜結合蛋白が抗体 である場合は、マトリックス表面は、その結合蛋白抗体のＦｃｅｌ域に特異的な 抗体（例えば免疫グロブリン誘導交差種）を含み、さらに、免疫グロブリンのＦ ｃｊｌ域と結合することが分かっている２つの蛋白、蛋白Ａまたは蛋白Ｇを用い てもよい。多種抗体をまたマトリックスに付着させ複数の分析物の分析系を提供 することもできる。

本発明は、迅速なフロースルー酵素結合免疫検定（ＥＬＩＳＡ）のための最適な 系を提供する。１つの具体例では、結合蛋白は、潅流性マトリックス粒子を含む カラム上に固定され、続いて、分析物は、固定結合蛋白を含むカラムを通って潅 流されて、結合蛋白：分析物複合体をマトリックス上に形成する。複合体と結合 することができる抗体に連結された酵素を含む標識試薬は、続いてカラムを通っ て潅流され、標識試薬を固定結合蛋白二分析複合体に結合される。酵素基質溶液 によるマトリックスの潅流によって生成物を溶出させ、これは分光光度計または 当該技術分野で既知の多くの方法のいずれかによって検出できる。これは該分析 物の迅速な検定を提供する。

本発明のこれらおよび他の特徴は、添付の図面と合わせて以下の詳細な説明を参 考にしてより完全に理解されるであろう。

阿皿互固単星五皿 図１−４は、本発明の一具体例において用いられるマトリックス粒子の図である 。

図５は、本発明の装置の図である。

図６−８は、本発明の詳細な説明するグラフである。

図９は、本発明の一具体例で用いられる毛細管マトリックスの図である。

註鞭星説所 その最も広い意味で、本発明は、分析物の迅速なフロースルー分析のための方法 および装置を開示する。この方法は、蛋白製造工程において蛋白濃度を検出する 監視機構として有用である。この方法はまた、生物学的液体サンプル中の分析物 を検出するために用いることができる。

本明細書で用いられている以下の用語は次の意味を有する：ここで用いられ−で いるように“分析物”とは、ここで゛結合蛋白”と呼ぶまた別の化合物と特異的 に、かつ可逆的に結合することができる分析されるべき一切のサンプル化合物を 含む。

有用な分析物および結合蛋白は、抗原（またはハプテン）および抗体結合部位、 リガンドおよびレセプター、並びに特異的な可逆的結合反応が可能な他の一切の 化合物の組み合わせを含む。

ここで用いられているように、マトリックスは、結合蛋白が固定されている表面 を、または表面の側を通過する分析物と接近しうる表面部分を形成する固体構造 を指す。

本発明は、分析物の迅速な高感度フロースルー分析のための方法および装置に関 する０分析物と選択的に結合することができる結合部位を有する結合蛋白は、流 路を形成する硬質のマトリックス上に固定される０分析物を含む液体サンプルは 、マトリックスを通って水圧の掛かる全容積に対流によって送られ、結合蛋白： 分析物複合体の形成を可能にする。続いて、結合蛋白または複合体と結合できる 検出可能な標識試薬がマトリックスに対流によって送られ、結合した標識試薬の 量を検出して、分析物の濃度または存在の検定が行われる。結合標識試薬の量は 、分光光度計、蛍光分光計、イルミネセンス検出器または他の手段によって検出 できる。別の具体例では、分析物または標識試薬の液体流を一時的に停止させ、 結合を強化させることができる。また別の具体例では、分析物および標識試薬は 、対流によって送り込む前に一緒に予備保温し、結合を促進し、続いて結合分析 物および標識試薬を一緒に対流によってマトリックスに送ることができる。

本発明について使用に適した潅流性マトリックスは、粒子１０のような高密度充 填粒子（図１に模式的に図示）を含む０図１に示すように、マトリックスは、充 填粒子間の間隙によって囲まれた第一の孔群の粒子外通路１２を含み、これは比 較的大きな平均直径を有する。マトリックスはまた、より小さな直径を有する第 二の貫通孔群１４を含み、これは各粒子１０の本体によって囲まれている。また 粒子１０の内側に囲まれているのは拡散輸送孔（１６）群である。粒子外通路１ ２の平均直径は貫通孔１４のそれより大きい６通路１２と貫通孔１４の平均直径 の比率は、粒子がベッド中に密に充填されているときは、貫通孔１４内の対流を 誘発することができる流速闇値が孔の内部の分子拡散速度より速くなるようなも のである。ベッド流速闇値以上では、ベッドは潅流範囲で作動していると考えら れ、この場合、結合蛋白と分析物間の接触は、もはや拡散輸送によっては結合し ない、正確には、この潅流閾値が生じる場合はいろいろな因子に依存するが、そ れは主に第一と第二の孔群の平均直径に依存する。その比率が小さければ小さい ほど、流速闇値は低くなる。好ましい具体例では、平均粒子直径対粒子内貫通孔 の平均直径の比は７０未満で、最も好ましくは５０未満である。

図２から４は、本発明の潅流マトリックスで用いられる粒子２０の種々のスケー ルにおける詳細な模式図である０図２はクロマトグラフィーカラムの横断面で、 直径が約１０μｍの多数の粒子２０を示しているが、それらの各々が近くの粒子 と接触し、第一の孔群を構成する間隙２２によって囲まれている。間隙の平均直 径は広範囲に変動するが、一般には粒子２０の平均直径の１／３のオーダーにあ るであろう０図２の円Ｂは、図３で１０倍になっている。ここでは約ＩＩＩｍの 縮尺でベッドの微細構造が図示されている。この粒子は、白丸２４として図示す るポロンの集塊を含む。ボロン塊の間の間隙は貫通孔２８をつくる。塊２４をつ くる個々のポロンはここでは点によって図示されている０次の精密レベル（すな わち０．１１ｊｍまたは１０００人（図示せず））では、ボロン塊２４は、大ま かに球形のポロン凝集塊を含むことが分かるであろう。そのような構造では、凝 集塊２４をつくるポロン間の間隙は、通常のクロマトグラフィー媒体の分散的に 結合した粒子と類似し、ここでは物質輸送は拡散に依存する。図４は、対流によ って液が流れる、粒子２０内の貫通孔２８の曲がりくねった通路を示している。

潅流孔は、異方性で無秩序に技分かれしており、いずれの部位からも異なる直径 をもち、多数の小さな、しばしば行き止まりの孔２９につながっているが、ここ では物質輸送は拡散が支配的である。

約５から１００μｍの潅流性マトリックス粒子は、ジビニルベンゼンまたは他の 共重合体と架橋させたスチレンのようなポリマーから通常の懸濁、乳濁またはハ イブリッド重合技術（米国特許５０１９２７０号、１９９１年５月２８日発効） を用い、はるかに小さなポロンから製造される。

潅流性マトリックス粒子は大きな表面領域を有し、その上に、結合蛋白が固定さ れるか、または他の可逆的で特異的な結合構造が作られるか、もしくは付着して いる。貫通孔を含む粒子の全表面に結合蛋白を固定することができる。結合蛋白 は、当業者に周知の多数の技術のいずれか１つを用いて、高濃度で当該表面に共 有結合で付けることができる。また別に、結合蛋白は、マトリックス支持体に非 共有結合的に付けてもよい、非共有結合による付着はζ共有結合による付着より 多くの利点をもたらすが、主なものは、経費効率および応用性である。結合蛋白 は、疎水性／疎水性反応を含む多数の周知の非共有結合反応のいずれかを用いて マトリックスに結合させることができる。その後、この結合蛋白を溶出させ、こ の結合蛋白およびマトリ・ンクスを、再使用することができる。

潅流性マトリックス材が好ましいが、一方、無孔性マトリックスでも実施するこ とができる。この場合、無孔性粒子の間の間隙によって曲がりくねった通路が形 成される。これらのマトリックスは潅流性マトリックスより正味収容能力は小さ いが、微量分析には非常に有用である０本発明の方法および装置で有用なマトリ ックスは、充填粒子の他に、微小毛細管の束（図９に模式的に示す）として具体 化できる。高い表面積／体積比は、非常に小さな内径毛細管（ｌ−５μｍ）を使 用することによって達成され、数マイクロリットル／　ｃ　ｍの反応容器を提供 することができる。結合蛋白は毛細管の内表面にコートされ、溶質は対流によっ て毛細管マトリックスを通って輸送される。毛細管の高い表面積対体積比により 、利用可能な反応容積が増加する。マトリックスはさらに膜構造を含むことがあ る。

本発明の方法で用いられる全てのマトリックス材において、表面の面積と、その 表面近くまで液体を満たすことができる体積に対する比は、少なくとも約１０” ／ｃｍ、好ましくは１０６／　ｃ　ｍである。これらのマトリックスでは、試薬 は結合部位を含む活性表面の非常に近くまで対流によって送られ、それによって 、拡散輸送が発生する距離を、通常の検定系と比べ顕著に減少させることができ る。

本マトリックスにより、極めて高い表面積対体積比（典型的には１０−２０μｍ 粒子について３０−５０ｍ”／ｍｌの規模）と迅速な反応速度が提供される。潅 流モードでは、分析物、標識試薬または基質を含む溶質のマトリックス内領域へ の物質輸送は対流に支配される。拡散輸送が発生する距離は非常に減少する。こ れにより、その能力を弱めることなく小容量で固定結合蛋白を用いて分析物の検 定を実施することが可能になる。さらに、この潅流系の迅速な処理により、結合 能を損なうことなく、標識試薬の他に結合蛋白と分析物を潅流系に迅速に（例え ば数秒または数分で）添加することが可能になる。

広い表面積のマトリックス（ここでは表面積対液体充填可能体積の比は、少なく とも１０’／ｃｍ）は、検定速度を高めるために有利な系を提供する０分析物質 および標識試薬を含む溶質は、例えば、表面に固定された結合蛋白を含むカラム を通って高圧下で迅速に対流によって輸送される。マトリックス内に通路や孔を 含む広い表面を迅速に通り抜けて流れることにより、溶質は、はるかに過剰の結 合蛋白結合部位に向けて対流によって送られ、マトリックスに迅速かつ効果的に 結合される。このマトリックス構造内では溶液の拡散通路は減少するので、物質 輸送は促進される。マトリックス上の第一の結合部位が満たされるにつれ、対流 による液通過により溶質は迅速にをカラムのさらに下方の結合部位に送られる。

検定速度は、迅速な液通過と過剰な利用可能結合部位によって高められる。

高表面積マトリックスは結合について非常に高い能力を有する０例えば、１０− ２０μｍ潅流マトリックス粒子は、典型的には３０−５０ｍ”／ｍ＋の範囲の表 面積を有する＊１ｍｌの潅流マトリックス粒子は、１０−２０ｍｇの結合蛋白を 結合させることができる。したがって大規模（ｍｇ）検定さえ、非常に少量の潅 流マトリックス材を用いて実施することができる。

ここで用いられるマトリックス総量に対して広い表面積上に固定された結合部位 は、高められた反応速度の範囲を提供する。

検定しようとする分析物の濃度は、極めて少量（ナノグラム）から掻めて多Ｉ（ ミリグラム）の範囲まで可能である。極めて少量の分析物をマトリックス（例え ば潅流マトリックス粒子を含むカラム）で検定する場合、該分析物はカラムの一 番上の最初に利用できる結合部位の位置に集められる。より大きな規模の検定で は、分析物は迅速にカラムに添加され、マトリックスの最初に利用できる結合蛋 白部位に結合することができる。最初の部位が飽和するにつれ、潅流マトリック ス中の対流により、分析物は迅速にマトリックスのさらに下方へと輸送され、次 の利用可能な結合蛋白部位を飽和させていく。したがって、少量および大量の分 析物の両方が迅速に、かつ簡便に分析できる。

本発明はまた、種々の型の複数の抗体をマトリックス表面に連続的ゾーンとして 固定し、ただ−回の通過で一連の分析物の検定を可能にするものである。マトリ ックス上の利用可能な全ての結合部位を飽和させない濃度の抗体群中の第一の抗 体を含む溶液を潅流マトリックスに、例えばカラムの充填粒子中を通過させる。

さらに、溶液は潅流を生じるに十分な液流速度で供給される。この流速またはこ れ以上の流速で、抗体は、それが通過する実質的に全ての利用可能な結合部位に 出会い、それによって最初の利用可能な部位を飽和させ、固定された抗体の明瞭 なゾーンを形成していく。続いて、第二の抗体を含む第二の溶液（これもまた金 での利用可能な結合部位を飽和するには十分でない濃度である）を添加する。第 二の溶液中の抗体もまた潅流流速でマトリックスに供給され、固定された第一の 抗体を含む飽和結合部位のゾーンを通過して、カラムのさらに下方の最初に利用 可能な部位に結合し、固定抗体の第二のゾーンを形成する。続いて他の種々の抗 体が同じ態様で添加できる。添加できる抗体の数は、主としてカラムの能力によ ってのみ制限される。

重要な具体例群では、本発明は、結合蛋白が抗体であり分析物が抗原である免疫 検定方法に関する。結合蛋白が抗体である場合には、マトリックス表面は、結合 蛋白抗体のＦ　ｃ　ｉｉ域に特異的な抗体を含むことができる。さらに、免疫グ ロブリンのＦｃ　ｅＪ域に結合することが知られている２つの蛋白、蛋白Ａまた は蛋白Ｇを用いることができる。

ここで開示したマトリックスを用いて競合免疫分析を実施することができる。分 析物を含むサンプルを既知量の分析物類似標識体とともにマトリックスに添加す ると、分析物と類似体とが限定量の固定抗体との複合体形成について競合する。

競合類似体はサンプル抗原の標識精製体であってもよい、類似体は、例えば蛍光 または放射能活性トレーサー物質または酵素でありでもよい。続いて、マトリッ クスに結合した標識類似体分画、または結合しなかった量を測定するが、それは サンプル中に存在する分析物の量に相関する。また別に、サンプルおよび標識類 似体は連続的にカラムに添加できる。競合分析は、類似体および分析物の全てと 結合するには十分な結合部位が存在しないということが必要であるので、無孔性 潅流粒子のような能力の低いマトリックスがこの方法には有利である。結合した 、または結合を免れた標識類（置体の量は、カラムから溶出させる前、または後 で測定することができる。カラムを通過する酵素基質溶液は、固定酵素によって 作用し、さらに反応の程度は、溶出液中の反応生成物をモニターすることによっ て測定できる。

現在のところ好ましい検定形式では、分析物は“サンドイツチ”法で検出される 。ここでは、第二の抗体が先に結合した分析物と結合するが、この場合、第二の 抗体は酵素のような検定可能な成分に連結されている。この方法では、試薬が表 面で相互作用的に接触できるようになる速度は、通常の酵素結合免疫検定（ＥＬ ＩＳＡ）で用いられる拡散と異なって、対流によって支配される。２つまたはそ れ以上の分析を容易に同時に実施できる。カラム上に固定された酵素１ｍの量を 測定するために用いる酵素基質液流をカラム通過中に短時間停止させ、感度を高 めることができる。

１つのＥ、ＬＩＳＡ具体例では、結合蛋白を潅流マトリックス粒子を含むカラム 上に固定し、続いて、抗原（分析物）を固定結合抗体を含むカラムに潅流させて 結合蛋白：分析物複合体をマトリ・ノクス上に形成させる。その後、複合体と結 合することができる抗体に連結した酵素を含む標ｖａ試薬をカラムに潅流させ、 固定された結合蛋白：分析物複合体と結合させる。酵素基質溶液でマトリックス を潅流させることによって、分光光度計または当該技術分野で既知の多数の方法 のいずれかで検出できる生成物が溶出する。このことにより分析物の迅速な検定 ができる。多数のパラメーターのいずれも、解析度を高めるために調整すること ができる。また、分析物、標識試薬または酵素基質のような溶質を添加した後、 液流を停止させて溶質をマトリックス上で結合または反応させ、それによって結 合を促進し、検定の感度を高めることができる。迅速なフロースルーＥＬＩＳＡ を実施するために潅流性マトリックスを使用することは、ウェルの使用と較べ改 善された方法を提供する。なぜならばサンプル中に存在するかもしれない酵素抑 制因子が除去されるからである。

ＥＬＩＳＡを実施するために用いることができる装置５８を図５に示す、装置５ ８は、分析物、標識試薬または他のサンプルを添加する注入口６０をもつ注入器 ５０を含む、注入器５０（例えばポンプ）からサンプル液は管６４を通って液流 調節バルブ５４へ送られる。バルブ５４は、液流を管６２から分析物に特異的な 固定結合部位を有する潅流性マトリックス粒子を密に充填したカラム５２へ向け る。続いて、バルブ５４に戻る管６６に液を流し、そこでカラム溶出液は管６８ から検出器５６（例えば慣用的な分光光度計）へ向けられる。液流ｕＲ節パルプ ５４または注入器５０は、カラムに液流停止モードを提供するために用いること ができる。液流停止モードでは、管６４からの液流は、バルブ５４を通り直接管 ６８から検出器５６へ送られるか、または液流は、注入器５０を停止させること によって中断させることができる０分析はシステム５８を用いて容易に実施でき る。液流停止モードは、分析物または標識試薬を含むいずれの試薬の添加に際し ても液流を停止させ、結合を高めることがができる。また、この検定の感度は、 カラムに添加する前に注入器５０中で分析物と標識試薬とを混合して、さらに結 合を促進することによって高めることができる。

利用可能な潅流性マトリックスカラムは、ＰｏｒｏｓＧ／Ｍ（蛋白Ｇ親和性、低 能カフ　ｍ　ｇ　／　ｍ　ｌ−ヒトＩｇＧ、２０μｍ）；ＰｏｒｏｓＧ／Ｍ（高 能力、１４ｍｇ／ｍｌ−ヒトＩｇＧ、２０μｍ）；ＰｏｒｏｓＲ／Ｍ　（逆相、 ２０μｍ）；およびＰａｒｏｓＯＨ／Ｍ（！１！水性基材、２０　ａｍ＞を含み 、これらはバーセプテイブバイオシステム社（ケンブリッジ、マサチューセッッ 、ＵＳＡ）から市販されている。

夫施脳上 分析物としてＩｇＧを用いるＥＬＩＳＡ−＠、ＩｇＧ結合蛋白（蛋白Ｇ）が固定 された潅流性カラムを用いて実施した。既知濃度のＩｇＧ溶液を、続いて標識試 薬溶液（アルカリホスファターゼ結合抗−１ｇＧ抗体）を潅流させた。カラムに この酵素基質、燐ａＩｐ−ニトロフェニル（ＰＮＰＰ）を潅流させ、このＩｇＧ を測定した。カラム内の流れを３０秒停止させることによって基質溶液を保温し 、さらに、カラム溶出液の吸収を４５０ｎｍで測定して反応を検出した。

以下の試薬をこの検定に用いた。潅流性マトリックスカラムはＰｏｒｏｓＣ，７ Ｍ（蛋白Ｇ親和性、低能力、７ｍｇ／ｍｌ−ヒトＩｇＧ、２０μｍ）、０．ｌＸ ２ｃｍ、５０バールで充填。

カラム添加用緩衝液は、ＩＭのＮＨ，ＣＨｉＣＯＯＨ，ｐＨ７，１，１１００１ Ｉ／ｍｌのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（シグマ、Ａ−７９０６）含有。分析 物、多クローン性ヤギ−ＩｇＣ（Ｇ−ＩｇＣ，）（シグマ、ｌ−５２５６）は、 添加用緩衝液に溶解し、注射筒型ろ過器（Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ　Ｄｅｖｉｃｅ ｓ　Ｉｎｃ、＋　アクトン、マサチューセッツ、２５ｍｍＸ０．２２μｍ）でろ 過し、０．０５ｍ１／分で添加した。アルカリホスファターゼ（ＲＡＧ−ＡＰ） （Ｐｉｅｒｃｅ、　３１３２４）標識ウサギ抗−ヤギ）”（ａｂ）ｔを添加用緩 衝液で希釈し、注射筒型ろ過器でろ過し、Ｏ，０１ｍ１／分で添加した。酵素基 質燐酸Ｐ−−１−トロフェニル（ＰＮＰＰ、　Ｐｉｅｒｃｅｓ　３４０４６）を １０ｍＭジェタノールアミン、０゜５ｍＭＭｇＣＩｔ　−ｐＨ９，５にＯ，ｌま たは１．０ｍｇ／ｍで溶解した。液流停止後３０秒で吸収を４０５ｎｍで調べた 。この溶液は毎日新しく調製し、その後ろ遇したＣＭｉ　ｌ１ｉｐｏｒｅ、タイ プＧＶ、　０．　２２　μｍ）　。

ＨＰ１０９０（ヒユーレットパラカード）ＨＰＬＣに１０ロバルプ（νａｌｃｏ 、　ヒユーストン、テキサス）を付加して用いた。

サンプルを自動注入器で注入し、外部バルブスイッチでカラムから検出器（パー キン−エルマー、ＬＣ−９５）に流れを変換した。

液流停止モードでは、外部バルブスイッチが作動し、カラムから検出器へと液流 を変える。液流停止モードは、所定の時間、基質をカラム上に停止させ、その間 基質のみの持続的なバックグラウンド測定を行うことを可能にする。各サンプル について数回の液流停止時間を取った後、カラムから内容物を絞り出した。

各分析を実施した後、蛋白Ｇカラムを添加用緩衝液で、続いて絞り出し溶液（３ ００ｍ　Ｍ　Ｍ　ｇ　Ｃ１を含有２０％酢酸）で洗浄し、全てのＩｇＧを除去し た。その後添加用緩衝液で再平衡化した。この後、次のサンプルを添加する前に ＰＮＰＰを絞り出しを行ったカラムに通し、液流停止測定を数回行い残留する酵 素活性を測定した。バックグラウンドが高すぎる場合には、カラムを再洗浄し、 再びバックグラウンドを点検した。

Ｇ−ＩｇＣ分析の結果は、図６のグラフに表した０図示したＧのナノグラム数に 比例している。

１里１ 標識試薬（ウサギ抗−ヤギＦ（ａｂ）ｚアルカリホスファターゼ）を添加した後 に、液流を１５．３０および６０秒間それぞれ停止させ、カラムのＧ−ＩｇＣへ の標識試薬の結合を高めさせたという点を除いて、実施例１の方法に従った。続 いてＰＮＰＰを添加し、酵素生成物形成によってつくられるピーク領域をＭａｘ ｉｍａ８２０ソフトを用いて分析した。図７に示すように、カラム上の標識試薬 滞留時間の増加は、約５０ｎｇまでこの検定の感度を増強した。

裏隻班ユ ＩｇＧおよび標識試薬（ウサギ抗−ヤギＦ（ａｂ）ｚアルカリホスファターゼ） を、結合を促進するために室温で３０分間予備保温し、その後カラムに添加した という点を除いて、実施例２の分析方法に従った。続いて液流を１５．３０、ま たは６０秒間液流を停止させながら、酵素基質Ｐ　Ｎ　Ｐ　Ｐをカラムに添加し た。酵素生成物形成に際してつくられるピーク領域をＭａｘｉｍａ８２０ソフト を用いて分析した。この方法にしたがえば、感度はさらに分析物１ｎｇまで増加 した。結果は図８に示す。

ＧＩｇＧ　ｌｎｇｌ ｍ−１−１５５ＥＣ ０Ｇ１　（ｎｇｌ −〇−１５ＳＥＣ 国際調査報告　・ｒＴ／ＩＫ　Ｏ’Ｊｌｎり、Ｉｔｃフロントページの続き （７２）発明者　レグニール、フレッド　イ゛−。

アメリカ合衆国　４７９０６　インディア九ウェスト　ラフアイエツト、タカホ ウレイン１２１９

Claims (25)

【特許請求の範囲】
1. １．分析物の迅速なフロースルー検定のための装置であって、該装置が、 表面上に配置され、該表面に固定された結合部位：分析物複合体を形成するため に、分析物と選択的に結合する第一の結合部位を含む表面と連絡している流路を 形成する硬質マトリックス； 結合部位：分析物複合体の形成を可能にする条件下で該流路を通って、該表面に 近い水圧のかかる全容積に分析物を含む液体サンプルを対流によって送るための 手段；該結合部位および該結合部位：分析物複合体の１つと結合し、それによっ て該標識試薬分子を該表面上に固定させる検出可能な標識試薬を該表面に近い該 容積に対流によって送るための手段；および 該表面上に固定された該標識試薬量を検出し、それによって当該サンプル中の分 析物の存在または濃度を決定することを可能にするための手段を含み、 該マトリックスの少なくとも一部分における、該表面近くの容積に対する該表面 積の比率が、少なくとも１０４ｃｍ−１である、フロースルー迅速検定装置。
2. ２．該比率が少なくとも１０４ｃｍ−１である、請求の範囲第１項の装置。
3. ３．該分析物または該標識試薬を対流によって送る該手段が、一時的に流通を停 止させ結合を強めるための手段を含む、請求の範囲第１項の装置。
4. ４．該標識試薬が該分析物と結合する場合であって、ここで、該装置がさらに、 分析物と標識試薬を予備保温し、分析物と標識試薬を結合させるための手段を含 み；さらにここで、該分析物を送るための手段および該標識試薬を送るための手 段が、結合分析物および標識試薬を一緒に対流によって送るための単一の手段か らなる、請求の範囲第１項の装置。
5. ５．検出のための該手段が、当該マトリックスから流出する液体の分析のために 搭載された分光光度計、蛍光分光計、またはイルミネッセンス検出器を含む、請 求の範囲第１項の装置。
6. ６．該標識試薬が酵素からなる場合であって、該装置がさらに酵素基質液を該マ トリックスの中を流すための手段を含み、検出のための手段が該基質の酵素反応 生成物を検出するための手段を含む、請求の範囲第１項の装置。
7. ７．該マトリックスが、内径が約４マイクロメートル未満である微小毛細管から なる、請求の範囲第１項の装置。
8. ８．該マトリックスが、該液体サンプルまたは標識試薬が流れる流路である粒子 内貫通孔および粒子間貫通孔を形成する複数の相互に接触する粒子からなる、請 求の範囲第１項の装置。
9. ９．該粒子が、互いに粘着したより小さな無孔性粒子塊からなり、かつ該表面が 該無孔性粒子の表面からなる、請求の範囲第８項の装置。
10. １０．該表面が疎水性ポリマー表面をからなる、請求の範囲第１項の装置。
11. １１．該結合蛋白が、疎水性／疎水性相互作用によって該表面に配置されている 、請求の範囲第１０項の装置。
12. １２．該表面が架橋アクリルポリマー表面からなる、請求の範囲第８項の装置。
13. １３．該アクリルポリマーがポリスチレンを含む、請求の範囲第１２項の装置。
14. １４．該ポリマーがポリスチレンジビニルベンゼンからなる、請求の範囲第１０ 項の装置。
15. １５．該マトリックスが、平均直径が約４マイクロメートル未満の粒子間貫通孔 をつくる、複数の相互に接触する無孔性粒子を含む、請求の範囲第１項の装置。
16. １６．該粒子が実質的に、平均直径が約１２マイクロメートル未満の球形の粒子 からなる、請求の範囲第１５項の装置。
17. １７．以下の工程を含む迅速な検定方法：表面に固定された結合部位：分析物複 合体を形成するために分析物と選択的に結合する、多数の第一の結合部位を有す る表面と連絡している流路をつくり、該マトリックスの少なくとも一部分内にお いて、当該表面近くの液体を充満させうる容積に対する該表面積の比率が少なく とも１０４ｃｍ−１である硬質マトリックスを装備し； 結合部位：分析物複合体を形成させるために、分析物を含む液体サンプルを該流 路を通って、該表面近くの水圧の掛かる全容積に対流によって送り； 該結合部位および該結合部位：分析物複合体の１つと結合し、それによって該標 識試薬分子を該表面上に固定する検出可能な標識試薬を該表面に近い該容積に対 流によって送り；そして該表面上に固定された該標識試薬量を検出し、それによ って該サンプル中の分析物の存在または濃度を決定する。
18. １８．該比率が少なくとも１０６ｃｍ−１である、請求の範囲第１７項の装置。
19. １９．該分析物または該標識試薬を対流によって送る該工程が、一時的に流通を 停止させ結合を強める工程を含む、請求の範囲第１７項の方法。
20. ２０．該標識試薬が該分析物と結合する場合であって、ここで、該方法がさらに 、該分析物と該標識試薬を一緒に送る該工程の前に、該分析物と該標識試薬を予 備保温し、結合を増強することを含み；そして、 該結合分析物および標識試薬が一緒に対流によって送られる、請求の範囲第１７ 項の方法。
21. ２１．標識試薬が、該マトリックスから流出する液体の分析のために搭載された 分光光度計、蛍光分光計、またはイルミネッセンス検出器の手段によって検出さ れる、請求の範囲第１７項の方法。
22. ２２．該標識試薬が酵素からなる場合であって、該方法がさらに、酵素基質液を 該マトリックスの中を流すための手段、および該基質の酵素反応生成物を検出す るための手段を装備することを含む、請求の範囲第１７項の方法。
23. ２３．該マトリックスが、内径が約４マイクロメートル未満である微小毛細管か らなる、請求の範囲第１７項の方法。
24. ２４．該マドサツクスが、該液体サンプルまたは標識試薬が流れる流路である粒 子内貫通孔および粒子間貫通孔を形成する複数の相互に接触する粒子からなる、 請求の範囲第１７項の方法。
25. ２５．該粒子が、互いに粘着したより小さな無孔性粒子塊からなり、かつ該表面 が該無孔性粒子の表面からなる、請求の範囲第１７項の方法。