ES2310853T3 - Peptidos citrulinados derivados de la fibrina reconocidos por autoanticuerpos especificos de la poliartritis reumatoide y usos de los mismos. - Google Patents
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- C07K14/75—Fibrinogen
Abstract
Péptido aislado reconocido por autoanticuerpos antiproteínas citrulinadas (AAPC) presentes en el suero de los pacientes afectados por poliartritis reumatoide (PR), caracterizado porque comprende al menos un resto citrulilo y porque se elige entre el grupo constituido por: a) un péptido definido por la secuencia X 1PAPPPISGGGYX 2AX 3 (ID SEC Nº: 1) en la que X 1, X 2 y X 3 representan cada uno un resto citrulilo o un resto arginilo y al menos uno de los restos X 2 o X 3 es un resto citrulilo; b) un péptido definido por la secuencia GPX 1VVEX 2HQSACKDS (ID SEC Nº: 2) en la que X 1 y X 2 representan cada uno un resto citrulilo o un resto arginilo y al menos uno de los restos X 1 o X 2 es un resto citrulilo; c) un péptido definido por la secuencia SGIGTLDGFX1HX2HPD (ID SEC Nº: 3) en la que X1 y X2 representan cada uno un resto citrulilo o un resto arginilo y al menos uno de los restos X 1 o X 2 es un resto citrulilo; d) un péptido definido por la secuencia VDIDIKIX1SCX2GSCS (ID SEC Nº: 4) en la que X1 y X2 representan cada uno un resto citrulilo o un resto arginilo y al menos uno de los restos X1 o X2 es un resto citrulilo; e) un péptido definido por la secuencia X1GHAKSX2PVX3GIHTS (ID SEC Nº: 12) en la que X1, X2 y X3 representan cada uno un resto citrulilo o un resto arginilo y al menos uno de los restos X1, X2 o X3 es un resto citrulilo; f) un péptido que comprende al menos 5 aminoácidos consecutivos, incluyendo al menos un resto citrulilo, de uno de los péptidos a) a e) anteriores.
Description
Péptidos citrulinados derivados de la fibrina
reconocidos por autoanticuerpos específicos de la poliartritis
reumatoide y usos de los mismos.
La presente invención se refiere a nuevos
péptidos citrulinados reconocidos por autoanticuerpos específicos
de la poliartritis reumatoide.
La poliartritis reumatoide (en lo sucesivo
abreviada como "PR") es el más frecuente de los reumatismos
inflamatorios crónicos. Se trata de una enfermedad autoinmune, y el
suero de los pacientes afectados contiene autoanticuerpos de los
que algunos son específicos y pueden constituir un marcador de esta
enfermedad, lo que permite su diagnóstico incluso en estados
precoces. Se han efectuado así investigaciones con vistas a
identificar antígenos reconocidos por estos anticuerpos, con el fin
de obtener preparaciones purificadas utilizables en técnicas
clásicas de diagnóstico inmunológico.
Se ha demostrado que autoanticuerpos específicos
de la PR reconocen diferentes variantes isoeléctricas de la
(pro)filagrina (para revisión, véase por ejemplo SERRE y
VINCENT, In: Autoantibodies, PETER and SHOENFELD Eds, Elsevier
Science Publishers, 271-276, 1996). Estos
autoanticuerpos han sido denominados por este motivo:
"autoanticuerpos antifilagrina (AAF)". La Solicitud
EP-0.511.116 describe la purificación y la
caracterización de antígenos de la familia de las filagrinas
reconocidos por estos anticuerpos y su uso en el diagnóstico de la
poliartritis reumatoide.
Posteriormente, los epítopos de filagrina
reconocidos por los AAF han sido identificados como regiones de la
molécula de filagrina portadoras de restos citrulilo, resultantes de
la transformación de restos arginilo por una peptidilarginina
desiminasa (Girbal-Neuhauser E y col., J Immunol,
162, 585-94, 1999; Schellekens GA y col., J Clin
Invest, 101, 273-81, 1998). El análisis de diversos
péptidos sintéticos derivados de la secuencia de la filagrina
humana ha demostrado que la desiminación (citrulinación) era
necesaria para la constitución de epítopos reconocidos por los AAF,
que hoy en día se denominan igualmente autoanticuerpos antiproteínas
citrulinadas (AAPC). En la exposición que se ofrece a continuación
se usará esta denominación.
Se ha observado igualmente que el entorno de los
restos citrulilo desempeñaba también un papel importante
(Girbal-Neuhauser E, 1999, citado anteriormente;
Schellekens GA, 1998, citado anteriormente; Union A y col.,
Arthritis Rheum, 46, 1185-95, 2002); se han
identificado algunos aminoácidos "permisivos" respecto de la
fijación del anticuerpo y cuya naturaleza modula probablemente la
afinidad de fijación del anticuerpo. Entre estos aminoácidos, los
restos -gly-, -ser-, -his-, -thr- y -gln-, son los que se encuentran
más a menudo en el entorno inmediato de los restos citrulilo de los
péptidos "filagrina" citrulinados que, en la actualidad, se han
identificado como portadores de epítopos reconocidos por los AAPC
(Sebbag M y col., Rev Rhum, 68, 106, 2001).
Se han obtenido péptidos citrulinados muy
numerosos reconocidos específicamente por AAPC y útiles en el
diagnóstico de la PR a partir de la filagrina. Sin embargo, se ha
observado igualmente que, aunque estrechamente específica de la PR,
la reactividad de estos diferentes péptidos citrulinados frente a
los AAPC era heterogénea, siendo péptidos diferentes reconocidos
por sueros extraídos de sujetos diferentes. Esto implica que para
obtener un reactivo de diagnóstico capaz de identificar la
presencia de AAPC en una gran población es necesario asociar varios
péptidos diferentes.
Paralelamente, se ha demostrado que los AAPC son
secretados por los plasmocitos del tejido sinovial
(Masson-Bessera C y col., Clin Exp Immunol, 119,
544-52, 2000) y son dirigidos específicamente contra
formas citrulinadas de las cadenas \alpha y \beta de fibrina
presentes en este tejido (Masson-Bessera C y col., J
Immunol, 166, 4177-84, 2001).
El documento WO 01/02.437 y Sebbag y col. (Joint
Bone Spine vol. 71, 2004, p. 493-502) divulgan el
uso de derivados citrulinados de la fibrina para el diagnóstico de
la poliartritis reumatoide. Nijenhuis y col. (Clinica Chimica Acta
vol. 350, 2004, p. 17-34) discuten las ventajas de
los péptidos citrulinados con respecto a las proteínas citrulinadas
para el diagnóstico de la poliartritis reumatoide.
Los autores de la invención han emprendido, con
el fin de caracterizar mejor los epítopos reconocidos por los AAPC,
la identificación de los presentados por las cadenas \alpha y
\beta de la fibrina. Con este fin han evaluado la reactividad de
sueros que contienen AAPC frente a péptidos sintéticos citrulinados
derivados de la secuencia de la cadena \alpha y de la secuencia
de la cadena \beta de la fibrina. Teniendo en cuenta la
heterogeneidad conocida de los perfiles de reacción de los péptidos
citrulinados extraídos de la filagrina con los AAPC, los autores de
la invención han usado mezclas de sueros elegidas de manera que
contengan AAPC que representan los diferentes perfiles de
reactividad observados en el caso de estos péptidos extraídos de la
filagrina, con el fin de detectar todos los péptidos de la fibrina
que pueden ser reconocidos por AAPC.
Los péptidos sometidos a ensayo se han obtenido
a partir de la secuencia de la cadena \alpha y de la secuencia de
la cadena \beta de la fibrina. En total, se han elegido 72
péptidos, de ellos 41 derivados de la cadena \alpha de la fibrina
y 31 derivados de su cadena \beta. Entre los 72 péptidos
citrulinados analizados, los autores de la invención han
identificado 13 péptidos derivados de la secuencia de la cadena
\alpha y 5 péptidos derivados de la de la cadena \beta de la
fibrina como reactivos significativamente con una y/u otra de las
mezclas de sueros sometidas a ensayo y así como portadores de
epítopos reconocidos por algunos de los AAPC presentes en
esta(s) mezcla(s).
Los autores de la invención han analizado a
continuación individualmente cada uno de los 18 péptidos reactivos
identificados con cada uno de los sueros constitutivos de las
mezclas sometidas a ensayo. Este análisis ha confirmado, para la
mayor parte de los péptidos sometidos a ensayo, la gran variabilidad
interindividual de especificidad de los AAPC observada
anteriormente en el caso de péptidos citrulinados derivados de la
filagrina.
Por otra parte, esto ha permitido a los autores
de la invención identificar péptidos que, de manera inesperada,
poseen un espectro de reactividad con los AAPC mucho mayor que los
comunicados hasta el presente en el caso de péptidos citrulinados
derivados de la filagrina. En efecto, los autores de la invención
han identificado 5 péptidos citrulinados (4 péptidos derivados de
la cadena \alpha y 1 derivado de la cadena \beta de la
fibrina), que son cada uno reconocidos individualmente por al menos
el 40% de los sueros analizados y parecen así portadores de
epítopos mayores. Entre estos péptidos, dos son reconocidos por la
mayoría de los sueros y presentan además perfiles de reactividad
complementarios que engloban la totalidad de los sueros analizados.
Cada uno de estos sueros reconoce en efecto a uno y/u otro de estos
péptidos. Esto sugiere que estos dos péptidos son portadores de
motivos estructurales representativos de una muy amplia mayoría de
los diferentes motivos reconocidos por los AAPC.
La presente invención tiene por objeto un
péptido aislado reconocido por autoanticuerpos antiproteínas
citrulinadas (AAPC) presentes en el suero de los pacientes
afectados de poliartritis reumatoide, caracterizado porque comprende
al menos un resto citrulilo y porque se elige en el grupo
constituido por:
a) un péptido definido por la secuencia
X_{1}PAPPPISGGGYX_{2}AX_{3} (ID SEC Nº: 1) en la que X_{1},
X_{2} y X_{3} representan cada uno un resto citrulilo o un resto
arginilo y al menos uno de los restos X_{2} o X_{3} es un resto
citrulilo;
b) un péptido definido por la secuencia
GPX_{1}VVEX_{2}HQSACKDS (ID SEC Nº: 2) en la que X_{1} y
X_{2} representan cada uno un resto citrulilo o un resto arginilo
y al menos uno de los restos X_{1} o X_{2} es un resto
citrulilo;
c) un péptido definido por la secuencia
SGIGTLDGFX_{1}HX_{2}HPD (ID SEC Nº: 3) en la que X_{1} y
X_{2} representan cada uno un resto citrulilo o un resto arginilo
y al menos uno de los restos X_{1} o X_{2} es un resto
citrulilo;
d) un péptido definido por la secuencia
VDIDIKIX_{1}SCX_{2}GSCS (ID SEC Nº: 4) en la que X_{1} y
X_{2} representan cada uno un resto citrulilo o un resto arginilo
y al menos uno de los restos X_{1} o X_{2} es un resto
citrulilo;
e) un péptido definido por la secuencia
X_{1}GHAKSX_{2}PVX_{3}GIHTS (ID SEC Nº: 12) en la que X_{1},
X_{2} y X_{3} representan cada uno un resto citrulilo o un
resto arginilo y al menos uno de los restos X_{1}, X_{2} o
X_{3} es un resto citrulilo;
f) un péptido que comprende al menos 5
aminoácidos consecutivos, preferentemente al menos 7 aminoácidos
consecutivos y ventajosamente, de 8 a 14 aminoácidos consecutivos,
incluyendo al menos un resto citrulilo, de uno de los péptidos a) a
e) anteriores.
Los péptidos según la invención tienen un tamaño
de al menos 5 aminoácidos, preferentemente un tamaño de 5 a 25
aminoácidos, y, de manera totalmente preferida, un tamaño de 10 a 20
aminoácidos.
Según una forma de realización preferida de un
péptido según la invención se elige entre:
- un péptido definido por la secuencia ID SEC
Nº: 1 en la que al menos X_{3} es un resto citrulilo, o un
péptido que comprende un fragmento de al menos 5 aminoácidos
consecutivos de dicha secuencia que contiene dicho resto
citrulilo;
- un péptido definido por la secuencia ID SEC
Nº: 2 en la que al menos X_{2} es un resto citrulilo, o un
péptido que comprende un fragmento de al menos 5 aminoácidos
consecutivos de dicha secuencia que contiene dicho resto
citrulilo;
- un péptido definido por la secuencia ID SEC
Nº: 3 en la que al menos X_{2} es un resto citrulilo, o un
péptido que comprende un fragmento de al menos 5 aminoácidos
consecutivos de dicha secuencia que contiene dicho resto
citrulilo;
- un péptido definido por la secuencia ID SEC
Nº: 4 en la que al menos X_{1} es un resto citrulilo, o un
péptido que comprende un fragmento de al menos 5 aminoácidos
consecutivos de dicha secuencia que contiene dicho resto
citrulilo;
- un péptido definido por la secuencia ID SEC
Nº: 12 en la que al menos X_{3} es un resto citrulilo, o un
péptido que comprende un fragmento de al menos 5 aminoácidos
consecutivos de dicha secuencia que contiene dicho resto
citrulilo.
De manera particularmente preferida, un péptido
según la invención se elige entre:
- un péptido definido por la secuencia ID SEC
Nº: 1 en la que X_{1}, X_{2} y X_{3} son restos citrulilo, o
un péptido de al menos 16 aminoácidos que comprende dicha
secuencia;
- un péptido definido por la secuencia ID SEC
Nº: 2 en la que X_{1} y X_{2} son restos citrulilo, o un
péptido que comprende un fragmento de al menos 5 aminoácidos
consecutivos de dicha secuencia que contiene dichos restos
citrulilo;
- un péptido definido por la secuencia ID SEC
Nº: 3 en la que X_{1} y X_{2} son restos citrulilo, o un
péptido que comprende un fragmento de al menos 5 aminoácidos
consecutivos de dicha secuencia que contiene dichos restos
citrulilo;
- un péptido definido por la secuencia ID SEC
Nº: 4 en la que X_{1} y X_{2} son restos citrulilo, o un
péptido que comprende un fragmento de al menos 5 aminoácidos
consecutivos de dicha secuencia que contiene dichos restos
citrulilo;
- un péptido definido por la secuencia ID SEC
Nº: 12 en la que X_{1}, X_{2} y X_{3} son restos citrulilo, o
un péptido que comprende un fragmento de al menos 10 aminoácidos
consecutivos de dicha secuencia que contiene dichos restos
citrulilo.
\vskip1.000000\baselineskip
Pueden obtenerse péptidos citrulinados conformes
a la invención, por ejemplo, a partir de fragmentos de fibrina o de
fibrinógeno naturales, recombinantes, o de síntesis, por la acción
de la peptidil-arginina-deiminasa
(PAD); pueden obtenerse igualmente por síntesis peptídica,
incorporando directamente uno o varios restos citrulina en el
péptido sintetizado.
Los péptidos citrulinados conformes a la
invención engloban igualmente derivados de los péptidos ID SEC Nº:
1 a 4 y 12 o fragmentos de éstos, definidos anteriormente, llevando
dichos derivados modificaciones destinadas a mejorar su
reconocimiento por los AAPC: a modo de ejemplos de tales derivados,
se citarán: péptidos ciclados; péptidos de tipo retro, en los que
se encadenan L-aminoácidos según una secuencia
inversa a la del péptido a reproducir; péptidos de tipo
retro-inverso, constituidos por aminoácidos de la
serie D (en lugar de aminoácidos de la serie L de péptidos
naturales) encadenados según una secuencia inversa a la del péptido
a reproducir.
Muy ventajosamente, se trata de péptidos en los
que la función carboxilo (COOH) terminal se sustituye por una
función carboxamida (CONH_{2}). En este marco, son péptidos
particularmente preferidos aquellos en los que el resto
C-terminal es un resto citrulilo cuya función
carboxilo se sustituye por una función carboxamida.
La presente invención tiene igualmente por
objeto todo péptido reconocido por los AAPC presentes en el suero
de los pacientes afectados por poliartritis reumatoide y que
contienen en su extremo C-terminal un resto
citrulilo cuya función carboxilo se sustituye por una función
carboxamida. Ventajosamente, dicho péptido contiene en su secuencia
al menos otro resto citrulilo. Preferentemente, dicho péptido
comprende de 5 a 25 aminoácidos.
La sustitución de la función carboxilo del resto
citrulina C-terminal por una función carboxamida
puede permitir aumentar la reactividad del péptido con los AAPC, o,
llegado el caso, convertir en reactivos con los AAPC péptidos que
no lo son naturalmente.
Los péptidos citrulinados conformes a la
invención engloban igualmente derivados de los péptidos ID SEC Nº:
1 a 4 y 12 o de fragmentos de éstos, como los definidos
anteriormente, llevando dichos derivados modificaciones destinadas
a facilitar su síntesis y/o a mejorar su estabilidad. A modo de
ejemplo de dichos derivados, se citarán los péptidos que incluyen
aminoácidos cuyos grupos carboxilo están esterificados o
transformados en grupos amida y/o aminoácidos cuyo grupo aminado
está alquilado, por ejemplo metilado o acetilado. Los grupos amina
y carboxilo de los péptidos pueden estar presentes en forma de la
sal correspondiente a la base o al ácido.
A partir de los péptidos citrulinados descritos
anteriormente es también posible obtener péptidos mimotopos que
comprenden al menos un resto citrulilo (péptido mimotopo
citrulinado).
Estos péptidos mimotopos pueden obtenerse
cribando bancos de péptidos citrulinados cuyas secuencias se definen
a partir de las de los péptidos ID SEC Nº 1, 2, 3, 4, 12 de la
presente invención, usados en este marco como "péptidos
modelo".
Preferentemente, estos bancos de péptidos se
realizan mediante síntesis de diferentes péptidos de tamaño
comprendido entre 10 y 20, preferentemente entre 12 y 17
aminoácidos, en particular 15 aminoácidos. Cada uno de estos
péptidos conserva al menos 2, preferentemente al menos 4,
ventajosamente al menos 6, de manera particularmente preferida al
menos 8 y muy ventajosamente al menos 10 aminoácidos, incluyendo al
menos un resto citrulilo, de la secuencia del péptido modelo
elegido en las mismas posiciones que en dicho péptido modelo, siendo
las otras posiciones variables.
Estos bancos pueden cribarse ventajosamente como
se describe en los ejemplos mostrados a continuación y sobre todo
con ayuda de sueros representativos de diferentes perfiles de
reactividad de AAPC, como los definidos en el Ejemplo 1 a
continuación.
\newpage
Los procedimientos de síntesis de péptidos
mimotopos son bien conocidos de por sí. Se hará referencia, por
ejemplo, al capítulo 6 de "Chemical approaches to the synthesis of
peptides and proteins", Paul Lloyd-Williams,
Fernando Albericio and Ernest Giralt, CRC Press New York, 1997,
"Peptides libraries", páginas 237-270.
Estos péptidos mimotopos citrulinados pueden
usarse, solos o en combinación con otros péptidos citrulinados, y
preferentemente en combinación con al menos uno de los otros
péptidos de la invención, en una prueba de diagnóstico de la PR
para reconocer los AAPC.
La presente invención tiene igualmente por
objeto el uso de los péptidos según la invención, como los definidos
anteriormente, para detectar la presencia de AAPC en una muestra
biológica, en el marco del diagnóstico in vitro de la
PR.
La presente invención tiene así por objeto
composiciones antigénicas, útiles para detectar la presencia de
AAPC en una muestra biológica en el marco del diagnóstico in
vitro de la PR, composiciones que se caracterizan porque
comprenden al menos un péptido según la invención.
Las composiciones según la invención pueden
asociar entre sí diferentes péptidos elegidos entre los péptidos
según la invención, o bien pueden asociar uno o varios péptidos
según la invención con uno o varios péptidos citrulinados derivados
sobre todo de la filagrina.
Según una forma de realización preferida de una
composición antigénica según la invención, ésta comprende al menos
un péptido de secuencia ID SEC Nº: 1 y al menos un péptido de
secuencia ID SEC Nº: 2, como se definen anteriormente.
Esta composición posee un espectro de
reactividad muy grande y puede permitir además detectar la PR en un
estado precoz.
Ventajosamente, una composición según la
invención puede comprender además un péptido de secuencia ID SEC
Nº: 3 y/o un péptido de secuencia ID SEC Nº: 4 y/o un péptido de
secuencia ID SEC Nº: 12, como los definidos anteriormente.
Las composiciones según la invención pueden,
llegado el caso, presentarse en forma de composiciones
multipeptídicas, en las que los péptidos constitutivos se asocian
entre sí o a una molécula portadora generalmente por unión
covalente. A modo de ejemplo, se citarán los multipéptidos
antigénicos (MAP, por "multiple antigen peptides"
descritos sobre todo por TAM (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85,
5409-13, 1988)).
La presente invención tiene igualmente por
objeto un procedimiento de detección de la presencia de AAPC en una
muestra biológica, en el marco del diagnóstico in vitro de la
PR, procedimiento que se caracteriza porque comprende:
- la puesta en contacto de dicha muestra
biológica con al menos un péptido o una composición antigénica según
la invención, según se define anteriormente, en condiciones que
permiten la formación de un complejo antígeno/anticuerpo con los
AAPC eventualmente presentes en dicha muestra;
- la detección, por todos los medios apropiados,
del complejo antígeno/anticuerpo eventualmente formado.
Este procedimiento de detección puede ponerse en
práctica gracias a un conjunto que comprende al menos un péptido o
una composición antigénica según la invención, y, llegado el caso,
tampones y reactivos apropiados para la constitución de un medio de
reacción que permita la formación de un complejo antígeno/anticuerpo
y/o de medios de detección de dicho complejo
antígeno/anticuerpo.
Ventajosamente, dicho conjunto comprende un
péptido o una composición antigénica según la invención,
inmovilizado en un soporte sólido. A modo de ejemplos no
limitativos de soportes sólidos utilizables, se citarán placas de
microvaloración, conos del aparato VIDAS® (comercializado por
BIOMERIEUX), bolas, microbolas o micropartículas, cintas, etc.
Dicho conjunto puede comprender igualmente
muestras de referencia, como uno o varios sueros negativos y uno o
varios sueros positivos.
La presente invención tiene también por objeto
un procedimiento de detección de la presencia de AAPC en una
muestra biológica, en el marco del diagnóstico in vitro de la
PR, procedimiento que se caracteriza porque comprende:
- el suministro de un primer péptido citrulinado
capaz de entrar en competencia para la unión a dichos AAPC con un
péptido según la invención, como el definido anteriormente;
- la puesta en contacto de dicho primer péptido
con dicha muestra biológica, en condiciones que permiten la
formación de un complejo antígeno/anticuerpo con los AAPC
eventualmente presentes en dicha muestra;
- la detección, por todos los medios apropiados,
del complejo antígeno/anticuerpo eventualmente formado.
En particular, el primer péptido citrulinado
capaz de entrar en competencia con un péptido según la invención es
un péptido mimotopo citrulinado que puede obtenerse como se describe
anteriormente.
La presente invención se comprenderá mejor con
ayuda del complemento de descripción que se ofrecerá a continuación,
que se refiere a ejemplos que ilustran la identificación de los
péptidos según la invención y la puesta de manifiesto de su perfil
de reactividad frente a los AAPC.
Ejemplo
1
Se han usado 90 sueros, que presentan AAPC
detectables a la vez mediante ELISA y mediante inmunotransferencia
en fibrinógeno humano desiminado in vitro
(Masson-Bessera C, 2001, citado anteriormente;
Nogueira L y col., Arthritis Res, 4, 90, 2002) pero también por
inmunofluorescencia indirecta en criocortes de esófago de rata
(Vincent C y col., Ann Rheum Dis, 48, 712-22, 1989)
y por inmunotransferencia en filagrina epidérmica humana (Vincent C
y col., J Rheumatol, 25, 838-46, 1998). La
reactividad de estos 90 sueros multipositivos se ha analizado en
ELISA con respecto a 5 péptidos citrulinados diferentes cuya
reactividad frente a AAPC se había establecido previamente. Estos
péptidos son los siguientes:
| E12D | ESSRDGSXHPRSHD | (ID SEC Nº: 5) |
| T12E | TGSSTGGXQGSHHE | (ID SEC Nº: 6) |
| E12H | EQSADSSXHSGSGH | (ID SEC Nº: 7) |
| cfc6 | SHQESTXGXSRGRSGRSGS | (ID SEC Nº: 8) |
| cf48-65-4 | TIHAHPGSXXGGRHGYHH | (ID SEC Nº: 9) |
| (X designa un resto citrulilo). |
Los péptidos E12D, T12E y E12H han sido
descritos por Girbal-Neuhauser, E. y col. (1999).
Los péptidos cfc6 y cf48-65-4 han
sido descritos por Schellekens, G. y col. (1998).
El análisis por ELISA se ha efectuado según el
protocolo descrito por Girbal-Neuhauser, E. y col.
(1999)
Este análisis ha permitido identificar 12
perfiles de reactividad con respecto a los 5 péptidos.
Estos perfiles se resumen en la Tabla I a
continuación.
Para que sean lo más representativas posible de
los diferentes perfiles de reactividad de AAPC, las mezclas,
denominadas en lo sucesivo mezclas: "A" y "B", se han
constituido cada una mediante mezcla a partes iguales de 10 sueros
que representan diferentes perfiles de reactividad en péptidos
"filagrina".
La composición de estas dos mezclas se indica en
la Tabla II a continuación.
Estas dos mezclas A y B son así representativas
de la heterogeneidad de especificidad de los sueros AAPC+.
Ejemplo
2
Los péptidos sometidos a ensayo se han obtenido
a partir de la secuencia de la cadena \alpha y de la secuencia
de la cadena \beta de la fibrina [parte correspondiente
respectivamente a los restos 36-635 y
45-491 de las cadenas A(\alpha) (referencia
NP Acceso: NP_068657) y B(\beta) (referencia SWISSPROT
FIBB_HUMAN Prim. Acceso: P02675) del fibrinógeno]. Las secuencias
de los restos 1 a 635 y 1 a 491 de las cadenas A(\alpha) y
B(\beta) del fibrinógeno se representan igualmente
respectivamente en la lista de secuencias en anexo en los números
ID SEC Nº: 10 y ID SEC Nº: 11 y en la fig. 1A y B. Las secuencias
indicadas en negrita en la fig. 1 son las de las secuencias de
señal de proteínas seguidas de las de sus fibrinopéptidos (A y B,
respectivamente).
Cada cadena \alpha o \beta de fibrina se ha
segmentado en secuencias contiguas de 15 aminoácidos y se han
elegido todos los péptidos que comprenden al menos un resto
arginilo. En el caso de los péptidos en los cuales el resto
arginilo se situaba en el extremo NH_{2}- o
COOH-terminal, se ha elegido una segunda serie de
péptidos de 15 aminoácidos, encabalgándose con los primeros, de
forma que se recentra el resto arginilo terminal en la secuencia.
Además, se ha sintetizado un péptido correspondiente a los restos
621-629 de la cadena \alpha de la fibrina. En
total, se han elegido 72 péptidos, de ellos 41 derivados de la
cadena \alpha de la fibrina y 31 derivados de su cadena \beta.
Para cada uno de los péptidos, la forma con resto(s) arginilo
(forma nativa) y la forma en la que todos los restos arginilo se
han sustituido por restos citrulilo (forma citrulinada) se han
sintetizado según el procedimiento en fase sólida de Merrifield con
una pureza \geq 60% [Société NeoMPS (Estrasburgo, Francia)].
La lista de los péptidos citrulinados elegidos
se da en la Tabla III a continuación:
La nomenclatura usada es la siguiente: nombre de
origen de la cadena polipeptídica (\alpha o \beta) del
fibrinógeno del que se deriva la secuencia, después posición en esta
secuencia del resto amino-terminal del péptido -
posición del resto carboxi-terminal del péptido.
Estas posiciones están numeradas con respecto al extremo
N-terminal del fibrinógeno. La mención Cit indica
que se trata de una forma citrulinada del péptido. La posición del
resto arginilo que se sustituye por un resto citrulilo se indica en
índice. Sólo se presentan las formas citrulinadas de los
péptidos.
Cada par de péptidos (citrulinado y no
citrulinado) se ha sometido a ensayo en ELISA con una mezcla a
partes iguales de 10 sueros que no presentan AAPC (mezcla de
control) y con las 2 mezclas A y B descritas en el Ejemplo 1.
Los péptidos se han sometido a ensayo después de
recubrimiento de placas de poliestireno irradiado (Nunc Maxisorp)
en tres tampones diferentes (acetato pH 5,0, PBS pH 7,4 y carbonato
pH 9,0), de manera que se optimicen las posibilidades de fijación
pasiva de los péptidos (10 \mug/ml) que presentaban puntos
isoeléctricos muy heterogéneos (que se extienden de 4 a 12 para las
formas no citrulinadas). Cada par de péptidos (forma nativa y
citrulinada) se ha sometido a ensayo en la misma placa y un par de
péptidos de control -péptido "filagrina" citrulinado cfc6 y su
correspondiente nativo cf0 (Schellekens GA, 1998, citado
anteriormente)- se ha incluido durante cada experimentación, lo que
ha permitido calcular un coeficiente de variación interensayos y
efectuar las correcciones.
Después de saturación en PBS-BSA
al 2%, se han incubado las mezclas de sueros diluidos al 1/50 en PBS
2 NaCl - BSA al 2% y después se ha revelado su fijación con IgG de
cabra anti-IgG humana marcada con peroxidasa
(Southern) diluidas al 1/1.000 en PBS BSA al 2%. Todas las
incubaciones han tenido lugar durante 1 h a 4ºC y han ido seguidas
seguido de lavados en PBS-Tween al 0,1%. La
actividad de la peroxidasa se ha revelado mediante una solución de
ortofenilendiamina (2 mg/ml - Sigma) en peróxido de hidrógeno (0,03%
- Sigma). La reacción se ha interrumpido después 5 minutos con
ácido sulfúrico 4 M y se ha medido la densidad óptica (DO) a 492 nm
gracias a un espectrofotómetro automático (Multiskan, Thermo
Labsystems).
La reactividad específica de las mezclas de
sueros con respecto a los péptidos citrulinados correspondía a la
diferencia entre la DO obtenida con el péptido citrulinado y la
obtenida con el péptido nativo correspondiente (delta DO). Los
resultados corresponden a la media de 2 determinaciones. Todo
péptido citrulinado que permite obtener una delta DO superior a
0,250 para al menos una de las dos mezclas A y B después de
recubrimiento en al menos uno de los tres tampones, se ha
considerado como reactivo.
Entre los 72 péptidos citrulinados analizados,
13 péptidos derivados de la secuencia de la cadena \alpha de la
fibrina y 5 péptidos derivados de la de la cadena \beta se han
revelado como portadores de epítopos reconocidos por los AAPC.
Entre estos péptidos, 6 péptidos eran muy reactivos (delta DO \geq
1,5), 8 péptidos lo eran de manera media (0,5 \leq delta DO <
1,5) y 4 péptidos lo eran poco (0,25 \leq delta DO < 0,5). Los
otros péptidos citrulinados han revelado ser poco o nada reactivos
(0,0 \leq delta DO < 0,25). No se ha observado ninguna
reactividad con la mezcla de control, lo que permite identificar los
péptidos reactivos como portadores de epítopo(s)
reconocido(s) por los AAPC.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\newpage
Los resultados obtenidos para los 18 péptidos
reactivos se presentan en la Tabla IV a continuación:
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Los 14 péptidos portadores de los epítopos más
reactivos (delta DO \geq 0,5 para una u otra de las mezclas de
suero (A y B) con al menos uno de los tres tampones de
recubrimiento) se han sometido a ensayo independientemente con los
20 sueros constitutivos de las mezclas A y B, con el fin de evaluar
el perfil de reactividad de cada uno de estos péptidos. Las pruebas
se han efectuado en ELISA en las mismas condiciones que en el
Ejemplo 2 anterior, salvo que, para cada par de péptidos, se ha
elegido como tampón de recubrimiento el que haya permitido obtener
la más alta reactividad frente a este péptido durante el cribado (el
tampón en el que la suma de las delta DO obtenidas respectivamente
para las mezclas A y B de sueros era máxima). Además, las diluciones
de los sueros se han ajustado de tal manera que tengan una avidez
equivalente para el fibrinógeno desiminado entero. Así, para cada
suero, se ha elegido la dilución que permite obtener una DO de 1 en
ELISA en el fibrinógeno desiminado (Nogueira L, 2002, citado
anteriormente). Las diluciones se escalonaron del 1/20 al
1/2700.
Los resultados se ilustran en la Tabla V a
continuación.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\newpage
Ejemplo
4
Se han recubierto placas ELISA con el péptido
\beta60-74Cit_{60,72,74} cuya función
C-terminal del resto citrulilo
carboxi-terminal no está amidada (forma que lleva
una función COOH terminal, en lo sucesivo designada como "forma
no amidada"), con el péptido
\beta60-74Cit_{60,72,74} cuya función
C-terminal del resto citrulilo
carboxi-terminal está amidada (forma que lleva una
función CONH_{2} terminal, en lo sucesivo designada como "forma
amidada") y el péptido no citrulinado
\beta60-74 (cuya función
C-terminal del resto arginilo
carboxi-terminal no está amidada), todos diluidos
en PBS. Las mezclas A y B de sueros descritos en el ejemplo 1 se han
sometido a ensayo según el procedimiento descrito en el ejemplo 2.
Como en el ejemplo 2, la reactividad específica del péptido en
forma no amidada o en forma amidada correspondía a la diferencia
entre la DO obtenida con estos dos péptidos citrulinados y la
obtenida con el péptido no citrulinado \beta60-74.
La reactividad de la forma amidada del péptido parece claramente
más intensa que la de la forma no amidada que era, sin embargo,
significativa. Los resultados corresponden a la media de dos
experimentos, cada uno de los cuales comprende dos determinaciones.
Los resultados se presentan en la Tabla VI a continuación.
\vskip1.000000\baselineskip
Esta lista de referencias citadas por el
solicitante pretende únicamente ayudar al lector y no forma parte
del documento de patente europeo. Aun cuando se ha puesto el mayor
esmero en su elaboración, no pueden excluirse errores u omisiones y
la EPO declina toda responsabilidad a este respecto.
\bullet
EP-0.511.116-A [0003]
\bullet
WO-0.102.437-A [0008]
\bullet FR-0.411.782
[0062]
\bullet FR-0.413.711
[0062]
\bullet FR-0.508.422
[0062].
\bulletSERRE; VINCENT. Autoantibodies.
Elsevier Science Publishers, 1996, 271-276
[0003]
\bulletGIRBAL-NEUHAUSER E y col. J Immunol,
1999, vol. 162, 585-94 [0004]
\bulletSCHELLEKENS GA y col. J Clin
Invest, 1998, vol. 101, 273-81 [0004]
\bulletUNION A y col. Arthritis
Rheum, 2002, vol. 46, 1185-95 [0005]
\bulletSEBBAG M y col. Rev
Rhum, 2001, vol. 68, 106 [0005]
\bulletMASSON-BESSERA
C y col. Clin Exp Immunol, 2000, vol. 119,
544-52 [0007]
\bulletMASSON-BESSERA
C y col. J Immunol, 2001, vol. 166,
4177-84 [0007]
\bulletSEBBAG y col. Joint Bone
Spine, 2004, vol. 71, 493-502 [0008]
\bulletNIJENHUIS y col. Clinica
Chimica Acta, 2004, vol. 350, 17-34
[0008]
\bullet Chemical approaches to the synthesis
of peptides and proteins. PAUL
LLOYD-WILLIAMS; FERNANDO ALBERICIO;
ERNEST GIRALT. Peptides libraries. CRC Press, 1997,
237-270 [0027]
\bulletTAM. Proc. Natl. Acad.
Sci. U.S.A., 1988, vol. 85, 5409-13
[0035]
\bulletNOGUEIRA L y col. Arthritis
Res, 2002, vol. 4, 90 [0041]
\bulletVINCENT C y col. Ann Rheum
Dis, 1989, vol. 48, 712-22 [0041]
\bulletVINCENT C y col. J
Rheumatol, 1998, vol. 25, 838-46
[0041].
<110> BIOMERIEUX
\hskip1cmSERRE, Guy
\hskip1cmSEBBAG, Mireille
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Péptidos citrulinados derivados de
la fibrina reconocidos por autoanticuerpos específicos de la
poliartritis reumatoide y usos de los mismos.
\vskip0.400000\baselineskip
<130> MJPbv-F1067/2
\vskip0.400000\baselineskip
<150> FR 0411782
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
04-11-2004
\vskip0.400000\baselineskip
<150> FR 0413711
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
22-12-2004
\vskip0.400000\baselineskip
<150> FR 0508422
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
08-08-2005
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.3
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
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<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido citrulinado
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> X = resto citrulilo o arginilo
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (13) .. (13)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> X = resto citrulilo o arginilo
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (15)..(15)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> X = resto citrulilo o arginilo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido citrulinado
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3)..(3)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> X = resto citrulilo o arginilo
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (7) .. (7)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> X = resto citrulilo o arginilo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido citrulinado
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (10)..(10)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> X = resto citrulilo o arginilo
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (12)..(12)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> X = resto citrulilo o arginilo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido citrulinado
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (8) .. (8)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> X = resto citrulilo o arginilo
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (11)..(11)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> X = resto citrulilo o arginilo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido citrulinado
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (8)..(8)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> X = resto citrulilo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido citrulinado
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (8)..(8)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> X = resto citrulilo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido citrulinado
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (8) .. (8)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> X = resto citrulilo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido citrulinado
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (7)..(7)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> X = resto citrulilo
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (9) .. (9)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> X = resto citrulilo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
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<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido citrulinado
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (9)..(10)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> X = resto citrulilo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 635
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 491
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\hskip1cm
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido citrulinado
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) .. (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> X = resto citrulilo o arginilo
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (7) .. (7)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> X = resto citrulilo o arginilo
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (10) .. (10)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> X = resto citrulilo o arginilo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (10)
1. Péptido aislado reconocido por
autoanticuerpos antiproteínas citrulinadas (AAPC) presentes en el
suero de los pacientes afectados por poliartritis reumatoide (PR),
caracterizado porque comprende al menos un resto citrulilo y
porque se elige entre el grupo constituido por:
- a)
- un péptido definido por la secuencia X_{1}PAPPPISGGGYX_{2}AX_{3} (ID SEC Nº: 1) en la que X_{1}, X_{2} y X_{3} representan cada uno un resto citrulilo o un resto arginilo y al menos uno de los restos X_{2} o X_{3} es un resto citrulilo;
- b)
- un péptido definido por la secuencia GPX_{1}VVEX_{2}HQSACKDS (ID SEC Nº: 2) en la que X_{1} y X_{2} representan cada uno un resto citrulilo o un resto arginilo y al menos uno de los restos X_{1} o X_{2} es un resto citrulilo;
- c)
- un péptido definido por la secuencia SGIGTLDGFX_{1}HX_{2}HPD (ID SEC Nº: 3) en la que X_{1} y X_{2} representan cada uno un resto citrulilo o un resto arginilo y al menos uno de los restos X_{1} o X_{2} es un resto citrulilo;
- d)
- un péptido definido por la secuencia VDIDIKIX_{1}SCX_{2}GSCS (ID SEC Nº: 4) en la que X_{1} y X_{2} representan cada uno un resto citrulilo o un resto arginilo y al menos uno de los restos X_{1} o X_{2} es un resto citrulilo;
- e)
- un péptido definido por la secuencia X_{1}GHAKSX_{2}PVX_{3}GIHTS (ID SEC Nº: 12) en la que X_{1}, X_{2} y X_{3} representan cada uno un resto citrulilo o un resto arginilo y al menos uno de los restos X_{1}, X_{2} o X_{3} es un resto citrulilo;
- f)
- un péptido que comprende al menos 5 aminoácidos consecutivos, incluyendo al menos un resto citrulilo, de uno de los péptidos a) a e) anteriores.
2. Péptido según la reivindicación 1,
caracterizado porque se elige entre el
grupo constituido por:
- -
- un péptido definido por la secuencia ID SEC Nº: 1 en la que al menos X_{3} es un resto citrulilo, o un péptido que comprende un fragmento de al menos 5 aminoácidos consecutivos de dicha secuencia que contiene dicho resto citrulilo;
- -
- un péptido definido por la secuencia ID SEC Nº: 2 en la que al menos X_{2} es un resto citrulilo, o un péptido que comprende un fragmento de al menos 5 aminoácidos consecutivos de dicha secuencia que contiene dicho resto citrulilo;
- -
- un péptido definido por la secuencia ID SEC Nº: 3 en la que al menos X_{2} es un resto citrulilo, o un péptido que comprende un fragmento de al menos 5 aminoácidos consecutivos de dicha secuencia que contiene dicho resto citrulilo;
- -
- un péptido definido por la secuencia ID SEC Nº: 4 en la que al menos X_{1} es un resto citrulilo, o un péptido que comprende un fragmento de al menos 5 aminoácidos consecutivos de dicha secuencia que contiene dicho resto citrulilo;
- -
- un péptido definido por la secuencia ID SEC Nº: 12 en la que al menos X_{3} es un resto citrulilo, o un péptido que comprende un fragmento de al menos 5 aminoácidos consecutivos de dicha secuencia que contiene dicho resto citrulilo.
3. Péptido según la reivindicación 2,
caracterizado porque se elige entre el
grupo constituido por:
- -
- un péptido definido por la secuencia ID SEC Nº: 1 en la que X_{1}, X_{2} y X_{3} son restos citrulilo, o un péptido de al menos 16 aminoácidos que comprende dicha secuencia;
- -
- un péptido definido por la secuencia ID SEC Nº: 2 en la que X_{1} y X_{2} son restos citrulilo, o un péptido que comprende un fragmento de al menos 5 aminoácidos consecutivos de dicha secuencia que contiene dichos restos citrulilo;
- -
- un péptido definido por la secuencia ID SEC Nº: 3 en la que X_{1} y X_{2} son restos citrulilo, o un péptido que comprende un fragmento de al menos 5 aminoácidos consecutivos de dicha secuencia que contiene dichos restos citrulilo;
- -
- un péptido definido por la secuencia ID SEC Nº: 4 en la que X_{1} y X_{2} son restos citrulilo, o un péptido que comprende un fragmento de al menos 5 aminoácidos consecutivos de dicha secuencia que contiene dichos restos citrulilo;
- -
- un péptido definido por la secuencia ID SEC Nº: 12 en la que X_{1}, X_{2} y X_{3} son restos citrulilo, o un péptido que comprende un fragmento de al menos 10 aminoácidos consecutivos de dicha secuencia que contiene dichos restos citrulilo.
4. Péptido según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que la función carboxilo (COOH)
terminal se sustituye por una función carboxamida (CONH_{2}).
5. Uso de un péptido según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4 para detectar la presencia de AAPC
específicos de la PR en una muestra biológica.
6. Composición antigénica, caracterizada
porque comprende al menos un péptido según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4.
7. Composición antigénica según la
reivindicación 6, caracterizada porque comprende un péptido
de secuencia ID SEC Nº: 1 y un péptido de secuencia ID SEC Nº: 2
según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
8. Composición antigénica según una cualquiera
de las reivindicaciones 6 ó 7, caracterizada porque comprende
un péptido de secuencia ID SEC Nº: 3 y/o un péptido de secuencia ID
SEC Nº: 4 y/o un péptido de secuencia ID SEC Nº: 12, según una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
9. Procedimiento de detección de la presencia de
AAPC en una muestra biológica, procedimiento que se
caracteriza porque comprende:
- -
- la puesta en contacto de dicha muestra biológica con al menos un péptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o una composición antigénica según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, en condiciones que permiten la formación de un complejo antígeno/anticuerpo con los AAPC eventualmente presentes en dicha muestra;
- -
- la detección, por todos los medios apropiados, del complejo antígeno/anticuerpo eventualmente formado.
10. Procedimiento de detección de la presencia
de AAPC en una muestra biológica, procedimiento que se
caracteriza porque comprende:
- -
- el suministro de un primer péptido citrulinado capaz de entrar en competencia para la unión a dichos AAPC con un péptido como el definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4;
- -
- la puesta en contacto de dicho primer péptido con dicha muestra biológica en condiciones que permiten la formación de un complejo antígeno/anticuerpo con los AAPC eventualmente presentes en dicha muestra;
- -
- la detección, por todos los medios apropiados, del complejo antígeno/anticuerpo eventualmente formado.
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