CN102959397A - 电化学检测结合反应的方法 - Google Patents

电化学检测结合反应的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN102959397A
CN102959397A CN2011800256012A CN201180025601A CN102959397A CN 102959397 A CN102959397 A CN 102959397A CN 2011800256012 A CN2011800256012 A CN 2011800256012A CN 201180025601 A CN201180025601 A CN 201180025601A CN 102959397 A CN102959397 A CN 102959397A
Authority
CN
China
Prior art keywords
antibody
redox
analyte
ferrocene
mark
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN2011800256012A
Other languages
English (en)
Other versions
CN102959397B (zh
Inventor
J·埃特林格
N·加约维奇-艾歇尔曼
B·米歇尔
G·沙尔特
J·申克
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV
Original Assignee
Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV filed Critical Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV
Publication of CN102959397A publication Critical patent/CN102959397A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN102959397B publication Critical patent/CN102959397B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/28—Electrolytic cell components
    • G01N27/30—Electrodes, e.g. test electrodes; Half-cells
    • G01N27/327—Biochemical electrodes, e.g. electrical or mechanical details for in vitro measurements
    • G01N27/3275—Sensing specific biomolecules, e.g. nucleic acid strands, based on an electrode surface reaction
    • G01N27/3277—Sensing specific biomolecules, e.g. nucleic acid strands, based on an electrode surface reaction being a redox reaction, e.g. detection by cyclic voltammetry
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/536—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase
    • G01N33/542—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase with steric inhibition or signal modification, e.g. fluorescent quenching
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54306—Solid-phase reaction mechanisms
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
    • G01N33/54373—Apparatus specially adapted for solid-phase testing involving physiochemical end-point determination, e.g. wave-guides, FETS, gratings
    • G01N33/5438—Electrodes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
    • G01N33/743—Steroid hormones

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Electrochemistry (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Abstract

本发明涉及一种在溶液中用高度灵敏的电化学检测进行均相免疫测定形式的方法，其特征在于将作为试剂的两种不同的结合物与样品或样品/缓冲液混合物组合，其中一种结合物包含氧化还原标志物和分析物分子，而另一种结合物包含抗氧化还原标志物抗体或其特异性结合片段以及特异性结合所述分析物的分子。所述方法适用于诊断中不含洗涤且不含分离的免疫测定，特别适用于自动化及微流体免疫测定。所述方法还适用于廉价的免疫测定系统和一次性测试条。

Description

电化学检测结合反应的方法
本发明涉及一种直接且高灵敏度的电化学检测溶液中的抗体-抗原结合反应和其他生物化学相互作用的方法。所述方法适用于诊断中不含洗涤且不含分离的免疫测定，特别适用于自动化及微流体免疫测定。所述方法还适用于廉价的免疫测定系统和一次性使用的测试条。
免疫测定使用抗原-抗体反应以特异性检测复杂介质如血液、血清、尿或食品中最小浓度的分析物。几十年来，免疫测定已成为临床诊断、环境分析和食品分析中不可缺少的工具，用于检测最小浓度的激素、代谢物、蛋白质、生物标记、毒素、杀虫剂、病原菌和病毒。许多最重要的临床-诊断分析物仅用免疫测定可廉价且快速地测量，因为没有提供高灵敏度(检测纳摩尔或更低浓度)和高特异性(在具有化学相似结构的干扰物质的存在下检测分析物)的相当组合的备选分析化学方法。备选方法如色谱法(例如HPLC、气相色谱法)常需要多步样品制备，例如通过提取和化学衍生化进行制备。
自50年前Rosalyn Yalow和Salomon Berson发明免疫测定以来，已开发了许多不同的实施方案，被称为不同的免疫测定形式(format)。异相形式如ELISA(酶联免疫吸附测定)与均相形式之间的根本区别建立在用于检测的抗体的聚集状态的基础上：在异相测定中，将抗体(较少见的是抗原)固定在表面(反应管、微量滴定板、测试条)上；所有反应步骤(如洗涤和分离步骤，如检测)同样在该表面上进行。在均相形式中，不将任何结合配偶体(binding partner)固定，无需洗涤和分离步骤，并且检测同样在溶液中进行。
区分的另一可能性来自使用的检测方法。因为不可能使得抗体-抗原结合反应直接可见，所以结合配偶体之一必须与分子标志物(marker)或“标记(label)”化学偶联(例外：基于表面等离子体共振的质量敏感型生物传感器、光栅耦合器、石英晶体微天平、表面声波以及实时直接测量分子结合反应的相似技术(如果结合配偶体之一固定在敏感表面上)。然而，这些方法迄今仅用于研究应用而不是常规分析中)。合适的标记必须具有高“比活度”，即每个标记分子必须产生尽可能多的信号传导事件。最常用的标记包括放射性同位素(放射免疫测定，“RIA”)、荧光染料(荧光素、罗丹明等)、荧光半导体纳米颗粒(“量子点”)、聚合物纳米颗粒(“胶乳珠”，团聚免疫测定)以及酶如过氧化物酶，连同比色、荧光或化学发光酶底物(ELISA)。放射性同位素具有最高的比活度，甚至允许检测单个标记分子。由于来自放射性的健康危害，相关的高实验室要求(“同位素实验室”)和高成本的残余物处置，因此放射性免疫测定逐渐被备选方法如ELISA代替。
不同免疫测定之间的另一区别由使用的抗体类型所致。抗体为具有复杂结构的蛋白质，其具有决定结构并在所有抗体类别中具有相似组成的恒定区以及形成抗原结合位点的高度可变区。最初使用的包含多种具有可变的特异性和亲和力的抗体的多克隆血清在许多应用中被单克隆抗体代替，所述单克隆抗体确切地仅包含一种具有明确定义的特异性和亲和力的抗体实体(“克隆”)。理论上，可以制备任意量的具有相同性质的单克隆抗体。此外，可以通过酶消化从完整抗体制备的所谓的抗体片段也用于一些分析。单链抗体是可以通过遗传工程方法制备的重组抗体片段。原则上，所有类型的抗体以及由其衍生的分子结合剂(molecular binder)均可以用于已知的免疫测定形式中。
公知的可以用免疫测定检测的临床分析物包括hCG (妊娠试验)、甲状腺激素如TSH(甲状腺病)、类固醇激素(内分泌学、能育性)和PSA(前列腺癌的生物标记)。
总体而言，可以说基于单克隆抗体或多克隆抗血清的免疫测定是生物技术、临床诊断、环境分析和食品分析的最重要的分析化学方法，并且具有高商业价值。
现有技术记载了多种进行免疫测定的方法。大多数异相免疫测定需要几个人工过程，例如移液步骤、样品稀释、洗涤步骤，它们必须按照确切的时间方案。因此，通常需要为这些过程特别配备的专门人才和实验室以正确进行这样的测定。需要的检测装置(“酶标仪”、微量滴定板读数器、免疫测定分析仪)昂贵且不便于携带。例如，进行ELISA测试的方案描述于专利[US4016043A、US3839153A]中。本领域技术人员容易地认识到这样复杂的分析方法仅可以由专门人才进行，并且仅可以在合适的实验室环境中进行。这样的方法的自动化是非常艰巨的，并且需要高度复杂的自动机。
对于现场(on-site)使用，已接受异相横向流动免疫测定形式(“测试条”免疫测定)。US6156271A记载了这种测定形式的现代变体。这种测试在加入样品溶液后自动运行，并且在完全可视的基础上进行检测(由使用者读出测试条上一条或两条有色条带的存在)。很明显这样的读数方法不能产生定量结果(即浓度的精确测量)，而仅可能是是/否陈述或半定量陈述(浓度低于/高于某一阈值)。
本领域技术人员已知相比之下，均相免疫测定(homogeneousimmunoassay)特别适合于实现快速、定量及全自动免疫测定。在均相免疫测定中，信号产生与结合反应同时进行。不同于上述异相免疫测定，均相免疫测定主要由仅一个或几个配料(dosing)操作、温育时间和检测步骤组成。在理想情况下，在可以测量最终值之前仅需要混合样品与预制的(ready-made)试剂混合物(所谓的“混合和测量”测试)。在1:1混合物即相同体积份的样品和试剂混合物的情况下，可用具有高精度的最简单的方法进行配料。
本领域技术人员可以容易地认识到均相免疫测定还允许最短的可能的分析持续时间，因为在实现抗体与抗原之间的结合平衡之后立即测量是可能的。
均相免疫测定的缺点是需要较高的化学合成支出以将结合反应与信号产生相关联。
在专利US4960693A中，记载了抗体-酶片段1结合物的合成，从而功能酶(“全酶”)仅在抗原-酶片段2结合物的结合之后形成。这样的结合物的化学合成是在空间上是困难的，并且不同样适合所有类型的分析物。此外，由于与酶反应关联需要额外的反应时间，因此这种原理不被接受。
用于低分子分析物的更普遍且化学上更简单的方法是荧光偏振免疫测定，例如EP0200960A所述。在这种方法中，合成分析物(此处是雌三醇)与荧光染料(在大多数情况下为荧光素)的结合物。用线偏振激发光照射测量的溶液。只要该结合物在溶液中是游离的，则发出的荧光不是偏振的(消偏振的)。仅在结合至抗体之后，结合物的旋转速度受限至这样的程度，以致发出的荧光也是偏振的。通过这样，可以实时测量结合平衡。这种方法的缺点是用于检测的设备的高支出，因为检测需要偏振单色光源和两个装备有偏振滤光片的荧光检测器。因此，这种原理仅在特殊实验室应用中被接受，但是在常规诊断和现场使用中则不被接受。此外，其仅适用于低分子分析物。对蛋白质分析物需要其他方法。
Sellrie等人的方法中实现了技术上更容易的低分子分析物的检测，其利用铕穴状化合物免疫测定(abbr.:EuCr)作为实例[US2008199972A]。在这种情况下，合成EuCr-荧光素结合物，其中在EuCr和荧光素之间可存在尽可能短的接头，所述接头由1个至不超过3个亚甲基组成。除了抗EuCr抗体外，另外采用抗荧光素抗体，其在结合至荧光素后猝灭后者的荧光。信号产生原理是基于这样的事实，为了空间原因，两种抗体中仅一种可以结合至所述结合物。结合平衡和因此的荧光强度取决于游离EuCr的浓度，并且可以直接实时测量。该系统的优点是仅需要一个常规荧光检测器。缺点是其同样仅适用于低分子分析物，并且结合物合成是在化学上是困难的。
同样基于结合依赖性荧光猝灭原理的低分子分析物的备选均相免疫测定方法由Coille等人公开，并且其改进形式由Tan等人公开[I.Coille,S.Reder,S.Bucher and G.Gauglitz,Biomol.Eng 18(2002),273-280;ChongxiaoTan,Nenad Gajovic-Eichelmann,Walter F.M.
Figure BDA00002454689400041
Rainer Polzius,FrankF.Bier,Analytica Chimica Acta 658(2010),187-192]。在这种情况下，将分析物四氢大麻酚偶联至蛋白质牛血清白蛋白，所述牛血清白蛋白在表面上另外携带几个荧光猝灭剂分子。将抗四氢大麻酚抗体与荧光分子缀合。当该抗体结合至结合物时荧光猝灭。如果分析样品包含游离四氢大麻酚，则该抗体结合后者并再次发出荧光。如Sellrie等人所述，该方法的优点是简单的测量设置可以用于荧光测量。同样地，在这种情况下，分析物-猝灭剂结合物和抗体-荧光团结合物的合成在化学上的困难是缺点。
虽然荧光测量技术在生物科学中经常采用，但是它是复杂的并因此是昂贵的测量技术。而例如用于现场使用的廉价且小巧的检测器用其他检测方法实现。电化学检测方法使得技术上最简单和最强集成的测量装置成为可能，并且例如在所有光学测量方法中用于葡萄糖的一次性生物传感器领域中已得到接受。因此，已努力许多年以实现基于简单的电化学检测原理的均相免疫测定。
用电化学检测的均相免疫测定的前提是灵敏的电分析方法和具有高比活度的氧化还原活性标记/标志物的可用性。安培法和伏安法是灵敏且合适的方法。氧化还原标记/标志物的比活度主要取决于电极的异相电子转移以及检测电位的速度常数。本领域技术人员已达成一致，在-200mV至+200mV的范围内的检测电位(针对银/氯化银参比电极，在下文中缩写为vs.Ag/AgCl)对于生物溶液如血液中的测量是理想的。电子转移常数是氧化还原标记/标志物的化学结构以及扩散系数和所用的电极材料的函数。本领域技术人员已知多种氧化还原介质，其具有有益的电化学特性，并且因此原则上是合适的免疫测定标记/标志物。为了用于生物介质，氧化还原介质必须不与样品成分反应，必须在氧化和还原状态下是稳定的，并且是足够水溶性的。这些氧化还原介质包括例如有机分子如氢醌/醌、对氨基苯酚，有机/无机夹心分子(sandwich molecule)如二茂铁，以及无机络合物如六氰合亚铁(II)酸盐/六氰合铁(III)酸盐或双-联吡啶合锇(bis-bipyridine osmium)。二茂铁和双-联吡啶合锇的水溶性很低，从而为此在大多数情况下采用相关的水溶性衍生物。
US2007/054317记载了具有上述有益特性的水溶性锇系氧化还原分子和不同的电化学免疫测定形式以及电极形状例如叉指电极，通过其可以灵敏方式检测所述水溶性氧化还原分子。除了使用新氧化还原介质以及基于后者的抗体和抗原结合物，US2007/054317中所记载的测定形式未超越现有技术；特别地，未描述新的高度灵敏的均相免疫测定形式。
EP1331482A1记载一种电化学免疫测定方法，其中采用二茂铁和其他氧化还原介质与分析物的结合物。对于该检测，使用酶生物传感器，例如葡萄糖传感器，二茂铁-分析物结合物的释放导致该葡萄糖传感器的电化学信号的调节。所述偶联化学(coupling chemistry)的缺点是蛋白质如人血清白蛋白用来制备具有良好水溶性的结合物。本领域技术人员已知不可能合成具有精确限定的化学计量比的蛋白质-氧化还原介质结合物。因此该测试的特征总是在批次之间有所不同。本领域技术人员还意识到这一事实，即这样的间接信号传导方法带来危险：来自酶反应的抑制剂能够如氧化还原介质-分析物结合物一样调节酶反应。氧化还原介质结合物直接调节电化学信号的方法会更加稳健。
Sung等人对马尿酸在微流体芯片中的均相电化学测定按照这样的原理设计[Sung Ju Yoo,Young Bong Choi,Jong Il Ju,Gun-Sik Tae,Hyug Han Kimand Sang-Hoon Lee.Analyst 134(2009),2462-2467]。合成二茂铁-马尿酸结合物并使用抗马尿酸抗体。将结合至聚合物颗粒的结合物和抗体以精确限定的量加入到样品中。如果样品不含游离马尿酸，则结合物结合至载有抗体的颗粒并与后者一起离心。在伏安实验中，在二茂铁的氧化电位下相对小的电流会在上清液中流动。然而，如果样品包含游离马尿酸，则与颗粒结合的抗体优选结合至后者，离心期间结合物保留在溶液中，并且在伏安实验中会有相对较高的电流流动(在二茂铁的氧化电位下)。该测定和所有按照该原理的测定均具有实际上不允许用于诊断的严重缺点。
首先，对于血液和血清中的选择性检测，二茂铁的氧化电位(+400mVvs.Ag/AgCl)太高。其次，对于大多数现场应用，离心步骤不可接受。第三，尽管有分离步骤(离心)，但这种方法非常不灵敏。例如，Sung等人已测量约10mg/mL的马尿酸作为最低浓度；这等于55mM的浓度。然而，典型的免疫测定分析物必须在纳摩尔浓度范围(或更低)中测量，即更灵敏百万倍。
没有分离步骤的均相电化学测定由Di Gleria等人提出[Katalin DiGleria,H.Allen,O.Hill,Calum J.McNeil,Anal.Chem.1988,58,1203-1205]。在这种情况下将二茂铁和分析物利多卡因的结合物以及抗分析物抗体也加入到样品中。作为检测原理，使用酶反应，其中二茂铁鎓(ferrocenium)-抗原结合物作为氧化还原介质。如果样品不含游离分析物，则结合物结合至抗体，并且酶反应(此处为葡萄糖氧化酶)延迟，而安培电流变小。这种形式的缺点是对于典型的免疫测定不够灵敏。例如，在血清中实现约5μM的检测下限，比典型的免疫测定中高约1000倍。
已描述这种均相氧化还原免疫测定的变体，其中直接电化学测量氧化还原介质结合物。同样在这种情况下，仅实现不足的检测限度。
该测定和所有按照相似原理(即通过抗体结合调节扩散常数)的测定均具有严重的缺点，使得在诊断中的使用复杂化。主要缺点是低灵敏度，因为扩散常数的调节仅带来轻微的信号调节：即使氧化还原-活性结合物被抗体完全结合，仍然可以测量明显的安培或伏安信号。期望的是与抗体结合的结合物不再产生电化学信号。
这同样适用于通过减少结合至抗体后的氧化还原介质来调节酶反应的原理。这种形式也仅可以检测微摩尔浓度(或更高)。
总体而言，可以说基于调节低分子结合物的扩散常数或者通过减少结合至抗体后的氧化还原介质来调节酶反应的均相电化学免疫测定对于测量免疫测定分析物典型的纳摩尔范围(或更低)中的浓度而言不够灵敏。因此，尽管是廉价的检测系统，这些测定均不能用于值得注目的商业应用中。
针对这一背景，本发明的目的是提供在溶液中进行免疫测定的新的改进的方法，其不再具有所提到的现有技术的缺点，并且特别提供显著提高的灵敏度。
根据本发明，通过权利要求1的方法来实现该目的。本发明的更为具体的实施方案和其他方面是其他权利要求的主题。
根据本发明用电化学检测进行均相免疫测定形式的方法的特征在于将作为试剂的两种不同的结合物与样品或样品/缓冲液混合物组合，一种结合物包含氧化还原标志物和分析物分子，而另一种结合物包含抗氧化还原标志物抗体或其特异性结合片段以及特异性结合所述分析物的分子。
分析物一般可以是在免疫测定或另一结合测定中可检测的任意分子，所述分子存在特异性结合配偶体。所述分析物可以是低分子量分析物即分子量<约1000道尔顿，或者较高或高分子量分析物。较高及高分子量分析物的实例为核酸、肽和蛋白质。特别优选的分析物为低分子量有机分子和蛋白质/肽，例如激素、酶、生物标记、生物活性物质和有害物质以及其他生理或代谢相关物质。
特异性结合分析物的分子可以是抗分析物抗体或其片段、适体、肽、核酸，或者通常为特异性结合分析物(例如在特殊结合口袋或配位结构中)且并非抗体(在文献中也称为“客分子”的“主分子”)的有机螯合剂。优选为抗分析物抗体或其片段。
更具体地，该方法的特征在于样品中游离分析物的存在诱导或促进氧化还原标志物结合至抗氧化还原标志物抗体或其特异性结合片段，结合的氧化还原标志物的氧化还原活性被这种结合抑制(“猝灭”)，从而产生或改变可检测的信号。本发明的方法为竞争性测定或通常包括竞争性测定。
例如，合适的方法设计如下：将包含抗分析物抗体和抗氧化还原标志物抗体的双特异性抗体结合物以及氧化还原标志物-分析物结合物溶于缓冲液中。部分结合物分子结合至双特异性抗体结合物，特别是在该结合物的空间条件下，它们中的大部分结合至作为抗分析物抗体的双特异性抗体结合物的抗分析物端，并优选具有比抗氧化还原标志物抗体显著更高的亲和常数。因此该结合物的氧化还原标志物端实际上并未结合，并因此可自由用于电化学测量(例如电流分析法或伏安法)，并且测量高还原电流。如果来自样品的游离分析物分子现在参与(come into play)，则这些分子代替来自分析物抗体结合位点的分析物-氧化还原标志物结合物的分析物端。该结合物的氧化还原标志物端现在仅可以结合至双特异性抗体结合物的抗氧化还原标志物抗体部分，从而结合的氧化还原标志物的氧化还原活性被抑制(“猝灭”)，并且测量减小的电化学信号。
本发明的方法远远优于现有技术，因为其首次将通过抗体-抗原结合来“猝灭”信号(类似于荧光猝灭)的原理转移到直接的电化学检测。荧光猝灭免疫测定属于最灵敏和最快速的均相免疫测定，因为信号与抗体-抗原结合相应地实时产生。现在首次在电化学检测中也实现了这样的信号特征。
根据本发明，二茂铁(或二茂铁的任意衍生物)、双-联吡啶合锇络合物和其他锇系络合物、联吡啶合钌(bipyridyl ruthenium)络合物和其他钌系络合物、对氨基苯酚、六氰合亚铁(II)酸盐/六氰合铁(III)酸盐、氢醌类/醌类或者其他氧化还原介质特别是已知并适合免疫测定的其他氧化还原标志物可以用作氧化还原活性标志物(类似于荧光团)。在免疫测定的条件下“猝灭”二茂铁或另一氧化还原介质的氧化还原活性到目前为止在现有技术中是不可能的。诸如Nielson等人[Roger M.Nielson,Joseph T.Hupp,Inorg.Chem.1996,35,1402-1404]的论文中的确记载了，与二茂铁形成弱键的杯芳烃类化合物能够完全猝灭二茂铁的氧化还原活性，但是仅在约10mM和更高的浓度下。这样高浓度的氧化还原猝灭剂完全不适合免疫测定。
令人惊讶地发现，本发明的发明人之一制备的用于结合二茂铁的单克隆抗体具有这样的猝灭特征。特别有效的新的单克隆抗体专门结合二茂铁的氧化形式二茂铁阳离子(ferrocenium cation)(或二茂基铁离子(ferricinium)，在下文中称为二茂铁鎓)。通过该单克隆抗体，结合的二茂铁鎓的氧化还原活性被完全猝灭；在结合状态下，其不再可以在电极(玻璃-碳、贵金属)上还原。在本发明的方法的示例性实施方案中，与二茂铁鎓结合的抗体用作氧化还原猝灭剂(类似于荧光猝灭剂)。
然而，在本发明的方法的范围内，还可以采用结合用于测试的氧化还原介质并因此抑制(猝灭)其氧化还原活性的任意其他抗体。就此而言，抗体是否结合氧化还原介质的氧化或还原状态对于本发明是无关的。然而，结合氧化介质的抗体在一些应用中(例如在首次用于所述发明的抗二茂铁鎓抗体的情况下)提供特别的优势。其原因是可以用于氧化还原标志物的还原的较低检测电位(在应用实例中，检测在+100mV vs.Ag/AgCl下进行；在氧化的情况下，检测必须在+250mV至+400mV下进行，这会导致血清中非特异性信号增加)。
这些具有猝灭剂作用的氧化还原标志物抗体以及包含这些抗体的双特异性抗体结合物代表了本发明的一方面。本发明的具有猝灭剂作用的氧化还原标志物抗体能够在很大程度上抑制(“猝灭”)所结合的氧化还原标志物的氧化还原活性，所述程度优选超过80%，更优选超过90%，更优选超过95%或完全抑制。
除非从上下文中可以明确地另外理解，本发明所用的术语“抗体”一般还包括其特异性结合片段。
使用本文首次记载的抗二茂铁鎓抗体可以实现用于检测二茂铁鎓(或二茂铁)的竞争性免疫测定，然而这不会有任何巨大的技术重要性。该方法仅在可以通过其用电化学免疫测定检测任何分析物时具有高技术效益和高商业价值。为了这种效果，二茂铁鎓-抗二茂铁鎓免疫复合物的形成必须与任何单克隆抗体以这样的方式相关联：靶分析物与互补抗体(complementaryantibody)的结合导致二茂铁鎓-抗二茂铁鎓键的调节。Sellrie等人[US2008199972A]所述的简单方法(通过用非常短的接头连接的两种抗原的结合物来关联两个免疫反应从而在每种情况下仅抗杀虫剂抗体或抗荧光素抗体可以结合)不能在本发明的方法的情况下使用，因为与低分子物质偶联的二茂铁结合物通常不是水溶性的。为了实际使用，必须制备具有足够高的水溶性的二茂铁-分析物结合物。本领域技术人员已知许多可以用于合成生物结合物(bioconjugate)的水溶性接头分子。由于具有良好的水溶性、与蛋白质和表面的边缘(marginal)非特异性结合以及存在多种链长和化学官能团，聚乙二醇接头(同义词：聚环氧乙烷接头、PEG、PEO)属于最常用的水溶性接头。聚乙二醇接头(同义词：聚环氧乙烷接头)为线性分子，其可以在一端或两端具有可偶联的官能团例如羧基、氨基、巯基(thiol group)等。聚乙二醇接头的水溶性非常高，并且随着接头链长的增加而增加。
为了制备用于本发明的方法的结合物，使用具有足够链长的双功能水溶性接头(例如具有两个末端可偶联官能团的400-30,000Da PEG接头，优选2000Da二氨基-PEG接头)来将二茂铁或另一合适的氧化还原介质与一端偶联并将靶分析物与另一端偶联。通过使用具有足够长度的PEG接头，还可以使不溶于水的分析物可用于该测试。可以使用在两端均具有相同偶联官能团的同型双功能接头，具有不同偶联官能团的异型双功能接头也是如此。
在游离抗二茂铁抗体、游离抗分析物抗体和二茂铁-分析物结合物的存在下用二茂铁-分析物结合物进行的结合研究证明没有发生足够的分析物对二茂铁信号的调节。还证明在分析的整个持续时间中二茂铁鎓-分析物结合物必须保持氧化状态以获得可测量的信号。令人惊讶地发现，在一些酸性缓冲液中，二茂铁始终保持氧化状态。在本发明的方法中，测定优选在pH 1至pH 7(特别优选pH 4至pH 5)的pH值下进行。合适的缓冲盐例如磷酸盐、MES、HEPES、TRIS、Bistris、乙酸盐、甘氨酰甘氨酸、甘氨酸。
现在发现惊人简单的将二茂铁鎓-抗二茂铁鎓结合反应与分析物-抗分析物结合反应关联的新原理。为了这种效果，通过以化学计量比(1:1)将抗二茂铁鎓抗体与抗分析物抗体偶联来制备双特异性抗体结合物，其中使用长度不超过10个亚甲基基团的短接头。通过该原理，首次可以在电化学免疫测定中实现上述期望的信号猝灭特征。
就此而言，对竞争性孕酮免疫测定的实例解释的功能原理如下：将由抗孕酮抗体和抗二茂铁鎓抗体组成的双特异性抗体结合物以及二茂铁鎓-孕酮结合物溶于缓冲液中。部分结合物分子结合至双特异性抗体结合物，它们中的大部分结合至双特异性抗体结合物的抗孕酮端(因为该抗体具有较高的亲和常数)。因为PEG接头对此太短，所以该结合物的二茂铁鎓端实际上并未结合，并且还必须采用能量上不利的弯曲构象(bent conformation)。因此二茂铁鎓端可自由用于电化学测量(电流分析法或伏安法)，并且测量高还原电流。如果来自样品的游离孕酮分子现在参与，则这些分子代替来自孕酮抗体结合位点的孕酮-二茂铁鎓结合物的孕酮端。该结合物的二茂铁鎓端现在仅可以结合至双特异性抗体结合物的抗二茂铁鎓抗体部分，并且测量减小的电化学信号(说明参见图1)。
当加入与二茂铁鎓-分析物结合物相比过量的双特异性抗体结合物时，大多数的二茂铁鎓残基被抗体结合物结合，并且电化学信号降低至几乎为零，因此猝灭。然而，本领域技术人员已知以能够获得孕酮结果的最大灵敏度的方式选择免疫测定中的抗体浓度或双特异性抗体浓度，从而在高度灵敏的测定中以不足的量加入抗体结合物。在这种情况下，甚至用高孕酮浓度，电化学(总)信号仍未完全猝灭。据证实当通过加入孕酮电化学信号仅可以猝灭约50%时，孕酮测定最灵敏(参见图2)。
实现的信号猝灭特征目前尚未在电化学免疫测定中显示，因为没有相应的猝灭剂分子可用。
根据本发明使用的抗二茂铁鎓抗体是这样的氧化还原猝灭剂分子的实例。然而，同样可制备结合其他氧化还原标志物并猝灭它们的信号的类似抗体。本发明也包括在双特异性抗体结合物中使用这样的抗体。
本发明提供在溶液中用灵敏的电化学检测进行直接的均相免疫测定的方法，其特征在于可以测量纳摩尔浓度的低分子或高分子分析物，没有试剂被固定，不进行分离和洗涤步骤，并且实时电化学检测结合反应。
本发明的方法的技术应用特别容易，因为其可以与本领域技术人员已知的不同电分析技术一起使用，不需要任何对测量电极的修饰(例如化学修饰、膜、用薄膜包覆、横向结构(lateral structuring)等)，并且实际上可以任意方式改变大小(减小电极尺寸、减小分析体积)。由于信号产生原理(即任何氧化还原介质的氧化还原活性的猝灭)可以应用于所有已知的电分析测量技术例如电流分析法、伏安法、库仑法、电流滴定、库仑滴定、电位测定法、阻抗谱(impedance spectroscopy)等，所以本发明的方法可以与所有那些方法联用以产生新的免疫测定应用。例如，在一些情况下电流分析法可以是选择的方法，例如以实现尽可能廉价的总系统，或者采用现有的安培检测器(例如葡萄糖-生物传感器测量装置)用于免疫测定。根据具体应用和期望的分析物，可改变电分析技术而原则上不必重新开发免疫测定。
在用于微流体分析系统(芯片实验室系统)时特别清楚地显示新免疫测定原理的可变性和技术适用性。这特别容易实现，因为它是没有固定的组分且没有分离步骤的均相免疫测定。可以将试剂引入液体形式或干燥形式的芯片实验室系统，从而通过加入样品而释放所述试剂，并且测定开始。测量信号可以连续测量或者仅在分析开始和结束时测量(在达到结合平衡之后)。获得分析结果无需过程(配料和洗涤或离心步骤)的同步。与许多光学测量方法(例如光度测量、荧光测量)相比，电分析方法的信噪比不恶化，甚至在微型化的情况下也是如此，即不必为微电极开发新的和复杂的检测器和放大器。
新方法的高价值还在这样的事实中得以证明，例如在现今习惯的按照横向流动免疫测定原理的妊娠试验中，可用该方法实现高度灵敏的用于一次性使用的一次性免疫传感器。可以将检测所需的电子设备(例如安培电路(amperometric circuit))集成入廉价的便携式装置(例如用于葡萄糖测试条的测量装置)中或者甚至可以作为一次性电子设备(例如印刷电路或高度集成的电路)实现。
新方法同样还适合全自动平行进行许多不同免疫测定的实验室分析仪。在这种情况下，1-5分钟的本发明的方法的短分析时间具有显著效果。
在本发明的方法的一具体实施方案中，以可溶形式加入所需的试剂，并且实时进行结合事件的电化学检测。
在另一具体实施方案中，将所有需要的试剂作为预制的混合物加入到样品中，并且实时进行结合事件的电化学检测(混合和测量(mix-and-measure)原理)。
在另一具体实施方案中，在合适的反应容器(例如Eppendorf离心管、微量滴定板、芯片实验室系统、测试条)中提供作为干燥试剂的所有需要的试剂，并且仅通过加入样品以及任选存在的缓冲液来溶解，这标志着分析开始。
在另一特别有益的具体实施方案中，免疫测定在微流体分析系统(芯片实验室)中进行。
在一典型的实施方案中，免疫测定在全自动分析仪上进行。
本发明的方法的另一改进可以通过将结构电极(structured electrode)如叉指电极而非简单电极用于检测来实现，这样分析的灵敏度可以通过所谓的氧化还原循环得到进一步提高。
本发明的方法的另一有利改进是采用酶促催化的循环反应(例如电化学还原，然后是二茂铁鎓的酶促再氧化)而非简单的电化学氧化还原反应(例如将二茂铁鎓还原为二茂铁)，即所谓的酶循环，这样分析的灵敏度可以进一步提高。
本发明的方法特别适合低纳摩尔浓度范围内的测量，并且比迄今已知的没有分离步骤的均相电化学免疫测定灵敏约1000倍。这种灵敏度的巨大改进通过上述新信号传导原理得以实现，在所述原理中，氧化还原-活性结合物的氧化还原活性在结合至抗体后完全猝灭(而非如迄今已知的方法中的仅减小扩散常数)。
就此而言，电化学测量方法在技术上与上述方法一样简单，因为在常规的裸电极(例如玻璃-碳电极)上进行安培或伏安测量。人工操作步骤仅限于加入试剂以及加入样品溶液；不需要分离步骤。本发明的方法还允许按照混合和测量原理的分析，并且特别适合自动化。就此而言，本发明的方法可良好扩展，即扩展至微型体积，例如可应用于微流体应用(芯片实验室)。因为这种特征以及通常为+100mV(vs.Ag/AgCl)的低检测电位，所以本发明的方法适用于直接测量低分子分析物如类固醇激素，以及高分子分析物如hCG，或者复杂生物学样品如血液中的蛋白质标志物。
因此本发明的方法适用于许多商业上重要的免疫测定，并且能够代替技术上复杂(并因此昂贵)或者难以微型化和自动化的现有检测方法。其适合临床诊断、环境分析和食品分析中的应用，并且由于微型化的良好适宜性和技术简单性，其特别适合实验室外的应用(现场应用、即时分析(point-of-care analyses)、一次性传感器、芯片实验室免疫测定)。因此本发明的方法具有在许多应用中代替常规的昂贵的检测系统如荧光检测器或荧光偏振检测器的潜力。
附图简述
图1：对孕酮检测实施例的本发明的免疫测定的示意图
图2：按照本发明的方法的孕酮的安培测量的剂量效应曲线
以下非限制性实施例会更详细地解释本发明。
实施例1
血清中的直接竞争性孕酮免疫测定
装置：电化学搅拌池(electrochemical stirred cell)(工作容积1mL)，安培模式的恒电位仪。
缓冲液：乙酸盐缓冲液，pH 4.4。
样品：人血清，未稀释。
校准品：人血清，未稀释，与2ng/mL、4ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、100ng/mL、200ng/mL的孕酮混合。
方法步骤：
·将450μLpH 4.4的乙酸盐缓冲液充入电化学测量池中；
·使工作电极极化至+100mV(vs.Ag/AgCl)；
·加入10μL的双特异性抗体结合物(终浓度约0.1μg/mL)；
·加入10μL的氧化还原标志物-孕酮结合物(终浓度约100nM)；
·加入30μL的H2O2/过氧化物酶(终浓度5mM的H2O2，过氧化物酶0.02nM)；
·测量基本信号；
·加入500μL的人血清(或500μL的校准品)；
·在加入血清后180秒测量最终信号。
在以前测量的剂量-效应曲线的基础上或者在2点校准的基础上进行评价。
实施例2
唾液中的直接竞争性孕酮免疫测定
装置：电化学搅拌池(工作容积1mL)，安培模式的恒电位仪。
缓冲液：乙酸盐缓冲液，pH 4.4。
样品：人唾液，1:5稀释。
校准品：人唾液，1:5稀释，与2ng/mL、4ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、100ng/mL、200ng/mL的孕酮混合。
方法步骤：
·将450μLpH 4.4的乙酸盐缓冲液充入电化学测量池中；
·使工作电极极化至+100mV(vs.Ag/AgCl)；
·加入10μL的双特异性抗体结合物(终浓度约0.1μg/mL)；
·加入10μL的氧化还原标志物-孕酮结合物(终浓度约100nM)；
·加入30μL的H2O2/过氧化物酶(终浓度5mM的H2O2，过氧化物酶0.02nM)；
·测量基本信号；
·加入500μL的人唾液，1:5稀释(或500μL的校准品)；
·在加入唾液后180秒测量最终信号。
在以前测量的剂量-效应曲线的基础上或者在2点校准的基础上进行评价。
实施例3
尿液中的直接竞争性人绒毛膜促性腺激素免疫测定(hCG)
装置：电化学搅拌池(工作容积1mL)，安培模式的恒电位仪。
缓冲液：乙酸盐缓冲液，pH 4.4。
样品：人血清，未稀释。
校准品：人血清，未稀释，与10mIU/mL、20mIU/mL、40mIU/mL、100mIU/mL、200mIU/mL的hCG混合。
方法步骤：
·将450μLpH 4.4的乙酸盐缓冲液充入电化学测量池中；
·使工作电极极化至+100mV(vs.Ag/AgCl)；
·加入10μL的双特异性抗体结合物(终浓度约0.3μg/mL)；
·加入10μL的氧化还原标志物-hCG结合物(终浓度约200nM)；
·加入30μL的H2O2/过氧化物酶(终浓度5mM的H2O2，过氧化物酶0.02nM)；
·测量基本信号；
·加入500μL的人血清(或500μL的校准品)；
·在加入血清后180秒测量最终信号。
在以前测量的剂量-效应曲线的基础上或者在2点校准的基础上进行评价。

Claims (16)

1.在溶液中用电化学检测进行均相免疫测定形式的方法，其特征在于将作为试剂的两种不同的结合物与样品或样品/缓冲液混合物组合，一种结合物包含氧化还原标志物和分析物分子，而另一种结合物包含抗氧化还原标志物抗体或其特异性结合片段以及特异性结合所述分析物的分子。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述样品中游离分析物的存在诱导或促进所述氧化还原标志物结合至所述抗氧化还原标志物抗体，结合的氧化还原标志物的氧化还原活性被所述结合抑制(“猝灭”)，从而产生或改变可检测的信号。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述氧化还原标志物选自二茂铁和二茂铁衍生物、双-联吡啶合锇络合物和其他锇系络合物、联吡啶合钌络合物和其他钌系络合物、对氨基苯酚、六氰合亚铁(II)酸盐/六氰合铁(III)酸盐、醌类以及已知用于电化学免疫测定的其他氧化还原标志物。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述氧化还原标志物为二茂铁鎓，并且所述抗氧化还原标志物抗体优选为单克隆抗二茂铁鎓抗体。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于所述特异性结合所述分析物的分子表示特异性结合所述分析物的抗分析物抗体、适体、肽、核酸或螯合剂。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于所述特异性结合所述分析物的分子为抗分析物抗体或其片段。
7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其特征在于所述两种结合物包含水溶性接头分子，特别是PEG接头。
8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其特征在于以可溶形式加入所需试剂，并且实时进行结合事件的电化学检测。
9.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其特征在于将全部所需试剂作为预制的混合物加入到所述样品中，并且实时进行结合事件的电化学检测。
10.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其特征在于在合适的反应容器中提供作为干燥试剂的全部所需试剂，并且仅通过加入所述样品以及任选存在的缓冲液来溶解，这标志着分析开始。
11.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其特征在于所述免疫测定在微流体分析系统(芯片实验室)中和/或在全自动分析仪上进行。
12.如权利要求1-11中任一项所述的方法，其特征在于将结构电极例如叉指电极而非简单电极用于所述检测。
13.如权利要求1-12中任一项所述的方法，其特征在于采用酶促催化的循环反应而非简单的电化学氧化还原反应。
14.特异性结合至氧化还原标志物的氧化还原标志物抗体或其片段，所述氧化还原标志物选自二茂铁和二茂铁衍生物、双-联吡啶合锇络合物和其他锇系络合物、联吡啶合钌络合物和其他钌系络合物、对氨基苯酚、六氰合亚铁(II)酸盐/六氰合铁(III)酸盐、醌类以及已知并适用于电化学免疫测定的其他氧化还原标志物，并且所述氧化还原标志物抗体或其片段在很大程度上抑制(猝灭)其结合的氧化还原标志物的氧化还原活性，所述程度优选超过90%，更优选超过95%或完全抑制。
15.如权利要求14所述的氧化还原标志物抗体或其片段，其为在很大程度上或完全抑制其结合的二茂铁鎓的氧化还原活性的抗二茂铁鎓抗体或其片段。
16.用于进行如权利要求1-13中任一项所述的方法的双特异性抗体结合物，其包含如权利要求14或15所述的氧化还原标志物抗体或其片段以及抗分析物抗体或其片段。
CN201180025601.2A 2010-05-25 2011-05-25 电化学检测结合反应的方法 Active CN102959397B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP10005425.3A EP2390664B1 (de) 2010-05-25 2010-05-25 Verfahren zur elektrochemischen Detektion von Bindungsreaktionen
EP10005425.3 2010-05-25
PCT/EP2011/002586 WO2011147563A1 (de) 2010-05-25 2011-05-25 Verfahren zur elektrochemischen detektion von bindungsreaktionen

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN102959397A true CN102959397A (zh) 2013-03-06
CN102959397B CN102959397B (zh) 2014-12-31

Family

ID=42340815

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201180025601.2A Active CN102959397B (zh) 2010-05-25 2011-05-25 电化学检测结合反应的方法

Country Status (8)

Country Link
US (1) US8945852B2 (zh)
EP (1) EP2390664B1 (zh)
JP (1) JP5781603B2 (zh)
CN (1) CN102959397B (zh)
BR (1) BR112012029769B1 (zh)
DK (1) DK2390664T3 (zh)
ES (1) ES2410754T3 (zh)
WO (1) WO2011147563A1 (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109416357A (zh) * 2016-06-30 2019-03-01 皇家飞利浦有限公司 用于检测包含多个细胞的体液样本中的分析物的设备、系统和方法
CN112218720A (zh) * 2017-06-12 2021-01-12 Essenlix公司 均相测定
CN113702452A (zh) * 2020-05-22 2021-11-26 罗伯特·博世有限公司 用于检测溶液中被分析物的量的方法

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2657347A1 (en) 2012-04-26 2013-10-30 Université Paris Diderot - Paris 7 Electrochemical competitive assay and use thereof
US11009479B2 (en) 2014-05-27 2021-05-18 Case Western Reserve University Systems and methods for the detection of HbA1c
CA3047317A1 (en) 2016-12-16 2018-06-21 Infusense Corp. Compositions and methods to detect molecules in a sample
US20210102913A1 (en) * 2017-03-29 2021-04-08 Case Western Reserve University Compositions and methods of detecting 17 beta-estradiol
EP4247256A1 (en) * 2020-11-18 2023-09-27 Cercacor Laboratories, Inc. Glucose sensors and methods of manufacturing
KR102674120B1 (ko) * 2021-01-18 2024-06-12 (주)옵토레인 스위칭 펩티드 및 이를 이용한 면역분석 방법

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1325490A (zh) * 1998-08-24 2001-12-05 传感技术有限公司 被分析物的电化学分析方法
US20040020791A1 (en) * 1997-11-21 2004-02-05 Porter Robert Andrew Electrochemical assays
CN1504746A (zh) * 2002-12-03 2004-06-16 北京博奥生物芯片有限责任公司 亲和反应的化学放大电化学检测方法及其试剂盒
WO2006067424A1 (en) * 2004-12-22 2006-06-29 Oxford Biosensors Limited Hdl cholesterol sensor
CN101184996A (zh) * 2005-03-31 2008-05-21 因韦尔尼斯医药瑞士股份有限公司 电化学检测法
CN101395473A (zh) * 2006-03-20 2009-03-25 因韦尔尼斯医药瑞士股份有限公司 用于电化学检测的水溶性轭合物
WO2009147093A1 (de) * 2008-06-06 2009-12-10 Fraunhofer-Gesellschaft Zur Foerderung Der Angewandten Forschung E.V. Verfahren zum detektieren von chemischen oder biologischen species sowie elektrodenanordnung hierfür

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NL154599B (nl) 1970-12-28 1977-09-15 Organon Nv Werkwijze voor het aantonen en bepalen van specifiek bindende eiwitten en hun corresponderende bindbare stoffen, alsmede testverpakking.
US4016043A (en) 1975-09-04 1977-04-05 Akzona Incorporated Enzymatic immunological method for the determination of antigens and antibodies
EP0200960A1 (en) 1985-05-08 1986-11-12 Abbott Laboratories Total estriol fluorescence polarization immunoassay
EP0274343A1 (en) 1987-01-06 1988-07-13 IntraCel Corporation A system of reactants involving an apo-enzyme useful in immunological analysis and a method for carrying out immunoassays with this system
US5198367A (en) * 1989-06-09 1993-03-30 Masuo Aizawa Homogeneous amperometric immunoassay
IL116921A (en) * 1996-01-26 2000-11-21 Yissum Res Dev Co Electrochemical system for determination of an analyte in a liquid medium
JPH09257793A (ja) * 1996-03-27 1997-10-03 Kagaku Gijutsu Shinko Jigyodan 免疫反応測定用抗体とこれを用いた電気化学的測定方 法
GB2322192B (en) 1997-02-14 2001-01-31 Unilever Plc Assay devices
EP1331482A1 (de) 2002-01-25 2003-07-30 BMS Sensor Technology SA Konjugat zur Bestimmung von Antigenen mittels Biosensoren
CA2694876A1 (en) 2003-07-01 2005-03-24 Eric R. Diebold Electrochemical affinity biosensor system and methods
DE102005020384A1 (de) 2005-05-02 2006-11-09 Therainvention Gmbh Spektroskopisches Verfahren zum Nachweis von Analyten

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040020791A1 (en) * 1997-11-21 2004-02-05 Porter Robert Andrew Electrochemical assays
CN1325490A (zh) * 1998-08-24 2001-12-05 传感技术有限公司 被分析物的电化学分析方法
CN1504746A (zh) * 2002-12-03 2004-06-16 北京博奥生物芯片有限责任公司 亲和反应的化学放大电化学检测方法及其试剂盒
WO2006067424A1 (en) * 2004-12-22 2006-06-29 Oxford Biosensors Limited Hdl cholesterol sensor
CN101184996A (zh) * 2005-03-31 2008-05-21 因韦尔尼斯医药瑞士股份有限公司 电化学检测法
CN101395473A (zh) * 2006-03-20 2009-03-25 因韦尔尼斯医药瑞士股份有限公司 用于电化学检测的水溶性轭合物
WO2009147093A1 (de) * 2008-06-06 2009-12-10 Fraunhofer-Gesellschaft Zur Foerderung Der Angewandten Forschung E.V. Verfahren zum detektieren von chemischen oder biologischen species sowie elektrodenanordnung hierfür

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
FORROW N J,ET AL.: "Synthesis, characterization, and evaluation of ferrocene-theophylline conjugates for use in electrochemical enzyme immunoassay", 《BIOCONJUGATE CHEMISTRY》, vol. 15, no. 1, 31 January 2004 (2004-01-31), pages 137 - 144, XP002593998, DOI: doi:10.1021/BC034131B *
GHINDILIS A L,ET AL.: "Nanomolar determination of the ferrocene derivatives using a recycling enzyme electrode: Development of a redox label immunoassay", 《ANALYTICAL LETTERS》, vol. 28, no. 1, 31 December 1995 (1995-12-31), XP008124810 *
SAPIN R，ET AL.: "Efficacy of a new blocker against anti-ruthenium antibody interference in the Elecsys free triiodothyronine assay", 《CLINICAL CHEMICAL LABORATORY MEDICINE》, vol. 45, no. 3, 31 March 2007 (2007-03-31), XP008124809, DOI: doi:10.1515/CCLM.2007.064 *
WEI M Y，ET AL.: "Development of redox-labeled electrochemical immunoassay for polycyclic aromatic hydrocarbons with controlled surface modification and catalytic voltammetric detection", 《BIOSENSORS AND BIOELECTRONICS》, vol. 24, no. 9, 15 May 2009 (2009-05-15), pages 2909 - 2914 *
谭钟扬 等: "生物传感器与分子信号转换技术研究进展", 《中国农业科技导报》, vol. 10, no. 2, 25 February 2009 (2009-02-25), pages 106 - 108 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109416357A (zh) * 2016-06-30 2019-03-01 皇家飞利浦有限公司 用于检测包含多个细胞的体液样本中的分析物的设备、系统和方法
CN109416357B (zh) * 2016-06-30 2022-07-15 西门子医疗系统荷兰有限公司 用于检测包含多个细胞的体液样本中的分析物的设备、系统和方法
CN112218720A (zh) * 2017-06-12 2021-01-12 Essenlix公司 均相测定
CN113702452A (zh) * 2020-05-22 2021-11-26 罗伯特·博世有限公司 用于检测溶液中被分析物的量的方法

Also Published As

Publication number Publication date
JP2013526720A (ja) 2013-06-24
WO2011147563A8 (de) 2012-12-06
US20130203065A1 (en) 2013-08-08
BR112012029769B1 (pt) 2019-12-24
US8945852B2 (en) 2015-02-03
DK2390664T3 (da) 2013-07-22
CN102959397B (zh) 2014-12-31
EP2390664A1 (de) 2011-11-30
EP2390664B1 (de) 2013-04-17
WO2011147563A1 (de) 2011-12-01
WO2011147563A9 (de) 2013-01-24
ES2410754T3 (es) 2013-07-03
JP5781603B2 (ja) 2015-09-24
BR112012029769A2 (pt) 2017-06-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102959397B (zh) 电化学检测结合反应的方法
US9939440B2 (en) Electrochemical analyte detection apparatus and method
Liu et al. Disposable electrochemical immunosensor diagnosis device based on nanoparticle probe and immunochromatographic strip
Znoyko et al. Ultrasensitive quantitative detection of small molecules with rapid lateral-flow assay based on high-affinity bifunctional ligand and magnetic nanolabels
Liu et al. Development of an electrochemical immunosensor for the detection of HbA1c in serum
US8617907B2 (en) Determining the presence or amount of a metal-labelled species
Sharma et al. Analytical techniques for the detection of glycated haemoglobin underlining the sensors
EP0286084A2 (en) A device for the rapid qualitative or quantitative assay of entities having a biological activity
Nian et al. Electrochemical immunoassay of cotinine in serum based on nanoparticle probe and immunochromatographic strip
JP4972295B2 (ja) 免疫分析方法及びバイオチップ
Tang et al. based electrochemical immunoassay for rapid, inexpensive cancer biomarker protein detection
JP4892686B2 (ja) 酵素センサ、該酵素センサを使用した分析方法及びキット
Lu et al. Rapid, quantitative and sensitive immunochromatographic assay based on stripping voltammetric detection of a metal ion label
Liu et al. Prostate-specific antigen detection by using a reusable amperometric immunosensor based on reversible binding and leasing of HRP-anti-PSA from phenylboronic acid modified electrode
Liu et al. Manganese modified CdTe/CdS quantum dots as an immunoassay biosensor for the detection of Golgi protein-73
Singampalli et al. Rapid magneto-enzyme-linked immunosorbent assay for ultrasensitive protein detection
Molinero-Fernández et al. An on-chip microfluidic-based electrochemical magneto-immunoassay for the determination of procalcitonin in plasma obtained from sepsis diagnosed preterm neonates
JP4753945B2 (ja) 銀ラベルされた化学種の存在またはその量を分析する方法
Popov et al. Ultra-sensitive Electrochemical Immunosensors for Clinically Important Biomarker Detection: Prospects, Opportunities, and Global Trends
Arshad et al. Gold-silver-platinum trimetallic nanozyme-based dual-mode immunosensor for ultrasensitive osteoprotegerin detection
Szűcs et al. Potentiometric enzyme immunoassay using miniaturized anion-selective electrodes for detection
Lee et al. Pump-free glass-based capillary microfluidic immuno-assay chip for electrochemical detection of prostate-specific antigen
Lim et al. Miniaturized amperometric flow immunoassay system using a glass fiber membrane modified with anion
CN118420461A (zh) 一种羧基蒽醌衍生物、免疫传感器及其制备方法及应用
JPH09257793A (ja) 免疫反応測定用抗体とこれを用いた電気化学的測定方 法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant