BR112012029769B1

BR112012029769B1 - processo para realização de formatos de imunoensaios homogêneos competitivos com a detecção eletroquímica em solução

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Publication number: BR112012029769B1
Application number: BR112012029769A
Authority: BR
Inventors: Micheel Burkhard; Scharte Gudrun; Ettlinger Julia; Schenk Jörg; Gajovic-Eichelmann Nenad
Original assignee: Fraunhofer Ges Forschung
Priority date: 2010-05-25
Filing date: 2011-05-25
Publication date: 2019-12-24
Also published as: WO2011147563A1; WO2011147563A9; CN102959397B; BR112012029769A2; EP2390664B1; US8945852B2; DK2390664T3; CN102959397A; EP2390664A1; WO2011147563A8; JP2013526720A; ES2410754T3; US20130203065A1; JP5781603B2

Abstract

processo para a detecção eletroquímica de reações de ligação. a presente invenção refere-se a um processo para a realização de formatos de imunoensaios homogêneos com detecção eletroquímica altamente sensível em solução, caracterizado pelo fato de que dois diferentes conjugados como reagentes são combinados com a amostra ou com uma mistura de tampão-amostra, sendo que o primeiro conjugado compreende um marcador redox e uma molécula de analito e o segundo conjugado compreende um anticorpo antimarcador redox ou um fragmento deste que liga especificamente e uma molécula que liga especificamente o analito. o processo é adequado para imunoensaios livres de lavagem e separação no diagnóstico, especialmente para imunoensaios automatizados e microfluídicos. o processo também é adequado para sistemas de imunoensaios automatizados e microfluídicos. o processo também é adequado para sistemas de imunoensaios econômicos e tiras de teste para uso descartável.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para PROCESSO PARA REALIZAÇÃO DE FORMATOS DE IMUNOENSAIOS HOMOGÊNEOS COMPETITIVOS COM A DETECÇÃO ELETROQUÍMICA EM SOLUÇÃO.

[0001] A presente invenção refere-se a um processo para a detecção eletroquímica altamente sensível, direta de reações de ligação de anticorpo-antígeno e outras interações bioquímicas em solução. O processo é adequado para imunoensaios livres de lavagem e separação no diagnóstico, especialmente para imunoensaios automatizados e microfluídicos. O processo também é adequado para sistemas de imunoensaios econômicos e tiras de teste de uso descartável.

[0002] Imunoensaios utilizam a reação de antígeno-anticorpo para a detecção específica das menores concentrações de um analito em meios complexos, tais como sangue, soro, urina ou alimentos. No diagnóstico clínico, na análise do meio ambiente e de alimentos, os imunoensaios são, há décadas, ferramentas indispensáveis para a detecção das menores concentrações de hormônios, metabolites, proteínas, biomarcadores, toxinas, pesticidas, bactérias patogênicas e virus. Muitos dos mais importantes analitos clínico-diagnósticos são econômicos e rapidamente mensuráveis somente com imunoensaios, pois não há processos analítico-químicos alternativos, que oferecem uma combinação equivalente de alta sensitividade (detecção de concentrações nanomolares ou mais baixas) e alta especificidade (detecção do analito na presença de interferentes formados quimicamente semelhantes). Processos alternativos, tais como a cromatografia (por exemplo, HPLC, cromatografia gasosa) necessitam de uma preparação de amostra frequentemente de multiestágios, por exemplo, através de extração e derivatização química.

[0003] Desde a invenção do imunoensaio há 50 anos por Rosalyn Yalow e Salomon Berson, foram desenvolvidos um grande número de

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2/27 diversas formas de execução, que são designadas como diferentes formatos de imunoensaio. A diferença fundamental de formatos heterogêneos, tal como o ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) e formatos homogêneos é realizada com base no estado físico dos anticorpos utilizados para a detecção: no caso dos ensaios heterogêneos, o anticorpo (mais raramente, o antígeno) é imobilizado em uma superfície (tubo de reação, placa de microtitulação, tiras de teste), todos os estágios de reação, tais como estágios de lavagem e separação, bem como a detecção são igualmente efetuados na superfície. Nos formatos homogêneos, nenhum dos participantes da ligação é imobilizado, não são necessários quaisquer estágios de lavagem e separação, a detecção é igualmente efetuada em solução. [0004] Uma outra possibilidade de distinção resulta com base no método de detecção usado. Visto que a reação de ligação anticorpoantígeno não pode ser tornada diretamente visível, um dos participantes da ligação deve ser acoplado quimicamente com um marcador molecular ou labei (exceção: biossensores sensíveis à massa à base de ressonância plasmon de superfície, acoplador de grade, microbalança de cristal de quartzo, ondas acústicas de superfície e técnicas semelhantes medem diretamente a reação de ligação molecular em tempo real, se um dos participantes de ligação é imobilizado na superfície sensitiva. No entanto, até agora, esses processos são usados apenas em aplicações de pesquisa, não na análise de rotina). Um marcador adequado deve ter uma alta atividade específica, isto é, para cada molécula de marcador este deve produzir o maior número de eventos de sinais possíveis. Aos marcadores mais frequentemente utilizados incluem-se isótopos radioativos (radioimunoensaio, RIA), corantes fluorescentes (fluoresce ína, rodamina e assim por diante), nanopartículas semicondutoras fluorescentes (quantum dots), partículas poliméricas (latex beads,

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3/27 imunoensaio de aglomeração) e enzimas, tais como peroxidase, juntamente com um substrato enzimático colorimétrico, fluorogênico ou quimioluminescente (ELISA). A maior atividade específica, que possibilita mesmo a detecção de uma única molécula marcada, possuem os isótopos radioativos. Com base no perigo para a saúde, que parte da radioatividade, nas altas exigências ao laboratório associadas com isso (laboratório de isótopos) e nos altos custos para o descarte dos resíduos, os imunoensaios de radioatividade são substituídos cada vez mais de processos alternativos, tais como do ELISA.

[0005] Uma outra distinção entre diversos imunoensaios resulta com base no tipo dos anticorpos usados. Anticorpos são proteínas estruturadas de forma complexa com domínios constantes, que determinam a estrutura e em todas as classes de anticorpos são compostas de forma semelhante e domínios altamente variáveis, que formam os pontos de ligação do antígeno. Os soros policlonais originalmente utilizados, que contêm um grande número de anticorpos com especificidade e afinidade variável, são substituídos em muitas aplicações por anticorpos monoclonais, que contêm apenas exatamente uma entidade de anticorpo (clone), com especificidade e afinidade definida. Anticorpos monoclonais podem ser teoricamente produzidos em quaisquer quantidades com propriedades idênticas. Além disso, para algumas análises também foram usados os chamados fragmentos de anticorpos, que podem ser produzidos através de digestão enzimática de anticorpos inteiros. Anticorpos de cadeia simples (singlechain) são fragmentos de anticorpos recombinantes, que podem ser produzidos por meio de métodos de engenharia genética. Em princípio, todos os tipos de anticorpos e ligantes moleculares derivados desses podem ser utilizados nos formatos de imunoensaios conhecidos.

[0006] Aos analitos clínicos mais conhecidos, que são detectados

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4/27 com imunoensaios, pertencem hCG (teste de gravidez), hormônios da tireóide, tal como TSH (doenças da tireóide), hormônios esteroidais (endocrinologia, fertilidade) e PSA (biomarcador para carcinoma de próstata).

[0007] Resumidamente pode ser dito, que os imunoensaios à base de anticorpos monoclonais ou antissoros policlonais são incluídos nos mais importantes processos analítico-químicos da biotecnologia, diagnóstico clínico, análise do meio ambiente e de alimentos e possuem um alto valor comercial.

[0008] No estado da técnica são descritos um grande número de métodos, para efetuar um imunoensaio. A maioria dos imunoensaios heterogêneos exigem várias etapas de trabalho manuais, tais como, por exemplo, processos de pipetação, diluição da amostra, processos de lavagem, que devem seguir um protocolo de tempo preciso. Por conseguinte, via de regra, é necessário um pessoal treinado e um laboratório especialmente equipado para esse fim, para efetuar corretamente tais ensaios. Os equipamentos de detecção necessários (ELISA-reader, leitor de placa de microtitulação, analisador de imunoensaio) são caros e não portáveis. Dessa maneira, por exemplo, nos relatórios descritivos [US 4016043A, US 3839153A], são descritos protocolos para a realização de um teste ELISA. O especialista reconhece facilmente, que decursos de análises tão complexos podem ser realizados somente por um pessoal treinado e somente em um ambiente de laboratório. A automatização de tais decursos é muito cara e requer máquinas altamente complexas.

[0009] Para o local de utilização prevaleceu o formato de imunoensaio heterogêneo de fluxo lateral (imunoensaio de tira de teste). A US6156271A descreve uma variante moderna deste formado de ensaio. Este teste decorre sozinho após a adição da solução de amostra e a detecção é efetuada de forma puramente visual (leitura da

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5/27 presença de uma ou duas faixas coloridas na tira de teste pelo usuário). É evidente, que um tal processo de seleção não pode fornecer quaisquer resultados quantitativos (isto é, medidas de concentração exatas), mas sim, que são possíveis somente afirmações sim/não ou uma afirmação semiquantitativa (a concentração encontra-se abaixo/acima de um determinado valor limiar).

[0010] O especialista sabe, que imunoensaios homogêneos, em contrapartida, são particularmente adequados, para realizar imunoensaios rápidos, quantitativos e totalmente automatizados. Nos imunoensaios homogêneos, a geração de sinal é realizada ao mesmo tempo com a reação de ligação. Ao contrário dos imunoensaios heterogêneos descritos acima, os imunoensaios homogêneos consistem na maioria somente em uma ou poucas operações de dosagem, em um tempo de incubação e na etapa de detecção. No caso ideal, é necessária apenas a mistura da amostra e de uma mistura de reagentes pronta, antes de poder medir um valor final (os chamados testes mix and measure). Em uma mistura 1:1, isto é, uma amostra de partes em volume iguais e mistura de reagentes, a dosagem é possível com os agentes mais simples com alta precisão.

[0011] É facilmente evidente ao especialista, que um imunoensaio homogêneo permite também a duração da análise mais curta possível, visto que a medição é possível imediatamente depois de obter o equilíbrio da ligação entre o anticorpo e o antígeno.

[0012] Uma desvantagem de imunoensaios homogêneos é a necessidade de um maior custo químico-sintético, para acoplar a reação de ligação com a geração de sinal.

[0013] Na patente US4960693 A está descrita a síntese de um conjugado de anticorpo-fragmento enzimático-1, de modo que somente após a ligação do conjugado de antígeno-fragmento enzimático-2 forma-se a enzima funcional (holoenzima). A síntese química de tais

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6/27 conjugados é estericamente exigente e não é igualmente adequada para todos os tipos de analitos. Além disso, através da copulação com a reação enzimática, é necessário um tempo de reação adicional, de modo que esse princípio não pôde prevalecer.

[0014] Um princípio mais universal e quimicamente mais simples para analitos de baixo peso molecular é o imunoensaio de polarização fluorescente, tal como descrito, por exemplo, na EP0200960A. Nesse caso, um conjugado é sintetizado do analito (aqui: estriol) e de um corante fluorescente, na maioria das vezes, fluoresceína. A solução de medição é iluminada com luz de estimulação polarizada linear. A luz fluorescente emitida não é polarizada (despolarizada), enquanto o conjugado está presente livre na solução. Somente após uma ligação ao anticorpo, a velocidade de rotação do conjugado é tão limitada, que também a luz fluorescente emitida é polarizada. Com isso, o equilíbrio de ligação pode ser medido em tempo real. A desvantagem deste processo é o alto custo de equipamentos para a detecção, visto que são necessários uma fonte de luz monocromática polarizada e dois detetores de fluorescência equipados com filtros de polarização para a detecção. Este princípio pôde prevalecer, por conseguinte, apenas em aplicações laboratoriais especiais, no entanto, não no diagnóstico de rotina e no emprego no local. Além disso, este é adequado somente para analitos de baixo peso molecular. Para analitos de proteína é necessário um processo adicional.

[0015] Uma detecção tecnicamente mais simples de analitos de baixo peso molecular foi realizada no processo de Sellrie e colaboradores no exemplo de um imunoensaio de európio-criptato (abreviação: EuKr) [US2008199972A]. Aqui, é sintetizado um conjugado de EuKr-fluoresceína, sendo que um ligante o mais curto possível, que consiste em um até o máximo de três grupos metileno, pode estar entre o EuKr e a fluoresceína. Além do anticorpo anti-EuKr é usado

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7/27 adicionalmente um anticorpo anti-fluoresceína, que depois da ligação à fluoresceína, exclui sua fluorescência. O princípio de geração de sinal baseia-se no fato, de que por motivos estéricos, somente um dos dois anticorpos pode ligar o conjugado. O equilíbrio de ligação e, com isso, a intensidade da fluorescência, depende da concentração de EuKr livre e pode ser medida diretamente em tempo real. A vantagem deste sistema é que apenas um detetor de fluorescência convencional é necessário. A desvantagem é que este, igualmente, é adequado apenas para analitos de baixo peso molecular e que a síntese do conjugado é quimicamente exigente.

[0016] Um processo de imunoensaio homogêneo alternativo para analitos de baixo peso molecular, que se baseia igualmente no princípio de supressão da fluorescência dependente de ligação, foi publicado por Coille e colaboradores e, de forma modificada, por Tan e colaboradores [I. Coille, S. Reder, S. Bucher and G. Gauglitz, Biomol. Eng 18 (2002) 273-280, / Chongxiao Tan, Nenad Gajovic-Eichelmann, Walter F. M. Stõcklein, Rainer Polzius, Frank F. Bier, Analytica Chimica Acta 658 (2010) 187-192]. Aqui, o analito, tetrahidrocanabiol, é acoplado a uma proteína, albumina de soro bovino, que na superfície porta adicionalmente várias moléculas de extinção de fluorescência. O anticorpo anti-tetrahidrocanabinol é conjugado com uma molécula fluorescente. A fluorescência é excluída, quando o anticorpo se liga ao conjugado. Se a amostra da análise contém tetrahidrocanabinol livre, o anticorpo liga-o e fluoresce novamente. A vantagem deste processo, igualmente como em Sellrie e colaboradores, é que a configuração de medição simples pode ser utilizada para medir a fluorescência. A desvantagem também aqui é a síntese quimicamente exigente do conjugado de analito-supressor e do conjugado de anticorpo-fluoróforo. [0017] Embora a técnica de medição de fluorescência nas biociências seja muitas vezes usada, ela é uma técnica de medição

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8/27 dispendiosa e, com isso, cara. Detectores econômicos e compactos, por exemplo, para o uso no local, são realizados antes com outros processos de detecção. Processos de detecção eletroquímicos possibilitam os equipamentos de medição tecnicamente mais simples e os mais integrados e prevaleceram, por exemplo, na área dos biossensores descartáveis para glicose em relação a todos os processos de medição óticos. Por isso, há muitos anos são feitos esforços para realizar imunoensaios homogêneos à base de um princípio de detecção eletroquímico simples.

[0018] A condição prévia para um imunoensaio homogêneo com detecção eletroquímica é a disponibilidade de um método eletroanalítico sensível e de um label/marcador ativo ao redox com alta atividade específica. Processos amperométricos e voltamétricos são processos sensíveis e adequados. A atividade específica do marcador redox/marcador depende principalmente da constante de velocidade da transferência de elétrons heterogêneos com o eletrodo e do potencial de detecção. Predomina uma opinião unânime entre especialistas, de que um potencial de detecção na faixa de -200 mV a +200 mV (contra o eletrodo de referência de prata/cloreto de prata, futuramente abreviado com vs. Ag/AgCI) é ideal para medições em soluções biológicas, tais como sangue. A constante de transferência de elétrons é uma função da estrutura química do marcador redox/marcador, bem como do coeficiente de difusão e do material de eletrodos usado. Um grande número de mediadores redox é conhecido pelo especialista, que têm propriedades eletroquímicas favoráveis e, com isso, em princípio, são marcadores adequados para um imunoensaio. Para o uso em meios biológicos, os mediadores redox não podem reagir com componentes de amostras, devem ser estáveis no estado oxidado e reduzido e ser suficientemente hidrossolúveis. A esses pertencem, por exemplo, as moléculas orgânicas, tais como hidroquinona/quinona, p-aminofenol,

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9/27 moléculas sanduíche orgânico/inorgânicas, tais como ferroceno e complexos inorgânicos, tais como, por exemplo, hexacianoferrato (ll/lll) ou di-bipiridina de ósmio. A hidrossolubilidade de ferroceno e dibipiridina de ósmio é ruim, de modo que aqui, na maioria das vezes, são usados derivados hidrossolúveis.

[0019] A US2007/054317 descreve moléculas redox hidrossolúveis à base de ósmio com as propriedades favoráveis citadas acima e vários formatos de imunoensaios eletroquímicos e geometrias de eletrodos, por exemplo, eletrodos interdigitais, com os quais as moléculas redox hidrossolúveis citadas podem ser sensivelmente detectadas. Os formatos de ensaios descritos na US2007/054317, além do uso dos novos mediadores redox e conjugados de anticorpo e antígeno baseados nesses, não ultrapassam o estado da técnica, especialmente não se descreve qualquer novo formato de imunoensaio homogêneo altamente sensível.

[0020] A EP1331482A1 descreve um processo de imunoensaio eletroquímico, em que conjugados de ferroceno e outros mediadores redox são usados com o analito. Para a detecção, é usado um biossensor enzimático, por exemplo, um sensor de glicose, em que a liberação do conjugado de ferroceno-analito leva a uma modulação do sinal eletroquímico do sensor de glicose. Uma desvantagem da química de copulação descrita é o uso de uma proteína, tal como albumina de soro humano, para produzir um conjugado bem hidrossolúvel. O especialista sabe, que não é possível sintetizar conjugados de proteínamediador redox com uma proporção estequiométrica exatamente definida. Com isso, a característica do teste é sempre diferente de carga para carga. O especialista também está ciente, de que um processo de sinal tão indireto traz consigo o perigo, de que substâncias inibidoras da amostra podem modular a reação enzimática bem como o conjugado de mediador redox-analito. Mais robusto seria um processo, no qual o

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10/27 conjugado de mediador redox modula diretamente o sinal eletroquímico. [0021] De acordo com um tal princípio, o ensaio eletroquímico homogêneo para ácido hipúrico é formado em um chip microfluídico por Sung e colaboradores [Sung Ju Yoo, Young Bong Choi, Jong II Ju, GunSik Tae, Hyug Han Kim and Sang-Hoon Lee. Analyst 134 (2009), 24622467]. É sintetizado um conjugado de ferroceno-ácido hipúrico e utilizado um anticorpo anti-ácido hipúrico. O conjugado e o anticorpo ligado à partícula polimérica são acrescentados à amostra em quantidade exatamente definida. Se uma amostra não contém qualquer ácido hipúrico, o conjugado se liga às partículas carregadas de anticorpos e é separado com essas por centrifugação. No sobrenadante, em um experimento voltamétrico, no potencial de oxidação do ferroceno, fluirá uma corrente correspondentemente menor. Se a amostra, ao contrário, contém ácido hipúrico livre, então o anticorpo ligado à partícula se liga preferivelmente a este, o conjugado permanece em solução durante a centrifugação e no experimento voltamétrico fluirá uma corrente correspondentemente maior (no potencial de oxidação do ferroceno). Este ensaio e todos, que seguem este princípio, têm sérias desvantagens, que praticamente não permitem o uso no diagnóstico.

[0022] Em primeiro lugar, o potencial de oxidação de ferroceno (+400 mV vs. Ag/AgCI) é alto demais para a detecção seletiva no sangue e soro sanguíneo. Em segundo lugar, uma etapa de centrifugação para a maioria das aplicações no local não é aceitável. Em terceiro lugar, este processo, apesar da etapa de separação (centrifugação) é muito insensível. Dessa maneira, Sung e colaboradores mediram cerca de 10 mg/ml de ácido hipúrico como menos concentração, isso corresponde a uma concentração de 55 mM. No entanto, analitos de imunoensaios típicos devem ser medidos na faixa de concentração nanomolar (ou abaixo), isto é, um milhão de

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11/27 vezes mais sensível.

[0023] Um ensaio eletroquímico homogêneo, que passa sem etapa de separação, foi apresentado por Di Gleria e colaboradores [Katalin Di Gleria, H. Allen, O. Hill, Calum J. McNeil, Anal. Chem. 1988, 58, 12031205]. Também aqui, um conjugado de ferroceno e o analito, lidocaína, bem como o anticorpo antianalito é acrescentado à amostra. Como princípio de detecção, foi utilizada uma reação enzimática, para a qual o conjugado de ferrocênio-antígeno age como mediador redox. Se a amostra não contém qualquer analito livre, o conjugado se liga ao anticorpo e a reação enzimática, aqui glicoseoxidase, é retardada, a corrente amperométrica diminui. A desvantagem deste formato é que este não é suficientemente sensível para um imunoensaio típico. Dessa maneira, obteve-se no soro um limite de detecção menor de cerca de 5 μΜ, aproximadamente 1000 vezes maior do que nos imunoensaios típicos.

[0024] Foi descrita uma variante deste imunoensaio redox homogêneo, na qual o conjugado do mediador redox é medido diretamente eletroquimicamente. Também aqui só foram obtidos limites de detecção insuficientes.

[0025] Este ensaio e todos que seguem um princípio semelhante (isto é, da modulação da constante de difusão por meio da ligação do anticorpo), têm sérias desvantagens, que dificultam o uso no diagnóstico. A principal desvantagem é a baixa sensibilidade, visto que a modulação da constante de difusão ocasiona apenas uma baixa modulação de sinal: também quando o conjugado ativo ao redox é completamente ligado pelo anticorpo, ainda é possível medir um sinal amperométrico ou voltamétrico digno de menção. Seria desejável, se o conjugado ligado ao anticorpo não produzisse qualquer sinal eletroquímico.

[0026] O mesmo vale para o princípio da modulação de uma reação

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12/27 enzimática através da escassez do mediador redox após a ligação a um anticorpo. Também esse formato só pôde detectar concentrações micromolares (ou maiores).

[0027] Ao todo, pode-se dizer, que imunoensaios eletroquímicos homogêneos, que se baseiam na modulação da constante de difusão de um conjugado de baixo peso molecular ou na modulação de uma reação enzimática através da escassez do mediador redox após a ligação de um anticorpo, não são suficientemente sensíveis, para medir concentrações na faixa nanomolar (ou inferior), tais como são típicos para analitos de imunoensaios. Por isso, apesar do sistema de detecção barato, nenhum desses ensaios pôde encontrar uma aplicação comercial digna de menção.

[0028] Neste contexto, o objetivo da presente invenção é o de proporcionar um novo processo aperfeiçoado para a realização de um imunoensaio em solução, o qual não apresenta mais as desvantagens citadas do estado da técnica e que ofereça especialmente uma sensitividade nitidamente aperfeiçoada.

[0029] Esse objetivo é resolvido de acordo com a invenção com o processo de acordo com a reivindicação 1. Formas de execução mais especiais e outros aspectos da invenção são objeto de outras reivindicações.

[0030] O processo de acordo com a invenção para a realização de formatos de imunoensaios homogêneos com detecção eletroquímica é caracterizado pelo fato de que dois diferentes conjugados como reagentes são combinados com a amostra ou com a mistura de amostra/tampão, sendo que o primeiro conjugado compreende um marcador redox e uma molécula de analito e o segundo conjugado compreende um anticorpo antimarcador redox ou um fragmento deste que liga especificamente e uma molécula que liga especificamente o analito.

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13/27 [0031] O analito pode ser fundamentalmente cada molécula detectável em um imunoensaio ou em um outro ensaio de ligação, para a qual existe um participante de ligação específico. O analito pode ser baixo peso molecular, isto é, apresentar uma massa molar de < cerca de 1000 Dáltons ou ser de peso molecular mais elevado ou elevado. Exemplos de analitos de peso molecular mais elevado e elevado são ácidos nucleicos, peptídeos e proteínas. Analitos particularmente preferidos são moléculas orgânicas de baixo peso molecular e proteínas/peptídeos, por exemplo, hormônios, enzimas, biomarcadores, substâncias ativas e substâncias nocivas biológicas e outras substâncias fisiologicamente ou metabolicamente relevantes.

[0032] A molécula que liga especificamente o analito, pode ser um anticorpo antianalito ou um fragmento deste, um aptâmero, um peptídeo, um ácido nucleico ou um quelator tipicamente orgânico, que liga especificamente o analito (por exemplo, em uma bolsa de ligação especial ou estrutura de coordenação) e não é qualquer anticorpo (na literatura também designada como molécula hospedeira para uma molécula hóspede). Preferivelmente, trata-se de um anticorpo antianalito ou de um fragmento deste.

[0033] Mais especialmente o processo é caracterizado pelo fato, de que a presença de analitos livres na amostra causa ou promove a ligação do marcador redox ao anticorpo antimarcador redox ou o fragmento de ligação específica deste, sendo que através dessa ligação, a atividade redox do marcador redox ligado é impedida (excluída ou extinta), pelo que um sinal detectável é produzido ou modificado. O processo de acordo com a invenção é ou mantém tipicamente um ensaio competitivo.

[0034] Uma concretização de processo adequada é, por exemplo, tal como segue: um conjugado de anticorpo biespecífico, compreendendo um anticorpo antianalito e um antimarcador redox e o

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14/27 conjugado de marcador redox-analito, são dissolvidos em tampão. Uma parte das moléculas do conjugado liga-se ao conjugado de anticorpo biespecífico, o múltiplo desse, à extremidade antianalito do conjugado de anticorpo biespecífico, visto que o anticorpo antianalito, especialmente nas condições estéricas do conjugado, possui preferivelmente uma constante de afinidade nitidamente maior do que a do anticorpo antimarcador redox. A extremidade do marcador redox do conjugado, por conseguinte, praticamente não é ligada e dessa maneira, é livremente acessível à medição eletroquímica (por exemplo, amperometria ou voltametria) e é medida uma alta corrente de redução. Se, agora, são acrescentadas moléculas de analito livres da amostra, essas afastam a extremidade do analito do conjugado de analitomarcador redox dos pontos de ligação do anticorpo do analito. Somente agora, as extremidades do marcador redox do conjugado podem ligarse à parte do anticorpo antimarcador redox do conjugado de anticorpo biespecífico, pelo que a atividade redox do marcador redox ligado é impedida (excluída) e é medido um sinal eletroquímico reduzido.

[0035] O processo de acordo com a invenção vai muito além do estado da técnica, visto que em primeiro lugar, ele transmite o princípio da supressão de um sinal através da ligação de anticorpo-antígeno (de maneira análoga à supressão de fluorescência ou extinção da fluorescência) para a detecção eletroquímica direta. Imunoensaios de extinção de fluorescência pertencem aos imunoensaios homogêneos mais sensíveis e mais rápidos, visto que o sinal é gerado em tempo real proporcionalmente à ligação de anticorpo-antígeno. Uma tal característica de sinal foi realizada, agora, pela primeira vez também em uma detecção eletroquímica.

[0036] Como marcadores radioativos (em analogia ao fluoróforo), podem ser usados de acordo com a invenção, o ferroceno (ou quaisquer derivados do ferroceno), complexos de ósmio-di-bipiridila e outros

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15/27 complexos à base de ósmio, p-aminofenol, hexacianoferrato (ll/lll), hidroquinonas/quinonas ou outros mediadores redox, especialmente outros marcadores redox adequados e conhecidos para imunoensaios. A supressão da atividade redox do ferrocene ou de um outro mediador redox não foi possível até agora no estado da técnica nas condições de um imunoensaio. De fato, em obras, tais como a descrita por Nielson e colaboradores [Roger M. Nielson, Joseph T. Hupp, Inorg. Chem. 1996, 35, 1402-1404], que calixarenos, que formam uma ligação fraca ao ferrocene, são capazes de suprimir completamente a atividade redox de ferrocenes, no entanto, somente em concentrações de aproximadamente 10 mM e maiores. Concentrações tão altas de um supressor de redox são completamente inadequadas para imunoensaios.

[0037] Surpreendentemente foi verificado, que anticorpos monoclonais, que foram gerados por um dos inventores para a ligação de ferroceno, apresentam uma tal característica de supressão. Um novo anticorpo monoclonal particularmente eficiente liga exclusivamente a forma oxidada de ferroceno, o cátion de ferrocênio (ou ferricínio), futuramente citado como ferrocênio. Com isso, a atividade redox do ferrocênio ligado é completamente excluída, no estado ligado, essa não pode mais ser reduzida em um eletrodo (carbono vítreo, metal nobre). O anticorpo que liga o ferrocênio é utilizado nos exemplos de execução do processo de acordo com a invenção como extintor redox (em analogia ao extintor de fluorescência).

[0038] No âmbito do processo de acordo com a invenção, no entanto, também pode ser utilizado qualquer outro anticorpo, que liga o mediador redox utilizado no teste e, com isso, impede sua atividade redox (exclui). Nesse caso, para a invenção é irrelevante, se o anticorpo liga o estado oxidado ou reduzido do mediador redox. Vantagens particulares oferecem em algumas aplicações, no entanto, um

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16/27 anticorpo, que liga o mediador oxidado, tal como no caso do anticorpo de antiferrocênio, que é aplicado pela primeira vez na invenção descrita. O motivo é o potencial de detecção mais baixo, que pode ser utilizado para a redução do marcador redox (no exemplo de aplicação é detectado com +100 mV vs. Ag/AgCI, no caso da oxidação, deveria ser detectado com +250 a +400 mV, o que teria como consequência sinais inespecíficos aumentados no soro do sangue).

[0039] Esses anticorpos de marcadores redox com efeito de extinção e esses conjugados de anticorpos biespecíficos abrangentes representam um dos aspectos da presente invenção. Os anticorpos de marcadores redox com efeito de extinção de acordo com a invenção, são capazes de impedir amplamente a atividade redox do marcador redox ligado, preferivelmente em mais de 80%, de modo mais preferido, em mais de 90%, de modo ainda mais preferido, em mais de 95% ou completamente (suprimir ou extinguir).

[0040] O termo anticorpo, tal como é usado no presente pedido, deve compreender fundamentalmente também fragmentos desses que ligam especificamente, desde que do contexto não sobressaia nitidamente de outro modo.

[0041] Com um anticorpo antiferrocênio descrito aqui pela primeira vez, pode ser realizado um imunoensaio competitivo para a detecção de ferrocênio (ou ferroceno), que, no entanto, não teria qualquer significado técnico grande. Um processo tem uma alta utilidade técnica e um alto valor comercial somente se com isso, os analitos arbitrários podem ser detectados com o imunoensaio eletroquímico. Para esse fim, a formação do imunocomplexo de ferrocênio-anti-ferrocênio deve poder ser acoplada com um anticorpo monoclonal arbitrário de modo tal, que a ligação do analito alvo ao anticorpo complementar tem como consequência uma modulação da ligação de ferrocênio-antiferrocênio. O princípio elegante, descrito por Sellrie e colaboradores

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17/27 [US2008199972A] do acoplamento de duas reações imunológicas através de um conjugado dos dois antígenos, que estão ligados com um ligante muito curto, de modo que em cada caso apenas o anticorpo antipesticida ou o anticorpo anti-fluoresceína pode ligar-se, não pôde ser utilizado no caso do processo de acordo com a invenção, visto que os conjugados de ferroceno, que são acoplados com substâncias de baixo peso molecular, via de regra, não são hidrossolúveis. Para a utilização prática, deveria ser produzido um conjugado de ferrocenoanalito, que apresenta uma hidrossolubilidade suficientemente alta. O especialista conhece um número de moléculas ligadoras hidrossolúveis, que podem ser utilizadas para a síntese de bioconjugados. Ligantes de polietilenoglicol (sinônimo: ligante de óxido de polietileno, PEG, PEO) pertencem, devido à boa hidrossolubilidade, à baixa ligação inespecífica à proteínas e superfícies e à disponibilidade de um grande número de comprimentos de cadeia e funções químicas, aos ligantes hidrossolúveis mais frequentemente utilizados. Ligantes de polietilenoglicol (sinônimo: ligantes de óxido de polietileno) são moléculas lineares, que em uma ou nas duas extremidades podem apresentar funções acopláveis, por exemplo, grupos carboxila, grupos amino, grupos tiol e assim por diante. A hidrossolubilidade de ligantes de polietilenoglicol é muito alta e aumenta com crescente comprimento de cadeia do ligante.

[0042] Para produzir os conjugados usados no processo de acordo com a invenção utiliza-se um ligante hidrossolúvel bifuncional com comprimento de cadeia suficiente, por exemplo, uma ligante PEG de 4030.000 Da com duas funções acopláveis terminais, preferivelmente um ligante PEG de diamino de 2000 Da, para acoplar ferroceno em uma extremidade ou um outro mediador redox adequado e, na outra extremidade, o analito alvo. Através do uso de ligantes PEG de comprimento suficiente, os analitos insolúveis em água também podem

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18/27 ser tornados acessíveis ao teste. Ligantes homo-bifuncionais, que apresentam a mesma função de acoplamento nas duas extremidades, podem ser igualmente utilizados, tais como ligantes hetero-bifuncionais, que apresentam duas funções de acoplamento distintas.

[0043] Em estudos de ligação com os conjugados de ferrocenoanalito na presença do anticorpo anti-ferrocênio livre, do anticorpo antianalito livre e do conjugado de ferro-analito, foi demonstrado, que não se realizou qualquer modulação suficiente do sinal de ferroceno por meio dos analitos. Foi demonstrado, também, que o conjugado de ferrocênio-analito teve de ser mantido no estado oxidado durante todo o período da análise, para obter sinais mensuráveis. Surpreendentemente foi verificado, que em alguns tampões ácidos, o ferroceno fica permanentemente no estado oxidado. No processo de acordo com a invenção o ensaio é preferivelmente efetuado em valores de pH entre pH 1 e pH 7, de modo particularmente preferido, entre pH 4 e pH 5. Sais de tampões adequados são, por exemplo, fosfato, MES, HEPES, TRIS, bistris, acetato, glicilglicina, glicina.

[0044] Foi encontrado, então, um novo princípio, surpreendentemente simples, para acoplar a reação de ligação de ferrocênio-anti-ferrocênio com a reação de ligação de analito-antianalito. Para isso, foi produzido um conjugado de anticorpo biespecífico, em que o anticorpo anti-ferrocênio foi acoplado na proporção estequiométrica (1:1) com o anticorpo antianalito, usando um ligante curto com um comprimento de no máximo 10 unidades de metileno. Com isso, em primeiro lugar, a característica de supressão de sinal desejada, descrita acima, pôde ser obtida em um imunoensaio eletroquímico.

[0045] O princípio funcional, esclarecido no exemplo de um imunoensaio de progesterona competitivo, nesse caso, é tal como segue: O conjugado de anticorpo biespecífico, consistindo em um anticorpo antiprogesterona e em um anticorpo anti-ferrocênio e o

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19/27 conjugado de ferrocênio-progesterona são dissolvidos em tampão. Uma parte das moléculas de conjugado ligam-se ao conjugado de anticorpo biespecífico, a maioria delas, na extremidade anti-progesterona do conjugado de anticorpo biespecífico (visto que este anticorpo possui uma constante de afinidade mais elevada). A extremidade do ferrocênio do conjugado praticamente não é ligada, visto que o ligante PEG é curto demais para essa finalidade e, além disso, teria que assumir uma conformação dobrada, energeticamente desfavorável. Por conseguinte, a extremidade do ferrocênio é livremente acessível à medição eletroquímica (amperometria ou voltametria) e é medida uma alta corrente de redução. Se, agora, as moléculas de progesterona livres da amostra têm acesso, elas deslocam a extremidade da progesterona do conjugado de progesterona-ferrocênio dos pontos de ligação do anticorpo de progesterona. Somente agora as extremidades de ferrocênio do conjugado podem ligar-se à parte do anticorpo do antiferrocênio do conjugado de anticorpo biespecífico e é medido um baixo sinal eletroquímico (para a ilustração vide a figura 1).

[0046] Ao adicionar um excesso de conjugado de anticorpo biespecífico em comparação com o conjugado de ferrocênio-analito, a maioria dos radicais de ferrocênio do conjugado de anticorpo que são ligados e o sinal eletroquímico é quase reduzido para zero, portanto, excluído. No entanto, o especialista sabe, que a concentração de anticorpo ou a concentração do anticorpo biespecífico no imunoensaio é selecionada de modo tal, que resulta uma sensibilidade máxima para progesterona, de modo que o conjugado de anticorpo em um ensaio altamente sensível é acrescentado em excesso. Neste caso, o sinal eletroquímico (total) também não é completamente excluído com alta concentração de progesterona. Foi demonstrado, que um ensaio de progesterona é o mais sensível, quando o sinal eletroquímico pode ser excluído em apenas cerca de 50% através da adição de progesterona

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20/27 (vide figura 2).

[0047] A característica de supressão de sinal obtida ainda não foi mostrada até agora em imunoensaios eletroquímicos, porque não havia quaisquer moléculas de extinção correspondentes à disposição.

[0048] Os anticorpos antiferrocênio utilizados de acordo com a invenção, são um exemplo para uma tal molécula de extinção redox. No entanto, é igualmente possível, produzir anticorpos análogos, que ligam outros marcadores redox e excluem seu sinal. O us desses anticorpos em um conjugado de anticorpo biespecífico é igualmente parte da invenção.

[0049] A presente invenção disponibiliza um processo para a realização de imunoensaios homogêneos, diretos em solução com detecção eletroquímica sensível, que é caracterizado pelo fato de que podem ser medidas concentrações nanomolares de analitos de baixo peso molecular ou peso molecular elevado, que nenhum dos reagentes é imobilizado, não são realizadas etapas de separação e lavagem e a reação de ligação é detectada eletroquimicamente em tempo real.

[0050] A aplicação técnica do processo de acordo com a invenção é particularmente simples, visto que esta pode ser utilizada com várias técnicas eletroanalíticas, que são conhecidas pelo especialista, não exige qualquer modificação do eletrodo de medição (por exemplo, modificação química, membranas, revestimento com películas finas, estruturação lateral e assim por diante) e praticamente é arbitrariamente escalonável (redução das dimensões dos eletrodos, redução do volume de análise). Visto que o princípio de geração de sinal, isto é, a supressão da atividade redox de um mediador redox arbitrário, pode ser aplicado em todas as técnicas de medição eletroanalíticas conhecidas, tais como, por exemplo, amperometria, voltametria, coulometria, titulação amperométrica, titulação coulométrica, potenciometria, espectroscopia de impedância e assim por diante, o processo de acordo com a invenção

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21/27 pode ser combinado com todos esses processos para novas aplicações de imunoensaio. Dessa maneira, em alguns casos a amperometria pode ser o método da seleção, por exemplo, para obter um sistema total com o melhor custo possível ou para usar detetores amperométricos existentes (por exemplo, equipamentos de medição de biossensor de glicose) para o uso de imunoensaios. Dependendo do caso de aplicação e do analito desejado, é possível variar a técnica de eletroanálise, sem precisar desenvolver fundamentalmente de novo o imunoensaio.

[0051] A variabilidade e aplicabilidade técnica do novo princípio de imunoensaio evidenciam-se particularmente nítida, quando é utilizada em sistemas de análises microfluidicas (sistemas lab-on-a-chip). Isso é possível de forma particularmente simples, visto que se trata de um imunoensaio homogêneo, sem componentes imobilizados e sem etapas de separação. Os reagentes podem ser introduzidos sob forma líquida ou seca no sistema lab-on-a-chip, de modo que eles são liberados através da adição da amostra e o ensaio é iniciado. O sinal de medição pode ser medido continuamente ou apenas no início e no final da análise (depois de obter o equilíbrio de ligação). Não é necessária qualquer sincronização de decursos, etapas de dosagem e lavagem ou centrifugação, para obter o resultado da análise. Ao contrário de muitos processos de medição ótica (por exemplo, fotometria, medição de fluorescência), a proporção de sinal-para-ruido de processos eletroanalíticos também não piora na miniaturização, isto é, para eletrodos miniaturizados não precisam ser desenvolvidos quaisquer detetores e amplificadores novos e dispendiosos.

[0052] O alto valor do novo processo também é evidente no fato, de que com este, é possível realizar imunossensores descartáveis altamente sensíveis para o uso descartável, tal como, por exemplo, no teste de gravidez pelo princípio de imunoensaio de fluxo lateral atualmente convencional. A eletrônica necessária para a detecção (por

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22/27 exemplo, um circuito de conexão amperométrico) ode ser integrado em um equipamento portátil barato (por exemplo, um equipamento de medição de tira de teste de glicose) ou mesmo como eletrônica descartável (por exemplo, um circuito impresso ou um circuito de conexão altamente integrado).

[0053] O novo processo também é igualmente adequado para analisadores de laboratório, que inteiramente automáticos, efetuam paralelamente um número de diferentes imunoensaios. Aqui, o curto tempo de análise do processo de acordo com a invenção manifesta-se de 1 a 5 minutos.

[0054] Em uma forma de execução especial do processo de acordo com a invenção, os reagentes necessários são acrescentados em forma solúvel e uma detecção eletroquímica do evento de ligação é efetuada em tempo real.

[0055] Em uma outra forma de execução especial, todos os reagentes necessários são acrescentados à amostra como mistura pronta e uma detecção eletroquímica do evento de ligação é efetuado em tempo real (princípio mix-and-measure).

[0056] Em uma outra forma de execução especial, todos os reagentes necessários são postos à disposição como reagentes secos em um reservatório de reação adequado (por exemplo, tubo de Eppendorf, placa de microtitulação, sistema lab-on-a-chip, tira de teste) e esses são dissolvidos somente através da adição da amostra e opcionalmente também tampão, o que caracteriza o início da análise.

[0057] Ainda em uma outra forma de execução especial particularmente favorável, o imunoensaio é efetuado em um sistema de análise microfluídico (lab-on-a-chip).

[0058] Em uma forma de execução típica, o imunoensaio é efetuado em um analisador inteiramente automático.

[0059] Um outro aperfeiçoamento do processo de acordo com a

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23/27 invenção pode ser obtido pelo fato, de que ao invés de um eletrodo simples para a detecção, é usado um eletrodo estruturado, por exemplo, um eletrodo interdigital, com o qual a sensibilidade da análise ainda pode ser aumentada por meio da reciclagem de redox.

[0060] Uma outra modificação vantajosa do processo de acordo com a invenção consiste em que, ao invés de uma reação redox eletroquímica simples (por exemplo, redução do ferrocênio para ferroceno), é utilizada uma reação cíclica enzimaticamente catalisada (por exemplo, redução eletroquímica seguida de reoxidação enzimática de ferrocênio), uma chamada reciclagem de enzima, com a qual a sensibilidade da análise ainda pode ser aumentada.

[0061] O processo de acordo com a invenção é especialmente adequado para medições na faixa de concentração nanomolar baixa e é cerca de 1000 vezes mais sensível do que os imunoensaios eletroquímicos homogêneos conhecidos até agora sem etapas de separação. Esse enorme aperfeiçoamento da sensibilidade é obtido pelo novo princípio de sinal, descrito acima, no qual a atividade redox do conjugado ativo ao redox pode ser completamente suprimida após a ligação ao anticorpo (ao invés de diminuir apenas a constante de difusão, tal como nos processos conhecidos até agora).

[0062] O processo eletroquímico de medição, nesse caso, é tecnicamente tão simples quanto nos processos mencionados acima, visto que uma medição amperométrica ou voltamétrica simples é realizada em eletrodos convencionais, não revestidos (por exemplo, eletrodos de carbono vítreo). As etapas de manuseio manuais restringem-se à adição dos reagentes, bem como à adição da solução da amostra, uma etapa de separação não é necessária. O processo de acordo com a invenção permite também uma análise pelo princípio mixand-measure e presta-se de maneira particular para a automatização. Nesse caso, o processo de acordo com a invenção é bem escalonável,

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24/27 isto é, aplicável para volumes miniaturizados, por exemplo, em aplicações microfluídicas (lab-on-a-chip). O processo de acordo com a invenção, com base nessa característica e no baixo potencial de detecção de tipicamente +100 mV (vs. Ag/AgCI) é adequado, com isso, para a medição direta de analitos de baixo peso molecular, tais como, por exemplo, hormônios esteroidais, do mesmo modo como de analitos de peso molecular elevado, tais como, por exemplo, hCG ou marcadores de proteína em amostras biológicas complexas, tais como por exemplo, sangue.

[0063] Com isso, o processo de acordo com a invenção é adequado para um grande número de imunoensaios comercialmente significativos e é capaz, de substituir processos de detecção atuais, que são tecnicamente dispendiosos (e, com isso, caros) ou são difíceis de serem miniaturizados e automatizados. Este é adequado para aplicações no diagnóstico clínico, nas análises ambientais e de alimentos e devido a boa capacidade de miniaturizar e à simplicidade técnica, especialmente para aplicações fora do laboratório (aplicações no local, análises de ponto de cuidado (point-of-care). O processo de acordo com a invenção dispõe, com isso, do potencial de substituir em muitas aplicações os sistemas de detecção caros, convencionais, tais como, por exemplo, detetores de fluorescência ou detetores de polarização fluorescente. Breve Descrição das Figuras [0064] Figura 1: Representação esquemática do imunoensaio de acordo com a invenção no exemplo da detecção de progesterona [0065] figura 2: Curva de efeito de dose para a medição amperométrica de progesterona pelo processo de acordo com a invenção [0066] Os seguintes exemplos não restritivos devem ilustrar detalhadamente a invenção.

EXEMPLO 1

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Imunoensaio de progesterona competitivo direto em soro sanguíneo [0067] Equipamentos: célula de agitação eletroquímica 1 ml de volume de trabalho, potenciostato no modo amperométrico [0068] Tampão: tampão de acetato, pH 4,4 [0069] Amostra: soro humano não diluído, [0070] Calibrador: soro humano não diluído, misturado com 2 ng/ml, 4 ng/ml, 10 ng/ml, 20 ng/ml, 100 ng/ml, 200 ng/ml de progesterona. [0071] Etapas do processo:

• enchimento da célula de medição eletroquímica com 450 pl de tampão de acetato pH 4,4 • polarização do eletrodo de trabalho para + 100 mV (vs. Ag/AgCI) • adição de 10 μΙ de conjugado de anticorpo biespecífico (concentração final cerca de 0,1 pg/ml) • adição de 10 μΙ de conjugado de progesterona-marcador redox (concentração final cerca de 100 nM) • adição de 30 μΙ de hhCWperoxidase (concentração final de 5 mM de H2O2 0,02 nM de peroxidase) • medição do sinal básico • adição de 500 μΙ de soro humano (ou 500 μΙ de calibrador) • medição do sinal final 180 segundos depois da adição do soro.

[0072] A avaliação é efetuada com base em uma curva de efeito de dosagem previamente medida ou com base em uma calibração de 2 pontos.

EXEMPLO 2

Imunoensaio de progesterona competitivo direto na saliva [0073] Equipamentos: célula de agitação eletroquímica 1 ml de volume de trabalho, potenciostato no modo amperométrico [0074] Tampão: tampão de acetato, pH 4,4

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26/27 [0075] Amostra: saliva humana, pH 4,4 [0076] Calibrador: saliva humana diluída em 1:5, misturada com 2 ng/ml, 4 ng/ml, 10 ng/ml, 20 ng/ml, 100 ng/ml, 200 ng/ml de progesterona.

[0077] Etapas do processo:

• enchimento da célula de medição eletroquímica com 450 pl de tampão de acetato pH 4,4 • polarização do eletrodo de trabalho para + 100 mV (vs. Ag/AgCI) • adição de 10 μΙ de conjugado de anticorpo biespecífico (concentração final cerca de 0,1 pg/ml) • adição de 10 μΙ de conjugado de progesterona-marcador redox (concentração final cerca de 100 nM) • adição de 30 μΙ de hhCWperoxidase (concentração final de 5 mM de H2O2 0,02 nM de peroxidase) • medição do sinal básico • adição de 500 μΙ de saliva humana diluída em 1:5 (ou 500 μΙ de calibrador) • medição do sinal final 180 segundos depois da adição da saliva.

[0078] A avaliação é efetuada com base em uma curva de efeito de dosagem previamente medida ou com base em uma calibração de 2 pontos.

EXEMPLO 3

Imunoensaio de coriogonadotropina humana competitiva direta (hCG) na urina [0079] Equipamentos: célula de agitação eletroquímica 1 ml de volume de trabalho, potenciostato no modo amperométrico [0080] Tampão: tampão de acetato, pH 4,4 [0081] Amostra: soro humano não diluído,

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27/27 [0082] Calibrador: soro humano não diluído, misturada com 10 mUI/ml, 20 mUI/ml, 40 mUI/ml, 100 mUI/ml, 200 mUI/ml de hCG [0083] Etapas do processo:

• enchimento da célula de medição eletroquímica com 450 pl de tampão de acetato pH 4,4 • polarização do eletrodo de trabalho para + 100 mV (vs. Ag/AgCI) • adição de 10 μΙ de conjugado de anticorpo biespecífico (concentração final cerca de 0,3 pg/ml) • adição de 10 μΙ de conjugado de hCG-marcador redox (concentração final cerca de 200 nM) • adição de 30 μΙ de H2O2/peroxidase (concentração final de 5 mM de H2O2 0,02 nM de peroxidase) • medição do sinal básico • adição de 500 μΙ de soro humano (ou 500 μΙ de calibrador) • medição do sinal final 180 segundos depois da adição do soro.

[0084] A avaliação é efetuada com base em uma curva de efeito de dosagem previamente medida ou com base em uma calibração de 2 pontos.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Processo para a realização de formatos de imunoensaios homogêneos competitivos com detecção eletroquímica em solução, caracterizado pelo fato de que dois diferentes conjugados como reagentes são combinados com a amostra ou com uma mistura de tampão-amostra, sendo que um conjugado compreende um marcador redox e uma molécula de analito e o segundo conjugado compreende um anticorpo antimarcador redox ou um fragmento de ligação específico e uma molécula que liga especificamente o analito, e em que, a presença de analito livre na amostra causa ou promove a ligação do marcador redox ao anticorpo antimarcador redox sendo que através dessa ligação, a atividade redox do marcador redox ligado é impedida (extinta), e por meio disto, um sinal detectável é produzido ou modificado.
2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o marcador redox é selecionado do grupo de ferro e derivados de ferroceno, complexos de ósmio-di-bipiridila e outros complexos à base de ósmio, complexos de rutênio-bipiridila e outros complexos à base de rutênio, p-aminofenol, hexacianoferrato (ll/lll), quinonas e outros marcadores redox conhecidos para imunoensaios eletroquímicos.
3. Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o marcador redox é ferrocênio e o anticorpo antimarcador redox é um anticorpo anti-ferrocênio, preferivelmente monoclonal.
4. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1a 3, caracterizado pelo fato de que a molécula que liga especificamente o analito apresenta um anticorpo antianalito, um aptâmero, um peptídeo, um ácido nucleico ou um quelator, que liga especificamente o analito.

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5. Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a molécula que liga especificamente o analito é um anticorpo antianalito ou um fragmento deste.
6. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que os dois conjugados compreendem moléculas ligantes hidrossolúveis, especialmente ligantes PEG.
7. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que os reagentes necessários são acrescentados em forma solúvel e uma detecção eletroquímica do evento de ligação é realizada em tempo real.
8. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que todos os reagentes necessários são acrescentados à amostra como mistura pronta e uma detecção eletroquímica do evento de ligação é realizada em tempo real.
9. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que todos os reagentes necessários são postos à disposição como reagentes secos em um reservatório de reação adequado e são dissolvidos através da adição da amostra e opcionalmente tampão, através do qual se marca o início da análise.
10. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que o imunoensaio é efetuado em um sistema de análise microfluídico (lab-on-a-chip) e/ou em um analisador totalmente automático.
11. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que um eletrodo estruturado, por exemplo um eletrodo interdigital, é usado ao invés de um eletrodo simples para a detecção.
12. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que ao invés de uma

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3/3 reação redox eletroquímica simples, é utilizada uma reação cíclica catalisada enzimaticamente.