CN103091496A - 免疫测定试剂、生物传感器和检测分析物的方法 - Google Patents

免疫测定试剂、生物传感器和检测分析物的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供使用鱼精蛋白测定在样品中存在的分析物的高度灵敏的方法、以及免疫测定试剂和生物传感器，其通过鱼精蛋白与样品中存在的纤维蛋白原的静电相互作用而减少非特异性结合。

Description

免疫测定试剂、生物传感器和检测分析物的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2011年11月4日提交的韩国专利申请No.10-2011-0114524的权益、以及由其产生的全部权益，其因此通过引用引入，如同在本文中全面阐述一样。
技术领域
本公开内容涉及免疫测定试剂、生物传感器、和测定(assay)分析物的方法，其可使用鱼精蛋白以高度灵敏的方式测定样品中存在的分析物。
背景技术
生物化学结合测定广泛用于确定生物样品中包含的分析物的存在和浓度。这样的测定基于结合配偶体(binding partners)的原理。所关心的分析物与分析物结合剂(例如对所述分析物的抗体或对所述分析物的受体)结合，且所述分析物和所述分析物结合剂因此称作“结合配偶体”。当所述结合配偶体之一结合至固相时，所述测定称作“非均相测定”。这样的非均相测定包括例如夹层法、间接法和竞争法，所有术语都是本领域容易理解的。
测定的灵敏度典型地是指当与在缺乏分析物的情况下得到的信号读取相比时在通过测定产生的信号中产生统计学显著变化的分析物的最小质量。增加的灵敏度是期望的，因为其容许检测更小量的分析物以及分析物的总体更高精度的测量。
非特异性结合是指在具有固相的非均相测定体系中结合配偶体的非特异性相互作用。非特异性结合经常降低非均相测定的灵敏度，且因此期望减少这样的非特异性结合。
仍需要容许以高度灵敏的方式检测分析物的免疫测定试剂、生物传感器和测定方法。
发明内容
本文中所公开的提供用于分析物的高度灵敏的检测的免疫测定试剂，其中所述免疫测定试剂包括(a)包括所述分析物和纤维蛋白原(血纤蛋白原，fibrinogen)的样品、及(b)鱼精蛋白。所公开的还提供生物传感器，其包括：(a)基底，对分析物特异性的捕获抗体固定至所述基底；(b)免疫测定试剂，其包括(i)包括所述分析物和纤维蛋白原的样品、及(ii)鱼精蛋白；和(c)对所述分析物特异性的检测抗体。
所公开的进一步提供测定分析物的高度灵敏的方法，包括：制备包括(i)包括所述分析物和纤维蛋白原的样品、及(ii)鱼精蛋白的免疫测定试剂；向所述免疫测定试剂添加检测抗体以提供检测抗体-分析物复合物(complex)；将所述检测抗体-分析物复合物与固定在基底上的捕获抗体接触以提供检测抗体-分析物-捕获抗体复合物；和检测所述分析物。
所公开的进一步提供用于检测分析物的方法，包括：制备包括(i)包括所述分析物和纤维蛋白原的样品、及(ii)鱼精蛋白的免疫测定试剂；将所述免疫测定试剂与固定在基底上的捕获抗体接触以提供捕获抗体-分析物复合物；将所述捕获抗体-分析物复合物与检测抗体接触以提供捕获抗体-分析物-检测抗体复合物；和检测所述分析物。
附图说明
以下参照附图进一步详细地描述示例性实施方式。可理解，为了清楚可已放大所述附图的各方面：
图1是金染色(gold staining)测定的示意图；和
图2是酶联免疫吸附测定的示意图。
具体实施方式
本文提供的是包括(a)包括所关心的分析物和纤维蛋白原的样品、及(b)鱼精蛋白的免疫测定试剂、以及使用所述试剂检测分析物的方法。不希望受任何特定理论或作用机理束缚，据信在样品例如血液样品中纤维蛋白原的存在降低基于结合配偶体的分析物检测方法的灵敏度和/或特异性(specificity)。进一步据信对于这样的测定的非特异性结合、或其它干扰模式可通过如下减少：在检测前将所述样品与鱼精蛋白组合以提供免疫测定试剂。更具体地，据信改善的性能是由于鱼精蛋白与所述样品中存在的纤维蛋白原的静电相互作用，由此显著改善所述分析物的测定的灵敏度和再现性。
根据所公开的一个方面，所述分析物为肌钙蛋白I，且所公开的提供测定肌钙蛋白I的高度灵敏的方法。
在本说明书中，术语“肌钙蛋白I(TnI)”是指与肌钙蛋白T和肌钙蛋白C一起通常存在于肌肉组织中的蛋白质。肌钙蛋白I调节肌动蛋白和肌球蛋白的钙依赖性相互作用。肌钙蛋白I的的三种同种型已被鉴别：慢缩(slow-twitch)骨骼肌亚型肌钙蛋白I、快缩(fast-twitch)骨骼肌亚型肌钙蛋白I和心肌肌钙蛋白I。当与其它肌钙蛋白比较时，心肌肌钙蛋白I在N-末端具有31个额外的氨基酸残基且为心肌中存在的唯一肌钙蛋白亚型。
临床研究已证明，心肌肌钙蛋白I(cTnI)是在急性心肌梗塞(AMI)后4-6小时在血流中可检测的且之后保持升高数天(参见Mair等，Clin.Chem.，41(9)：1266-1272(1995)；和Larue等，Clin.Chem.，39(6)：972-979(1993))。因此，cTnI升高覆盖肌酸激酶-MB(CK-MB)和乳酸脱氢酶两者的诊断窗口(diagnostic window)(参见Bodor，J.Clin.Immunoassay，17(1)：40-44(1994))。进一步的研究已表明，cTnI具有比CK-MB高的对心肌损伤的临床特异性(参见Adams等，Circulation，88(1)：101-106(1993)；和Apple等，Clin.Chim.Acta237：59-66(1995))。
由于其心脏特异性和灵敏度，cTnI已用作在诊断具有不稳定心绞痛和非-ST段抬高急性冠状动脉综合征(ACS)的病人中的可靠标志(marker)。具有ACS的病人的先前临床研究已显示，cTnI值的较小增加提供关于死亡的短期和长期风险的预后(prognostic)信息(参见Lindahl等，J.Am.Coll.Cardiol.，38：1497-1498，(2001)；Venge等，Am.J.Cardiol.，89：1035-1041(2002)；Galvani等，Circulation，95：2053-2059(1997)；Antman等，N.Eng.J.Med.，335：1342-1349(1996)；Ottani等，Am.Heart J.，40：917-927(2000)；和Heidenreich等，J.Am.Coll.Cardiol.，38：478-485(2001))。最终，预后评估在鉴别最可能受益于特定治疗干预的病人中可为有用的。
但是，样品中包含的一些因素例如蛋白质、葡萄糖和离子可在TnI的免疫测定期间阻碍抗原-抗体结合。特别地，纤维蛋白原(其为以约1.5-4.0g/L的量存在于人血浆中的蛋白质)大大地阻碍抗原-抗体反应，特别是TnI-抗体反应。因此，所公开的提供通过经由将样品与鱼精蛋白组合来除去样品中包含的纤维蛋白原而减少非特异性结合、且由此改善使用所述样品的TnI测定的灵敏度和再现性的方法。
根据示例性实施方式，所公开的提供用于TnI的高度灵敏测定的免疫测定试剂。所述免疫测定试剂包括(a)包含TnI和纤维蛋白原的样品、及(b)鱼精蛋白。如所提及的，据信由于鱼精蛋白和样品中存在的纤维蛋白原的静电相互作用而产生鱼精蛋白-纤维蛋白原复合物。因此，免疫测定中的纤维蛋白原和鱼精蛋白可全部或部分地作为复合物存在于所述免疫测定试剂中。
如本文中使用的术语“样品”是指宽范围的生物学物质以及由所述生物学物质诱导或提取的组合物。包含分析物的样品可为任何合适的样品，包括但不限于血液样品如血清样品或血浆样品。
血浆是其中悬浮血细胞的血液的液体组分。例如，血浆可包含水，血浆蛋白质，脂质，糖类，无机盐，和非蛋白质的氮化合物如尿素、氨基酸和尿酸。血浆可通过任何合适的方式(例如使用离心)与血液样品中的其它组分(例如血细胞)分离。血浆样品从包含抗凝血剂如肝素钠、柠檬酸钠、氟化钠和草酸钾或乙二胺四乙酸(EDTA)钾的血液管(采血管，blood tube)得到。在一个示例性实施方式中，使用血浆样品。
如本文中使用的术语“分析物”是指待测量的物质或化学成分。在一个示例性实施方式中，分析物为肌钙蛋白如肌钙蛋白I。在优选的实施方式中，分析物为心肌肌钙蛋白I。
如本文中使用的术语“纤维蛋白原”是指存在于脊椎动物血浆和淋巴中且在血液凝固中起关键作用的因子。纤维蛋白原为具有约340,000道尔顿(340KDa)分子量的糖蛋白。在血浆中，纤维蛋白原典型地具有约1.5-4.0g/L的浓度。纤维蛋白原为包含经由二硫键彼此连接的两组三个不同链(α(A)、β(V)、γ)的六聚物。这三个链的N-末端部分包含参与链的交联的半胱氨酸。C-末端部分包含约225个氨基酸残基的域(domain)，其可用作分子识别单元。
如本文中使用的术语“鱼精蛋白”是指具有多个正离子的蛋白质，其具有+20的平均电荷量且由式1表示：
式1
Figure BSA00000760046800051
鱼精蛋白可以任何合适的量用在本发明的免疫测定试剂、生物传感器和测定方法中。例如，鱼精蛋白可以约2ng/ml-约4mg/ml的量、或约1mg/ml-约3mg/ml的量、或约1.5mg/ml-约2.5mg/ml的量使用。在一个示例性实施方式中，使用2.5mg/ml的鱼精蛋白。
根据另一示例性实施方式，提供采用所述免疫测定试剂的生物传感器。所述生物传感器包括：(a)基底，对分析物特异性的捕获抗体(分析物结合剂)固定(fix，affix，或immobilize)至所述基底；(b)免疫测定试剂，其包括(i)包括所述分析物和纤维蛋白原的样品、及(ii)鱼精蛋白；和(c)与固定至所述基底的捕获抗体相同的检测抗体。如先前讨论的，认为鱼精蛋白与来自所述样品的纤维蛋白原形成复合物。因此，纤维蛋白原和鱼精蛋白可全部或部分地作为纤维蛋白原-鱼精蛋白复合物存在于所述免疫测定试剂中。
如本文中使用的术语“生物传感器”是指能够使用分析物的特异性识别反应定性或定量地检测所述分析物的装置。取决于检测分析物的方法，生物传感器可分为基于质量的传感器(mass-based sensor)、光学传感器、电传感器和磁传感器。所述基于质量的传感器包括，但不限于，石英晶体微量天平(QCM)、悬臂传感器和表面声波(SAW)传感器。所述光学传感器包括，但不限于，使用紫外(UV)-可见光谱法、比色法和表面等离子体激元共振(SPR)的传感器。所述电传感器包括，但不限于，电化学传感器和场效应晶体管(FET)传感器。所述磁传感器包括，但不限于，磁力显微术(MFM)传感器。在一个示例性实施方式中，使用SAW传感器。
如本文中使用的术语“基底”是指由不是磁性的且不可能影响磁性纳米颗粒的材料形成的薄片。所述基底可为选自硅晶片、玻璃基底、石英基底、金属基底、和塑料基底的至少一种，但是本发明不限于此。在一个示例性实施方式中，使用硅晶片。
如本文中使用的术语“分析物结合剂”是指针对所述分析物的抗体或对于所述分析物的受体，且所述分析物和分析物结合剂称作“结合配偶体”。所述抗体可为单克隆的或多克隆的。所述抗体可为具有两种或多种抗原或表位特异性的杂交抗体或嵌合抗体。如本文中使用的术语“抗体”还包括单链抗体和抗体片段，如F(ab′)2、Fab′、Fab、scFv等。所述抗体可为可商购抗体或可通过本领域已知的技术制备(参见Harlow和Lane，Antibodies，ALaboratory Manual.Cold Spring Harbor Publications，New York(1988))。
在一个实施方式中，所述抗体为抗-肌钙蛋白I抗体、单克隆的抗-肌钙蛋白I抗体、多克隆的抗-肌钙蛋白I抗体、或者其化学或基因工程抗体。例如，单克隆的抗-肌钙蛋白I抗体选自包括如下的组：克隆(clones)A34500(结合至肌钙蛋白I的氨基酸87-91)、81-87(a34780，结合至肌钙蛋白I的氨基酸136-154)、A34650(结合至肌钙蛋白I的氨基酸41-49)、267(ab14530，结合至肌钙蛋白I的氨基酸169-184)、16A11(a24460，结合至肌钙蛋白I的氨基酸87-91)、19C7(a19615，结合至肌钙蛋白I的氨基酸41-49)、560(结合至cTnI的氨基酸83-93)或其组合，但不限于此。在一个示例性实施方式中，16A11用作所述抗-肌钙蛋白I抗体。
在一个实施方式中，在使用金染色测定增强分析物的质量后，使用所述生物传感器。使用金染色测定法测定肌钙蛋白I的方法示于图1中。
图1说明固定在基底10上的捕获抗体11。将结合至金(Au)纳米颗粒14的检测抗体13添加到通过鱼精蛋白从其中除去或复合样品中存在的纤维蛋白原的免疫测定试剂以产生“检测抗体(13)-肌钙蛋白I(12)复合物”。接着，将检测抗体(13)-肌钙蛋白I(12)复合物结合至捕获抗体11以产生“检测抗体(13)-肌钙蛋白I(12)-捕获抗体(11)复合物”，并添加HAuCl4的Au+3离子和NH2OH还原剂。所述Au+3离子被所述NH2OH还原剂还原为金纳米颗粒以产生质量-增强的Au纳米颗粒17，使得可放大信号。之后，可通过SAW传感器测量相的变化。
根据上述生物传感器，可以高灵敏度快速地测定分析物，且测定再现性可显著改善。因此，即使在低浓度下也可有效地测定分析物。
根据另一示例性实施方式，提供使用所述免疫测定试剂测定分析物的高度灵敏的方法。所述方法包括：(a)制备包括(i)包括所述分析物和纤维蛋白原的样品、及(ii)鱼精蛋白的免疫测定试剂；(b)向所述免疫测定试剂添加检测抗体以产生检测抗体-分析物复合物；(c)将所述检测抗体-分析物复合物与固定在基底上的捕获抗体结合，由此产生检测抗体-分析物-捕获抗体复合物；和(d)检测所述分析物。
或者，所述样品可在用检测抗体标记之前捕获在基底上。在该实施方式中，所述方法包括：(a)制备包括(i)包括所述分析物和纤维蛋白原的样品、及(ii)鱼精蛋白的免疫测定试剂；(b)将所述免疫测定试剂与固定在基底上的捕获抗体接触以形成捕获抗体-分析物复合物；和(c)将所述捕获抗体-分析物复合物与检测抗体接触以形成捕获抗体-分析物-检测抗体复合物；和(d)检测所述分析物。
在一些实施方式中，所述捕获抗体与所述检测抗体相同。在另外的实施方式中，所述捕获抗体与所述检测抗体不同，尽管两者优选是对于所述分析物特异性的。
所述免疫测定试剂可通过将包含所关心的分析物(例如TnI)和纤维蛋白原的样品与鱼精蛋白组合而制备。据信所述鱼精蛋白与所述样品中包含的纤维蛋白原复合。因此，所述鱼精蛋白和纤维蛋白原可完全或部分地作为鱼精蛋白-纤维蛋白原复合物存在于所述免疫测定试剂中。所述测定可以包含所述复合物的免疫测定试剂进行，或者所述复合物可在进行所述测定之前从所述免疫测定试剂除去。换句话说，在根据所公开的测定分析物的方法中，制备免疫测定试剂的步骤可进一步包括在进行如本文中阐述的步骤(b)、(c)和(d)之前从所述免疫测定试剂除去一些或全部鱼精蛋白-纤维蛋白原复合物。如本文中使用的术语“测定方法”是指检验分析物的存在、不存在或量的方法。检测所述分析物可包括检测所述捕获抗体-分析物-检测抗体复合物的存在，其中这样的复合物的存在表明所述分析物的存在。这样的检测可通过任何合适的技术进行。
所述测定方法包括，但不限于，酶联免疫吸附测定(ELISA)方法、电-化学发光测定(ECL)方法、放射免疫测定(RIA)方法、固相RIA(SPRIA)方法、免疫印迹方法(immunoblotting method)、免疫沉淀方法、免疫组织化学染色方法、或荧光激活细胞分类(FACS)方法。在一个示例性实施方式中，使用ELISA方法。
在夹层免疫测定中，分析物被固定在基底上的捕获抗体捕获。捕获抗体的固定可使用已知的技术、例如通过使用链霉抗生物素蛋白涂覆的基底实现。所述捕获抗体可被直接或间接标记。例如，所述捕获抗体可用生物素标记并结合至涂覆有链霉抗生物素蛋白的基底。或者，所述捕获抗体可未标记，且靶分析物可在结合至所述捕获抗体后结合至经标记的检测抗体。
用于所公开的标记的实例包括，但不限于，已知的标记如萤光素酶、萤光素、马来酸脱氢酶、脲酶、过氧化物酶如辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(AP)、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶、杂环(hetorocyclic)氧化酶、乳过氧化物酶和微过氧化物酶、及其组合。HRP氧化邻苯二胺(OPD)或3，3′，5，5′-四甲基联苯胺氢氯化物(TMB)，且AR氧化对硝基苯基磷酸酯。在一个示例性实施方式中，使用HRP标记和TMB。
所述测定方法可使用ELISA方法进行。使用ELISA方法检测肌钙蛋白I的方法示于图2中。
首先，将捕获抗体11固定到基底10上。将用HRP酶15标记的检测抗体13添加到通过鱼精蛋白从其中除去样品中存在的纤维蛋白原的免疫测定试剂，以产生“检测抗体(13)-肌钙蛋白I(12)复合物”。接着，将检测抗体(13)-肌钙蛋白I(12)复合物结合至捕获抗体11以产生“检测抗体(13)-肌钙蛋白I(12)-捕获抗体(11)复合物”。在添加TMB16后，通过使用显色反应测量光的强度。
根据所述测定方法，可以高灵敏度快速地检测分析物。例如，根据上述测定方法，分析物如肌钙蛋白I的测定灵敏度比当不使用本发明的免疫测定试剂时显著改善，例如至少2、3、4或5倍。而且，根据上述测定方法，分析物如肌钙蛋白I的测定的再现性比当不使用本发明的免疫测定试剂时显著改善，例如至少2、3或4倍。
下文中，仅为了描述提供多种实施方式，且保护范围不限于本文中阐述的实施方式。
实施例1
该实施例证明在使用ELISA的免疫反应中鱼精蛋白的效果。
将25mg/ml鱼精蛋白添加到从人体分离的血浆，并离心以提取上清液。对所提取的上清液进行ELISA。在该情况下，使用用HRP标记的16A11作为检测抗体，且鉴别由于TMB氧化反应的发光信号的强度。结果示于表1中。
表1
  鱼精蛋白(mg/ml)   肌钙蛋白I(0ng/ml)   肌钙蛋白I(100ng/ml)   斜率(slope)
  0   0.00625   0.0115   0.0000525
  CV(％)   35.4   24.7
  2.5   0.0084   0.09405   0.0008565
  CV(％)   10.8   11.3
CV：变化系数
参照表1，当添加鱼精蛋白时，所有发光信号增加大于不添加鱼精蛋白时。而且，CV％分别从35.4和24.7降低到10.8和11.3，证明测定重现性显著改善。
实施例2
该实施例证明在使用金染色测定的免疫反应中鱼精蛋白的效果。
将25mg/ml鱼精蛋白添加到从人体分离的血浆，并离心以提取上清液。对所提取的上清液进行金染色测定。在该情况下，Au离子被还原为结合至检测抗体的Au纳米颗粒，使得Au纳米颗粒的尺寸增加以得到质量增强的Au纳米颗粒。因此，使用SAW传感器测量相变化的斜率。结果示于表2中。
表2
  鱼精蛋白(mg/ml)   肌钙蛋白I(0ng/ml)   肌钙蛋白I(10ng/ml)   斜率
  0   3   6.2   0.32
  CV(％)   25.9   23.1
  2.5   12.4   57   4.46
  CV(％)   8.3   7.9
参照表2，当添加鱼精蛋白时，所有相斜率增加大于不添加鱼精蛋白时。而且，CV％分别从25.9和23.1降低到8.3和7.9，证明测定重现性显著改善。
如由实施例1和2的结果明显的，当添加鱼精蛋白时，分析物如肌钙蛋白I的测定的灵敏度和再现性显著改善。
尽管在本文中已公开了示例性实施方式，但是应理解，其它变化可为可能的。这样的变化不被认为脱离示例性实施方式的范围，且如将对本领域技术人员来说显见的所有这样的变更意图包括在所附权利要求的范围内。
本文中列举的所有参考文献(包括出版物、专利申请和专利)都通过参考以如同各参考文献被独立且具体地表明通过参考引入且在本文中全部阐述的程度据此引入。
在描述本发明的上下文中(特别是在所附权利要求的上下文中)术语“一个(种)”和“该”及类似对象的使用将被解释为包括单数和复数，除非在本文中另外表示或与上下文明显矛盾。术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”将被解释为开放式术语(即意味着“包括，但不限于”)，除非另外注明。本文中数值范围的列举仅意在用作单独指出落在所述范围内的各单独值的速记方法，除非在本文中另外表明，且各单独值如同其在本文中单独列举一样引入说明书中。在本文中描述的所有方法可以任何合适的顺序进行，除非在本文中另外表明或与上下文明显矛盾。本文中提供的任何和全部实例、或示例性语言(如“例如(如)”)仅意在更好地说明本发明，且不对本发明的范围施加限制，除非另外要求。在说明书中的语言都不应解释为表明任何非要求的要素作为本发明的实践所必须的。
在本文中描述了本发明的优选实施方式，包括发明人已知的用于实施本发明的最好方式。在阅读上述描述时，这些优选实施方式的变化对于本领域技术人员来说可变得明晰。发明人期望技术人员适当使用这样的变化，且发明人意图本发明与如本文中具体描述的不同地实践。因此，本发明包括由适用法律所容许的在所附权利要求中列举的主题的全部变更和等价物。而且，在其所有可能的改变中的上述要素的任何组合被本发明覆盖，除非在本文中另外表明或与上下文明显矛盾。

Claims (23)

1.用于分析物的高度灵敏的检测的免疫测定试剂，包括(a)包含所述分析物和纤维蛋白原的样品、及(b)鱼精蛋白，其中所述纤维蛋白原和鱼精蛋白可为鱼精蛋白-纤维蛋白原复合物的部分。
2.权利要求1的试剂，其中所述分析物为肌钙蛋白I。
3.权利要求1的试剂，其中所述样品为血浆。
4.权利要求1的试剂，其中以约2纳克/毫升-约4毫克/毫升的量包含所述鱼精蛋白。
5.生物传感器，包括：
(a)基底，对分析物特异性的捕获抗体固定至所述基底；
(b)根据权利要求1-4中任一项的免疫测定试剂；和
(c)与固定至所述基底的所述捕获抗体相同的检测抗体。
6.权利要求5的生物传感器，其为基于质量的传感器、光学传感器、电传感器或磁传感器。
7.权利要求5的生物传感器，其中所述基底为选自硅晶片、玻璃基底、石英基底、金属基底、和塑料基底的至少一种。
8.检测分析物的高度灵敏的方法，包括：
制备根据权利要求1-4中任一项的免疫测定试剂；
向所述免疫测定试剂添加检测抗体以产生检测抗体-分析物复合物；
将所述检测抗体-分析物复合物与捕获抗体结合，由此产生检测抗体-分析物-捕获抗体复合物；和
检测所述分析物。
9.权利要求8的方法，其中检测所述分析物包括使用酶联免疫吸附测定(ELISA)、电-化学发光测定(ECL)、放射免疫测定(RIA)、固相RIA(SPRIA)、免疫印迹、免疫沉淀、免疫组织化学染色、或荧光激活细胞分类(FACS)。
10.权利要求8的方法，其中所述捕获抗体或检测抗体用萤光素酶、萤光素、马来酸脱氢酶、脲酶、过氧化物酶、碱性磷酸酶(AP)、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶、杂环氧化酶、乳过氧化物酶或微过氧化物酶标记。
11.权利要求8的方法，其中使用包括鱼精蛋白的免疫测定试剂的测定的灵敏度比没有鱼精蛋白的相同测定的大。
12.权利要求8的方法，进一步包括将对所述分析物特异性的捕获抗体固定至基底。
13.权利要求8的方法，其中所述捕获抗体和所述检测抗体相同。
14.权利要求8的方法，其中制备免疫测定试剂包括将包括分析物和纤维蛋白原的样品与鱼精蛋白组合以形成鱼精蛋白-纤维蛋白原复合物。
15.权利要求8的方法，其中所述方法进一步包括在将所述免疫测定试剂与检测抗体接触之前，从所述免疫测定试剂除去所述鱼精蛋白-纤维蛋白原复合物。
16.检测分析物的高度灵敏的方法，包括：
制备根据权利要求1-4中任一项的免疫测定试剂；
将所述免疫测定试剂与捕获抗体接触以形成捕获抗体-分析物复合物；
将所述捕获抗体-分析物复合物与检测抗体接触以形成捕获抗体-分析物-检测抗体复合物；和
检测所述分析物。
17.权利要求16的方法，其中检测所述分析物包括使用酶联免疫吸附测定(ELISA)、电-化学发光测定(ECL)、放射免疫测定(RIA)、固相RIA(SPRIA)、免疫印迹、免疫沉淀、免疫组织化学染色、或荧光激活细胞分类(FACS)。
18.权利要求16的方法，其中所述捕获抗体或检测抗体用萤光素酶、萤光素、马来酸脱氢酶、脲酶、过氧化物酶、碱性磷酸酶(AP)、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶、杂环氧化酶、乳过氧化物酶或微过氧化物酶标记。
19.权利要求16的方法，其中使用包括鱼精蛋白的免疫测定试剂的测定的灵敏度比没有鱼精蛋白的相同测定的大。
20.权利要求16的方法，进一步包括将对所述分析物特异性的捕获抗体固定至基底。
21.权利要求16的方法，其中所述捕获抗体和所述检测抗体相同。
22.权利要求16的方法，其中制备免疫测定试剂包括将包括分析物和纤维蛋白原的样品与鱼精蛋白组合以形成鱼精蛋白-纤维蛋白原复合物。
23.权利要求16的方法，其中所述方法进一步包括在将所述免疫测定试剂与捕获抗体接触之前，从所述免疫测定试剂除去所述鱼精蛋白-纤维蛋白原复合物。
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C06 Publication
PB01 Publication
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

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