JP2005017133A - 免疫組織化学的染色方法による抗原の検出方法 - Google Patents
免疫組織化学的染色方法による抗原の検出方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2005017133A JP2005017133A JP2003183193A JP2003183193A JP2005017133A JP 2005017133 A JP2005017133 A JP 2005017133A JP 2003183193 A JP2003183193 A JP 2003183193A JP 2003183193 A JP2003183193 A JP 2003183193A JP 2005017133 A JP2005017133 A JP 2005017133A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- antigen
- reaction
- solution
- antibody
- substance
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54393—Improving reaction conditions or stability, e.g. by coating or irradiation of surface, by reduction of non-specific binding, by promotion of specific binding
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/5306—Improving reaction conditions, e.g. reduction of non-specific binding, promotion of specific binding
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Sampling And Sample Adjustment (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
【課題】本発明は、抗原の検出に際して、検出時間の大幅な短縮、染色に用いる色素の選別、方法の自動化にも適する抗原の検出方法を提供することにある。
【解決手段】本発明の抗原の検出方法は、呈色物又は発光物で抗原を多重染色する多重免疫組織化学的染色方法を用いて二以上の異なる抗原を検出する抗原の検出方法であって、非特異反応抑制処理を行なうことによって、一次抗体と非特異的に結合する非特異的結合物質へ非特異反応抑制物質を被膜し、前記一次抗体と非特異的結合物質との結合を抑制することを特徴とする。
【選択図】 なし
【解決手段】本発明の抗原の検出方法は、呈色物又は発光物で抗原を多重染色する多重免疫組織化学的染色方法を用いて二以上の異なる抗原を検出する抗原の検出方法であって、非特異反応抑制処理を行なうことによって、一次抗体と非特異的に結合する非特異的結合物質へ非特異反応抑制物質を被膜し、前記一次抗体と非特異的結合物質との結合を抑制することを特徴とする。
【選択図】 なし
Description
【０００１】
【発明が属する技術分野】
本発明は、抗原の検出方法に関し、特に、多重免免疫組織化学的染色方法を用いた抗原の検出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年の免疫科学の進歩により、抗原抗体反応を用いて微量の物資を感度良く検出する免疫測定が広く用いられている。免疫測定の中で一般的なものとして、免疫組織染色及び酵素免疫測定がある。
【０００３】
免疫組織染色とは、組織上の特定の抗原を、その抗原を特異的に認識する抗体によって検出する方法である。通常、組織を固定後パラフィン包埋したブロックから薄切した切片上に特定の抗原を認識する抗体を反応させ、反応した抗体の有無から抗原の存在を判断する。最初に抗原と反応させる抗体を、通常、第一抗体と呼ぶ。第一抗体に、視覚又は機器により検出し得るシグナルを発する物質を結合させておけば、そのシグナルの強度から第一抗体の量がわかり、それは即ち切片上の抗原の量に対応する。この目的を達成するためのシグナルを発する物質として蛍光物質、酵素などが挙げられる。
【０００４】
光学顕微鏡での染色像の解析が可能となった現在では、シグナルを発する物質として酵素を用いるのが一般的となった。免疫組織染色を行なう際、第一抗体に酵素を結合させておけば、その酵素の発色性の基質を加えることにより酵素活性に対応した発色が得られ、それは抗体の量に対応、即ち組織上に存在する抗原の量に対応する。しかし、この方法では通常十分な感度が得られない。
【０００５】
抗原を検出する免疫組織化学的染色方法には、一次抗体を可視化できる酵素や標識物で標識したものを用いる直接法と一次抗体を標識せずに二次抗体を標識する間接法があることが記載されている（酵素抗体法 学際企画 ２０００２．２．１８発刊、ｐ．２３−２５（以下、非特許文献１という））。一般に、間接法には、抗原を一次抗体で標識した後に、この特異抗体を標識する間接法に属するペルオキシダーゼ抗ペルオキシダーゼ法（以下、ＰＡＰ法という）、ストレプトアビチンービオチン複合体法（以下、ｓＡＢＣ法という）、二次抗体と標識酵素とのポリマーへ結合させたポリマー試薬法、ＦＩＴＣで標識した一次抗体ないし二次抗体をＨＲＰ標識抗ＦＩＴＣ抗体を用いる方法、ｓＡＢＣ法に異化レポーター沈着反応（以下、ＣＡＲＤという）を追加した超高感度の免疫組織化学的染色方法がある。
【０００６】
ＰＡＰ法は、「改訂四版 渡辺・中根 酵素抗体法 名倉宏、長村義之、堤寛編 学際企画 ２０００２．２．１８発刊、非特許文献１」に記載されている。これには、ウサギの一次抗体を反応させ、次ぎに、過剰なブタ抗ウサギ抗体を反応させる方法である（当該文献、ｐ．１３６−１３８）。ブタ抗ウサギ抗体の２つのウサギ抗体に対する結合部の一つに、ウサギ抗ＨＲＰ抗体とＨＲＰを可溶性結合させた複合体（ＰＡＰ複合体）を抗原抗体反応で結合する。ＨＲＰと過酸化水素水とジアミノベンチジン等のカップリング色素で抗原の存在部位に呈色反応を生じさせる。ヘマトキシリン溶液で核を対比染色した後に、濃度の漸増するエタノール系列に切片を浸し脱水し、キシレンを浸透させ、カバーガラスでプラスチック溶剤を用いて封入する。
【０００７】
次に、ｓＡＢＣ法は、上記非特許文献１のｐ．１３８−１４４に記載されている。この方法によれば、固定組織パラフィン切片のパラフィンの除去、非特許文献１のｐ．１６３に記載されている０．０３％過酸化水素水メータノール液に２０分間浸し内因性ぺルオキシダーゼ活性を抑制し、リン酸緩衝液で親水化する。切片中の抗原を一次抗体で標識する。ビオチン化二次抗体を一次抗体と反応させ、ストレプトアビチン−ＨＲＰ複合体で標識し、ＨＲＰと過酸化水素水とジアミノベンチジン等のカップリング色素で抗原の存在部位に呈色反応を生じさせる。ヘマトキシリン溶液で核を対比染色した後に、濃度の漸増するエタノール系列に切片を浸し脱水し、キシレンを浸透させ、カバーグラスでプラスチック溶剤を用いて封入する。
【０００８】
また、ＨＲＰ標識抗ＦＩＴＣ抗体を用いる方法は、上記非特許文献１のｐ．１５８に記載されている。これによれば、ｓＡＢＣ法と同様に固定標本切片を親水化し、ＦＩＴＣ標識の一次抗体で抗原を標識するか、抗原と反応させた一次抗体をＦＩＴＣ標識二次抗体で標識し、そのＦＩＴＣをＨＲＰなどの酵素で標識した抗ＦＩＴＣ抗体と反応させ、ＨＲＰなどの呈色反応で、抗原の検出を間接的に行う。ザイメッド社のホームページ（以下、非特許文献２という）に、商業的にこのキットの記載がある。
【０００９】
また、特開２００１−１８１２９９号（以下、特許文献１という）では、ポリマー試薬法が知られている。特許文献１では、ポリマーを担体として酵素（ＨＲＰなど）と抗体（蛋白）の複合体で、高感度に特異抗体で標識される物質の検出が可能との記載がある。この特許文献１の請求項１３に、ポリマー試薬法の記載がある。また、上記非特許文献１のｐ．１４７に、以下に示すポリマー試薬法の実施法の記載がある。ｓＡＢＣ法と同様に固定標本切片を親水化し、切片中の抗原を特異抗体と反応させ、二次抗体とＨＲＰ等の酵素とポリマーの複合体と反応させ、ＨＲＰなどの呈色反応で、抗原の検出を間接的に行う。商業的には、ＥＮＶＩＳＩＯＮ、ＣｈｅｍＭａｔｅ ＥＮＶＩＳＩＯＮがダコサイトメーション社から、ｓｉｍｐｌｅ ｓｔａｉｎ ｓｙｓｔｅｍがニチレイから、二次抗体の代わりに特異抗体と酵素とポリマーの複合体を用いるＥＰＯＳ ｓｙｓｔｅｍがダコサイトメーション社から供給されている。
【００１０】
また、ＣＡＲＤは、米国特許第 ５，７３１，１５８ 号（以下、特許文献２という）に記載があり、この特許文献２では、ｃｌａｉｍ ９に、ビオチン化タイラマイドや蛍光標識（フルオレスシン・イソサイアネート（ＦＩＴＣ）等）タイラマイドの利用の記述がある。この特許文献２の請求項９に、ビオチン化タイラマイドのＣＡＲＤの記載がある。上記非特許文献１のｐ．１５０−１５２とＪＩｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ． １９８９（以下、非特許文献３という）では、酵素反応での特異物質の沈着を特定の物質の検出の増幅に用い、超高感度の検出が可能であるとの記載がある。また、Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ．（以下、非特許文献４という）では、化学固定された組織のパラフィン切片で、抗原回復処理と〔非特許文献１〕の標識シグナルの増幅法の組み合わせ（ＩｍｍｕｎｏＭａｘ法）で、化学固定された組織のパラフィン切片では検出できなかった抗原を検出することができるとの記載がある。上記非特許文献３及び上記非特許文献４に、超高感度の免疫組織化学的染色法の以下に示す実施法の記載がある。すなわち、ｓＡＢＣ法と同様に固定標本切片を親水化し、抗原回復し、ｓＡＢＣ法で抗原を標識し、ＨＲＰによるビオチン化タイラマイドを沈着させ、ストレプトアビチン−ＨＲＰ複合体で標識増幅を行い、抗原の検出感度をｓＡＢＣ法の１０００倍に増幅する超高感度の免疫組織化学的染色を行う方法である。この染色方法はＩｍｍｕｎｏＭａｘ法として報告され、商業的にはｃａｔａｌｙｚｅｄ ｓｉｇｎａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ （ＣＳＡ） ｓｙｓｔｅｍとしてダコサイトメーション社より供給されている。しかし、抗原回復による内因性ビオチンによる非特異反応は強く、非特許文献１のｐ１６４−１６５に記載の内因性ビオチンを０．１％アビチン溶液と０．０１％ビオチン溶液に浸しマスクする方法を導入したものが開発された。そして、ＤＥＮＤＲＩＴＩＣ ＣＥＬＬＳ １９９７（以下、非特許文献５という）と平成１０年度〜平成１１年度科学研究費補助金（基盤研究（Ｃ）（２））研究成果報告書 ＨＴＬＶ−１関連疾患のＨＴＬＶ−１超高感度組織科学的検出法による研究（以下、非特許文献６という）に記載のｍｏｄｉｆｉｅｄ ＩｍｍｕｎｏＭａｘ法が開発された。また、ｓＡＢＣ法の代わりに、ＨＲＰ標識抗ＦＩＴＣ抗体を用いる方法に、ＨＲＰによるビオチン化タイラマイドを沈着させ、ストレプトアビチン−ＨＲＰ複合体で標識増幅を行い、抗原の検出感度をＨＲＰ標識抗ＦＩＴＣ抗体を用いる方法の１０００倍に増幅する超高感度の免疫組織化学的染色方法がキット化され、非ビオチン法としてザイメット社から供給されている。さらに、米国特許第 ６，２０３，９８９号（以下、特許文献５という）では、標的核酸を標識するｉｎ−ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎの増幅したシグナルを可視化する方法として、ＨＲＰ、アルカリフォスファターゼなどの酵素反応の他に、蛍光標識（フルオレスシン・イソサイアネート（ＦＩＴＣ）等）が利用できるとの記載がある。特許文献２の請求項９と特許文献５にＣＡＲＤでの沈着したタイラマイドの標識に、蛍光物質を使う記載がある。
【００１１】
現在、固定組織標本パラフィン切片中の二つ以上の抗原を検出する免疫組織化学的染色方法には、二つの抗原（以下、第１抗原と第２抗原と記載）を検出する場合には、第１抗原を検出し呈色反応物（以下カップリング色素という）ないし発光反応物の沈着を含む免疫組織化学的染色後に、沈着したカップリング色素ないし発光反応物以外の免疫反応産物をｐＨ３以下ないしｐＨ９以上の緩衝液で洗浄することで除去し、第２抗原の免疫組織化学的染色を行う古典的多重免疫組織化学的染色方法がある。
【００１２】
また、古典的多重免液組織化学的染色方法の、一般的な説明と実施法の解説が知られている（ザイメッド社のホームページ、ｐ．１９１−１９４（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｚｙｍｅｄ．ｃｏｍ／）のＮＢＡ ｋｉｔ（非ビオチン法のキット）のページ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｚｙｍｅｄ．ｃｏｍ／ｐｉｎｄｅｘ／ｉｎｄｅｘ９．ｈｔｍｌ）。この染色方法で行われる沈着したカップリング色素ないし発光反応物以外の免疫反応産物をｐＨ３以下ないしｐＨ９以上の緩衝液での洗浄は、一般に、０．１Ｍグリシン塩酸緩衝液ｐＨ２．２が用いられ、第１抗原の免疫組織化学的染色を終えた固定組織パラフィン標本切片をこの緩衝液に浸し、室温で、数時間、攪拌させながらこの緩衝液を３度は交換することで行われると記載されている。また、この文献においては、加熱処理によって、抗原回復を行なうことも記載されている。すなわち、この文献のｐ．１９５に抗原回復の加熱処理を行うことで第１抗原の検出の免疫反応産物の沈着したカップリング色素ないし発光反応物以外の免疫反応産物を無効又は除去する方法の説明の記載がある。この方法は、一般に、第１抗原の免疫組織化学的染色を終えた固定組織パラフィン標本切片を０．０１Ｍクエン酸緩衝液ｐＨ６．０に浸し、加熱型攪拌器やオートクレーブで加熱することにより行われる。抗原回復の加熱処理を行うことで第１抗原の検出の免疫反応産物の沈着したカップリング色素ないし発光反応物以外の免疫反応産物を無効又は除去する方法の一つが、ダコサイトメーション社からキット化されて供給されている。
【００１３】
その他に、免疫組織化学的染色方法に含まれる抗原抗体反応等の飽和状態を利用するか、抗原回復の加熱処理を行うことで第１抗原の免疫組織化学的染色の沈着したカップリング色素ないし発光反応物以外の免疫反応産物を無効又は除去し、第２抗原を検出する免疫組織化学的染色の呈色ないし発光反応反応物の酵素反応における酵素を例えば西洋ワサビペルオキシダーゼからアルカリフォスファターゼに変えて実施する方法がある。
【００１４】
また、第１抗原と第２抗原を検出する免疫組織化学的反応の特異抗体（以下一次抗体という）の抗原性の異なるものを用いるか、異なる抗原抗体反応ないし化学的反応で特異的に検出できる標識物例えばフルオレスシン・イソチオネート（以下ＦＩＴＣという）で標識した一次抗体を用いて、同時に第１抗原と第２抗原を標識し、その標識された二つの抗原を一次抗体の抗原性ないし標識物の特異性に依存して検出する方法がある。
【００１５】
これらの二つ以上の抗原を検出する免疫組織化学的染色方法は多重免疫染色法と呼ばれるが、三つ以上の抗原を検出する方法は実用性があまり無く、実用性のある二つの抗原を検出する免疫組織化学的染色方法が二重免疫染色法と呼ばれている。この多重免疫染色法は、一般に、免疫組織化学的染色方法で一度検索された二つの抗原の関係を知る為に用いられる。
【００１６】
また、免疫組織化学的染色における非特異反応は、目的とする抗原以外の非特異的結合物質をも染色され、ひいては目的とする抗原として最終的に検出されてしまうという問題がある。
【００１７】
このような非特異反応は、固定組織標本切片に内在する原因によるものと固定組織標本切片の処理に起因するもの、染色の各反応の試薬の問題、染色の各反応後の洗浄の問題、染色操作の問題が原因となるものがある。
【００１８】
このような非特異的反応による問題を解決するために、内因性ぺルオキシダーゼ活性による非特異反応の抑制方法が知られている（上記非特許文献１のｐ．１６３）。内因性ぺルオキシダーゼ活性による非特異反応は、固定組織標本切片の内在する原因による非特異反応の一つである。内因性ぺルオキシダーゼ活性の抑制は、固定組織標本パラフィン切片のパラフィンを除き親水化の前に、０．０３％過酸化水素メタノール溶液に切片を２０分間浸すか、親水化後に０．３％過酸化水素リン酸緩衝液に５分間浸して行なう。
【００１９】
抗体の非特異反応は、染色の各反応の試薬の問題、染色の各反応後の洗浄の問題による非特異反応に含まれる。染色に関わる非特異的反応の問題に対して、断片化免疫グロブリン抗体を特異（一次）抗体や二次抗体に用いることで非特異反応を抑制することが知られている米国特許第 ５，８６９，２７４ 号（以下、特許文献４という）では、特異抗体反応の前に一価の抗体を反応させることで、抗体の非特異反応を抑制できるとの記載がある。この特許文献４と上記非特許文献１のｐ．４３）。非特許文献１のｐ． １８５に、抗体希釈液に一次抗体と対応したウマ、ヒツジ、ウサギなどの動物血清を１％から５％加えることで非特異反応を抑制することの記載がある。また、非特許文献１のｐ．１１５に、０．２５％カゼイン溶液を抗体反応の前に５〜３０分間反応させることで非特異反応抑制することの記載がある。抗体希釈液に０．１％Ｔｗｅｅｎ２０などの界面活性剤を添加したトリス緩衝液が商業的に供給され用いられている。
【００２０】
また、抗原回復法による非特異反応は、固定組織標本切片の処理に起因するものであるが、超高感度の免疫組織化学的染色法で問題となる。その主たる原因が抗原回復された内因性ビオチンである。非特許文献１のｐ１６４−１６５に、０．１％アビチン溶液で、内因性ビオチンをマスクし、アビチンの残余ビオチンとの結合部を０．０１％ビオチン溶液でマスクする方法の知られている。この方法をｓＡＢＣ法を含む超高感度の免疫組織化学的染色方法に導入することも知られている（Ｈａｓｕｉ Ｋ， Ｓａｔｏ Ｅ， Ｔａｎａｋａ Ｙ， Ｙａｓｈｉｋｉ Ｓ， Ｉｚｕｍｏ Ｓ． （１９９７） Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｈｉｇｈｌｙ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ ＩｍｍｕｎｏＭａｘ） ｏｆ ＨＴＬＶ−１ ｐ４０ｔａｘ ａｎｄ ｐ２７ｒｅｘ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ＨＴＬＶ−１−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｎｏｎ−ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ ｌｙｍｐｈａｄｅｎｏｐａｔｈｙ （ＨＡＮＮＬＡ） ｗｉｔｈ ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ ｏｆ ＨＴＬＶ−１ｄｏｓｅ ｂｙ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ． ＤＥＮＤＲＩＴＩＣ ＣＥＬＬＳ １９９７ Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ７：１９−２７．（以下、非特許文献５という。））。この非特許文献５には、〔非特許文献２〕のＩｍｍｕｎｏＭａｘ法で、内因性ビオチンによる非特異反応があり、従来発表されているアビチン溶液とビオチン溶液でのビオチンのマスクを導入し、反応後の洗浄条件を変えることで、超高感度免疫組織化学染色が可能であるとの記載がある。（蓮井和久 平成１０年度〜平成１１年度科学研究費補助金（基盤研究（Ｃ）（２））研究成果報告書 ＨＴＬＶ−１関連疾患のＨＴＬＶ−１超高感度組織科学的検出法による研究（課題番号 １０６７０１６６））（以下非特許文献６という）。この文献には、平成１２年３月 ｐ．３−９では、ＨＲＰによるビオチン化タイラマイドの沈着反応による標識の増幅が１０００倍であること、内印性ビオチンのマスク法の超高感度免疫染色法への至適導入部、各超高感度免疫組織科学的染色の反応後の洗浄、後固定の非特異反応抑制条件等の記載がある。
【００２１】
免疫組織化学的染色法の洗浄液は、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、界面活性剤を加えたトリス緩衝液が用いられる。免疫組織化学的染色では、各反応後に、５分間３回の洗浄が行われる。非特許文献５と非特許文献６に、超高感度免疫組織化学的染色方法では、それに含まれるｓＡＢＣ法では充分な反応後の洗浄が必要であり、ＣＡＲＤのビオチン化タイラマイドの沈着は非特異なものであるので、非沈着ビオチン化タイラマイドの残留を除く洗浄と沈着ビオチン化タイラマイドのＨＲＰ標識ストレプトアビチンによる標識後のある程度の洗浄が必要になることの記載がある。また、非特許文献５と非特許文献６に、キャピラリーギャップ法の染色装置を用いた場合には、ｓＡＢＣ法の充分な洗浄は３５℃に加熱した界面活性剤を加えたトリス緩衝液で、ＨＲＰによるビオチン化タイラマイド沈着反応後は室温トリス緩衝液での洗浄が必要であるとの記載がある。
【００２２】
一方、免疫組織化学的染色法の基準化の為に、自動免疫染色装置が普及してきている。キャピラリーギャップ法と呼ばれる２枚の固定組織標本切片のスライドグラスを向き合わせ、その間に毛細管現象を利用して反応液や洗浄液を吸い上げ、反応ないし洗浄後に吸収材で溶液を吸収する。この操作をコンピューター制御するものである。また、コンピューター制御で、反応液や洗浄液を所定の場所からマイクロポンプで吸引し、水平に配置した固定組織標本切片のスライドグラスに反応液や洗浄液を滴下する滴下型がある。この滴下型の自動免疫染色装置の染色方法は用手法と同じもので、普及して来ている。更に、加熱温度制御の出来る基盤の上に、基盤に固定組織標本切片を対面させてスライドガラスをセットし、反応液や洗浄液を基盤とスライドガラスの間に送り、温度制御下で諸反応と洗浄を行う自動免疫装置も出現している。
【００２３】
自動免疫染色装置は、コンピューター制御下の装置で、組織化学的染色方法を実施するものである。組織標本の切片を貼付したスライドの装置へのセットの方法で、二枚のスライドを狭い間隙で重ね、その間に毛細管現象で反応試薬等は入ってくるキャピラリーギャップ法とその変法、スライドに反応試薬等を滴下する滴下型がある。また、免疫組織染色方法の各反応の時間、各反応後の洗浄の方法等をコンピューターのプログラムとして供給されているものと、各反応の試薬の各スライドへの分配、各反応の時間、各反応後の洗浄方法を、任意に設定できるものがある。前者は、特定の免疫組織化学的方法を実施するもの（固定型装置）であり、一般に、その試薬や洗浄液等が共に供給されることが多い。後者は、その使用者の設定した免疫組織化学的染色法を実施させることが可能なもの（自由型装置）がある。米国特許第 ６，３４９，２６４号（以下、特許文献３という）では、コンピューター制御による水平に配列したスライドへの滴下方式での自動免疫染色装置の記載がある。この特許文献３に、この自由型装置の記載がある。また、Ａｐｐｌ Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍ Ｍｏｌ Ｍｏｒｐｈｏｌ． ２００１ Ｍａｒ（以下、非特許文献７という）では、抗原回復を加熱式攪拌装置での熱処理による抗原回復法と従来発表されているアビチン溶液とビオチン溶液でのビオチンのマスクを導入した超高感度免疫染色法（ＣＳＡ法）の自動免疫染色装置での実施が可能であるとの記載がある。この非特許文献７には、この自動免疫染色装置での超高感度の免疫組織化学的染色が可能であると記載されている。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｖｅｎｔａｎａｄｉｓｃｏｖｅｒｙ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ（以下、非特許文献８という）では、加熱温度制御の出来る基盤の上に、基盤に対応する面に固定組織標本切片が来る形でスライドグラスをセットし、反応液や洗浄液を基盤とスライドグラスの間に送り、温度制御下で諸反応と洗浄を行う自動免疫装置（Ｔｈｅ Ｖｅｎｔａｎａ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）の記載がある。この非特許文献８には、加熱温度制御の出来る基盤の上に、基盤に対面して固定組織標本切片のスライドガラスをセットし、反応液や洗浄液を基盤とスライドガラスの間に送り、温度制御下で諸反応と洗浄を行う自動免疫装置の記載がある。
【００２４】
【特許文献１】
特開２００１−１８１２９９号公報（株式会社ニチレイ、平成１３（２００１）年７月３日、酵素−タンパク質複合体）。
【特許文献２】
米国特許第 ５，７３１，１５８ 号公報明細書 （Ｂｏｂｒｏｗ， ｅｔ ａｌ． Ｍａｒｃｈ ２４， １９９８， Ｃａｔａｌｙｚｅｄ ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ）。
【特許文献３】
米国特許第 ６，３４９，２６４号公報明細書 （Ｒｈｅｔｔ， ｅｔ ａｌ． Ｆｅｂｒｕａｒｙ １９， ２００２ Ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ ａｐｐａｒａｔｕｓ ｆｏｒ ａｕｔｏｍａｔｉｃ ｔｉｓｓｕｅ ｓｔａｉｎｉｎｇ）。
【特許文献４】
米国特許第 ５，８６９，２７４ 号公報明細書 （Ｔｓａｏ， ｅｔ ａｌ． Ｆｅｂｒｕａｒｙ ９， １９９９ Ｉｍｍｕｎｏ−ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄ ｔｈａｔ ｒｅｄｕｃｅｓ ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ ｓｔａｉｎｉｎｇ ）。
【特許文献５】
米国特許第 ６，２０３，９８９号公報明細書 （Ｇｏｌｄｂｅｒｇ ， ｅｔ ａｌ． Ｍａｒｃｈ ２０， ２００１ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ａｍｐｌｉｆｙｉｎｇ ｄｅｔｅｃｔａｂｌｅ ｓｉｇｎａｌｓ ｉｎ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｓｓａｙｓ ）。
【非特許文献１】
改訂四版 渡辺・中根 酵素抗体法 名倉宏、長村義之、堤寛編 学際企画 ２０００２．２．１８発刊
【非特許文献２】
ザイメッド社のホームページ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｚｙｍｅｄ．ｃｏｍ／）のＮＢＡ ｋｉｔ（非ビオチン法のキット）のページ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｚｙｍｅｄ．ｃｏｍ／ｐｉｎｄｅｘ／ｉｎｄｅｘ９．ｈｔｍｌ）
【非特許文献３】
Ｂｏｂｒｏｗ ＭＮ， Ｈａｒｒｉｓ ＴＤ， Ｓｈａｕｇｈｎｅｓｓｙ ＫＪ， Ｌｉｔｔ ＧＪ． Ｃａｔａｌｙｚｅｄ ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ， ａ ｎｏｖｅｌ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｓｉｇｎａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ． Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ． Ｊ−Ｉｍｍｕｎｏｌ−Ｍｅｔｈｏｄｓ． １９８９ Ｄｅｃ ２０； １２５（１−２）： ２７９−８５。
【非特許文献４】
Ｍｅｒｚ Ｈ， Ｍａｌｉｓｉｕｓ Ｒ， Ｍａｎｎｗｅｉｌｅｒ Ｓ， Ｚｈｏｕ Ｒ， Ｈａｒｔｍａｎｎ Ｗ， Ｏｒｓｃｈｅｓｃｈｅｋ Ｋ， Ｍｏｕｂａｙｅｄ Ｐ， Ｆｅｌｌｅｒ ＡＣ （１９９５） ＩｍｍｕｎｏＭａｘ． Ａ ｍａｘｉｍｉｚｅｄ ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｒｅｔｒｉｅｖａｌ ａｎｄ ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｏｆ ｈｉｄｄｅｎ ａｎｔｉｇｅｎｓ． Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ． Ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ａｎｄ Ｃａｎａｄｉａｎ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ． ＬＷＷ， Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ ｐｕｂｌｉｓｈｅｓ １９９５ Ｊｕｌ；７３（１）：１４９−５６．。
【非特許文献５】
Ｈａｓｕｉ Ｋ， Ｓａｔｏ Ｅ， Ｔａｎａｋａ Ｙ， Ｙａｓｈｉｋｉ Ｓ， Ｉｚｕｍｏ Ｓ． （１９９７） Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｈｉｇｈｌｙ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ （Ｍｏｄｉｆｉｅｄ ＩｍｍｕｎｏＭａｘ） ｏｆ ＨＴＬＶ−１ ｐ４０ｔａｘ ａｎｄ ｐ２７ｒｅｘ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ＨＴＬＶ−１−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｎｏｎ−ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ ｌｙｍｐｈａｄｅｎｏｐａｔｈｙ （ＨＡＮＮＬＡ） ｗｉｔｈ ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ ｏｆ ＨＴＬＶ−１ ｄｏｓｅ ｂｙ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ． ＤＥＮＤＲＩＴＩＣ ＣＥＬＬＳ １９９７ Ｊａｐａｎｅｓｅ ＤｅｎｄｒｉｔｉｃＣｅｌｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ７：１９−２７。
【非特許文献６】
蓮井和久 平成１０年度〜平成１１年度科学研究費補助金（基盤研究（Ｃ）（２））研究成果報告書 ＨＴＬＶ−１関連疾患のＨＴＬＶ−１超高感度組織科学的検出法による研究（課題番号 １０６７０１６６）。
【非特許文献７】
Ｈａｓｈｉｚｕｍｅ Ｋ， Ｈａｔａｎａｋａ Ｙ， Ｋａｍｉｈａｒａ Ｙ， Ｔａｎｉ Ｙ． Ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｔａｉｎｉｎｇ ｏｆ ｆｏｒｍａｌｉｎ−ｆｉｘｅｄ ａｎｄ ｐａｒａｆｆｉｎ−ｅｍｂｅｄｄｅｄ ｔｉｓｓｕｅｓ ｕｓｉｎｇ ａ ｃａｔａｌｙｚｅｄ ｓｉｇｎａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ． Ａｐｐｌ−Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍ−Ｍｏｌ−Ｍｏｒｐｈｏｌ． ２００１ Ｍａｒ； ９（１）： ５４−６０。
【非特許文献８】
ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｖｅｎｔａｎａｄｉｓｃｏｖｅｒｙ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ。
【００２５】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上述した古典的多重免液組織化学的染色方法において、沈着したカップリング色素ないし発光反応物以外の免疫反応産物を０．１Ｍグリシン塩酸緩衝液ｐＨ２．２等で除去するには、室温で数時間要し、完全な除去の達成の指標がなく、基準化されていない。また、カップリング色素は、ＨＲＰでも複数あり、その組み合わせが明らかにされていない。ダコサイトメーション社からキット化され供給されているものは、加熱処理がその染色過程で必要とされ、自動免疫染色装置への導入が困難である等の問題がある。
【００２６】
そこで、本発明は、抗原の検出に際して、検出時間の大幅な短縮、染色に用いる色素の選別、方法の自動化にも適する抗原の検出方法を提供することにある。
【００２７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、一次抗体の非特異的反応の抑制に着目し、種々の緩衝液、非特異反応抑制物質を鋭意研究した結果、本発明の抗原の検出方法を見出すに至った。すなわち、本発明の抗原の検出方法は、呈色物又は発光物で抗原を多重染色する多重免疫組織化学的染色方法を用いて二以上の異なる抗原を検出する抗原の検出方法であって、非特異反応抑制処理を行なうことによって、一次抗体と非特異的に結合する非特異的結合物質へ非特異反応抑制物質を被膜し、前記一次抗体と非特異的結合物質との結合を抑制することを特徴とする。
【００２８】
また、本発明の抗原の検出方法の好ましい実施態様において、前記非特異的反応抑制処理を、第一抗原と一次抗体との抗原抗体反応の前に行なうことを特徴とする。
【００２９】
また、本発明の抗原の検出方法の好ましい実施態様において、前記非特異的反応抑制処理が、二次抗体と同種の動物血清による処理、スキンミルクによる処理、ノンファットミルクによる処理、及びガゼイン溶液による処理からなる群から選択される少なくとも１種であることを特徴とする。
【００３０】
また、前記カゼイン処理を、０．０２５〜２．５％の範囲のカゼインを含む溶液により行なうことを特徴とする。
【００３１】
また、本発明の抗原の検出方法の好ましい実施態様において、抗体に結合している免疫反応物であって、最後に検出する抗原以外の抗原を検出する免疫反応産物の呈色物又は発光物を除いたものを、ｐＨ３以下又はｐＨ９以上の緩衝液で除去することを特徴とする。
また、本発明の抗原の検出方法の好ましい実施態様において、さらに、非特異反応生成物、及びその他の残存反応物を除去するために、加熱した洗浄液によって洗浄する工程を含む、ことを特徴とする。
また、本発明の抗原の検出方法の好ましい実施態様において、前記加熱した洗浄液の温度が、２５〜６０℃の範囲内であることを特徴とする。
【００３２】
また、本発明の抗原の検出方法の好ましい実施態様において、前記呈色物又は発光物の除去を、前記最後に検出する抗原以外の抗原の同定後に行なうことを特徴とする。
【００３３】
また、本発明の抗原の検出方法の好ましい実施態様において、免疫組織化学的染色方法が、異なる成分強度を有する複数の色素を用いて染色する方法であり、前記成分強度の差異に基づいて抗原を検出することを特徴とする。
【００３４】
また、本発明の抗原の検出方法の好ましい実施態様において、前記成分が、Ｒ（赤）成分、Ｂ（青）成分、及びＧ（緑）成分からなることを特徴とする。
【００３５】
また、本発明の抗原の検出方法の好ましい実施態様において、前記呈色物又は発光物が、可視化することができる物質であることを特徴とする。
【００３６】
また、本発明の抗原の検出方法の好ましい実施態様において、可視化することができる物質が、免疫組織化学的反応の標識酵素の基質との反応で呈色ないし発光するカップリング物質であることを特徴とする。
【００３７】
また、本発明の抗原の検出方法の好ましい実施態様において、可視化することができる物質が、西洋ワサビペルオキシダーゼ（以下、ＨＲＰという）、アルカリフォスファターゼ（以下、ＡＬＰという）、グルコースオキシダーゼ、ベータガラクトシダーゼからなる群からなることを特徴とする。
【００３８】
また、本発明の抗原の検出方法の好ましい実施態様において、反応液、反応時間、及び洗浄回数をプログラムして自動免疫装置に組み込み、自動化して行なうことを特徴とする。
【００３９】
【発明の実施の形態】
まず、本発明の抗原の検出方法について概略を説明すれば、以下のようになる。すなわち、抗原回復処理（この処理は必須ではないが、抗原の抗原性をより高め、ひいては、目的抗原を検出しやすくするのに用いられる。）、洗浄、非特異反応抑制処理、特異抗体反応（一次抗体と第一抗原との抗原抗体反応）、前記抗原抗体反応した一次抗体と酵素を含む二次抗体との結合（複合体の形成）、第一抗原の同定、洗浄、の工程からなる。これらの工程を繰り返しながら、最終的に複数あるすべての抗原を検出せんとするものである。
【００４０】
二以上の抗原は、通常、一つの固定組織標本切片中に設置させることができるので、このような固定組織標本切片を用いてもよい。ここで、固定組織（パラフィン包埋）標本切片について説明すると、固定組織（パラフィン包埋）標本とは、生物組織から切り出され、固定化された標本のことで、例えば、１０％緩衝ホルマリン液等で化学固定され、濃度が漸増するエタノール溶液系列で水分が除かれ、１００％キシレン等で浸透され、６０℃前後の溶解したパラフィン等の溶液で浸透され、低温下でパラフィン等で固化された標本をいう。固定組織（パラフィン包埋）標本切片は、通常、薄切装置で作成されたその標本の３ミクロン前後の厚さの切片で、適切に処理されたスライドに貼付されている。固定組織パラフィン標本切片が免疫組織化学的染色に供される時には、１００％キシレンに浸透することでパラフィンを除き、１００％エタノールでそのキシレンを置換した後に、リン酸緩衝液等に浸透して、親水化される。
【００４１】
次に、本発明の方法の原理について説明する。図１は、古典的二重免疫組織化学的染色方法による局在の異なる第１と第２抗原を検出した場合の産物の概念図を示す。図１では、説明を簡略化するために２つの抗原を用いるが、本発明は２つの抗原に限定されることを意図するものではなく、複数の抗原の検出を行なうことが可能である。従来の方法では、第１抗原の一次抗体とその検出の酵素を含む複合体の除去を行っても、完全には非特異的に結合した一次抗体の除去が出来ないので、結果として非特異的に結合した一次抗体を第２抗原の一次抗体の検出の酵素を含む複合体が検出し、それぞれの一次抗体の非特異的結合部に、第１と第２抗原の検出の為のカップリング色素の共染が見られる。これに対して、本発明の方法では、一次抗体の非特異結合を非特異反応抑制処理で抑制され、一次抗体とその酵素を含む検出複合体が除去されているので、第１抗原の周囲には沈着したカップリング色素のみが存在し、第２抗原には一次抗体とその酵素を含む検出複合体とその酵素のカップリング色素が存在する。古典的二重免疫染色方法以外の二重免疫染色でも、一次抗体の非特異結合反応の抑制を実施しない場合には、第１と第２抗原の検出の為のカップリング色素の共染を認めることになる。従って、本発明においては、非特異的結合物質に抗体等が結合することはないので、目的の抗原のみを精度良く検出することが可能であり、従来の方法と本発明の二重免疫組織化学的染色方法の最終産物は異なることが理解出来る。
【００４２】
本発明の抗原の検出方法では、呈色物又は発光物で抗原を多重染色する多重免疫組織化学的染色方法を用いて二以上の異なる抗原を検出する。多重染色とは、複数の色素を用いて免疫組織染色する方法である。
【００４３】
本発明では、当該多重免疫組織化学的染色を用いて、さらに、非特異反応抑制処理を行なうことによって、一次抗体と非特異的に結合する非特異的結合物質へ被膜し、前記一次抗体と非特異的結合物質との結合を抑制する。
【００４４】
ここで、非特異反応抑制処理とは、広く、一次抗体と、非特異反応結合物質との結合を抑制する処理を意図し、このような作用があれば、特に限定されるものではない。このような非特異反応抑制処理として、例えば、カゼインによる処理、二次抗体と同種の動物血清、スキンミルク乃至ノンファットミルク、からなる群から選択される少なくとも１種を挙げることができる。スキンミルク、ノンファットミルクは、特に血清中の酵素等の活性を避ける為にも用いることができる。
【００４５】
また、前記カゼイン処理を、０．０２５〜２．５％の範囲のカゼインを含む溶液により行なうことが好ましい。このような範囲としたのは、さらに好ましくは、０．１〜１．０％の範囲、最も好ましくは、０．２５％±０．１％である。
【００４６】
本発明においては、複数の抗原を検出することが事実上可能であるが、第一抗原（最初に検出する抗原）から第ｎ抗原（最後に検出する抗原、ｎ＝１，２，３・・・）を検出する場合、抗体に結合している免疫反応物であって、最後に検出する抗原（第ｎ抗原）以外の抗原（第１〜（ｎ−１）抗原）を検出する免疫反応産物の呈色物又は発光物を除いたものを、ｐＨ３以下又はｐＨ９以上の緩衝液で除去することが好ましい。ｐＨ３以下又はｐＨ９以上としたのは、ｐＨ３以下又はｐＨ９以上では、抗原抗体反応が起こらないので、結合していた一次抗体が抗原から離れ、ひいては抗体に結合している免疫反応物であって、カップリング色素（呈色物、発光物）を除いたものを除去できるという観点からである。
ここで、抗体に結合している免疫反応物であって、最後に検出する抗原（第ｎ抗原）以外の抗原（第１〜（ｎ−１）抗原）を検出する免疫反応産物の呈色物又は発光物を除いたものについて、具体的に述べると、ＡＢＣ法の場合、一次抗体、ボオチン標識二次抗体、酵素標識アビチンを意味する。また、ポリマー法の場合、一次抗体、酵素、二次抗体を標識したポリマーを意味する。
また、本発明の抗原の検出方法の好ましい実施態様において、さらに、非特異反応生成物、及びその他の残存反応物を除去するために、加熱した洗浄液によって洗浄する工程を含む。この工程において、非特異的反応生成物及び残存反応物を除去することができる。また、前記加熱した洗浄液の温度が、２５〜６０℃の範囲内であることを特徴とする。かかる温度範囲では、抗原抗体反応が起こり、ひいては、非特異的反応生成物及び残存反応物の充分な除去が可能となる。
【００４７】
また、前記呈色物又は発光物を除いたものの除去を、最後に検出する抗原以外の抗原の同定後に行なうことができる。これは、それ以降で行なわれる工程の抗原の検出への影響を最小限度にするという観点からである。但し、特殊な第１と第２抗原に対する一次抗体の二次抗体を含む検出系の組み合わせが可能な場合には、このような洗浄は特に要求されない。このような特殊な例として、ＣＤ６８とＦａｃｉｎとによる二重染色（実施例４）を挙げることができる。
【００４８】
ここで、免疫組織化学的染色方法について説明すると、これは、組織上の特定の抗原を、その抗原を特異的に認識する抗体によって検出する方法である。本発明においては、免疫組織化学的染色方法が、異なる成分強度を有する複数の色素を用いて染色する方法であり、前記成分強度の差異に基づいて抗原を検出することができる。これは、異なる成分強度を有する複数の色素を用いれば、原理的に複数の抗原の検出が可能となるからである。成分強度の差異に基づいて検出するとは、例えば、色素としてジアミノベンチジン（ＤＡＢ）と、シアミノベンチジンニッケル（ＤＡＢ−Ｎｉ）を用いた場合、ＤＡＢはＲ成分の強度が高く、ＤＡＢ−ＮｉもＲ成分の強度が高いが（表２）、各成分比から相対的には、ＤＡＢのＲ成分強度が、他のＧ，Ｂ成分と比較して高いといえる。実際に、デジタル電子顕微鏡画像をＲＧＢ分解して、Ｒ、Ｇ、Ｂ成分として解析した場合、ＤＡＢでは、ＧとＢとの成分を強く反映する一方で、ＤＡＢ−Ｎｉは、Ｒ，Ｇ，Ｂ成分を均等に強く反映するという異なる結果を表示する。したがって、これらの強度差を利用すれば、抗原の検出も可能となる。
【００４９】
好ましい実施態様において、前記成分が、Ｒ（赤）成分、Ｂ（青）成分、及びＧ（緑）成分からなる。このようなＲＧＢ成分を採用したのは、カラー図における各カップリング色素の組み合わせを白黒図でも理解できるようにという観点からであり、採用する成分として特に限定されることを意図するものではない。前記呈色物又は発光物は、また可視化することができるものが好ましい。
【００５０】
また、当該呈色物又は発光物は、標識物質との反応で呈色乃至発光するカップリング物質であることが好ましい。さらに、好ましくは、可視化することができる物質が、免疫組織化学的反応の標識酵素の基質との反応で呈色ないし発光するカップリング物質である。このように標識酵素の基質との反応で呈色乃至発光するものとしたのは、免疫染色された標本の観察に光学顕微鏡と蛍光顕微鏡又はレーザー共焦点顕微鏡が用いられるという観点からである。
【００５１】
可視化することができる物質としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ（以下、ＨＲＰという）、アルカリフォスファターゼ（以下、ＡＬＰという）、グルコースオキシダーゼ、ベータガラクトシダーゼを挙げることができる。可視化することができる物質は、一般的で汎用性が高いという観点から、ＨＲＰ、ＡＬＰを挙げることができる。
【００５２】
免疫組織化学的反応の標識酵素の基質との反応で呈色するカップリング色素としては、ＨＲＰでは、過酸化水素を基質に、一般に用いられるジアミノベンチジン（以下、ＤＡＢという）、アミノエチルカルバゾール（以下、ＡＥＣという）の他に、ベクター社からＶＩＰ、ＳＧ、ＮｏｖａＲＥＤ、ＴＭＢと呼ばれる色素が供給されている。ＡＬＰでは、ナフトールＡＳ−ＢＩリン酸ナトリウム等を基質に、ファストレッド、ファストバイオレット、ファストブルー、ニューフクシン、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシルフォスフェート／ニトロブルーテトラゾリウ等のカップリング色素がある。
【００５３】
また、本発明の好ましい実施態様において、反応液、反応時間、及び洗浄回数をプログラムして自動免疫装置に組み込み、自動化して行なうことが可能である。
【００５４】
すなわち、市販の自動免疫組織化学的染色装置に、上記反応液、反応時間、及び洗浄回数などの情報をプログラムして導入し、自動化して行なうことができる。
【００５５】
【実施例】
以下、本発明を実施例により更に具体的に説明するが、本発明は、下記実施例に限定して解釈される意図ではない。
【００５６】
実施例１
本発明の多重免疫組織化学的染色方法の第１抗原と第２抗原を検出し一次抗体をポリマー試薬法を用いた二重免疫組織化学的染色方法は、次ぎの１８工程により実施した。
１）固定組織パラフィン切片を、キシレンとエタノールにそれぞれ３〜５回、３〜２０分間浸すことでパラフィンを除き、
２）０．３〜６％ 過酸化水素水メタノール溶液に５〜３０分間浸し、一次の内因性ぺルオキシダーゼの活性の抑制を行い、
３）０．００５〜０．０２Ｍリン酸緩衝液０．５〜１％塩化ナトリウム溶液（ＰＢＳ）で洗浄し、固定組織標本切片の親水化を行い、
４）抗原に対応した抗原回復処理（一般的には、０．００１〜０．０２Ｍクエン酸緩衝液等に切片を浸し、オートクレーブで１１０〜１４０℃、１〜１５分間の熱処理を行い、冷却後に、０．０１〜０．１Ｍリン酸緩衝液０．８５％塩化ナトリウム溶液（以下、ＰＢＳという）に浸す。）を行い、
５）自動免疫染色装置に固定組織標本切片を配置し、
６）２５〜６０℃に加熱した０．０１〜０．２％ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（ｔｗｅｅｎ ２０）を含む０．５〜１％塩化ナトリウムを加えた０．０１〜０．１Ｍトリス緩衝液（以下、ＴＢＳという）洗浄液で１〜４回洗浄し、
７）０．１〜１％カゼイン溶液に２〜３０分間反応させ、第１抗原に対する一次抗体の非特異反応の抑制前処理を行い、
８）第１抗原に対する一次抗体の至適希釈溶液と至適反応時間（１３分間〜２時間）で反応させた後、２５〜６０℃に加熱したＴＢＳ洗浄液で２〜５回洗浄し、
９）反応した一次抗体をポリマー試薬を１０分間〜１時間反応させて標識し、２５〜６０℃前後に加熱したＴＢＳ洗浄液で２〜５回洗浄し、
１０）対応した酵素の発色剤（ＨＲＰであればヂアミノベンチジン（以下、ＤＡＢという）ないしヂアミノベンチジンニッケル（以下、ＤＡＢ−Ｎｉという）ないしベクター社のＳＧと過酸化水素）の溶液で呈色反応させ、２５〜６０℃前後に加熱したＴＢＳ洗浄液で２〜５回洗浄し、
１１）ｐＨ３以下かｐＨ９以上の緩衝液、例えば、０．１Ｍグリシン塩酸緩衝液ｐＨ２．２、を１分間、３回反応させ、２５〜６０℃前後に加熱したＴＢＳ洗浄液で２〜５回洗浄し、
１２）０．１〜１％カゼイン溶液に２〜３０分間反応させ、第２抗原に対する一次抗体の非特異反応の抑制前処理を行い、
１３）第２抗原に対する一次抗体の至適希釈溶液と至適反応時間（１３分間〜２時間）で反応させた後、２５〜６０℃に加熱したＴＢＳ洗浄液で２〜５回洗浄し、
１４）反応した一次抗体をポリマー試薬を１０分間〜１時間反応させて標識し、２５〜６０℃前後に加熱したＴＢＳ洗浄液で２〜５回洗浄し、
１５）対応した酵素の発色剤（ＨＲＰであれば工程１０で用いた色素以外のＤＡＢないしＤＡＢ−Ｎｉないしベクター社のＶＩＰ、ＳＧ、ＮｏｖａＲＥＤの一つと過酸化水素）の溶液で呈色反応させ、２５〜６０℃前後に加熱したＴＢＳ洗浄液で２〜５回洗浄する。
１６）ヘマトキシン等の溶液で、後対比染色を行い、水で１〜３回洗浄し、
１７）自動免疫染色装置から固定組織標本切片を外し、
１８）封入剤に対応した処理を行い、超高感度免疫染色を行った固定組織標本パラフィン切片を永久標本とし、光学顕微鏡下での抗原の検出となる。
【００５７】
工程１０と１５で、ストレプトアビチンないし蛍光物質を標識した物質の沈着反応を行い、工程１５と特異的に反応する抗体と蛍光物質の複合体溶液を用いる場合、その後に、蛍光物質による核等の対比染色を実施するか、実施せずに、染色は終了し、蛍光顕微鏡下での抗原の検出となる。
【００５８】
工程７から１０と工程１２から１５で、一次抗体を検出する免疫組織化学的染色で、ストレプトアビチンないし蛍光物質を標識した物質の沈着反応を行い、工程１５と特異的に反応する抗体と蛍光物質の複合体溶液を用いる場合、その後に、蛍光物質による核等の対比染色を実施するか、実施せずに、染色は終了し、蛍光顕微鏡下での抗原の検出となる。
【００５９】
自動化とは、上記工程５から工程１５までの各反応液、反応時間、洗浄回数をプログラムして自動免疫染色装置に組み込み、染色を基準化することである。
【００６０】
＜溶液等の説明＞
なお、用いた溶液等について説明すれば、以下の通りである。
キシレン
キシレンは、特級キシレンを用いた。
【００６１】
エタノール
エタノールは、特級エタノールを用いた。
【００６２】
０．３％過酸化水素水メタノール溶液
特級過酸化水素水（３０％溶液）を、特級メタノールで１００倍希釈したものを用いた。
【００６３】
０．０１Ｍリン酸緩衝液０．８５％塩化ナトリウム溶液（ＰＢＳ）
２８．７ｇのリン酸水素第二ナトリウム・１２水と３．３ｇのリン酸第二水素ナトリウム二水和物を１Ｌのイオン交換水に溶解した０．１Ｍリン酸緩衝液に、８５ｇの塩化ナトリウムを加え、オートクレーブで完全に溶解し室温まで冷却し、１０Ｎ 水酸化ナトリウム水でｐＨを７．６に調整したものを１０倍溶液として、使用時に１０倍にイオン交換水で希釈した。
【００６４】
０．０１Ｍクエン酸緩衝液等ｐＨ６．０
２．１ｇのクエン酸・一水和物と２．９４ｇクエン酸三ナトリウム・二水和物を１００ ｍｌのイオン交換水にオートクレーブで加熱し溶解し、１０Ｎ水酸化ナトリウム水でｐＨを６．０に調整し、イオン交換水で１００ｍｌに調節したものを１０倍溶液とし、使用時に１０倍にイオン交換水で希釈した。商業的には、１０倍溶液がダコサイトメーション社やダイヤトロン社から供給されている。その他に、抗原回復には、
【非特許文献７】のｐ．１１４に記載されている１ｍＭＥＤＴＡ溶液ｐＨ８．０、などが用いられ、ダコサイトメーション社から供給されている。
【００６５】
３％過酸化水素水ＰＢＳ
特級過酸化水素水（３０％溶液）を、２８．７ｇのリン酸水素第二ナトリウム・１２水と３．３ｇのリン酸第二水素ナトリウム二水和物を１Ｌのイオン交換水に溶解した０．１Ｍリン酸緩衝液に、８５ｇの塩化ナトリウムを加え、オートクレーブで完全に溶解し室温まで冷却し、１０Ｎ 水酸化ナトリウム水でｐＨを７．６に調整したものを１０倍溶液として、使用時に１０倍にイオン交換水で希釈する０．０１Ｍリン酸緩衝液０．８５％塩化ナトリウム溶液（ＰＢＳ）で１００倍に希釈した。
【００６６】
３５℃前後に加熱した０．１％ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（ｔｗｅｅｎ ２０）を含む０．８２５塩化ナトリウム加０．０５Ｍトリス緩衝液（ＴＢＳ）洗浄液
１２１．１ｇのトリスハイドロオキシメチルアミノメタン（シグマ社）を８００ｍｌのイオン交換水で希釈しオートクレーブで加熱溶解後に、１Ｎ塩酸でｐＨを７．５に調整し、イオン交換水で１Ｌにした１Ｍトリス溶液５００ｍｌと、２９２．２ｇの塩化ナトリウムを８００ｍｌのイオン交換水でオートクレーブ加熱溶解しイオン交換水で１Ｌにした５Ｍ塩化ナトリウム溶液３６０ｍｌを、イオン交換水で２０Ｌに希釈し、０．１％ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（ｔｗｅｅｎ ２０）とした溶液。自動免疫染色装置の洗浄液タンクに入れて、３５℃前後に加熱したものである。
【００６７】
０．２５％カゼイン溶液
２５ｍｇのカゼイン（シグマ社）を２８．７ｇのリン酸水素第二ナトリウム・１２水と３．３ｇのリン酸第二水素ナトリウム二水和物を１Ｌのイオン交換水に溶解した０．１Ｍリン酸緩衝液に、８５ｇの塩化ナトリウムを加え、オートクレーブで完全に溶解し室温まで冷却し、１０Ｎ水酸化ナトリウム水でｐＨを７．６に調整したものを１０倍溶液として、使用時に１０倍にイオン交換水で希釈する０．０１Ｍ ＰＢＳの１０ｍｌに希釈したもの。商業的には、ダコサイトメーション社から供給されている。
【００６８】
０．１Ｍグリシン塩酸緩衝液ｐＨ２．２
グリシン７．５グラムを５００ｍｌのイオン交換水に溶解し、濃塩酸を滴下してｐＨ２．２に調整し、イオン交換水を加えて１Ｌにする。
【００６９】
ポリマー試薬
デキストランポリマーに直接二次抗体とＨＲＰを結合させた試薬で、ダコサイトメーション社から商業的にダコ ＣｈｅｍＭａｔｅ ＥＮＶＩＳＩＯＮ試薬として供給されている。
【００７０】
酵素の発色剤（カップリング色素）
ヂアミノベンチジン（ＤＡＢ）
３，３’−ヂアミノベンチジン（以下ＤＡＢという）四塩酸塩（同仁化学社）２０ｍｇを１００ｍｌの０．０５Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ．７．６）に溶解し、これに、過酸化水素原液２０μｌを加えて使用する。ダコサイトメーション社から、液状試薬としてＫ３４６６として供給されている。ベクター社からＤＡＢ基質キット（ＳＫ−４１００）として供給されている。０．０５Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ．７．６）は、１２１．１ｇのトリスハイドロオキシメチルアミノメタン（シグマ社）を８００ｍｌのイオン交換水で希釈しオートクレーブで加熱溶解後に、１Ｎ塩酸でｐＨを７．６に調整し、イオン交換水で１Ｌにした１Ｍトリス溶液５００ｍｌと、２９２．２ｇの塩化ナトリウムを８００ｍｌのイオン交換水でオートクレーブ加熱溶解しイオン交換水で１Ｌにした５Ｍ塩化ナトリウム溶液３６０ｍｌを、イオン交換水で２０Ｌに希釈する。
【００７１】
ヂアミノベンチジンニッケル（ＤＡＢ−Ｎｉ）
ＤＡＢ２０ｍｇ、硫化ニッケル（ＮｉＳＯ４・（ＮＨ４）２ＳＯ４・６Ｈ２Ｏ）４０ｍｇを０．０５Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．６）１００ｍｌに溶解し、７μｌの過酸化水素水原液を加え、ろ過して使用する。ベクター社からＤＡＢ基質キット（ＳＫ−４１００）として供給されている。
【００７２】
アミノエチルカルバゾール（ＡＥＣ）
３ーアミノー９ーエチルカルバゾール（シグマ社）を０．４％になるようにジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、保全液とする。保存液５ｍｌを０．１Ｍ酢酸緩衝液ｐＨ５．０の９５ｍｌと混合し、２０μｌの過酸化水素水原液を加え、ろ過して用いる。０．１Ｍ酢酸緩衝液ｐＨ５．０は、９９％酢酸１１．５ｍｌをイオン交換水で１Ｌとし、この１４．８ｍｌと酢酸ナトリウム１６．４ｇないし酢酸ナトリウム・三水塩２７．２ｇをイオン交換水に溶解し１Ｌとした０．２Ｍ酢酸ナトリウム水溶液３５．２ｍｌを混合し、イオン交換水を加えて１００ｍｌとする。ダコサイトメーション社からキットが供給されている。
【００７３】
ＶＩＰ、ＳＧ、ＮｏｖａＲＥＤ
それぞれ、西洋ワサビペルオキシダーゼの発色カップリング色素として、ベクター社から、ＳＫ−４６００、ＳＫ−４７００、ＳＫ−４８００としてキット化され供給されている。
【００７４】
ヘマトキシン等の溶液
上記の発色色素と区別できる色素溶液を用いた核ないし細胞質の染色で、後対比染色を行う。一般的には、ヘマトキシリン溶液が用いられる。ダコサイトメーション社から自動免疫染色装置での染色用にダコＣｈｅｍＭａｔｅヘマトキシリン試薬が供給されている。
【００７５】
封入剤に対応した処理
発色基質に合わせて、ジアミノベンチジンであれば、エタノール系列に浸しての脱水後に、プラスチック封入剤（オイキット）で封入し、長期の保存に耐える永久標本を作成する。ＡＥＣでの発色では、ダコサイトメーション社から供給されるＵｌｔｒａｍｏｕｎｔ試薬で、７０℃での加熱固化で永久標本を作成する。ベクター社の種々の発色基質では、冷風による乾燥後に、ＶｅｃｔａＭｏｕｎｔ封入剤で封入し乾燥固化し、永久標本を作成する。
【００７６】
次に、実際に非特異反応抑制処理と緩衝液の効果を確かめるために試験を行なった。
【００７７】
工程１から１０（但し、工程７を除く）と１６から１８を行い、工程１１のｐＨ３以下かｐＨ９以上の緩衝液として、０．１Ｍグリシン塩酸緩衝液ｐＨ２．２を用い、工程１１を工程９と１０の間で０．１Ｍグリシン塩酸緩衝液ｐＨ２．２溶液を反応時間を変えて反応させる実験Ａ、工程８と９の間で０．１Ｍグリシン塩酸緩衝ｐＨ２．２溶液を反応時間を変えて反応させる実験Ｂを行った。固定組織標本切片はヒト扁桃組織の１０％ホルマリン固定パラフィン包埋標本切片を用い、０．０１Ｍクエン酸緩衝液ｐＨ６．０でオートクレーブによる加熱による抗原回復を行い、リンパ小節に分布する樹状細胞等を標識する抗ＣＤ６８抗体を用いた。工程９のポリマー試薬はダコＣｈｅｍＭａｔｅ ＥＮＶＩＳＩＯＮ試薬を用いた。工程１０の酵素はＨＲＰでカップリング色素はＤＡＢを用い、工程１８ではエタノールで脱水し、キシレンへ浸透し、プラスチック封入剤（オイキット）で封入した。
【００７８】
実験Ａは一次抗体と二次抗体と酵素が標識された複合体（ポリマー試薬）の除去効果を検討するものであり、実験Ｂは一次抗体の除去効果を検討している。ただし、工程７は実験Ａ、Ｂでは実施せずに、実験Ｂ＃では実施している。
【００７９】
表１に示すように、実験Ａでは、０．１Ｍグリシン塩酸緩衝液ｐＨ２．２での反応時間を２、７、１７、３７、７７分間の全てで，残留抗体産物を示すＤＡＢ反応は見られなかった。実験Ｂでは、淡い染色が７７分の処理でも除去出来ていないことが判明した。この残存反応は，一次抗体の非特異的反応の結果である可能性が考えられたので，工程７の０．２５％カゼイン溶液反応を行う（実験Ｂ＃）と，１分のグリシン溶液反応でも一次抗体が除去されていることが判明した。図２のＡは実験Ｂの、Ｂは実験Ｂ＃の染色結果を示す。図２は、０．１Ｍグリシン塩酸緩衝液ｐＨ２．２の反応なし（Ａ１，Ａ４，Ｂ１，Ｂ４）、１７分間反応（Ａ２，Ａ５，Ｂ２，Ｂ５）、３７分間反応（Ａ３，Ａ６，Ｂ３，Ｂ６）の染色結果を示す。図２のＡ５とＢ５、図２のＡ６とＢ６で、工程７の０．２５％カゼイン溶液反応で、非特異反応の陽性像が図２Ｂ５とＢ６で消失していることが解る。
【００８０】
従って、この実施例１で、工程１１のｐＨ３以下かｐＨ９以上の緩衝液として、０．１Ｍグリシン塩酸緩衝液ｐＨ２．２を用いた場合、１分間の反応で抗原抗体反応での抗体の結合は解離することが示された。従って、工程１１で、０．１Ｍグリシン塩酸緩衝液ｐＨ２．２を用いた場合、１分間３回の反応で、一次抗体反応の前に非特異反応を抑制する処理を行うと、固定パラフィン包埋標本切片に反応した一次抗体もその検出試薬も、除去できることが明らかになった。表１は、グリシン処理後の残留免疫組織化学的反応産物の評価結果を示す。
【００８１】
【表１】
【００８２】
＜実施例１において行なった処理と用いた溶液等＞
０．１Ｍグリシン塩酸緩衝液ｐＨ２．２
グリシン７．５グラムを５００ｍｌのイオン交換水に溶解し、濃塩酸を滴下してｐＨ２．２に調整し、イオン交換水を加えて１Ｌにする。
【００８３】
抗原回復
パラフィン等を除かれた固定組織パラフィン標本切片を、０．０１Ｍクエン酸緩衝液ｐＨ６．０に浸し加熱処理する。加熱処理は、オートクレーブで行なう。
【００８４】
０．０１Ｍクエン酸緩衝液等ｐＨ６．０
２．１ｇのクエン酸・一水和物と２．９４ｇクエン酸三ナトリウム・二水和物を１００ｍｌのイオン交換水にオートクレーブで加熱し溶解し、１０Ｎ水酸化ナトリウム水でｐＨを６．０に調整し、イオン交換水で１００ｍｌに調節したものを１０倍溶液とし、使用時に１０倍にイオン交換水で希釈する。商業的には、１０倍溶液がダコサイトメーション社やダイヤトロン社から供給されている。
【００８５】
抗ＣＤ６８抗体
ダコサイトメーション社が供給しているマウス抗ヒトＣＤ６８マクロファージ抗体（ＰＧ−Ｍ１，Ｍ０８７６）で、５０倍にダコサイトメーション社が供給しているダコＣｈｅｍＭａｔｅ抗体希釈液（Ｓ２０２２）で希釈する。
【００８６】
ポリマー試薬
デキストランポリマーに直接二次抗体とＨＲＰを結合させた試薬で、ダコサイトメーション社から商業的にダコＣｈｅｍＭａｔｅ ＥＮＶＩＳＩＯＮ試薬として供給されている。
【００８７】
酵素の発色剤（カップリング色素）
ヂアミノベンチジン（ＤＡＢ）
ダコサイトメーション社から、液状試薬としてＫ３４６６として供給されている。
【００８８】
〔実施例２〕
次に、ｐＨ３以下又はｐＨ９以上の緩衝液の使用による抗原の影響を調べた。
工程１から６、工程１１から１８を行い、固定組織標本切片はヒト扁桃組織のもので、０．０１Ｍクエン酸緩衝液ｐＨ６．０でオートクレーブによる加熱による抗原回復を行い、ＣＤ６８とＫｉ−６７抗原抗体の一次抗体を用いて、工程１１に於けるｐＨ３以下かｐＨ９以上の緩衝液として、０．１Ｍグリシン塩酸緩衝液ｐＨ２．２を用いた場合の抗原への影響を検討した。工程１４のポリマー試薬はダコＣｈｅｍＭａｔｅ ＥＮＶＩＳＩＯＮ試薬を用いた。工程１５の酵素はＨＲＰで発色色素はヂアミノベンチジンを用い、工程１８ではエタノールで脱水し、キシレンへ浸透し、プラスチック封入剤（オイキット）で封入した。
【００８９】
その結果を図３に示す。図３では、ａとｂとｃはＣＤ６８抗体で、ｄとｅとｆはＫｉ−６７抗原抗体、ａとｄは、０．１Ｍグリシン塩酸緩衝液ｐＨ２．２の代わりにリン酸緩衝液ｐＨ７．４を反応させ、ｂとｅでは０．１Ｍグリシン塩酸緩衝液ｐＨ２．２を７分間、ｃとｆでは０．１Ｍグリシン塩酸緩衝液ｐＨ２．２を１７分間反応させた染色結果を示す。ＣＤ６８の抗原は、この０．１Ｍグリシン塩酸緩衝液ｐＨ２．２反応７７分間まで観察しても変化が認められなかったが、Ｋｉ６７抗原はこの０．１Ｍグリシン塩酸緩衝液ｐＨ２．２反応７分間でその回復された抗原が再度マスクされ始めていることが判明した。従って、Ｋｉ−６７抗原の検出は工程１１のｐＨ３以下かｐＨ９以上の緩衝液による色素以外の免疫反応産物の除去の前に行う必要があることが示唆された。
【００９０】
従って、本発明の多重染色では、抗体の除去の処理の前ですべき抗原の検出と抗体の除去の後の検出で問題のない抗原を、実施する前に検討しておく必要があることが示唆された。
【００９１】
＜実施例２において行なった処理と用いた溶液等＞
抗原回復処理
パラフィン等を除かれた固定組織パラフィン標本切片を、トリプシン等の酵素で処理するか、０．０１Ｍクエン酸緩衝液ｐＨ６．０などの緩衝液に浸し加熱処理する方法がある。加熱処理は、マイクロウエーブ装置、オートクレーブ、圧力鍋、温浴装置等で行なわれる。酵素処理も加熱処理も、標的抗原により、その処理条件は異なる。
【００９２】
０．０１Ｍクエン酸緩衝液等ｐＨ６．０
２．１ｇのクエン酸・一水和物と２．９４ｇクエン酸三ナトリウム・二水和物を１００ｍｌのイオン交換水にオートクレーブで加熱し溶解し、１０Ｎ水酸化ナトリウム水でｐＨを６．０に調整し、イオン交換水で１００ｍｌに調節したものを１０倍溶液とし、使用時に１０倍にイオン交換水で希釈する。商業的には、１０倍溶液がダコサイトメーション社やダイヤトロン社から供給されている。
【００９３】
抗ＣＤ６８抗体
ダコサイトメーション社が供給しているマウス抗ヒトＣＤ６８マクロファージ抗体（ＰＧ−Ｍ１，Ｍ０８７６）で、５０倍にダコサイトメーション社が供給しているダコＣｈｅｍＭａｔｅ抗体希釈液（Ｓ２０２２）で希釈し、使用する。
【００９４】
抗Ｋｉ−６７抗原抗体
ダコサイトメーション社が供給しているマウス抗ヒトＫｉ−６７抗原抗体（ＭＩＢ−１， Ｍ７２４０）で、５０倍にダコサイトメーション社が供給しているダコＣｈｅｍＭａｔｅ抗体希釈液（Ｓ２０２２）で希釈し、使用する。
【００９５】
０．１Ｍグリシン塩酸緩衝液ｐＨ２．２
グリシン７．５グラムを５００ｍｌのイオン交換水に溶解し、濃塩酸を滴下してｐＨ２．２に調整し、イオン交換水を加えて１Ｌにする。
【００９６】
ポリマー試薬
デキストランポリマーに直接二次抗体とＨＲＰを結合させた試薬で、ダコサイトメーション社から商業的にダコＣｈｅｍＭａｔｅ ＥＮＶＩＳＩＯＮ試薬として供給されている。
【００９７】
酵素の発色剤（カップリング色素）
ヂアミノベンチジン（ＤＡＢ）
ダコサイトメーション社から、液状試薬としてＫ３４６６として供給されている。
【００９８】
〔実施例３〕
工程１から６、工程１２から１８で、固定組織標本切片はヒト扁桃組織のもので、０．０１Ｍクエン酸緩衝液ｐＨ６．０でオートクレーブによる加熱による抗原回復を行い、ＣＤ６８一次抗体を用い、ポリマー試薬ダコＣｈｅｍＭａｔｅ ＥＮＶＩＳＩＯＮを用いて、以下の検討を行った。
【００９９】
西洋ワサビペルオキシダーゼ過酸化水素反応のカップリング色素で、商業的に供給されてダコサイトメーションのＤＡＢとＡＥＣ、ベクター社のＤＡＢ−ＮｉとＮｏｖａＲＥＤ，ＶＩＰ，ＴＭＢ，ＳＧ，ＴＭＢの永久標本作成の封入方法と色素の組み合わせを検討した。
【０１００】
染色後に、固定組織標本切片を、エタノールに浸し脱水し、キシレンに浸し透徹し、プラスチック封入剤のオイキットで封入する通常法、ダコサイトメーション社のＵｌｔｒａｍｏｕｎｔを固定組織標本切片を被うように滴下して７０℃で加熱固化する方法（Ｕｌｔｒａｍｏｕｎｔ法），ベクター社から供給されているＶｅｃｔａＭｏｕｎｔを固定組織標本切片を被うように滴下しスライドグラスで被い自然固化させる方法（ＶｅｃｔａＭｏｕｎｔ法）を検討した。
【０１０１】
各色素の色は、デジタル顕微鏡画像で陽性部位をＰｈｏｔｏｓｈｏｐでＲＧＢチャンネル分解し、ＮＩＨ−ｉｍａｇｅでＲ，Ｇ，Ｂの画像が反転させて、その平均濃度を求め、Ｒ，Ｇ，Ｂ成分として解析した。
【０１０２】
使用出来る色素は封入法に規定された。図４にカラーないしグレースケール、Ｒ，Ｇ，Ｂ成分の対応した染色像を示し、表２に、それぞれの色素のＲＧＢ解析の結果を示す。図４のａは通常法で封入したＤＡＢでありＧとＢ成分が強いことが解る。ｂは通常法で封入したＤＡＢ−ＮｉでありＲ，Ｇ，Ｂ成分の均等に強いことが解る。ｃはＵｌｔｒａｍｏｕｎｔ法で封入したＡＥＣであり、ＤＡＢ同様にＧとＢの成分が強いことが解る。ｄはＶｅｃｔａＭｏｕｎｔ法で封入したＮｏｖａＲＥＤ、ｅはＶｅｃｔａＭｏｕｎｔ法で封入したＶＩＰであり、両者共に、Ｒ、Ｇ、Ｂ成分が強いことが解る。ｆはＶｅｃｔａＭｏｕｎｔ法で封入したＳＧであり、Ｒ、Ｇ、Ｂ成分が強いことが解る。ＤＡＢ、ＡＥＣ、ＮｏｖａＲＥＤ、ＶＩＰがＲ画像で、前２者と後２者で区別出来ることが解かる。表２は、それぞれの色素は特徴的なＲ，Ｇ，Ｂ成分の構成を示した。通常法では，ＤＡＢ，ＤＡＢ−Ｎｉ，ＳＧが使用可能であった。これらの色素はグリシン処理にて赤（Ｒ）成分が増加し青（Ｂ）成分が減少するが，使用可能であり，２重染色の標的抗原Ａの検出に用い得ることが示された。Ｕｌｔｒａｍｏｕｎｔ法では，ＤＡＢ，ＤＡＢ−Ｎｉ，ＡＥＣ，ＳＧが使えた。ＶｅｃｔａＭｏｕｎｔ法では，ＤＡＢ，ＤＡＢ−Ｎｉ，ＮｏｖａＲＥＤ，ＶＩＰ，ＳＧが使えた。
【０１０３】
ＳＧは，発色自体が他の色素に比べて低くかったが，それぞれの封入とグリシン処理で変化しないことから、検出結果が強すぎる抗原と検出結果が弱い抗原の２重染色で、前者の呈色に使える色素であることが判明した。
【０１０４】
ＴＭＢは反応後の沈着が明瞭でなく，封入操作で退色した。表２〜４は、西洋ワサビペルオキダーゼ過酸化水素反応のカップリング色素の封入方法とそのＲＧＢ解析を示す。
【０１０５】
【表２】
【０１０６】
【表３】
【０１０７】
【表４】
【０１０８】
＜実施例３において行なった処理と用いた溶液等＞
抗原回復
パラフィン等を除かれた固定組織パラフィン標本切片を、０．０１Ｍクエン酸緩衝液ｐＨ６．０に浸し加熱処理する方法がある。加熱処理は、オートクレーブ行なう。
【０１０９】
０．０１Ｍクエン酸緩衝液等ｐＨ６．０
２．１ｇのクエン酸・一水和物と２．９４ｇクエン酸三ナトリウム・二水和物を１００ｍｌのイオン交換水にオートクレーブで加熱し溶解し、１０Ｎ水酸化ナトリウム水でｐＨを６．０に調整し、イオン交換水で１００ｍｌに調節したものを１０倍溶液とし、使用時に１０倍にイオン交換水で希釈する。商業的には、１０倍溶液がダコサイトメーション社やダイヤトロン社から供給されている。その他に、抗原回復には、〔非特許文献７〕のｐ．１１４に記載されている１ｍＭ ＥＤＴＡ溶液ｐＨ ８．０、などが用いられ、ダコサイトメーション社から供給されている。
【０１１０】
抗ＣＤ６８抗体
ダコサイトメーション社が供給しているマウス抗ヒトＣＤ６８マクロファージ抗体（ＰＧ−Ｍ１，Ｍ０８７６）で、５０倍にダコサイトメーション社が供給しているダコＣｈｅｍＭａｔｅ抗体希釈液（Ｓ２０２２）で希釈し、使用する。
【０１１１】
ポリマー試薬
デキストランポリマーに直接二次抗体とＨＲＰを結合させた試薬で、ダコサイトメーション社から商業的にダコＣｈｅｍＭａｔｅ ＥＮＶＩＳＩＯＮ試薬として供給されている。
【０１１２】
酵素の発色剤（カップリング色素）
ヂアミノベンチジン（ＤＡＢ）
ダコサイトメーション社から、液状試薬としてＫ３４６６として供給されている。
【０１１３】
ヂアミノベンチジンニッケル （ＤＡＢ−Ｎｉ）
ＤＡＢ２０ｍｇ、硫化ニッケル（ＮｉＳＯ４・（ＮＨ４）２ＳＯ４・６Ｈ２Ｏ）４０ｍｇを０．０５Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．６）１００ｍｌに溶解し、７μｌの過酸化水素水原液を加え、ろ過して使用する。ベクター社からＤＡＢ基質キット（ＳＫ−４１００）として供給されている。
【０１１４】
アミノエチルカルバゾール（ＡＥＣ）
３ーアミノー９ーエチルカルバゾール（シグマ社）を０．４％になるようにジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、保全液とする、保存液５ｍｌを０．１Ｍ酢酸緩衝液ｐＨ５．０の９５ｍｌと混合し、２０μｌの過酸化水素水原液を加え、ろ過して用いる。０．１Ｍ酢酸緩衝液ｐＨ５．０は、９９％酢酸１１．５ｍｌをイオン交換水で１Ｌとし、この１４．８ｍｌと酢酸ナトリウム１６．４ｇないし酢酸ナトリウム・三水塩２７．２ｇをイオン交換水に溶解し１Ｌとした０．２Ｍ酢酸ナトリウム水溶液３５．２ｍｌを混合し、イオン交換水を加えて１００ｍｌとする。ダコサイトメーション社からキットが供給されている。
【０１１５】
ＶＩＰ、ＳＧ、ＮｏｖａＲＥＤ、ＴＭＢ
ＶＩＰ、ＳＧ、ＮｏｖａＲＥＤ，ＴＭＢのそれぞれ、西洋ワサビペルオキシダーゼの発色カップリング色素として、ベクター社から、ＳＫ−４６００、ＳＫ−４７００、ＳＫ−４８００、ＳＫ−４４００としてキット化され供給されている。
【０１１６】
永久標本作成の為の封入法
染色後に、固定組織標本切片を、エタノールに浸し脱水し、キシレンに浸し透徹し、プラスチック封入剤のオイキットで封入する。通常用いられる封入方法であり、通常法と記す。
【０１１７】
Ｕｌｔｒａｍｏｕｎｔ法
ダコサイトメーション社から供給されている永久標本用マウンティングメディウムＵｌｔｒａｍｏｕｎｔ（Ｓ１９６４）を、固定組織標本切片を被うように滴下して、７０℃加熱したオーブン中で加熱固化する方法。
【０１１８】
ＶｅｃｔａＭｏｕｎｔ法
ベクター社から供給されているＶｅｃｔａＭｏｕｎｔ （Ｈ−５０００）を固定組織標本切片を被うように滴下しスライドグラスで被い自然固化させる方法。
【０１１９】
Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ
アドベ社から供給されているコンピュータソフトで、画像処理を行う。この検索では、Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ ３．０Ｊを使用している。このソフトを用いて、顕微鏡カラー写真画像をカラー画像を、チャンネル分割機能で、ＲＧＢないしＣＭＹＫのグレースケール画像に分割できる。ＲＧＢシステムで色を表現する場合には、光が基準となるので、以下のＮＩＨ−ｉｍａｇｅでそのＲＧＢ各成分の測定値を得るには、画像を反転する必要がある。画像の反転の機能はＮＩＨ−ｉｍａｇｅにある。
【０１２０】
ＮＩＨ−ｉｍａｇｅ
画像の解析ソフト。分析メニューの測定で、画像の平均グレースケールと面積（ピクセル換算）を得ることができる。
【０１２１】
〔実施例４〕
一部で同一局在を示す二つの抗原の二重免疫染色の例として、ＣＤ６８とＦａｓｃｉｎ の２重免疫染色を行った。実施例３で検討したＨＲＰ過酸化水素反応のカップリング色素を用い実施し、色素の組み合わせの妥当性を検討した。実際の２重免疫染色は、核の対比染色を行うので、表２に示すヘマトキシリンを加えた３重染色になる。一次抗体のＣＤ６８は 単球と組織球，状細胞）を標識し、一次抗体のＦａｓｃｉｎは樹状細胞を標識する。固定組織標本切片はヒト扁桃組織を用いた。抗原回復は，ＥＤＴＡ溶液によるオートクレーブによる熱処理で行った。反応した一次抗体の検出はポリマー試薬のＣｈｅｍＭａｔｅ ＥＮＶＩＳＩＯＮを用いた。
【０１２２】
その二重免疫染色像を図５に示す。ａは、ＤＡＢ−ＮｉとＤＡＢ、ｂはＤＡＢ−ＮｉとＡＥＣ、ｃはＤＡＢとＡＥＣ、ｄはＤＡＢとＶＩＰ、ｅはＳＧとＡＥＣ、ｆはＳＧとＮｏｖａＲＥＤのカップリング色素の組み合わせである。図５は、ＤＡＢとＡＥＣ，ＤＡＢとＶＩＰ，ＳＧとＡＥＣ，ＳＧとＮｏｖａＲＥＤが使用可能な色素の組み合わせであることを示唆し、一部で同一局在を示す抗原の２重免疫染色では有効なカップリング色素の組み合わせであることが示唆された。
【０１２３】
表２によれば、ＤＡＢ−Ｎｉのグリシン処理による赤（Ｒ）成分の増加からＤＡＢ−ＮｉとＤＡＢと区別できる可能性があるが、ＤＡＢ−Ｎｉのグリシン処理による青（Ｂ）成分の減少によりＤＡＢ−ＮｉとＤＡＢは近似した青（Ｂ）成分を示し、結果的に、図５ａに示すように、ＤＡＢ−Ｎｉ−とＤＡＢの組み合わせは、ＤＡＢ−ＮｉとＤＡＢの識別が容易でない結果になっている。
【０１２４】
また、ＤＡＢ−ＮｉとＡＥＣの組み合わせは、ＤＡＢ−Ｎｉのグリシン処理による赤（Ｒ）成分の増加により、ＤＡＢ−ＮｉとＡＥＣは近似した赤（Ｒ）成分を示し、図５ｂに示すように、ＤＡＢ−ＮｉとＡＥＣの識別が容易でないものになっている。
【０１２５】
ＲＧＢ画像では、ＤＡＢとＶＩＰの組み合わせが、ＤＡＢをＢ画像で、ＶＩＰをＲ画像で判別出来、良い組み合わせであることが、Ｒ、Ｇ、Ｂのグレースケールの画像でも理解できる。
【０１２６】
＜実施例４において行なった処理と用いた溶液等＞
抗原回復
パラフィン等を除かれた固定組織パラフィン標本切片を、トリプシン等の酵素で処理するか、０．０１Ｍクエン酸緩衝液ｐＨ６．０などの緩衝液に浸し加熱処理する方法がある。加熱処理は、マイクロウエーブ装置、オートクレーブ、圧力鍋、温浴装置等で行なわれる。酵素処理も加熱処理も、標的抗原により、その処理条件は異なる。
【０１２７】
１ｍＭないし０．０１Ｍ ＥＤＴＡ溶液ｐＨ８．０
エチレンジアミン四酢酸（以下，ＥＤＴＡという）・二ナトリウム（同仁化学社）０．３７ｇをイオン交換水１Ｌに加え、１Ｎ水酸化ナトリウムでｐＨ ８．０に調整する。ダコサイトメーション社からこの試薬（Ｓ３３０７ないしＳ３３０８）が供給されている。
【０１２８】
抗ＣＤ６８抗体
ダコサイトメーション社が供給しているマウス抗ヒトＣＤ６８マクロファージ抗体（ＰＧ−Ｍ１，Ｍ０８７６）で、５０倍にダコサイトメーション社が供給しているダコＣｈｅｍＭａｔｅ抗体希釈液（Ｓ２０２２）で希釈し、使用する。
【０１２９】
抗Ｆａｓｃｉｎ抗体
ダコサイトメーション社が供給しているマウス抗ヒトＦａｓｃｉｎ蛋白抗体（５５Ｋ−２、Ｍ３５６７）で、５０倍にダコサイトメーション社が供給しているダコＣｈｅｍＭａｔｅ抗体希釈液（Ｓ２０２２）で希釈し、使用する。
【０１３０】
ポリマー試薬
デキストランポリマーに直接二次抗体とＨＲＰを結合させた試薬で、ダコサイトメーション社から商業的にダコ ＣｈｅｍＭａｔｅ ＥＮＶＩＳＩＯＮ試薬として供給されている。
【０１３１】
酵素の発色剤（カップリング色素）
ヂアミノベンチジン（ＤＡＢ）
ダコサイトメーション社から、液状試薬としてＫ３４６６として供給されている。
【０１３２】
ヂアミノベンチジンニッケル（ＤＡＢ−Ｎｉ）
ＤＡＢ２０ｍｇ、硫化ニッケル（ＮｉＳＯ４・（ＮＨ４）２ＳＯ４・６Ｈ２Ｏ）４０ｍｇを０．０５Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．６）１００ｍｌに溶解し、７μｌの過酸化水素水原液を加え、ろ過して使用する。ベクター社からＤＡＢ基質キット（ＳＫ−４１００）として供給されている。
【０１３３】
アミノエチルカルバゾール（ＡＥＣ）
３ーアミノー９ーエチルカルバゾール（シグマ社）を０．４％になるようにジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、保全液とする。保存液５ｍｌを０．１Ｍ酢酸緩衝液ｐＨ５．０の９５ｍｌと混合し、２０μｌの過酸化水素水原液を加え、ろ過して用いる。０．１Ｍ酢酸緩衝液ｐＨ５．０は、９９％酢酸１１．５ｍｌをイオン交換水で１Ｌとし、この１４．８ｍｌと酢酸ナトリウム１６．４ｇないし酢酸ナトリウム・三水塩２７．２ｇをイオン交換水に溶解し１Ｌとした０．２Ｍ酢酸ナトリウム水溶液３５．２ｍｌを混合し、イオン交換水を加えて１００ｍｌとする。ダコサイトメーション社からキットが供給されている。
【０１３４】
ＶＩＰ、ＳＧ、ＮｏｖａＲＥＤ
それぞれ、西洋ワサビペルオキシダーゼの発色カップリング色素として、ベクター社から、ＳＫ−４６００、ＳＫ−４７００、ＳＫ−４８００としてキット化され供給されている。
【０１３５】
グレースケールの画像
各ピクセルを０から２５５の２５６階調の濃淡で表した画像。ピクセルとは、画像の一つの要素で細小単位の面積を有する。Ｒ、Ｇ、Ｂのカラー画像からＰｈｏｔｏｓｈｏｐのＲＧＢチャンネル分割機能で作成された各画像は、このグレースケール画像になる。
【０１３６】
〔実施例５〕
一部で局在が異なる二つの抗原の二重免疫染色として、ＣＤ３とＣＤ５の２重免疫染色を行った。ＣＤ３はＴ細胞に認められる抗原であり、ＣＤ５はＴ細胞とＢ細胞の一部に見られる。固定組織標本切片は１０％ホルマリン緩衝液固定のヒト扁桃組織のものを用い、０．０１Ｍクエン酸緩衝液ｐＨ６．０でオートクレーブで抗原回復を行った。反応した一次抗体はポリマー試薬のＣｈｅｍＭａｔｅ ＥＮＶＩＳＩＯＮを用い、ＨＲＰのカップリング色素としては、ＣＤ３ではＤＡＢを、ＣＤ５ではＶＩＰを用いた。
【０１３７】
図６に、リンパ瀘胞マントル周囲の染色像を示す。多くのＣＤ３陽性ＣＤ５陽性のＴ細胞の分布を図の左側に認め、Ｂ画像の陽性細胞として認める。図右側が胚中心領域である。図中央部がマントルから瀘胞辺縁域であり、この部分でにＣＤ３陰性ＣＤ５陽性のＢ細胞を認める。このＣＤ３陰性ＣＤ５陽性のＢ細胞は、Ｒ画像での陽性細胞と判別される。これは、ＤＡＢを用いた場合ＢＧでしか現われず、ＶＩＰでは、ＢＧＲすべてにおいて現われるからである。
【０１３８】
＜実施例５において行なった処理と用いた溶液等＞
抗原回復
パラフィン等を除かれた固定組織パラフィン標本切片を、トリプシン等の酵素で処理するか、０．０１Ｍクエン酸緩衝液ｐＨ６．０などの緩衝液に浸し加熱処理する方法がある。加熱処理は、マイクロウエーブ装置、オートクレーブ、圧力鍋、温浴装置等で行なわれる。酵素処理も加熱処理も、標的抗原により、その処理条件は異なる。
【０１３９】
０．０１Ｍクエン酸緩衝液等
２．１ｇのクエン酸・一水和物と２．９４ｇクエン酸三ナトリウム・二水和物を１００ｍｌのイオン交換水にオートクレーブで加熱し溶解し、１０Ｎ 水酸化ナトリウム水でｐＨを６．０に調整し、イオン交換水で１００ｍｌに調節したものを１０倍溶液とし、使用時に１０倍にイオン交換水で希釈する。
【０１４０】
抗ＣＤ３抗体
ノボキャストラ社が供給しているマウス抗ヒトＣＤ３抗体（ＮＣＬ−ＣＤ３−ＰＳ１）で、１００倍にダコサイトメーション社が供給しているダコＣｈｅｍＭａｔｅ抗体希釈液（Ｓ２０２２）で希釈する。
【０１４１】
抗ＣＤ５抗体
ノボキャストラ社が供給しているマウス抗ヒトＣＤ５抗体（ＮＣＬ−ＣＤ５−４Ｃ７）で，１００倍にダコサイトメーション社が供給しているダコＣｈｅｍＭａｔｅ抗体希釈液（Ｓ２０２２）で希釈する。
【０１４２】
ポリマー試薬
デキストランポリマーに直接二次抗体とＨＲＰを結合させた試薬で、ダコサイトメーション社から商業的にダコＣｈｅｍＭａｔｅ ＥＮＶＩＳＩＯＮ試薬として供給されている。
【０１４３】
ヂアミノベンチジン （ＤＡＢ）
ダコサイトメーション社から、液状試薬としてＫ３４６６として供給されている。
【０１４４】
ＶＩＰ
西洋ワサビペルオキシダーゼの発色カップリング色素として、ベクター社から、ＳＫ−４６００としてキット化され供給されている。
【０１４５】
〔実施例６〕
局在の異なる二つの抗原の二重免疫染色の例としてＣＤ３とＣＤ７９ａの二重免疫染色を行った。ＣＤ３はＴ細胞に認められ、ＣＤ７９ａはＢ細胞に認められる。抗原回復は０．０１Ｍクエン酸緩衝液ｐＨ６．０でのオートクレーブ処理を行い，酵素処理を通常使用の１０分１活性で３５℃で５分間の反応を自動免疫染色装置のプロトコールに組み込み行った。固定組織標本切片は１０％ホルマリン緩衝液固定のヒト扁桃組織のものを用い、０．０１Ｍクエン酸緩衝液ｐＨ６．０でオートクレーブで抗原回復を行った。反応した一次抗体はポリマー試薬のＣｈｅｍＭａｔｅ ＥＮＶＩＳＩＯＮを用い、ＨＲＰのカップリング色素としては、ＣＤ３ではＤＡＢを、ＣＤ７９ａではＶＩＰを用いた。
【０１４６】
その染色像を図７に示す。図７のａとｂは弱拡大像、ｃとｄは強拡大像、ｃは胚中心、ｄはマントルから辺縁域である。ＤＡＢで標識されたＴ細胞は茶色に発色しＢ画像の陽性細胞であり、Ｂ細胞は紫に発色しＲ画像の陽性細胞である。明瞭に本発明の免疫組織化学的染色方法で、Ｔ細胞をＢ細胞が染め分けられているのが解る。
【０１４７】
＜実施例６において行なった処理と用いた溶液等＞
抗原回復
パラフィン等を除かれた固定組織パラフィン標本切片を、トリプシン等の酵素で処理するか、０．０１Ｍクエン酸緩衝液ｐＨ６．０などの緩衝液に浸し加熱処理する方法がある。加熱処理は、マイクロウエーブ装置、オートクレーブ、圧力鍋、温浴装置等で行なわれる。酵素処理も加熱処理も、標的抗原により、その処理条件は異なる。
【０１４８】
０．０１Ｍクエン酸緩衝液等ｐＨ６．０
２．１ｇのクエン酸・一水和物と２．９４ｇクエン酸三ナトリウム・二水和物を１００ ｍｌのイオン交換水にオートクレーブで加熱し溶解し、１０Ｎ 水酸化ナトリウム水でｐＨを６．０に調整し、イオン交換水で１００ｍｌに調節したものを１０倍溶液とし、使用時に１０倍にイオン交換水で希釈する。
【０１４９】
酵素処理
トリプシン（シグマ社、Ｔ７１６８ Ｔａｂｌｅｔ）
一錠を１ｍｌのイオン交換水に溶解したものを反応液として用いる。
【０１５０】
プロナーゼ
プロナーゼ（ダコサイトメーション社）１００ｍｇを１０ｍｌの０．１Ｍ／Ｌの塩化ナトリウムを含む０．０５Ｍトリス塩酸緩衝液ｐＨ７．２に溶解する。この原液を０．１Ｍ／Ｌの塩化ナトリウムを含む０．０５Ｍトリス塩酸緩衝液ｐＨ７．２で２０倍に希釈する。
【０１５１】
プロテイナーゼＫ
プロテイナーゼＫ濃縮液（ダコサイトメーション社、Ｓ３００４）の４０μｌを０．０５Ｍトリス塩酸緩衝液ｐＨ７．５〜７．７の２ｍｌに加える。
【０１５２】
抗ＣＤ３抗体
ノボキャストラ社が供給しているマウス抗ヒトＣＤ３抗体（ＮＣＬ−ＣＤ３−ＰＳ１）で、１００倍にダコサイトメーション社が供給しているダコＣｈｅｍＭａｔｅ抗体希釈液（Ｓ２０２２）で希釈し、使用する。
【０１５３】
抗ＣＤ７９ａ抗体
ノボキャストラ社が供給しているマウス抗ヒトＣＤ７９ａ抗体（ＣＤ７９ａ、Ｂセッｌ、ＪＣＢ１１７、Ｍ７０５０）で，２００倍にダコサイトメーション社が供給しているダコＣｈｅｍＭａｔｅ抗体希釈液（Ｓ２０２２）で希釈し、使用する。
【０１５４】
ポリマー試薬
デキストランポリマーに直接二次抗体とＨＲＰを結合させた試薬で、ダコサイトメーション社から商業的にダコＣｈｅｍＭａｔｅ ＥＮＶＩＳＩＯＮ試薬として供給されている。
【０１５５】
ヂアミノベンチジン（ＤＡＢ）
ダコサイトメーション社から、液状試薬としてＫ３４６６として供給されている。
【０１５６】
ＶＩＰ
西洋ワサビペルオキシダーゼの発色カップリング色素として、ベクター社から、ＳＫ−４６００としてキット化され供給されている。
【０１５７】
〔実施例７〕
局在が同じ二つの抗原の二重免疫染色の例として、増殖抑制遺伝子産物であるｐ５３ 蛋白と増殖細胞を標識するＫｉ−６７抗原の２重免疫染色を行った。緩衝１０％ホルマリン溶液固定組織パラフィン包埋標本切片は口腔粘膜扁平上皮癌の周辺粘膜の切片である。抗原回復は、０．０１Ｍクエン酸緩衝液ｐＨ６．０でオートクレーブで行った。一次抗体はポリマー試薬ダコＣｈｅｍＭａｔｅ ＥＮＶＩＳＩＯＮで検出し、ＨＲＰのカップリング色素は、ｐ５３蛋白はＳＧを、Ｋｉ−３７抗原はＡＥＣを用いた。
【０１５８】
図８に、その染色像を示す。図８のａは過形成を示す扁平上皮、ｂは異形成を示す扁平上皮、ｃは強度の異形成ないしｉｎ−ｓｉｔｕの癌を示す扁平上皮である。ｐ５３蛋白の過剰核内蓄積はＳＧで核に青黒に標識され、Ｇ画像の陽性核で示されている。Ｋｉ−６７抗原陽性の増殖細胞の核はＡＥＣで赤く、Ｂ画像の陽性核で示されている。過形成から強度の異形成ないしｉｎ−ｓｉｔｕの癌までの扁平上皮の増殖性病変を特徴づけるｐ５３蛋白とＫｉ６７抗原の２重免疫染色像が得られた。
【０１５９】
＜実施例７において行なった処理と用いた溶液等＞
緩衝１０％ホルマリン溶液
リン酸一ナトリウム・２水塩４ｇとリン酸二ナトリウム・１２水塩２６ｇをイオン交換水９００ｍｌに溶解し、特級ホルムアルデヒド液（ホルマリン）１００ｍｌを加えて作成する。
【０１６０】
抗原回復
パラフィン等を除かれた固定組織パラフィン標本切片を、トリプシン等の酵素で処理するか、０．０１Ｍクエン酸緩衝液ｐＨ６．０などの緩衝液に浸し加熱処理する方法がある。加熱処理は、マイクロウエーブ装置、オートクレーブ、圧力鍋、温浴装置等で行なわれる。酵素処理も加熱処理も、標的抗原により、その処理条件は異なる。
【０１６１】
０．０１Ｍクエン酸緩衝液等ｐＨ６．０
２．１ｇのクエン酸・一水和物と２．９４ｇクエン酸三ナトリウム・二水和物を１００ ｍｌのイオン交換水にオートクレーブで加熱し溶解し、１０Ｎ 水酸化ナトリウム水でｐＨを６．０に調整し、イオン交換水で１００ｍｌに調節したものを１０倍溶液とし、使用時に１０倍にイオン交換水で希釈する。
【０１６２】
抗ｐ５３蛋白抗体
ノボキャストラ社が供給しているマウス抗ヒトｐ５３蛋白抗体（ＮＣＬ−ｐ５３−１８０１）で、１００倍にダコサイトメーション社が供給しているダコＣｈｅｍＭａｔｅ抗体希釈液（Ｓ２０２２）で希釈し、使用する。
【０１６３】
抗Ｋｉ−６７抗原抗体
ダコサイトメーション社が供給しているマウス抗ヒトＫｉ−６７抗原抗体（ＭＩＢ−１， Ｍ７２４０）で、５０倍にダコサイトメーション社が供給しているダコＣｈｅｍＭａｔｅ抗体希釈液（Ｓ２０２２）で希釈し、使用する。
【０１６４】
ポリマー試薬
デキストランポリマーに直接二次抗体とＨＲＰを結合させた試薬で、ダコサイトメーション社から商業的にダコ ＣｈｅｍＭａｔｅ ＥＮＶＩＳＩＯＮ試薬として供給されている。
【０１６５】
アミノエチルカルバゾール（ＡＥＣ）
３ーアミノー９ーエチルカルバゾール（シグマ社）を０．４％になるようにジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、保全液とする、保存液５ｍｌを０．１Ｍ酢酸緩衝液ｐＨ５．０の９５ｍｌと混合し、２０μｌの過酸化水素水原液を加え、ろ過して用いる。０．１Ｍ酢酸緩衝液ｐＨ５．０は、９９％酢酸１１．５ｍｌをイオン交換水で１Ｌとし、この１４．８ｍｌと酢酸ナトリウム１６．４ｇないし酢酸ナトリウム・三水塩２７．２ｇをイオン交換水に溶解し１Ｌとした０．２Ｍ酢酸ナトリウム水溶液３５．２ｍｌを混合し、イオン交換水を加えて１００ｍｌとする。ダコサイトメーション社からキットが供給されている。
【０１６６】
ＳＧ
西洋ワサビペルオキシダーゼの発色カップリング色素として、ベクター社から、ＳＫ−４７００としてキット化され供給されている。
【０１６７】
【発明の効果】
本発明は、抗原の検出に際して、検出時間の大幅な短縮、染色に用いる色素の選別、方法の自動化にも適する抗原の検出方法を提供し得るという有利な効果を奏する。
【０１６８】
また、本発明は、多重免疫染色方法の普及にも大きく貢献するものであり、また、腫瘍化の段階を２つ以上の抗原を標識する多重免液染色方法の実用化の大きな契機にもなるものであると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の二重免疫染色を含む免疫組織化学的染色法の一実施態様による光顕的に識別される最終産物の概念図である。
【図２】グリシン緩衝液による一次抗体除去効果を示すもので、非特異的一次抗体反応の抑制の効果を示す。
【図３】グリシン緩衝液による抗原のマスク効果を示す。
【図４】西洋ワサビペルオキシダーゼのカップリング色素の発色の実際を示す。
【図５】西洋ワサビペルオキシダーゼのカップリング色素の組み合わせによるＣＤ６８とＦａｓｃｉｎ（抗原の局在が一部で重なる場合）の二重免疫染色を示す。
【図６】西洋ワサビペルオキシダーゼのカップリング色素であるＤＡＢとＶＩＰによるＣＤ３とＣＤ５（抗原の局在が一部で異なる場合）の二重免疫染色像を示す。
【図７】西洋ワサビペルオキシダーゼのカップリング色素であるＤＡＢとＶＩＰによるＣＤ３とＣＤ７９ａ（抗原の局在が異なる場合）の二重免疫染色像を示す。
【図８】西洋ワサビペルオキシダーゼのカップリング色素であるＳＧとＡＥＣによるｐ５３蛋白とＫｉ−６７抗原（抗原の局在が異なる場合）の二重免疫染色像を示す。
【発明が属する技術分野】
本発明は、抗原の検出方法に関し、特に、多重免免疫組織化学的染色方法を用いた抗原の検出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年の免疫科学の進歩により、抗原抗体反応を用いて微量の物資を感度良く検出する免疫測定が広く用いられている。免疫測定の中で一般的なものとして、免疫組織染色及び酵素免疫測定がある。
【０００３】
免疫組織染色とは、組織上の特定の抗原を、その抗原を特異的に認識する抗体によって検出する方法である。通常、組織を固定後パラフィン包埋したブロックから薄切した切片上に特定の抗原を認識する抗体を反応させ、反応した抗体の有無から抗原の存在を判断する。最初に抗原と反応させる抗体を、通常、第一抗体と呼ぶ。第一抗体に、視覚又は機器により検出し得るシグナルを発する物質を結合させておけば、そのシグナルの強度から第一抗体の量がわかり、それは即ち切片上の抗原の量に対応する。この目的を達成するためのシグナルを発する物質として蛍光物質、酵素などが挙げられる。
【０００４】
光学顕微鏡での染色像の解析が可能となった現在では、シグナルを発する物質として酵素を用いるのが一般的となった。免疫組織染色を行なう際、第一抗体に酵素を結合させておけば、その酵素の発色性の基質を加えることにより酵素活性に対応した発色が得られ、それは抗体の量に対応、即ち組織上に存在する抗原の量に対応する。しかし、この方法では通常十分な感度が得られない。
【０００５】
抗原を検出する免疫組織化学的染色方法には、一次抗体を可視化できる酵素や標識物で標識したものを用いる直接法と一次抗体を標識せずに二次抗体を標識する間接法があることが記載されている（酵素抗体法 学際企画 ２０００２．２．１８発刊、ｐ．２３−２５（以下、非特許文献１という））。一般に、間接法には、抗原を一次抗体で標識した後に、この特異抗体を標識する間接法に属するペルオキシダーゼ抗ペルオキシダーゼ法（以下、ＰＡＰ法という）、ストレプトアビチンービオチン複合体法（以下、ｓＡＢＣ法という）、二次抗体と標識酵素とのポリマーへ結合させたポリマー試薬法、ＦＩＴＣで標識した一次抗体ないし二次抗体をＨＲＰ標識抗ＦＩＴＣ抗体を用いる方法、ｓＡＢＣ法に異化レポーター沈着反応（以下、ＣＡＲＤという）を追加した超高感度の免疫組織化学的染色方法がある。
【０００６】
ＰＡＰ法は、「改訂四版 渡辺・中根 酵素抗体法 名倉宏、長村義之、堤寛編 学際企画 ２０００２．２．１８発刊、非特許文献１」に記載されている。これには、ウサギの一次抗体を反応させ、次ぎに、過剰なブタ抗ウサギ抗体を反応させる方法である（当該文献、ｐ．１３６−１３８）。ブタ抗ウサギ抗体の２つのウサギ抗体に対する結合部の一つに、ウサギ抗ＨＲＰ抗体とＨＲＰを可溶性結合させた複合体（ＰＡＰ複合体）を抗原抗体反応で結合する。ＨＲＰと過酸化水素水とジアミノベンチジン等のカップリング色素で抗原の存在部位に呈色反応を生じさせる。ヘマトキシリン溶液で核を対比染色した後に、濃度の漸増するエタノール系列に切片を浸し脱水し、キシレンを浸透させ、カバーガラスでプラスチック溶剤を用いて封入する。
【０００７】
次に、ｓＡＢＣ法は、上記非特許文献１のｐ．１３８−１４４に記載されている。この方法によれば、固定組織パラフィン切片のパラフィンの除去、非特許文献１のｐ．１６３に記載されている０．０３％過酸化水素水メータノール液に２０分間浸し内因性ぺルオキシダーゼ活性を抑制し、リン酸緩衝液で親水化する。切片中の抗原を一次抗体で標識する。ビオチン化二次抗体を一次抗体と反応させ、ストレプトアビチン−ＨＲＰ複合体で標識し、ＨＲＰと過酸化水素水とジアミノベンチジン等のカップリング色素で抗原の存在部位に呈色反応を生じさせる。ヘマトキシリン溶液で核を対比染色した後に、濃度の漸増するエタノール系列に切片を浸し脱水し、キシレンを浸透させ、カバーグラスでプラスチック溶剤を用いて封入する。
【０００８】
また、ＨＲＰ標識抗ＦＩＴＣ抗体を用いる方法は、上記非特許文献１のｐ．１５８に記載されている。これによれば、ｓＡＢＣ法と同様に固定標本切片を親水化し、ＦＩＴＣ標識の一次抗体で抗原を標識するか、抗原と反応させた一次抗体をＦＩＴＣ標識二次抗体で標識し、そのＦＩＴＣをＨＲＰなどの酵素で標識した抗ＦＩＴＣ抗体と反応させ、ＨＲＰなどの呈色反応で、抗原の検出を間接的に行う。ザイメッド社のホームページ（以下、非特許文献２という）に、商業的にこのキットの記載がある。
【０００９】
また、特開２００１−１８１２９９号（以下、特許文献１という）では、ポリマー試薬法が知られている。特許文献１では、ポリマーを担体として酵素（ＨＲＰなど）と抗体（蛋白）の複合体で、高感度に特異抗体で標識される物質の検出が可能との記載がある。この特許文献１の請求項１３に、ポリマー試薬法の記載がある。また、上記非特許文献１のｐ．１４７に、以下に示すポリマー試薬法の実施法の記載がある。ｓＡＢＣ法と同様に固定標本切片を親水化し、切片中の抗原を特異抗体と反応させ、二次抗体とＨＲＰ等の酵素とポリマーの複合体と反応させ、ＨＲＰなどの呈色反応で、抗原の検出を間接的に行う。商業的には、ＥＮＶＩＳＩＯＮ、ＣｈｅｍＭａｔｅ ＥＮＶＩＳＩＯＮがダコサイトメーション社から、ｓｉｍｐｌｅ ｓｔａｉｎ ｓｙｓｔｅｍがニチレイから、二次抗体の代わりに特異抗体と酵素とポリマーの複合体を用いるＥＰＯＳ ｓｙｓｔｅｍがダコサイトメーション社から供給されている。
【００１０】
また、ＣＡＲＤは、米国特許第 ５，７３１，１５８ 号（以下、特許文献２という）に記載があり、この特許文献２では、ｃｌａｉｍ ９に、ビオチン化タイラマイドや蛍光標識（フルオレスシン・イソサイアネート（ＦＩＴＣ）等）タイラマイドの利用の記述がある。この特許文献２の請求項９に、ビオチン化タイラマイドのＣＡＲＤの記載がある。上記非特許文献１のｐ．１５０−１５２とＪＩｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ． １９８９（以下、非特許文献３という）では、酵素反応での特異物質の沈着を特定の物質の検出の増幅に用い、超高感度の検出が可能であるとの記載がある。また、Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ．（以下、非特許文献４という）では、化学固定された組織のパラフィン切片で、抗原回復処理と〔非特許文献１〕の標識シグナルの増幅法の組み合わせ（ＩｍｍｕｎｏＭａｘ法）で、化学固定された組織のパラフィン切片では検出できなかった抗原を検出することができるとの記載がある。上記非特許文献３及び上記非特許文献４に、超高感度の免疫組織化学的染色法の以下に示す実施法の記載がある。すなわち、ｓＡＢＣ法と同様に固定標本切片を親水化し、抗原回復し、ｓＡＢＣ法で抗原を標識し、ＨＲＰによるビオチン化タイラマイドを沈着させ、ストレプトアビチン−ＨＲＰ複合体で標識増幅を行い、抗原の検出感度をｓＡＢＣ法の１０００倍に増幅する超高感度の免疫組織化学的染色を行う方法である。この染色方法はＩｍｍｕｎｏＭａｘ法として報告され、商業的にはｃａｔａｌｙｚｅｄ ｓｉｇｎａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ （ＣＳＡ） ｓｙｓｔｅｍとしてダコサイトメーション社より供給されている。しかし、抗原回復による内因性ビオチンによる非特異反応は強く、非特許文献１のｐ１６４−１６５に記載の内因性ビオチンを０．１％アビチン溶液と０．０１％ビオチン溶液に浸しマスクする方法を導入したものが開発された。そして、ＤＥＮＤＲＩＴＩＣ ＣＥＬＬＳ １９９７（以下、非特許文献５という）と平成１０年度〜平成１１年度科学研究費補助金（基盤研究（Ｃ）（２））研究成果報告書 ＨＴＬＶ−１関連疾患のＨＴＬＶ−１超高感度組織科学的検出法による研究（以下、非特許文献６という）に記載のｍｏｄｉｆｉｅｄ ＩｍｍｕｎｏＭａｘ法が開発された。また、ｓＡＢＣ法の代わりに、ＨＲＰ標識抗ＦＩＴＣ抗体を用いる方法に、ＨＲＰによるビオチン化タイラマイドを沈着させ、ストレプトアビチン−ＨＲＰ複合体で標識増幅を行い、抗原の検出感度をＨＲＰ標識抗ＦＩＴＣ抗体を用いる方法の１０００倍に増幅する超高感度の免疫組織化学的染色方法がキット化され、非ビオチン法としてザイメット社から供給されている。さらに、米国特許第 ６，２０３，９８９号（以下、特許文献５という）では、標的核酸を標識するｉｎ−ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎの増幅したシグナルを可視化する方法として、ＨＲＰ、アルカリフォスファターゼなどの酵素反応の他に、蛍光標識（フルオレスシン・イソサイアネート（ＦＩＴＣ）等）が利用できるとの記載がある。特許文献２の請求項９と特許文献５にＣＡＲＤでの沈着したタイラマイドの標識に、蛍光物質を使う記載がある。
【００１１】
現在、固定組織標本パラフィン切片中の二つ以上の抗原を検出する免疫組織化学的染色方法には、二つの抗原（以下、第１抗原と第２抗原と記載）を検出する場合には、第１抗原を検出し呈色反応物（以下カップリング色素という）ないし発光反応物の沈着を含む免疫組織化学的染色後に、沈着したカップリング色素ないし発光反応物以外の免疫反応産物をｐＨ３以下ないしｐＨ９以上の緩衝液で洗浄することで除去し、第２抗原の免疫組織化学的染色を行う古典的多重免疫組織化学的染色方法がある。
【００１２】
また、古典的多重免液組織化学的染色方法の、一般的な説明と実施法の解説が知られている（ザイメッド社のホームページ、ｐ．１９１−１９４（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｚｙｍｅｄ．ｃｏｍ／）のＮＢＡ ｋｉｔ（非ビオチン法のキット）のページ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｚｙｍｅｄ．ｃｏｍ／ｐｉｎｄｅｘ／ｉｎｄｅｘ９．ｈｔｍｌ）。この染色方法で行われる沈着したカップリング色素ないし発光反応物以外の免疫反応産物をｐＨ３以下ないしｐＨ９以上の緩衝液での洗浄は、一般に、０．１Ｍグリシン塩酸緩衝液ｐＨ２．２が用いられ、第１抗原の免疫組織化学的染色を終えた固定組織パラフィン標本切片をこの緩衝液に浸し、室温で、数時間、攪拌させながらこの緩衝液を３度は交換することで行われると記載されている。また、この文献においては、加熱処理によって、抗原回復を行なうことも記載されている。すなわち、この文献のｐ．１９５に抗原回復の加熱処理を行うことで第１抗原の検出の免疫反応産物の沈着したカップリング色素ないし発光反応物以外の免疫反応産物を無効又は除去する方法の説明の記載がある。この方法は、一般に、第１抗原の免疫組織化学的染色を終えた固定組織パラフィン標本切片を０．０１Ｍクエン酸緩衝液ｐＨ６．０に浸し、加熱型攪拌器やオートクレーブで加熱することにより行われる。抗原回復の加熱処理を行うことで第１抗原の検出の免疫反応産物の沈着したカップリング色素ないし発光反応物以外の免疫反応産物を無効又は除去する方法の一つが、ダコサイトメーション社からキット化されて供給されている。
【００１３】
その他に、免疫組織化学的染色方法に含まれる抗原抗体反応等の飽和状態を利用するか、抗原回復の加熱処理を行うことで第１抗原の免疫組織化学的染色の沈着したカップリング色素ないし発光反応物以外の免疫反応産物を無効又は除去し、第２抗原を検出する免疫組織化学的染色の呈色ないし発光反応反応物の酵素反応における酵素を例えば西洋ワサビペルオキシダーゼからアルカリフォスファターゼに変えて実施する方法がある。
【００１４】
また、第１抗原と第２抗原を検出する免疫組織化学的反応の特異抗体（以下一次抗体という）の抗原性の異なるものを用いるか、異なる抗原抗体反応ないし化学的反応で特異的に検出できる標識物例えばフルオレスシン・イソチオネート（以下ＦＩＴＣという）で標識した一次抗体を用いて、同時に第１抗原と第２抗原を標識し、その標識された二つの抗原を一次抗体の抗原性ないし標識物の特異性に依存して検出する方法がある。
【００１５】
これらの二つ以上の抗原を検出する免疫組織化学的染色方法は多重免疫染色法と呼ばれるが、三つ以上の抗原を検出する方法は実用性があまり無く、実用性のある二つの抗原を検出する免疫組織化学的染色方法が二重免疫染色法と呼ばれている。この多重免疫染色法は、一般に、免疫組織化学的染色方法で一度検索された二つの抗原の関係を知る為に用いられる。
【００１６】
また、免疫組織化学的染色における非特異反応は、目的とする抗原以外の非特異的結合物質をも染色され、ひいては目的とする抗原として最終的に検出されてしまうという問題がある。
【００１７】
このような非特異反応は、固定組織標本切片に内在する原因によるものと固定組織標本切片の処理に起因するもの、染色の各反応の試薬の問題、染色の各反応後の洗浄の問題、染色操作の問題が原因となるものがある。
【００１８】
このような非特異的反応による問題を解決するために、内因性ぺルオキシダーゼ活性による非特異反応の抑制方法が知られている（上記非特許文献１のｐ．１６３）。内因性ぺルオキシダーゼ活性による非特異反応は、固定組織標本切片の内在する原因による非特異反応の一つである。内因性ぺルオキシダーゼ活性の抑制は、固定組織標本パラフィン切片のパラフィンを除き親水化の前に、０．０３％過酸化水素メタノール溶液に切片を２０分間浸すか、親水化後に０．３％過酸化水素リン酸緩衝液に５分間浸して行なう。
【００１９】
抗体の非特異反応は、染色の各反応の試薬の問題、染色の各反応後の洗浄の問題による非特異反応に含まれる。染色に関わる非特異的反応の問題に対して、断片化免疫グロブリン抗体を特異（一次）抗体や二次抗体に用いることで非特異反応を抑制することが知られている米国特許第 ５，８６９，２７４ 号（以下、特許文献４という）では、特異抗体反応の前に一価の抗体を反応させることで、抗体の非特異反応を抑制できるとの記載がある。この特許文献４と上記非特許文献１のｐ．４３）。非特許文献１のｐ． １８５に、抗体希釈液に一次抗体と対応したウマ、ヒツジ、ウサギなどの動物血清を１％から５％加えることで非特異反応を抑制することの記載がある。また、非特許文献１のｐ．１１５に、０．２５％カゼイン溶液を抗体反応の前に５〜３０分間反応させることで非特異反応抑制することの記載がある。抗体希釈液に０．１％Ｔｗｅｅｎ２０などの界面活性剤を添加したトリス緩衝液が商業的に供給され用いられている。
【００２０】
また、抗原回復法による非特異反応は、固定組織標本切片の処理に起因するものであるが、超高感度の免疫組織化学的染色法で問題となる。その主たる原因が抗原回復された内因性ビオチンである。非特許文献１のｐ１６４−１６５に、０．１％アビチン溶液で、内因性ビオチンをマスクし、アビチンの残余ビオチンとの結合部を０．０１％ビオチン溶液でマスクする方法の知られている。この方法をｓＡＢＣ法を含む超高感度の免疫組織化学的染色方法に導入することも知られている（Ｈａｓｕｉ Ｋ， Ｓａｔｏ Ｅ， Ｔａｎａｋａ Ｙ， Ｙａｓｈｉｋｉ Ｓ， Ｉｚｕｍｏ Ｓ． （１９９７） Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｈｉｇｈｌｙ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ ＩｍｍｕｎｏＭａｘ） ｏｆ ＨＴＬＶ−１ ｐ４０ｔａｘ ａｎｄ ｐ２７ｒｅｘ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ＨＴＬＶ−１−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｎｏｎ−ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ ｌｙｍｐｈａｄｅｎｏｐａｔｈｙ （ＨＡＮＮＬＡ） ｗｉｔｈ ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ ｏｆ ＨＴＬＶ−１ｄｏｓｅ ｂｙ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ． ＤＥＮＤＲＩＴＩＣ ＣＥＬＬＳ １９９７ Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ７：１９−２７．（以下、非特許文献５という。））。この非特許文献５には、〔非特許文献２〕のＩｍｍｕｎｏＭａｘ法で、内因性ビオチンによる非特異反応があり、従来発表されているアビチン溶液とビオチン溶液でのビオチンのマスクを導入し、反応後の洗浄条件を変えることで、超高感度免疫組織化学染色が可能であるとの記載がある。（蓮井和久 平成１０年度〜平成１１年度科学研究費補助金（基盤研究（Ｃ）（２））研究成果報告書 ＨＴＬＶ−１関連疾患のＨＴＬＶ−１超高感度組織科学的検出法による研究（課題番号 １０６７０１６６））（以下非特許文献６という）。この文献には、平成１２年３月 ｐ．３−９では、ＨＲＰによるビオチン化タイラマイドの沈着反応による標識の増幅が１０００倍であること、内印性ビオチンのマスク法の超高感度免疫染色法への至適導入部、各超高感度免疫組織科学的染色の反応後の洗浄、後固定の非特異反応抑制条件等の記載がある。
【００２１】
免疫組織化学的染色法の洗浄液は、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、界面活性剤を加えたトリス緩衝液が用いられる。免疫組織化学的染色では、各反応後に、５分間３回の洗浄が行われる。非特許文献５と非特許文献６に、超高感度免疫組織化学的染色方法では、それに含まれるｓＡＢＣ法では充分な反応後の洗浄が必要であり、ＣＡＲＤのビオチン化タイラマイドの沈着は非特異なものであるので、非沈着ビオチン化タイラマイドの残留を除く洗浄と沈着ビオチン化タイラマイドのＨＲＰ標識ストレプトアビチンによる標識後のある程度の洗浄が必要になることの記載がある。また、非特許文献５と非特許文献６に、キャピラリーギャップ法の染色装置を用いた場合には、ｓＡＢＣ法の充分な洗浄は３５℃に加熱した界面活性剤を加えたトリス緩衝液で、ＨＲＰによるビオチン化タイラマイド沈着反応後は室温トリス緩衝液での洗浄が必要であるとの記載がある。
【００２２】
一方、免疫組織化学的染色法の基準化の為に、自動免疫染色装置が普及してきている。キャピラリーギャップ法と呼ばれる２枚の固定組織標本切片のスライドグラスを向き合わせ、その間に毛細管現象を利用して反応液や洗浄液を吸い上げ、反応ないし洗浄後に吸収材で溶液を吸収する。この操作をコンピューター制御するものである。また、コンピューター制御で、反応液や洗浄液を所定の場所からマイクロポンプで吸引し、水平に配置した固定組織標本切片のスライドグラスに反応液や洗浄液を滴下する滴下型がある。この滴下型の自動免疫染色装置の染色方法は用手法と同じもので、普及して来ている。更に、加熱温度制御の出来る基盤の上に、基盤に固定組織標本切片を対面させてスライドガラスをセットし、反応液や洗浄液を基盤とスライドガラスの間に送り、温度制御下で諸反応と洗浄を行う自動免疫装置も出現している。
【００２３】
自動免疫染色装置は、コンピューター制御下の装置で、組織化学的染色方法を実施するものである。組織標本の切片を貼付したスライドの装置へのセットの方法で、二枚のスライドを狭い間隙で重ね、その間に毛細管現象で反応試薬等は入ってくるキャピラリーギャップ法とその変法、スライドに反応試薬等を滴下する滴下型がある。また、免疫組織染色方法の各反応の時間、各反応後の洗浄の方法等をコンピューターのプログラムとして供給されているものと、各反応の試薬の各スライドへの分配、各反応の時間、各反応後の洗浄方法を、任意に設定できるものがある。前者は、特定の免疫組織化学的方法を実施するもの（固定型装置）であり、一般に、その試薬や洗浄液等が共に供給されることが多い。後者は、その使用者の設定した免疫組織化学的染色法を実施させることが可能なもの（自由型装置）がある。米国特許第 ６，３４９，２６４号（以下、特許文献３という）では、コンピューター制御による水平に配列したスライドへの滴下方式での自動免疫染色装置の記載がある。この特許文献３に、この自由型装置の記載がある。また、Ａｐｐｌ Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍ Ｍｏｌ Ｍｏｒｐｈｏｌ． ２００１ Ｍａｒ（以下、非特許文献７という）では、抗原回復を加熱式攪拌装置での熱処理による抗原回復法と従来発表されているアビチン溶液とビオチン溶液でのビオチンのマスクを導入した超高感度免疫染色法（ＣＳＡ法）の自動免疫染色装置での実施が可能であるとの記載がある。この非特許文献７には、この自動免疫染色装置での超高感度の免疫組織化学的染色が可能であると記載されている。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｖｅｎｔａｎａｄｉｓｃｏｖｅｒｙ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ（以下、非特許文献８という）では、加熱温度制御の出来る基盤の上に、基盤に対応する面に固定組織標本切片が来る形でスライドグラスをセットし、反応液や洗浄液を基盤とスライドグラスの間に送り、温度制御下で諸反応と洗浄を行う自動免疫装置（Ｔｈｅ Ｖｅｎｔａｎａ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）の記載がある。この非特許文献８には、加熱温度制御の出来る基盤の上に、基盤に対面して固定組織標本切片のスライドガラスをセットし、反応液や洗浄液を基盤とスライドガラスの間に送り、温度制御下で諸反応と洗浄を行う自動免疫装置の記載がある。
【００２４】
【特許文献１】
特開２００１−１８１２９９号公報（株式会社ニチレイ、平成１３（２００１）年７月３日、酵素−タンパク質複合体）。
【特許文献２】
米国特許第 ５，７３１，１５８ 号公報明細書 （Ｂｏｂｒｏｗ， ｅｔ ａｌ． Ｍａｒｃｈ ２４， １９９８， Ｃａｔａｌｙｚｅｄ ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ）。
【特許文献３】
米国特許第 ６，３４９，２６４号公報明細書 （Ｒｈｅｔｔ， ｅｔ ａｌ． Ｆｅｂｒｕａｒｙ １９， ２００２ Ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ ａｐｐａｒａｔｕｓ ｆｏｒ ａｕｔｏｍａｔｉｃ ｔｉｓｓｕｅ ｓｔａｉｎｉｎｇ）。
【特許文献４】
米国特許第 ５，８６９，２７４ 号公報明細書 （Ｔｓａｏ， ｅｔ ａｌ． Ｆｅｂｒｕａｒｙ ９， １９９９ Ｉｍｍｕｎｏ−ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄ ｔｈａｔ ｒｅｄｕｃｅｓ ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ ｓｔａｉｎｉｎｇ ）。
【特許文献５】
米国特許第 ６，２０３，９８９号公報明細書 （Ｇｏｌｄｂｅｒｇ ， ｅｔ ａｌ． Ｍａｒｃｈ ２０， ２００１ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ａｍｐｌｉｆｙｉｎｇ ｄｅｔｅｃｔａｂｌｅ ｓｉｇｎａｌｓ ｉｎ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｓｓａｙｓ ）。
【非特許文献１】
改訂四版 渡辺・中根 酵素抗体法 名倉宏、長村義之、堤寛編 学際企画 ２０００２．２．１８発刊
【非特許文献２】
ザイメッド社のホームページ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｚｙｍｅｄ．ｃｏｍ／）のＮＢＡ ｋｉｔ（非ビオチン法のキット）のページ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｚｙｍｅｄ．ｃｏｍ／ｐｉｎｄｅｘ／ｉｎｄｅｘ９．ｈｔｍｌ）
【非特許文献３】
Ｂｏｂｒｏｗ ＭＮ， Ｈａｒｒｉｓ ＴＤ， Ｓｈａｕｇｈｎｅｓｓｙ ＫＪ， Ｌｉｔｔ ＧＪ． Ｃａｔａｌｙｚｅｄ ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ， ａ ｎｏｖｅｌ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｓｉｇｎａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ． Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ． Ｊ−Ｉｍｍｕｎｏｌ−Ｍｅｔｈｏｄｓ． １９８９ Ｄｅｃ ２０； １２５（１−２）： ２７９−８５。
【非特許文献４】
Ｍｅｒｚ Ｈ， Ｍａｌｉｓｉｕｓ Ｒ， Ｍａｎｎｗｅｉｌｅｒ Ｓ， Ｚｈｏｕ Ｒ， Ｈａｒｔｍａｎｎ Ｗ， Ｏｒｓｃｈｅｓｃｈｅｋ Ｋ， Ｍｏｕｂａｙｅｄ Ｐ， Ｆｅｌｌｅｒ ＡＣ （１９９５） ＩｍｍｕｎｏＭａｘ． Ａ ｍａｘｉｍｉｚｅｄ ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｒｅｔｒｉｅｖａｌ ａｎｄ ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｏｆ ｈｉｄｄｅｎ ａｎｔｉｇｅｎｓ． Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ． Ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ａｎｄ Ｃａｎａｄｉａｎ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ． ＬＷＷ， Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ ｐｕｂｌｉｓｈｅｓ １９９５ Ｊｕｌ；７３（１）：１４９−５６．。
【非特許文献５】
Ｈａｓｕｉ Ｋ， Ｓａｔｏ Ｅ， Ｔａｎａｋａ Ｙ， Ｙａｓｈｉｋｉ Ｓ， Ｉｚｕｍｏ Ｓ． （１９９７） Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｈｉｇｈｌｙ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ （Ｍｏｄｉｆｉｅｄ ＩｍｍｕｎｏＭａｘ） ｏｆ ＨＴＬＶ−１ ｐ４０ｔａｘ ａｎｄ ｐ２７ｒｅｘ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ＨＴＬＶ−１−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｎｏｎ−ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ ｌｙｍｐｈａｄｅｎｏｐａｔｈｙ （ＨＡＮＮＬＡ） ｗｉｔｈ ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ ｏｆ ＨＴＬＶ−１ ｄｏｓｅ ｂｙ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ． ＤＥＮＤＲＩＴＩＣ ＣＥＬＬＳ １９９７ Ｊａｐａｎｅｓｅ ＤｅｎｄｒｉｔｉｃＣｅｌｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ７：１９−２７。
【非特許文献６】
蓮井和久 平成１０年度〜平成１１年度科学研究費補助金（基盤研究（Ｃ）（２））研究成果報告書 ＨＴＬＶ−１関連疾患のＨＴＬＶ−１超高感度組織科学的検出法による研究（課題番号 １０６７０１６６）。
【非特許文献７】
Ｈａｓｈｉｚｕｍｅ Ｋ， Ｈａｔａｎａｋａ Ｙ， Ｋａｍｉｈａｒａ Ｙ， Ｔａｎｉ Ｙ． Ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｔａｉｎｉｎｇ ｏｆ ｆｏｒｍａｌｉｎ−ｆｉｘｅｄ ａｎｄ ｐａｒａｆｆｉｎ−ｅｍｂｅｄｄｅｄ ｔｉｓｓｕｅｓ ｕｓｉｎｇ ａ ｃａｔａｌｙｚｅｄ ｓｉｇｎａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ． Ａｐｐｌ−Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍ−Ｍｏｌ−Ｍｏｒｐｈｏｌ． ２００１ Ｍａｒ； ９（１）： ５４−６０。
【非特許文献８】
ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｖｅｎｔａｎａｄｉｓｃｏｖｅｒｙ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ。
【００２５】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上述した古典的多重免液組織化学的染色方法において、沈着したカップリング色素ないし発光反応物以外の免疫反応産物を０．１Ｍグリシン塩酸緩衝液ｐＨ２．２等で除去するには、室温で数時間要し、完全な除去の達成の指標がなく、基準化されていない。また、カップリング色素は、ＨＲＰでも複数あり、その組み合わせが明らかにされていない。ダコサイトメーション社からキット化され供給されているものは、加熱処理がその染色過程で必要とされ、自動免疫染色装置への導入が困難である等の問題がある。
【００２６】
そこで、本発明は、抗原の検出に際して、検出時間の大幅な短縮、染色に用いる色素の選別、方法の自動化にも適する抗原の検出方法を提供することにある。
【００２７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、一次抗体の非特異的反応の抑制に着目し、種々の緩衝液、非特異反応抑制物質を鋭意研究した結果、本発明の抗原の検出方法を見出すに至った。すなわち、本発明の抗原の検出方法は、呈色物又は発光物で抗原を多重染色する多重免疫組織化学的染色方法を用いて二以上の異なる抗原を検出する抗原の検出方法であって、非特異反応抑制処理を行なうことによって、一次抗体と非特異的に結合する非特異的結合物質へ非特異反応抑制物質を被膜し、前記一次抗体と非特異的結合物質との結合を抑制することを特徴とする。
【００２８】
また、本発明の抗原の検出方法の好ましい実施態様において、前記非特異的反応抑制処理を、第一抗原と一次抗体との抗原抗体反応の前に行なうことを特徴とする。
【００２９】
また、本発明の抗原の検出方法の好ましい実施態様において、前記非特異的反応抑制処理が、二次抗体と同種の動物血清による処理、スキンミルクによる処理、ノンファットミルクによる処理、及びガゼイン溶液による処理からなる群から選択される少なくとも１種であることを特徴とする。
【００３０】
また、前記カゼイン処理を、０．０２５〜２．５％の範囲のカゼインを含む溶液により行なうことを特徴とする。
【００３１】
また、本発明の抗原の検出方法の好ましい実施態様において、抗体に結合している免疫反応物であって、最後に検出する抗原以外の抗原を検出する免疫反応産物の呈色物又は発光物を除いたものを、ｐＨ３以下又はｐＨ９以上の緩衝液で除去することを特徴とする。
また、本発明の抗原の検出方法の好ましい実施態様において、さらに、非特異反応生成物、及びその他の残存反応物を除去するために、加熱した洗浄液によって洗浄する工程を含む、ことを特徴とする。
また、本発明の抗原の検出方法の好ましい実施態様において、前記加熱した洗浄液の温度が、２５〜６０℃の範囲内であることを特徴とする。
【００３２】
また、本発明の抗原の検出方法の好ましい実施態様において、前記呈色物又は発光物の除去を、前記最後に検出する抗原以外の抗原の同定後に行なうことを特徴とする。
【００３３】
また、本発明の抗原の検出方法の好ましい実施態様において、免疫組織化学的染色方法が、異なる成分強度を有する複数の色素を用いて染色する方法であり、前記成分強度の差異に基づいて抗原を検出することを特徴とする。
【００３４】
また、本発明の抗原の検出方法の好ましい実施態様において、前記成分が、Ｒ（赤）成分、Ｂ（青）成分、及びＧ（緑）成分からなることを特徴とする。
【００３５】
また、本発明の抗原の検出方法の好ましい実施態様において、前記呈色物又は発光物が、可視化することができる物質であることを特徴とする。
【００３６】
また、本発明の抗原の検出方法の好ましい実施態様において、可視化することができる物質が、免疫組織化学的反応の標識酵素の基質との反応で呈色ないし発光するカップリング物質であることを特徴とする。
【００３７】
また、本発明の抗原の検出方法の好ましい実施態様において、可視化することができる物質が、西洋ワサビペルオキシダーゼ（以下、ＨＲＰという）、アルカリフォスファターゼ（以下、ＡＬＰという）、グルコースオキシダーゼ、ベータガラクトシダーゼからなる群からなることを特徴とする。
【００３８】
また、本発明の抗原の検出方法の好ましい実施態様において、反応液、反応時間、及び洗浄回数をプログラムして自動免疫装置に組み込み、自動化して行なうことを特徴とする。
【００３９】
【発明の実施の形態】
まず、本発明の抗原の検出方法について概略を説明すれば、以下のようになる。すなわち、抗原回復処理（この処理は必須ではないが、抗原の抗原性をより高め、ひいては、目的抗原を検出しやすくするのに用いられる。）、洗浄、非特異反応抑制処理、特異抗体反応（一次抗体と第一抗原との抗原抗体反応）、前記抗原抗体反応した一次抗体と酵素を含む二次抗体との結合（複合体の形成）、第一抗原の同定、洗浄、の工程からなる。これらの工程を繰り返しながら、最終的に複数あるすべての抗原を検出せんとするものである。
【００４０】
二以上の抗原は、通常、一つの固定組織標本切片中に設置させることができるので、このような固定組織標本切片を用いてもよい。ここで、固定組織（パラフィン包埋）標本切片について説明すると、固定組織（パラフィン包埋）標本とは、生物組織から切り出され、固定化された標本のことで、例えば、１０％緩衝ホルマリン液等で化学固定され、濃度が漸増するエタノール溶液系列で水分が除かれ、１００％キシレン等で浸透され、６０℃前後の溶解したパラフィン等の溶液で浸透され、低温下でパラフィン等で固化された標本をいう。固定組織（パラフィン包埋）標本切片は、通常、薄切装置で作成されたその標本の３ミクロン前後の厚さの切片で、適切に処理されたスライドに貼付されている。固定組織パラフィン標本切片が免疫組織化学的染色に供される時には、１００％キシレンに浸透することでパラフィンを除き、１００％エタノールでそのキシレンを置換した後に、リン酸緩衝液等に浸透して、親水化される。
【００４１】
次に、本発明の方法の原理について説明する。図１は、古典的二重免疫組織化学的染色方法による局在の異なる第１と第２抗原を検出した場合の産物の概念図を示す。図１では、説明を簡略化するために２つの抗原を用いるが、本発明は２つの抗原に限定されることを意図するものではなく、複数の抗原の検出を行なうことが可能である。従来の方法では、第１抗原の一次抗体とその検出の酵素を含む複合体の除去を行っても、完全には非特異的に結合した一次抗体の除去が出来ないので、結果として非特異的に結合した一次抗体を第２抗原の一次抗体の検出の酵素を含む複合体が検出し、それぞれの一次抗体の非特異的結合部に、第１と第２抗原の検出の為のカップリング色素の共染が見られる。これに対して、本発明の方法では、一次抗体の非特異結合を非特異反応抑制処理で抑制され、一次抗体とその酵素を含む検出複合体が除去されているので、第１抗原の周囲には沈着したカップリング色素のみが存在し、第２抗原には一次抗体とその酵素を含む検出複合体とその酵素のカップリング色素が存在する。古典的二重免疫染色方法以外の二重免疫染色でも、一次抗体の非特異結合反応の抑制を実施しない場合には、第１と第２抗原の検出の為のカップリング色素の共染を認めることになる。従って、本発明においては、非特異的結合物質に抗体等が結合することはないので、目的の抗原のみを精度良く検出することが可能であり、従来の方法と本発明の二重免疫組織化学的染色方法の最終産物は異なることが理解出来る。
【００４２】
本発明の抗原の検出方法では、呈色物又は発光物で抗原を多重染色する多重免疫組織化学的染色方法を用いて二以上の異なる抗原を検出する。多重染色とは、複数の色素を用いて免疫組織染色する方法である。
【００４３】
本発明では、当該多重免疫組織化学的染色を用いて、さらに、非特異反応抑制処理を行なうことによって、一次抗体と非特異的に結合する非特異的結合物質へ被膜し、前記一次抗体と非特異的結合物質との結合を抑制する。
【００４４】
ここで、非特異反応抑制処理とは、広く、一次抗体と、非特異反応結合物質との結合を抑制する処理を意図し、このような作用があれば、特に限定されるものではない。このような非特異反応抑制処理として、例えば、カゼインによる処理、二次抗体と同種の動物血清、スキンミルク乃至ノンファットミルク、からなる群から選択される少なくとも１種を挙げることができる。スキンミルク、ノンファットミルクは、特に血清中の酵素等の活性を避ける為にも用いることができる。
【００４５】
また、前記カゼイン処理を、０．０２５〜２．５％の範囲のカゼインを含む溶液により行なうことが好ましい。このような範囲としたのは、さらに好ましくは、０．１〜１．０％の範囲、最も好ましくは、０．２５％±０．１％である。
【００４６】
本発明においては、複数の抗原を検出することが事実上可能であるが、第一抗原（最初に検出する抗原）から第ｎ抗原（最後に検出する抗原、ｎ＝１，２，３・・・）を検出する場合、抗体に結合している免疫反応物であって、最後に検出する抗原（第ｎ抗原）以外の抗原（第１〜（ｎ−１）抗原）を検出する免疫反応産物の呈色物又は発光物を除いたものを、ｐＨ３以下又はｐＨ９以上の緩衝液で除去することが好ましい。ｐＨ３以下又はｐＨ９以上としたのは、ｐＨ３以下又はｐＨ９以上では、抗原抗体反応が起こらないので、結合していた一次抗体が抗原から離れ、ひいては抗体に結合している免疫反応物であって、カップリング色素（呈色物、発光物）を除いたものを除去できるという観点からである。
ここで、抗体に結合している免疫反応物であって、最後に検出する抗原（第ｎ抗原）以外の抗原（第１〜（ｎ−１）抗原）を検出する免疫反応産物の呈色物又は発光物を除いたものについて、具体的に述べると、ＡＢＣ法の場合、一次抗体、ボオチン標識二次抗体、酵素標識アビチンを意味する。また、ポリマー法の場合、一次抗体、酵素、二次抗体を標識したポリマーを意味する。
また、本発明の抗原の検出方法の好ましい実施態様において、さらに、非特異反応生成物、及びその他の残存反応物を除去するために、加熱した洗浄液によって洗浄する工程を含む。この工程において、非特異的反応生成物及び残存反応物を除去することができる。また、前記加熱した洗浄液の温度が、２５〜６０℃の範囲内であることを特徴とする。かかる温度範囲では、抗原抗体反応が起こり、ひいては、非特異的反応生成物及び残存反応物の充分な除去が可能となる。
【００４７】
また、前記呈色物又は発光物を除いたものの除去を、最後に検出する抗原以外の抗原の同定後に行なうことができる。これは、それ以降で行なわれる工程の抗原の検出への影響を最小限度にするという観点からである。但し、特殊な第１と第２抗原に対する一次抗体の二次抗体を含む検出系の組み合わせが可能な場合には、このような洗浄は特に要求されない。このような特殊な例として、ＣＤ６８とＦａｃｉｎとによる二重染色（実施例４）を挙げることができる。
【００４８】
ここで、免疫組織化学的染色方法について説明すると、これは、組織上の特定の抗原を、その抗原を特異的に認識する抗体によって検出する方法である。本発明においては、免疫組織化学的染色方法が、異なる成分強度を有する複数の色素を用いて染色する方法であり、前記成分強度の差異に基づいて抗原を検出することができる。これは、異なる成分強度を有する複数の色素を用いれば、原理的に複数の抗原の検出が可能となるからである。成分強度の差異に基づいて検出するとは、例えば、色素としてジアミノベンチジン（ＤＡＢ）と、シアミノベンチジンニッケル（ＤＡＢ−Ｎｉ）を用いた場合、ＤＡＢはＲ成分の強度が高く、ＤＡＢ−ＮｉもＲ成分の強度が高いが（表２）、各成分比から相対的には、ＤＡＢのＲ成分強度が、他のＧ，Ｂ成分と比較して高いといえる。実際に、デジタル電子顕微鏡画像をＲＧＢ分解して、Ｒ、Ｇ、Ｂ成分として解析した場合、ＤＡＢでは、ＧとＢとの成分を強く反映する一方で、ＤＡＢ−Ｎｉは、Ｒ，Ｇ，Ｂ成分を均等に強く反映するという異なる結果を表示する。したがって、これらの強度差を利用すれば、抗原の検出も可能となる。
【００４９】
好ましい実施態様において、前記成分が、Ｒ（赤）成分、Ｂ（青）成分、及びＧ（緑）成分からなる。このようなＲＧＢ成分を採用したのは、カラー図における各カップリング色素の組み合わせを白黒図でも理解できるようにという観点からであり、採用する成分として特に限定されることを意図するものではない。前記呈色物又は発光物は、また可視化することができるものが好ましい。
【００５０】
また、当該呈色物又は発光物は、標識物質との反応で呈色乃至発光するカップリング物質であることが好ましい。さらに、好ましくは、可視化することができる物質が、免疫組織化学的反応の標識酵素の基質との反応で呈色ないし発光するカップリング物質である。このように標識酵素の基質との反応で呈色乃至発光するものとしたのは、免疫染色された標本の観察に光学顕微鏡と蛍光顕微鏡又はレーザー共焦点顕微鏡が用いられるという観点からである。
【００５１】
可視化することができる物質としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ（以下、ＨＲＰという）、アルカリフォスファターゼ（以下、ＡＬＰという）、グルコースオキシダーゼ、ベータガラクトシダーゼを挙げることができる。可視化することができる物質は、一般的で汎用性が高いという観点から、ＨＲＰ、ＡＬＰを挙げることができる。
【００５２】
免疫組織化学的反応の標識酵素の基質との反応で呈色するカップリング色素としては、ＨＲＰでは、過酸化水素を基質に、一般に用いられるジアミノベンチジン（以下、ＤＡＢという）、アミノエチルカルバゾール（以下、ＡＥＣという）の他に、ベクター社からＶＩＰ、ＳＧ、ＮｏｖａＲＥＤ、ＴＭＢと呼ばれる色素が供給されている。ＡＬＰでは、ナフトールＡＳ−ＢＩリン酸ナトリウム等を基質に、ファストレッド、ファストバイオレット、ファストブルー、ニューフクシン、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシルフォスフェート／ニトロブルーテトラゾリウ等のカップリング色素がある。
【００５３】
また、本発明の好ましい実施態様において、反応液、反応時間、及び洗浄回数をプログラムして自動免疫装置に組み込み、自動化して行なうことが可能である。
【００５４】
すなわち、市販の自動免疫組織化学的染色装置に、上記反応液、反応時間、及び洗浄回数などの情報をプログラムして導入し、自動化して行なうことができる。
【００５５】
【実施例】
以下、本発明を実施例により更に具体的に説明するが、本発明は、下記実施例に限定して解釈される意図ではない。
【００５６】
実施例１
本発明の多重免疫組織化学的染色方法の第１抗原と第２抗原を検出し一次抗体をポリマー試薬法を用いた二重免疫組織化学的染色方法は、次ぎの１８工程により実施した。
１）固定組織パラフィン切片を、キシレンとエタノールにそれぞれ３〜５回、３〜２０分間浸すことでパラフィンを除き、
２）０．３〜６％ 過酸化水素水メタノール溶液に５〜３０分間浸し、一次の内因性ぺルオキシダーゼの活性の抑制を行い、
３）０．００５〜０．０２Ｍリン酸緩衝液０．５〜１％塩化ナトリウム溶液（ＰＢＳ）で洗浄し、固定組織標本切片の親水化を行い、
４）抗原に対応した抗原回復処理（一般的には、０．００１〜０．０２Ｍクエン酸緩衝液等に切片を浸し、オートクレーブで１１０〜１４０℃、１〜１５分間の熱処理を行い、冷却後に、０．０１〜０．１Ｍリン酸緩衝液０．８５％塩化ナトリウム溶液（以下、ＰＢＳという）に浸す。）を行い、
５）自動免疫染色装置に固定組織標本切片を配置し、
６）２５〜６０℃に加熱した０．０１〜０．２％ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（ｔｗｅｅｎ ２０）を含む０．５〜１％塩化ナトリウムを加えた０．０１〜０．１Ｍトリス緩衝液（以下、ＴＢＳという）洗浄液で１〜４回洗浄し、
７）０．１〜１％カゼイン溶液に２〜３０分間反応させ、第１抗原に対する一次抗体の非特異反応の抑制前処理を行い、
８）第１抗原に対する一次抗体の至適希釈溶液と至適反応時間（１３分間〜２時間）で反応させた後、２５〜６０℃に加熱したＴＢＳ洗浄液で２〜５回洗浄し、
９）反応した一次抗体をポリマー試薬を１０分間〜１時間反応させて標識し、２５〜６０℃前後に加熱したＴＢＳ洗浄液で２〜５回洗浄し、
１０）対応した酵素の発色剤（ＨＲＰであればヂアミノベンチジン（以下、ＤＡＢという）ないしヂアミノベンチジンニッケル（以下、ＤＡＢ−Ｎｉという）ないしベクター社のＳＧと過酸化水素）の溶液で呈色反応させ、２５〜６０℃前後に加熱したＴＢＳ洗浄液で２〜５回洗浄し、
１１）ｐＨ３以下かｐＨ９以上の緩衝液、例えば、０．１Ｍグリシン塩酸緩衝液ｐＨ２．２、を１分間、３回反応させ、２５〜６０℃前後に加熱したＴＢＳ洗浄液で２〜５回洗浄し、
１２）０．１〜１％カゼイン溶液に２〜３０分間反応させ、第２抗原に対する一次抗体の非特異反応の抑制前処理を行い、
１３）第２抗原に対する一次抗体の至適希釈溶液と至適反応時間（１３分間〜２時間）で反応させた後、２５〜６０℃に加熱したＴＢＳ洗浄液で２〜５回洗浄し、
１４）反応した一次抗体をポリマー試薬を１０分間〜１時間反応させて標識し、２５〜６０℃前後に加熱したＴＢＳ洗浄液で２〜５回洗浄し、
１５）対応した酵素の発色剤（ＨＲＰであれば工程１０で用いた色素以外のＤＡＢないしＤＡＢ−Ｎｉないしベクター社のＶＩＰ、ＳＧ、ＮｏｖａＲＥＤの一つと過酸化水素）の溶液で呈色反応させ、２５〜６０℃前後に加熱したＴＢＳ洗浄液で２〜５回洗浄する。
１６）ヘマトキシン等の溶液で、後対比染色を行い、水で１〜３回洗浄し、
１７）自動免疫染色装置から固定組織標本切片を外し、
１８）封入剤に対応した処理を行い、超高感度免疫染色を行った固定組織標本パラフィン切片を永久標本とし、光学顕微鏡下での抗原の検出となる。
【００５７】
工程１０と１５で、ストレプトアビチンないし蛍光物質を標識した物質の沈着反応を行い、工程１５と特異的に反応する抗体と蛍光物質の複合体溶液を用いる場合、その後に、蛍光物質による核等の対比染色を実施するか、実施せずに、染色は終了し、蛍光顕微鏡下での抗原の検出となる。
【００５８】
工程７から１０と工程１２から１５で、一次抗体を検出する免疫組織化学的染色で、ストレプトアビチンないし蛍光物質を標識した物質の沈着反応を行い、工程１５と特異的に反応する抗体と蛍光物質の複合体溶液を用いる場合、その後に、蛍光物質による核等の対比染色を実施するか、実施せずに、染色は終了し、蛍光顕微鏡下での抗原の検出となる。
【００５９】
自動化とは、上記工程５から工程１５までの各反応液、反応時間、洗浄回数をプログラムして自動免疫染色装置に組み込み、染色を基準化することである。
【００６０】
＜溶液等の説明＞
なお、用いた溶液等について説明すれば、以下の通りである。
キシレン
キシレンは、特級キシレンを用いた。
【００６１】
エタノール
エタノールは、特級エタノールを用いた。
【００６２】
０．３％過酸化水素水メタノール溶液
特級過酸化水素水（３０％溶液）を、特級メタノールで１００倍希釈したものを用いた。
【００６３】
０．０１Ｍリン酸緩衝液０．８５％塩化ナトリウム溶液（ＰＢＳ）
２８．７ｇのリン酸水素第二ナトリウム・１２水と３．３ｇのリン酸第二水素ナトリウム二水和物を１Ｌのイオン交換水に溶解した０．１Ｍリン酸緩衝液に、８５ｇの塩化ナトリウムを加え、オートクレーブで完全に溶解し室温まで冷却し、１０Ｎ 水酸化ナトリウム水でｐＨを７．６に調整したものを１０倍溶液として、使用時に１０倍にイオン交換水で希釈した。
【００６４】
０．０１Ｍクエン酸緩衝液等ｐＨ６．０
２．１ｇのクエン酸・一水和物と２．９４ｇクエン酸三ナトリウム・二水和物を１００ ｍｌのイオン交換水にオートクレーブで加熱し溶解し、１０Ｎ水酸化ナトリウム水でｐＨを６．０に調整し、イオン交換水で１００ｍｌに調節したものを１０倍溶液とし、使用時に１０倍にイオン交換水で希釈した。商業的には、１０倍溶液がダコサイトメーション社やダイヤトロン社から供給されている。その他に、抗原回復には、
【非特許文献７】のｐ．１１４に記載されている１ｍＭＥＤＴＡ溶液ｐＨ８．０、などが用いられ、ダコサイトメーション社から供給されている。
【００６５】
３％過酸化水素水ＰＢＳ
特級過酸化水素水（３０％溶液）を、２８．７ｇのリン酸水素第二ナトリウム・１２水と３．３ｇのリン酸第二水素ナトリウム二水和物を１Ｌのイオン交換水に溶解した０．１Ｍリン酸緩衝液に、８５ｇの塩化ナトリウムを加え、オートクレーブで完全に溶解し室温まで冷却し、１０Ｎ 水酸化ナトリウム水でｐＨを７．６に調整したものを１０倍溶液として、使用時に１０倍にイオン交換水で希釈する０．０１Ｍリン酸緩衝液０．８５％塩化ナトリウム溶液（ＰＢＳ）で１００倍に希釈した。
【００６６】
３５℃前後に加熱した０．１％ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（ｔｗｅｅｎ ２０）を含む０．８２５塩化ナトリウム加０．０５Ｍトリス緩衝液（ＴＢＳ）洗浄液
１２１．１ｇのトリスハイドロオキシメチルアミノメタン（シグマ社）を８００ｍｌのイオン交換水で希釈しオートクレーブで加熱溶解後に、１Ｎ塩酸でｐＨを７．５に調整し、イオン交換水で１Ｌにした１Ｍトリス溶液５００ｍｌと、２９２．２ｇの塩化ナトリウムを８００ｍｌのイオン交換水でオートクレーブ加熱溶解しイオン交換水で１Ｌにした５Ｍ塩化ナトリウム溶液３６０ｍｌを、イオン交換水で２０Ｌに希釈し、０．１％ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（ｔｗｅｅｎ ２０）とした溶液。自動免疫染色装置の洗浄液タンクに入れて、３５℃前後に加熱したものである。
【００６７】
０．２５％カゼイン溶液
２５ｍｇのカゼイン（シグマ社）を２８．７ｇのリン酸水素第二ナトリウム・１２水と３．３ｇのリン酸第二水素ナトリウム二水和物を１Ｌのイオン交換水に溶解した０．１Ｍリン酸緩衝液に、８５ｇの塩化ナトリウムを加え、オートクレーブで完全に溶解し室温まで冷却し、１０Ｎ水酸化ナトリウム水でｐＨを７．６に調整したものを１０倍溶液として、使用時に１０倍にイオン交換水で希釈する０．０１Ｍ ＰＢＳの１０ｍｌに希釈したもの。商業的には、ダコサイトメーション社から供給されている。
【００６８】
０．１Ｍグリシン塩酸緩衝液ｐＨ２．２
グリシン７．５グラムを５００ｍｌのイオン交換水に溶解し、濃塩酸を滴下してｐＨ２．２に調整し、イオン交換水を加えて１Ｌにする。
【００６９】
ポリマー試薬
デキストランポリマーに直接二次抗体とＨＲＰを結合させた試薬で、ダコサイトメーション社から商業的にダコ ＣｈｅｍＭａｔｅ ＥＮＶＩＳＩＯＮ試薬として供給されている。
【００７０】
酵素の発色剤（カップリング色素）
ヂアミノベンチジン（ＤＡＢ）
３，３’−ヂアミノベンチジン（以下ＤＡＢという）四塩酸塩（同仁化学社）２０ｍｇを１００ｍｌの０．０５Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ．７．６）に溶解し、これに、過酸化水素原液２０μｌを加えて使用する。ダコサイトメーション社から、液状試薬としてＫ３４６６として供給されている。ベクター社からＤＡＢ基質キット（ＳＫ−４１００）として供給されている。０．０５Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ．７．６）は、１２１．１ｇのトリスハイドロオキシメチルアミノメタン（シグマ社）を８００ｍｌのイオン交換水で希釈しオートクレーブで加熱溶解後に、１Ｎ塩酸でｐＨを７．６に調整し、イオン交換水で１Ｌにした１Ｍトリス溶液５００ｍｌと、２９２．２ｇの塩化ナトリウムを８００ｍｌのイオン交換水でオートクレーブ加熱溶解しイオン交換水で１Ｌにした５Ｍ塩化ナトリウム溶液３６０ｍｌを、イオン交換水で２０Ｌに希釈する。
【００７１】
ヂアミノベンチジンニッケル（ＤＡＢ−Ｎｉ）
ＤＡＢ２０ｍｇ、硫化ニッケル（ＮｉＳＯ４・（ＮＨ４）２ＳＯ４・６Ｈ２Ｏ）４０ｍｇを０．０５Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．６）１００ｍｌに溶解し、７μｌの過酸化水素水原液を加え、ろ過して使用する。ベクター社からＤＡＢ基質キット（ＳＫ−４１００）として供給されている。
【００７２】
アミノエチルカルバゾール（ＡＥＣ）
３ーアミノー９ーエチルカルバゾール（シグマ社）を０．４％になるようにジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、保全液とする。保存液５ｍｌを０．１Ｍ酢酸緩衝液ｐＨ５．０の９５ｍｌと混合し、２０μｌの過酸化水素水原液を加え、ろ過して用いる。０．１Ｍ酢酸緩衝液ｐＨ５．０は、９９％酢酸１１．５ｍｌをイオン交換水で１Ｌとし、この１４．８ｍｌと酢酸ナトリウム１６．４ｇないし酢酸ナトリウム・三水塩２７．２ｇをイオン交換水に溶解し１Ｌとした０．２Ｍ酢酸ナトリウム水溶液３５．２ｍｌを混合し、イオン交換水を加えて１００ｍｌとする。ダコサイトメーション社からキットが供給されている。
【００７３】
ＶＩＰ、ＳＧ、ＮｏｖａＲＥＤ
それぞれ、西洋ワサビペルオキシダーゼの発色カップリング色素として、ベクター社から、ＳＫ−４６００、ＳＫ−４７００、ＳＫ−４８００としてキット化され供給されている。
【００７４】
ヘマトキシン等の溶液
上記の発色色素と区別できる色素溶液を用いた核ないし細胞質の染色で、後対比染色を行う。一般的には、ヘマトキシリン溶液が用いられる。ダコサイトメーション社から自動免疫染色装置での染色用にダコＣｈｅｍＭａｔｅヘマトキシリン試薬が供給されている。
【００７５】
封入剤に対応した処理
発色基質に合わせて、ジアミノベンチジンであれば、エタノール系列に浸しての脱水後に、プラスチック封入剤（オイキット）で封入し、長期の保存に耐える永久標本を作成する。ＡＥＣでの発色では、ダコサイトメーション社から供給されるＵｌｔｒａｍｏｕｎｔ試薬で、７０℃での加熱固化で永久標本を作成する。ベクター社の種々の発色基質では、冷風による乾燥後に、ＶｅｃｔａＭｏｕｎｔ封入剤で封入し乾燥固化し、永久標本を作成する。
【００７６】
次に、実際に非特異反応抑制処理と緩衝液の効果を確かめるために試験を行なった。
【００７７】
工程１から１０（但し、工程７を除く）と１６から１８を行い、工程１１のｐＨ３以下かｐＨ９以上の緩衝液として、０．１Ｍグリシン塩酸緩衝液ｐＨ２．２を用い、工程１１を工程９と１０の間で０．１Ｍグリシン塩酸緩衝液ｐＨ２．２溶液を反応時間を変えて反応させる実験Ａ、工程８と９の間で０．１Ｍグリシン塩酸緩衝ｐＨ２．２溶液を反応時間を変えて反応させる実験Ｂを行った。固定組織標本切片はヒト扁桃組織の１０％ホルマリン固定パラフィン包埋標本切片を用い、０．０１Ｍクエン酸緩衝液ｐＨ６．０でオートクレーブによる加熱による抗原回復を行い、リンパ小節に分布する樹状細胞等を標識する抗ＣＤ６８抗体を用いた。工程９のポリマー試薬はダコＣｈｅｍＭａｔｅ ＥＮＶＩＳＩＯＮ試薬を用いた。工程１０の酵素はＨＲＰでカップリング色素はＤＡＢを用い、工程１８ではエタノールで脱水し、キシレンへ浸透し、プラスチック封入剤（オイキット）で封入した。
【００７８】
実験Ａは一次抗体と二次抗体と酵素が標識された複合体（ポリマー試薬）の除去効果を検討するものであり、実験Ｂは一次抗体の除去効果を検討している。ただし、工程７は実験Ａ、Ｂでは実施せずに、実験Ｂ＃では実施している。
【００７９】
表１に示すように、実験Ａでは、０．１Ｍグリシン塩酸緩衝液ｐＨ２．２での反応時間を２、７、１７、３７、７７分間の全てで，残留抗体産物を示すＤＡＢ反応は見られなかった。実験Ｂでは、淡い染色が７７分の処理でも除去出来ていないことが判明した。この残存反応は，一次抗体の非特異的反応の結果である可能性が考えられたので，工程７の０．２５％カゼイン溶液反応を行う（実験Ｂ＃）と，１分のグリシン溶液反応でも一次抗体が除去されていることが判明した。図２のＡは実験Ｂの、Ｂは実験Ｂ＃の染色結果を示す。図２は、０．１Ｍグリシン塩酸緩衝液ｐＨ２．２の反応なし（Ａ１，Ａ４，Ｂ１，Ｂ４）、１７分間反応（Ａ２，Ａ５，Ｂ２，Ｂ５）、３７分間反応（Ａ３，Ａ６，Ｂ３，Ｂ６）の染色結果を示す。図２のＡ５とＢ５、図２のＡ６とＢ６で、工程７の０．２５％カゼイン溶液反応で、非特異反応の陽性像が図２Ｂ５とＢ６で消失していることが解る。
【００８０】
従って、この実施例１で、工程１１のｐＨ３以下かｐＨ９以上の緩衝液として、０．１Ｍグリシン塩酸緩衝液ｐＨ２．２を用いた場合、１分間の反応で抗原抗体反応での抗体の結合は解離することが示された。従って、工程１１で、０．１Ｍグリシン塩酸緩衝液ｐＨ２．２を用いた場合、１分間３回の反応で、一次抗体反応の前に非特異反応を抑制する処理を行うと、固定パラフィン包埋標本切片に反応した一次抗体もその検出試薬も、除去できることが明らかになった。表１は、グリシン処理後の残留免疫組織化学的反応産物の評価結果を示す。
【００８１】
【表１】
＜実施例１において行なった処理と用いた溶液等＞
０．１Ｍグリシン塩酸緩衝液ｐＨ２．２
グリシン７．５グラムを５００ｍｌのイオン交換水に溶解し、濃塩酸を滴下してｐＨ２．２に調整し、イオン交換水を加えて１Ｌにする。
【００８３】
抗原回復
パラフィン等を除かれた固定組織パラフィン標本切片を、０．０１Ｍクエン酸緩衝液ｐＨ６．０に浸し加熱処理する。加熱処理は、オートクレーブで行なう。
【００８４】
０．０１Ｍクエン酸緩衝液等ｐＨ６．０
２．１ｇのクエン酸・一水和物と２．９４ｇクエン酸三ナトリウム・二水和物を１００ｍｌのイオン交換水にオートクレーブで加熱し溶解し、１０Ｎ水酸化ナトリウム水でｐＨを６．０に調整し、イオン交換水で１００ｍｌに調節したものを１０倍溶液とし、使用時に１０倍にイオン交換水で希釈する。商業的には、１０倍溶液がダコサイトメーション社やダイヤトロン社から供給されている。
【００８５】
抗ＣＤ６８抗体
ダコサイトメーション社が供給しているマウス抗ヒトＣＤ６８マクロファージ抗体（ＰＧ−Ｍ１，Ｍ０８７６）で、５０倍にダコサイトメーション社が供給しているダコＣｈｅｍＭａｔｅ抗体希釈液（Ｓ２０２２）で希釈する。
【００８６】
ポリマー試薬
デキストランポリマーに直接二次抗体とＨＲＰを結合させた試薬で、ダコサイトメーション社から商業的にダコＣｈｅｍＭａｔｅ ＥＮＶＩＳＩＯＮ試薬として供給されている。
【００８７】
酵素の発色剤（カップリング色素）
ヂアミノベンチジン（ＤＡＢ）
ダコサイトメーション社から、液状試薬としてＫ３４６６として供給されている。
【００８８】
〔実施例２〕
次に、ｐＨ３以下又はｐＨ９以上の緩衝液の使用による抗原の影響を調べた。
工程１から６、工程１１から１８を行い、固定組織標本切片はヒト扁桃組織のもので、０．０１Ｍクエン酸緩衝液ｐＨ６．０でオートクレーブによる加熱による抗原回復を行い、ＣＤ６８とＫｉ−６７抗原抗体の一次抗体を用いて、工程１１に於けるｐＨ３以下かｐＨ９以上の緩衝液として、０．１Ｍグリシン塩酸緩衝液ｐＨ２．２を用いた場合の抗原への影響を検討した。工程１４のポリマー試薬はダコＣｈｅｍＭａｔｅ ＥＮＶＩＳＩＯＮ試薬を用いた。工程１５の酵素はＨＲＰで発色色素はヂアミノベンチジンを用い、工程１８ではエタノールで脱水し、キシレンへ浸透し、プラスチック封入剤（オイキット）で封入した。
【００８９】
その結果を図３に示す。図３では、ａとｂとｃはＣＤ６８抗体で、ｄとｅとｆはＫｉ−６７抗原抗体、ａとｄは、０．１Ｍグリシン塩酸緩衝液ｐＨ２．２の代わりにリン酸緩衝液ｐＨ７．４を反応させ、ｂとｅでは０．１Ｍグリシン塩酸緩衝液ｐＨ２．２を７分間、ｃとｆでは０．１Ｍグリシン塩酸緩衝液ｐＨ２．２を１７分間反応させた染色結果を示す。ＣＤ６８の抗原は、この０．１Ｍグリシン塩酸緩衝液ｐＨ２．２反応７７分間まで観察しても変化が認められなかったが、Ｋｉ６７抗原はこの０．１Ｍグリシン塩酸緩衝液ｐＨ２．２反応７分間でその回復された抗原が再度マスクされ始めていることが判明した。従って、Ｋｉ−６７抗原の検出は工程１１のｐＨ３以下かｐＨ９以上の緩衝液による色素以外の免疫反応産物の除去の前に行う必要があることが示唆された。
【００９０】
従って、本発明の多重染色では、抗体の除去の処理の前ですべき抗原の検出と抗体の除去の後の検出で問題のない抗原を、実施する前に検討しておく必要があることが示唆された。
【００９１】
＜実施例２において行なった処理と用いた溶液等＞
抗原回復処理
パラフィン等を除かれた固定組織パラフィン標本切片を、トリプシン等の酵素で処理するか、０．０１Ｍクエン酸緩衝液ｐＨ６．０などの緩衝液に浸し加熱処理する方法がある。加熱処理は、マイクロウエーブ装置、オートクレーブ、圧力鍋、温浴装置等で行なわれる。酵素処理も加熱処理も、標的抗原により、その処理条件は異なる。
【００９２】
０．０１Ｍクエン酸緩衝液等ｐＨ６．０
２．１ｇのクエン酸・一水和物と２．９４ｇクエン酸三ナトリウム・二水和物を１００ｍｌのイオン交換水にオートクレーブで加熱し溶解し、１０Ｎ水酸化ナトリウム水でｐＨを６．０に調整し、イオン交換水で１００ｍｌに調節したものを１０倍溶液とし、使用時に１０倍にイオン交換水で希釈する。商業的には、１０倍溶液がダコサイトメーション社やダイヤトロン社から供給されている。
【００９３】
抗ＣＤ６８抗体
ダコサイトメーション社が供給しているマウス抗ヒトＣＤ６８マクロファージ抗体（ＰＧ−Ｍ１，Ｍ０８７６）で、５０倍にダコサイトメーション社が供給しているダコＣｈｅｍＭａｔｅ抗体希釈液（Ｓ２０２２）で希釈し、使用する。
【００９４】
抗Ｋｉ−６７抗原抗体
ダコサイトメーション社が供給しているマウス抗ヒトＫｉ−６７抗原抗体（ＭＩＢ−１， Ｍ７２４０）で、５０倍にダコサイトメーション社が供給しているダコＣｈｅｍＭａｔｅ抗体希釈液（Ｓ２０２２）で希釈し、使用する。
【００９５】
０．１Ｍグリシン塩酸緩衝液ｐＨ２．２
グリシン７．５グラムを５００ｍｌのイオン交換水に溶解し、濃塩酸を滴下してｐＨ２．２に調整し、イオン交換水を加えて１Ｌにする。
【００９６】
ポリマー試薬
デキストランポリマーに直接二次抗体とＨＲＰを結合させた試薬で、ダコサイトメーション社から商業的にダコＣｈｅｍＭａｔｅ ＥＮＶＩＳＩＯＮ試薬として供給されている。
【００９７】
酵素の発色剤（カップリング色素）
ヂアミノベンチジン（ＤＡＢ）
ダコサイトメーション社から、液状試薬としてＫ３４６６として供給されている。
【００９８】
〔実施例３〕
工程１から６、工程１２から１８で、固定組織標本切片はヒト扁桃組織のもので、０．０１Ｍクエン酸緩衝液ｐＨ６．０でオートクレーブによる加熱による抗原回復を行い、ＣＤ６８一次抗体を用い、ポリマー試薬ダコＣｈｅｍＭａｔｅ ＥＮＶＩＳＩＯＮを用いて、以下の検討を行った。
【００９９】
西洋ワサビペルオキシダーゼ過酸化水素反応のカップリング色素で、商業的に供給されてダコサイトメーションのＤＡＢとＡＥＣ、ベクター社のＤＡＢ−ＮｉとＮｏｖａＲＥＤ，ＶＩＰ，ＴＭＢ，ＳＧ，ＴＭＢの永久標本作成の封入方法と色素の組み合わせを検討した。
【０１００】
染色後に、固定組織標本切片を、エタノールに浸し脱水し、キシレンに浸し透徹し、プラスチック封入剤のオイキットで封入する通常法、ダコサイトメーション社のＵｌｔｒａｍｏｕｎｔを固定組織標本切片を被うように滴下して７０℃で加熱固化する方法（Ｕｌｔｒａｍｏｕｎｔ法），ベクター社から供給されているＶｅｃｔａＭｏｕｎｔを固定組織標本切片を被うように滴下しスライドグラスで被い自然固化させる方法（ＶｅｃｔａＭｏｕｎｔ法）を検討した。
【０１０１】
各色素の色は、デジタル顕微鏡画像で陽性部位をＰｈｏｔｏｓｈｏｐでＲＧＢチャンネル分解し、ＮＩＨ−ｉｍａｇｅでＲ，Ｇ，Ｂの画像が反転させて、その平均濃度を求め、Ｒ，Ｇ，Ｂ成分として解析した。
【０１０２】
使用出来る色素は封入法に規定された。図４にカラーないしグレースケール、Ｒ，Ｇ，Ｂ成分の対応した染色像を示し、表２に、それぞれの色素のＲＧＢ解析の結果を示す。図４のａは通常法で封入したＤＡＢでありＧとＢ成分が強いことが解る。ｂは通常法で封入したＤＡＢ−ＮｉでありＲ，Ｇ，Ｂ成分の均等に強いことが解る。ｃはＵｌｔｒａｍｏｕｎｔ法で封入したＡＥＣであり、ＤＡＢ同様にＧとＢの成分が強いことが解る。ｄはＶｅｃｔａＭｏｕｎｔ法で封入したＮｏｖａＲＥＤ、ｅはＶｅｃｔａＭｏｕｎｔ法で封入したＶＩＰであり、両者共に、Ｒ、Ｇ、Ｂ成分が強いことが解る。ｆはＶｅｃｔａＭｏｕｎｔ法で封入したＳＧであり、Ｒ、Ｇ、Ｂ成分が強いことが解る。ＤＡＢ、ＡＥＣ、ＮｏｖａＲＥＤ、ＶＩＰがＲ画像で、前２者と後２者で区別出来ることが解かる。表２は、それぞれの色素は特徴的なＲ，Ｇ，Ｂ成分の構成を示した。通常法では，ＤＡＢ，ＤＡＢ−Ｎｉ，ＳＧが使用可能であった。これらの色素はグリシン処理にて赤（Ｒ）成分が増加し青（Ｂ）成分が減少するが，使用可能であり，２重染色の標的抗原Ａの検出に用い得ることが示された。Ｕｌｔｒａｍｏｕｎｔ法では，ＤＡＢ，ＤＡＢ−Ｎｉ，ＡＥＣ，ＳＧが使えた。ＶｅｃｔａＭｏｕｎｔ法では，ＤＡＢ，ＤＡＢ−Ｎｉ，ＮｏｖａＲＥＤ，ＶＩＰ，ＳＧが使えた。
【０１０３】
ＳＧは，発色自体が他の色素に比べて低くかったが，それぞれの封入とグリシン処理で変化しないことから、検出結果が強すぎる抗原と検出結果が弱い抗原の２重染色で、前者の呈色に使える色素であることが判明した。
【０１０４】
ＴＭＢは反応後の沈着が明瞭でなく，封入操作で退色した。表２〜４は、西洋ワサビペルオキダーゼ過酸化水素反応のカップリング色素の封入方法とそのＲＧＢ解析を示す。
【０１０５】
【表２】
【表３】
【表４】
＜実施例３において行なった処理と用いた溶液等＞
抗原回復
パラフィン等を除かれた固定組織パラフィン標本切片を、０．０１Ｍクエン酸緩衝液ｐＨ６．０に浸し加熱処理する方法がある。加熱処理は、オートクレーブ行なう。
【０１０９】
０．０１Ｍクエン酸緩衝液等ｐＨ６．０
２．１ｇのクエン酸・一水和物と２．９４ｇクエン酸三ナトリウム・二水和物を１００ｍｌのイオン交換水にオートクレーブで加熱し溶解し、１０Ｎ水酸化ナトリウム水でｐＨを６．０に調整し、イオン交換水で１００ｍｌに調節したものを１０倍溶液とし、使用時に１０倍にイオン交換水で希釈する。商業的には、１０倍溶液がダコサイトメーション社やダイヤトロン社から供給されている。その他に、抗原回復には、〔非特許文献７〕のｐ．１１４に記載されている１ｍＭ ＥＤＴＡ溶液ｐＨ ８．０、などが用いられ、ダコサイトメーション社から供給されている。
【０１１０】
抗ＣＤ６８抗体
ダコサイトメーション社が供給しているマウス抗ヒトＣＤ６８マクロファージ抗体（ＰＧ−Ｍ１，Ｍ０８７６）で、５０倍にダコサイトメーション社が供給しているダコＣｈｅｍＭａｔｅ抗体希釈液（Ｓ２０２２）で希釈し、使用する。
【０１１１】
ポリマー試薬
デキストランポリマーに直接二次抗体とＨＲＰを結合させた試薬で、ダコサイトメーション社から商業的にダコＣｈｅｍＭａｔｅ ＥＮＶＩＳＩＯＮ試薬として供給されている。
【０１１２】
酵素の発色剤（カップリング色素）
ヂアミノベンチジン（ＤＡＢ）
ダコサイトメーション社から、液状試薬としてＫ３４６６として供給されている。
【０１１３】
ヂアミノベンチジンニッケル （ＤＡＢ−Ｎｉ）
ＤＡＢ２０ｍｇ、硫化ニッケル（ＮｉＳＯ４・（ＮＨ４）２ＳＯ４・６Ｈ２Ｏ）４０ｍｇを０．０５Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．６）１００ｍｌに溶解し、７μｌの過酸化水素水原液を加え、ろ過して使用する。ベクター社からＤＡＢ基質キット（ＳＫ−４１００）として供給されている。
【０１１４】
アミノエチルカルバゾール（ＡＥＣ）
３ーアミノー９ーエチルカルバゾール（シグマ社）を０．４％になるようにジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、保全液とする、保存液５ｍｌを０．１Ｍ酢酸緩衝液ｐＨ５．０の９５ｍｌと混合し、２０μｌの過酸化水素水原液を加え、ろ過して用いる。０．１Ｍ酢酸緩衝液ｐＨ５．０は、９９％酢酸１１．５ｍｌをイオン交換水で１Ｌとし、この１４．８ｍｌと酢酸ナトリウム１６．４ｇないし酢酸ナトリウム・三水塩２７．２ｇをイオン交換水に溶解し１Ｌとした０．２Ｍ酢酸ナトリウム水溶液３５．２ｍｌを混合し、イオン交換水を加えて１００ｍｌとする。ダコサイトメーション社からキットが供給されている。
【０１１５】
ＶＩＰ、ＳＧ、ＮｏｖａＲＥＤ、ＴＭＢ
ＶＩＰ、ＳＧ、ＮｏｖａＲＥＤ，ＴＭＢのそれぞれ、西洋ワサビペルオキシダーゼの発色カップリング色素として、ベクター社から、ＳＫ−４６００、ＳＫ−４７００、ＳＫ−４８００、ＳＫ−４４００としてキット化され供給されている。
【０１１６】
永久標本作成の為の封入法
染色後に、固定組織標本切片を、エタノールに浸し脱水し、キシレンに浸し透徹し、プラスチック封入剤のオイキットで封入する。通常用いられる封入方法であり、通常法と記す。
【０１１７】
Ｕｌｔｒａｍｏｕｎｔ法
ダコサイトメーション社から供給されている永久標本用マウンティングメディウムＵｌｔｒａｍｏｕｎｔ（Ｓ１９６４）を、固定組織標本切片を被うように滴下して、７０℃加熱したオーブン中で加熱固化する方法。
【０１１８】
ＶｅｃｔａＭｏｕｎｔ法
ベクター社から供給されているＶｅｃｔａＭｏｕｎｔ （Ｈ−５０００）を固定組織標本切片を被うように滴下しスライドグラスで被い自然固化させる方法。
【０１１９】
Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ
アドベ社から供給されているコンピュータソフトで、画像処理を行う。この検索では、Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ ３．０Ｊを使用している。このソフトを用いて、顕微鏡カラー写真画像をカラー画像を、チャンネル分割機能で、ＲＧＢないしＣＭＹＫのグレースケール画像に分割できる。ＲＧＢシステムで色を表現する場合には、光が基準となるので、以下のＮＩＨ−ｉｍａｇｅでそのＲＧＢ各成分の測定値を得るには、画像を反転する必要がある。画像の反転の機能はＮＩＨ−ｉｍａｇｅにある。
【０１２０】
ＮＩＨ−ｉｍａｇｅ
画像の解析ソフト。分析メニューの測定で、画像の平均グレースケールと面積（ピクセル換算）を得ることができる。
【０１２１】
〔実施例４〕
一部で同一局在を示す二つの抗原の二重免疫染色の例として、ＣＤ６８とＦａｓｃｉｎ の２重免疫染色を行った。実施例３で検討したＨＲＰ過酸化水素反応のカップリング色素を用い実施し、色素の組み合わせの妥当性を検討した。実際の２重免疫染色は、核の対比染色を行うので、表２に示すヘマトキシリンを加えた３重染色になる。一次抗体のＣＤ６８は 単球と組織球，状細胞）を標識し、一次抗体のＦａｓｃｉｎは樹状細胞を標識する。固定組織標本切片はヒト扁桃組織を用いた。抗原回復は，ＥＤＴＡ溶液によるオートクレーブによる熱処理で行った。反応した一次抗体の検出はポリマー試薬のＣｈｅｍＭａｔｅ ＥＮＶＩＳＩＯＮを用いた。
【０１２２】
その二重免疫染色像を図５に示す。ａは、ＤＡＢ−ＮｉとＤＡＢ、ｂはＤＡＢ−ＮｉとＡＥＣ、ｃはＤＡＢとＡＥＣ、ｄはＤＡＢとＶＩＰ、ｅはＳＧとＡＥＣ、ｆはＳＧとＮｏｖａＲＥＤのカップリング色素の組み合わせである。図５は、ＤＡＢとＡＥＣ，ＤＡＢとＶＩＰ，ＳＧとＡＥＣ，ＳＧとＮｏｖａＲＥＤが使用可能な色素の組み合わせであることを示唆し、一部で同一局在を示す抗原の２重免疫染色では有効なカップリング色素の組み合わせであることが示唆された。
【０１２３】
表２によれば、ＤＡＢ−Ｎｉのグリシン処理による赤（Ｒ）成分の増加からＤＡＢ−ＮｉとＤＡＢと区別できる可能性があるが、ＤＡＢ−Ｎｉのグリシン処理による青（Ｂ）成分の減少によりＤＡＢ−ＮｉとＤＡＢは近似した青（Ｂ）成分を示し、結果的に、図５ａに示すように、ＤＡＢ−Ｎｉ−とＤＡＢの組み合わせは、ＤＡＢ−ＮｉとＤＡＢの識別が容易でない結果になっている。
【０１２４】
また、ＤＡＢ−ＮｉとＡＥＣの組み合わせは、ＤＡＢ−Ｎｉのグリシン処理による赤（Ｒ）成分の増加により、ＤＡＢ−ＮｉとＡＥＣは近似した赤（Ｒ）成分を示し、図５ｂに示すように、ＤＡＢ−ＮｉとＡＥＣの識別が容易でないものになっている。
【０１２５】
ＲＧＢ画像では、ＤＡＢとＶＩＰの組み合わせが、ＤＡＢをＢ画像で、ＶＩＰをＲ画像で判別出来、良い組み合わせであることが、Ｒ、Ｇ、Ｂのグレースケールの画像でも理解できる。
【０１２６】
＜実施例４において行なった処理と用いた溶液等＞
抗原回復
パラフィン等を除かれた固定組織パラフィン標本切片を、トリプシン等の酵素で処理するか、０．０１Ｍクエン酸緩衝液ｐＨ６．０などの緩衝液に浸し加熱処理する方法がある。加熱処理は、マイクロウエーブ装置、オートクレーブ、圧力鍋、温浴装置等で行なわれる。酵素処理も加熱処理も、標的抗原により、その処理条件は異なる。
【０１２７】
１ｍＭないし０．０１Ｍ ＥＤＴＡ溶液ｐＨ８．０
エチレンジアミン四酢酸（以下，ＥＤＴＡという）・二ナトリウム（同仁化学社）０．３７ｇをイオン交換水１Ｌに加え、１Ｎ水酸化ナトリウムでｐＨ ８．０に調整する。ダコサイトメーション社からこの試薬（Ｓ３３０７ないしＳ３３０８）が供給されている。
【０１２８】
抗ＣＤ６８抗体
ダコサイトメーション社が供給しているマウス抗ヒトＣＤ６８マクロファージ抗体（ＰＧ−Ｍ１，Ｍ０８７６）で、５０倍にダコサイトメーション社が供給しているダコＣｈｅｍＭａｔｅ抗体希釈液（Ｓ２０２２）で希釈し、使用する。
【０１２９】
抗Ｆａｓｃｉｎ抗体
ダコサイトメーション社が供給しているマウス抗ヒトＦａｓｃｉｎ蛋白抗体（５５Ｋ−２、Ｍ３５６７）で、５０倍にダコサイトメーション社が供給しているダコＣｈｅｍＭａｔｅ抗体希釈液（Ｓ２０２２）で希釈し、使用する。
【０１３０】
ポリマー試薬
デキストランポリマーに直接二次抗体とＨＲＰを結合させた試薬で、ダコサイトメーション社から商業的にダコ ＣｈｅｍＭａｔｅ ＥＮＶＩＳＩＯＮ試薬として供給されている。
【０１３１】
酵素の発色剤（カップリング色素）
ヂアミノベンチジン（ＤＡＢ）
ダコサイトメーション社から、液状試薬としてＫ３４６６として供給されている。
【０１３２】
ヂアミノベンチジンニッケル（ＤＡＢ−Ｎｉ）
ＤＡＢ２０ｍｇ、硫化ニッケル（ＮｉＳＯ４・（ＮＨ４）２ＳＯ４・６Ｈ２Ｏ）４０ｍｇを０．０５Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．６）１００ｍｌに溶解し、７μｌの過酸化水素水原液を加え、ろ過して使用する。ベクター社からＤＡＢ基質キット（ＳＫ−４１００）として供給されている。
【０１３３】
アミノエチルカルバゾール（ＡＥＣ）
３ーアミノー９ーエチルカルバゾール（シグマ社）を０．４％になるようにジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、保全液とする。保存液５ｍｌを０．１Ｍ酢酸緩衝液ｐＨ５．０の９５ｍｌと混合し、２０μｌの過酸化水素水原液を加え、ろ過して用いる。０．１Ｍ酢酸緩衝液ｐＨ５．０は、９９％酢酸１１．５ｍｌをイオン交換水で１Ｌとし、この１４．８ｍｌと酢酸ナトリウム１６．４ｇないし酢酸ナトリウム・三水塩２７．２ｇをイオン交換水に溶解し１Ｌとした０．２Ｍ酢酸ナトリウム水溶液３５．２ｍｌを混合し、イオン交換水を加えて１００ｍｌとする。ダコサイトメーション社からキットが供給されている。
【０１３４】
ＶＩＰ、ＳＧ、ＮｏｖａＲＥＤ
それぞれ、西洋ワサビペルオキシダーゼの発色カップリング色素として、ベクター社から、ＳＫ−４６００、ＳＫ−４７００、ＳＫ−４８００としてキット化され供給されている。
【０１３５】
グレースケールの画像
各ピクセルを０から２５５の２５６階調の濃淡で表した画像。ピクセルとは、画像の一つの要素で細小単位の面積を有する。Ｒ、Ｇ、Ｂのカラー画像からＰｈｏｔｏｓｈｏｐのＲＧＢチャンネル分割機能で作成された各画像は、このグレースケール画像になる。
【０１３６】
〔実施例５〕
一部で局在が異なる二つの抗原の二重免疫染色として、ＣＤ３とＣＤ５の２重免疫染色を行った。ＣＤ３はＴ細胞に認められる抗原であり、ＣＤ５はＴ細胞とＢ細胞の一部に見られる。固定組織標本切片は１０％ホルマリン緩衝液固定のヒト扁桃組織のものを用い、０．０１Ｍクエン酸緩衝液ｐＨ６．０でオートクレーブで抗原回復を行った。反応した一次抗体はポリマー試薬のＣｈｅｍＭａｔｅ ＥＮＶＩＳＩＯＮを用い、ＨＲＰのカップリング色素としては、ＣＤ３ではＤＡＢを、ＣＤ５ではＶＩＰを用いた。
【０１３７】
図６に、リンパ瀘胞マントル周囲の染色像を示す。多くのＣＤ３陽性ＣＤ５陽性のＴ細胞の分布を図の左側に認め、Ｂ画像の陽性細胞として認める。図右側が胚中心領域である。図中央部がマントルから瀘胞辺縁域であり、この部分でにＣＤ３陰性ＣＤ５陽性のＢ細胞を認める。このＣＤ３陰性ＣＤ５陽性のＢ細胞は、Ｒ画像での陽性細胞と判別される。これは、ＤＡＢを用いた場合ＢＧでしか現われず、ＶＩＰでは、ＢＧＲすべてにおいて現われるからである。
【０１３８】
＜実施例５において行なった処理と用いた溶液等＞
抗原回復
パラフィン等を除かれた固定組織パラフィン標本切片を、トリプシン等の酵素で処理するか、０．０１Ｍクエン酸緩衝液ｐＨ６．０などの緩衝液に浸し加熱処理する方法がある。加熱処理は、マイクロウエーブ装置、オートクレーブ、圧力鍋、温浴装置等で行なわれる。酵素処理も加熱処理も、標的抗原により、その処理条件は異なる。
【０１３９】
０．０１Ｍクエン酸緩衝液等
２．１ｇのクエン酸・一水和物と２．９４ｇクエン酸三ナトリウム・二水和物を１００ｍｌのイオン交換水にオートクレーブで加熱し溶解し、１０Ｎ 水酸化ナトリウム水でｐＨを６．０に調整し、イオン交換水で１００ｍｌに調節したものを１０倍溶液とし、使用時に１０倍にイオン交換水で希釈する。
【０１４０】
抗ＣＤ３抗体
ノボキャストラ社が供給しているマウス抗ヒトＣＤ３抗体（ＮＣＬ−ＣＤ３−ＰＳ１）で、１００倍にダコサイトメーション社が供給しているダコＣｈｅｍＭａｔｅ抗体希釈液（Ｓ２０２２）で希釈する。
【０１４１】
抗ＣＤ５抗体
ノボキャストラ社が供給しているマウス抗ヒトＣＤ５抗体（ＮＣＬ−ＣＤ５−４Ｃ７）で，１００倍にダコサイトメーション社が供給しているダコＣｈｅｍＭａｔｅ抗体希釈液（Ｓ２０２２）で希釈する。
【０１４２】
ポリマー試薬
デキストランポリマーに直接二次抗体とＨＲＰを結合させた試薬で、ダコサイトメーション社から商業的にダコＣｈｅｍＭａｔｅ ＥＮＶＩＳＩＯＮ試薬として供給されている。
【０１４３】
ヂアミノベンチジン （ＤＡＢ）
ダコサイトメーション社から、液状試薬としてＫ３４６６として供給されている。
【０１４４】
ＶＩＰ
西洋ワサビペルオキシダーゼの発色カップリング色素として、ベクター社から、ＳＫ−４６００としてキット化され供給されている。
【０１４５】
〔実施例６〕
局在の異なる二つの抗原の二重免疫染色の例としてＣＤ３とＣＤ７９ａの二重免疫染色を行った。ＣＤ３はＴ細胞に認められ、ＣＤ７９ａはＢ細胞に認められる。抗原回復は０．０１Ｍクエン酸緩衝液ｐＨ６．０でのオートクレーブ処理を行い，酵素処理を通常使用の１０分１活性で３５℃で５分間の反応を自動免疫染色装置のプロトコールに組み込み行った。固定組織標本切片は１０％ホルマリン緩衝液固定のヒト扁桃組織のものを用い、０．０１Ｍクエン酸緩衝液ｐＨ６．０でオートクレーブで抗原回復を行った。反応した一次抗体はポリマー試薬のＣｈｅｍＭａｔｅ ＥＮＶＩＳＩＯＮを用い、ＨＲＰのカップリング色素としては、ＣＤ３ではＤＡＢを、ＣＤ７９ａではＶＩＰを用いた。
【０１４６】
その染色像を図７に示す。図７のａとｂは弱拡大像、ｃとｄは強拡大像、ｃは胚中心、ｄはマントルから辺縁域である。ＤＡＢで標識されたＴ細胞は茶色に発色しＢ画像の陽性細胞であり、Ｂ細胞は紫に発色しＲ画像の陽性細胞である。明瞭に本発明の免疫組織化学的染色方法で、Ｔ細胞をＢ細胞が染め分けられているのが解る。
【０１４７】
＜実施例６において行なった処理と用いた溶液等＞
抗原回復
パラフィン等を除かれた固定組織パラフィン標本切片を、トリプシン等の酵素で処理するか、０．０１Ｍクエン酸緩衝液ｐＨ６．０などの緩衝液に浸し加熱処理する方法がある。加熱処理は、マイクロウエーブ装置、オートクレーブ、圧力鍋、温浴装置等で行なわれる。酵素処理も加熱処理も、標的抗原により、その処理条件は異なる。
【０１４８】
０．０１Ｍクエン酸緩衝液等ｐＨ６．０
２．１ｇのクエン酸・一水和物と２．９４ｇクエン酸三ナトリウム・二水和物を１００ ｍｌのイオン交換水にオートクレーブで加熱し溶解し、１０Ｎ 水酸化ナトリウム水でｐＨを６．０に調整し、イオン交換水で１００ｍｌに調節したものを１０倍溶液とし、使用時に１０倍にイオン交換水で希釈する。
【０１４９】
酵素処理
トリプシン（シグマ社、Ｔ７１６８ Ｔａｂｌｅｔ）
一錠を１ｍｌのイオン交換水に溶解したものを反応液として用いる。
【０１５０】
プロナーゼ
プロナーゼ（ダコサイトメーション社）１００ｍｇを１０ｍｌの０．１Ｍ／Ｌの塩化ナトリウムを含む０．０５Ｍトリス塩酸緩衝液ｐＨ７．２に溶解する。この原液を０．１Ｍ／Ｌの塩化ナトリウムを含む０．０５Ｍトリス塩酸緩衝液ｐＨ７．２で２０倍に希釈する。
【０１５１】
プロテイナーゼＫ
プロテイナーゼＫ濃縮液（ダコサイトメーション社、Ｓ３００４）の４０μｌを０．０５Ｍトリス塩酸緩衝液ｐＨ７．５〜７．７の２ｍｌに加える。
【０１５２】
抗ＣＤ３抗体
ノボキャストラ社が供給しているマウス抗ヒトＣＤ３抗体（ＮＣＬ−ＣＤ３−ＰＳ１）で、１００倍にダコサイトメーション社が供給しているダコＣｈｅｍＭａｔｅ抗体希釈液（Ｓ２０２２）で希釈し、使用する。
【０１５３】
抗ＣＤ７９ａ抗体
ノボキャストラ社が供給しているマウス抗ヒトＣＤ７９ａ抗体（ＣＤ７９ａ、Ｂセッｌ、ＪＣＢ１１７、Ｍ７０５０）で，２００倍にダコサイトメーション社が供給しているダコＣｈｅｍＭａｔｅ抗体希釈液（Ｓ２０２２）で希釈し、使用する。
【０１５４】
ポリマー試薬
デキストランポリマーに直接二次抗体とＨＲＰを結合させた試薬で、ダコサイトメーション社から商業的にダコＣｈｅｍＭａｔｅ ＥＮＶＩＳＩＯＮ試薬として供給されている。
【０１５５】
ヂアミノベンチジン（ＤＡＢ）
ダコサイトメーション社から、液状試薬としてＫ３４６６として供給されている。
【０１５６】
ＶＩＰ
西洋ワサビペルオキシダーゼの発色カップリング色素として、ベクター社から、ＳＫ−４６００としてキット化され供給されている。
【０１５７】
〔実施例７〕
局在が同じ二つの抗原の二重免疫染色の例として、増殖抑制遺伝子産物であるｐ５３ 蛋白と増殖細胞を標識するＫｉ−６７抗原の２重免疫染色を行った。緩衝１０％ホルマリン溶液固定組織パラフィン包埋標本切片は口腔粘膜扁平上皮癌の周辺粘膜の切片である。抗原回復は、０．０１Ｍクエン酸緩衝液ｐＨ６．０でオートクレーブで行った。一次抗体はポリマー試薬ダコＣｈｅｍＭａｔｅ ＥＮＶＩＳＩＯＮで検出し、ＨＲＰのカップリング色素は、ｐ５３蛋白はＳＧを、Ｋｉ−３７抗原はＡＥＣを用いた。
【０１５８】
図８に、その染色像を示す。図８のａは過形成を示す扁平上皮、ｂは異形成を示す扁平上皮、ｃは強度の異形成ないしｉｎ−ｓｉｔｕの癌を示す扁平上皮である。ｐ５３蛋白の過剰核内蓄積はＳＧで核に青黒に標識され、Ｇ画像の陽性核で示されている。Ｋｉ−６７抗原陽性の増殖細胞の核はＡＥＣで赤く、Ｂ画像の陽性核で示されている。過形成から強度の異形成ないしｉｎ−ｓｉｔｕの癌までの扁平上皮の増殖性病変を特徴づけるｐ５３蛋白とＫｉ６７抗原の２重免疫染色像が得られた。
【０１５９】
＜実施例７において行なった処理と用いた溶液等＞
緩衝１０％ホルマリン溶液
リン酸一ナトリウム・２水塩４ｇとリン酸二ナトリウム・１２水塩２６ｇをイオン交換水９００ｍｌに溶解し、特級ホルムアルデヒド液（ホルマリン）１００ｍｌを加えて作成する。
【０１６０】
抗原回復
パラフィン等を除かれた固定組織パラフィン標本切片を、トリプシン等の酵素で処理するか、０．０１Ｍクエン酸緩衝液ｐＨ６．０などの緩衝液に浸し加熱処理する方法がある。加熱処理は、マイクロウエーブ装置、オートクレーブ、圧力鍋、温浴装置等で行なわれる。酵素処理も加熱処理も、標的抗原により、その処理条件は異なる。
【０１６１】
０．０１Ｍクエン酸緩衝液等ｐＨ６．０
２．１ｇのクエン酸・一水和物と２．９４ｇクエン酸三ナトリウム・二水和物を１００ ｍｌのイオン交換水にオートクレーブで加熱し溶解し、１０Ｎ 水酸化ナトリウム水でｐＨを６．０に調整し、イオン交換水で１００ｍｌに調節したものを１０倍溶液とし、使用時に１０倍にイオン交換水で希釈する。
【０１６２】
抗ｐ５３蛋白抗体
ノボキャストラ社が供給しているマウス抗ヒトｐ５３蛋白抗体（ＮＣＬ−ｐ５３−１８０１）で、１００倍にダコサイトメーション社が供給しているダコＣｈｅｍＭａｔｅ抗体希釈液（Ｓ２０２２）で希釈し、使用する。
【０１６３】
抗Ｋｉ−６７抗原抗体
ダコサイトメーション社が供給しているマウス抗ヒトＫｉ−６７抗原抗体（ＭＩＢ−１， Ｍ７２４０）で、５０倍にダコサイトメーション社が供給しているダコＣｈｅｍＭａｔｅ抗体希釈液（Ｓ２０２２）で希釈し、使用する。
【０１６４】
ポリマー試薬
デキストランポリマーに直接二次抗体とＨＲＰを結合させた試薬で、ダコサイトメーション社から商業的にダコ ＣｈｅｍＭａｔｅ ＥＮＶＩＳＩＯＮ試薬として供給されている。
【０１６５】
アミノエチルカルバゾール（ＡＥＣ）
３ーアミノー９ーエチルカルバゾール（シグマ社）を０．４％になるようにジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、保全液とする、保存液５ｍｌを０．１Ｍ酢酸緩衝液ｐＨ５．０の９５ｍｌと混合し、２０μｌの過酸化水素水原液を加え、ろ過して用いる。０．１Ｍ酢酸緩衝液ｐＨ５．０は、９９％酢酸１１．５ｍｌをイオン交換水で１Ｌとし、この１４．８ｍｌと酢酸ナトリウム１６．４ｇないし酢酸ナトリウム・三水塩２７．２ｇをイオン交換水に溶解し１Ｌとした０．２Ｍ酢酸ナトリウム水溶液３５．２ｍｌを混合し、イオン交換水を加えて１００ｍｌとする。ダコサイトメーション社からキットが供給されている。
【０１６６】
ＳＧ
西洋ワサビペルオキシダーゼの発色カップリング色素として、ベクター社から、ＳＫ−４７００としてキット化され供給されている。
【０１６７】
【発明の効果】
本発明は、抗原の検出に際して、検出時間の大幅な短縮、染色に用いる色素の選別、方法の自動化にも適する抗原の検出方法を提供し得るという有利な効果を奏する。
【０１６８】
また、本発明は、多重免疫染色方法の普及にも大きく貢献するものであり、また、腫瘍化の段階を２つ以上の抗原を標識する多重免液染色方法の実用化の大きな契機にもなるものであると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の二重免疫染色を含む免疫組織化学的染色法の一実施態様による光顕的に識別される最終産物の概念図である。
【図２】グリシン緩衝液による一次抗体除去効果を示すもので、非特異的一次抗体反応の抑制の効果を示す。
【図３】グリシン緩衝液による抗原のマスク効果を示す。
【図４】西洋ワサビペルオキシダーゼのカップリング色素の発色の実際を示す。
【図５】西洋ワサビペルオキシダーゼのカップリング色素の組み合わせによるＣＤ６８とＦａｓｃｉｎ（抗原の局在が一部で重なる場合）の二重免疫染色を示す。
【図６】西洋ワサビペルオキシダーゼのカップリング色素であるＤＡＢとＶＩＰによるＣＤ３とＣＤ５（抗原の局在が一部で異なる場合）の二重免疫染色像を示す。
【図７】西洋ワサビペルオキシダーゼのカップリング色素であるＤＡＢとＶＩＰによるＣＤ３とＣＤ７９ａ（抗原の局在が異なる場合）の二重免疫染色像を示す。
【図８】西洋ワサビペルオキシダーゼのカップリング色素であるＳＧとＡＥＣによるｐ５３蛋白とＫｉ−６７抗原（抗原の局在が異なる場合）の二重免疫染色像を示す。
Claims (14)
- 呈色物又は発光物で抗原を多重染色する多重免疫組織化学的染色方法を用いて二以上の異なる抗原を検出する抗原の検出方法であって、非特異反応抑制処理を行なうことによって、一次抗体と非特異的に結合する非特異的結合物質へ非特異反応抑制物質を被膜し、前記一次抗体と非特異的結合物質との結合を抑制することを特徴とする検出方法。
- 前記非特異的反応抑制処理を、第一抗原と一次抗体との抗原抗体反応の前に行なうことを特徴とする請求項１記載の方法。
- 前記非特異的反応抑制処理が、二次抗体と同種の動物血清による処理、スキンミルクによる処理、ノンファットミルクによる処理、及びガゼイン溶液による処理からなる群から選択される少なくとも１種であることを特徴とする請求項１又は２項に記載の方法。
- 前記カゼイン処理を、０．０２５〜２．５％の範囲のカゼインを含む溶液により行なうことを特徴とする請求項１〜３項のいずれか１項に記載の方法。
- 抗体に結合している免疫反応物であって、最後に検出する抗原以外の抗原を検出する免疫反応産物の呈色物又は発光物を除くものを、ｐＨ３以下又はｐＨ９以上の緩衝液で除去する請求項１〜４項のいずれか１項に記載の方法。
- さらに、非特異反応生成物、及びその他の残存反応物を除去するために、加熱した洗浄液によって洗浄する工程を含む、ことを特徴とする請求項５記載の方法。
- 前記加熱した洗浄液の温度が、２５〜６０℃の範囲内であることを特徴とする請求項６記載の方法。
- 前記呈色物又は発光物を除くものの除去を、前記最後に検出する抗原以外の抗原の同定後に行なう請求項５〜７項のいずれか１項に記載の方法。
- 免疫組織化学的染色方法が、異なる成分強度を有する複数の色素を用いて染色する方法であり、前記成分強度の差異に基づいて抗原を検出する請求項１〜８項のいずれか１項に記載の方法。
- 前記成分が、Ｒ（赤）成分、Ｂ（青）成分、及びＧ（緑）成分からなることを特徴とする請求項９記載の方法。
- 前記呈色物又は発光物が、可視化することができる物質であることを特徴とする請求項１〜１０項のいずれか１項に記載の方法。
- 可視化することができる物質が、免疫組織化学的反応の標識酵素の基質との反応で呈色ないし発光するカップリング物質であることを特徴とする請求項１１項記載の方法。
- 可視化することができる物質が、西洋ワサビペルオキシダーゼ（以下、ＨＲＰという）、アルカリフォスファターゼ（以下、ＡＬＰという）、グルコースオキシダーゼ、ベータガラクトシダーゼからなる群から選択される少なくとも１種であることを特徴とする請求項１１記載の方法。
- 反応液、反応時間、及び洗浄回数をプログラムして自動免疫装置に組み込み、自動化して行なう請求項１〜１３項のいずれか１項に記載の方法。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2003183193A JP3899407B2 (ja) | 2003-06-26 | 2003-06-26 | 免疫組織化学的染色方法による抗原の検出方法 |
| US10/872,462 US20050032129A1 (en) | 2003-06-26 | 2004-06-22 | Detection of antigen by immunohistochemical staining |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2003183193A JP3899407B2 (ja) | 2003-06-26 | 2003-06-26 | 免疫組織化学的染色方法による抗原の検出方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2005017133A true JP2005017133A (ja) | 2005-01-20 |
| JP3899407B2 JP3899407B2 (ja) | 2007-03-28 |
Family
ID=34113554
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2003183193A Expired - Lifetime JP3899407B2 (ja) | 2003-06-26 | 2003-06-26 | 免疫組織化学的染色方法による抗原の検出方法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20050032129A1 (ja) |
| JP (1) | JP3899407B2 (ja) |
Cited By (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007055302A1 (ja) * | 2005-11-10 | 2007-05-18 | National University Corporation University Of Toyama | 生体物質と生体物質結合性物質との結合性評価方法 |
| JP2007127505A (ja) * | 2005-11-02 | 2007-05-24 | Kagoshima Univ | 免疫染色法、及び当該免疫染色法を利用した細胞の評価方法 |
| CN102539415A (zh) * | 2011-12-27 | 2012-07-04 | 北京富通华投资有限公司 | 一种快速检测鲜奶中植脂末掺假的方法 |
| JP2013503332A (ja) * | 2009-08-26 | 2013-01-31 | ゼネラル・エレクトリック・カンパニイ | 抗原賦活プロセスのための方法及び装置 |
| WO2015045961A1 (ja) * | 2013-09-26 | 2015-04-02 | コニカミノルタ株式会社 | 蛍光ナノ粒子標識体、多重免疫染色剤キットおよび多重免疫染色法 |
| WO2015093116A1 (ja) * | 2013-12-17 | 2015-06-25 | コニカミノルタ株式会社 | 細胞の蛍光免疫染色方法ならびにそのためのシステムおよびキット |
| JP2015219109A (ja) * | 2014-05-16 | 2015-12-07 | 国立大学法人神戸大学 | 迅速かつ高感度な多重免疫染色法 |
| JP2017129447A (ja) * | 2016-01-20 | 2017-07-27 | コニカミノルタ株式会社 | 酸性水溶液を用いた免疫染色スライドの洗浄方法 |
| CN109283032A (zh) * | 2018-11-19 | 2019-01-29 | 中山大学肿瘤防治中心（中山大学附属肿瘤医院、中山大学肿瘤研究所） | 一种冷冻切片免疫组织化学自动化染色仪 |
| JP2019100945A (ja) * | 2017-12-06 | 2019-06-24 | キヤノンメディカルシステムズ株式会社 | タンパク質をイメージングする方法 |
| CN112129946A (zh) * | 2020-08-16 | 2020-12-25 | 陆修委 | 无糖链型惰性蛋白封闭剂的制备方法及应用 |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8673643B2 (en) * | 2010-11-30 | 2014-03-18 | General Electric Company | Closed loop monitoring of automated molecular pathology system |
| US11415493B2 (en) | 2016-03-17 | 2022-08-16 | Perkinelmer Health Sciences B.V. | Detection of cells in a liquid sample |
| RU2627448C1 (ru) * | 2016-04-05 | 2017-08-08 | федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Ставропольский государственный аграрный университет" | Способ иммуногистохимического выявления антигенов в препаратах органов продуктивных и непродуктивных животных длительного хранения в фиксаторах |
| EP3443126B1 (en) * | 2016-04-15 | 2023-11-15 | Icahn School of Medicine at Mount Sinai | Tissue profiling using multiplexed immunohistochemical consecutive staining |
| US10921223B2 (en) * | 2018-10-12 | 2021-02-16 | Shenzhen Prs Limited | Process record slide for staining and method of using the same |
| CN110646274B (zh) * | 2019-09-18 | 2022-04-22 | 山东省立医院 | 一种一次性术中冰冻病理组织取材收集装置及其应用 |
| CN111965341B (zh) * | 2020-08-10 | 2023-04-11 | 武汉菲恩生物科技有限公司 | 一种基于葡聚糖的HRP-羊抗鼠IgG标记抗体及其制备方法 |
| CN114594245A (zh) * | 2022-01-26 | 2022-06-07 | 浙江莱阅病理诊断科技有限公司 | 一种全自动免疫组化染色机适配的清洗缓冲液及其制备方法 |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5869274A (en) * | 1995-08-09 | 1999-02-09 | Zymed Laboratories, Inc. | Immuno-histochemical method that reduces background staining |
| US5713158A (en) * | 1995-12-04 | 1998-02-03 | Gibbs; Alden T. | Roofing ridge installation |
| US5839091A (en) * | 1996-10-07 | 1998-11-17 | Lab Vision Corporation | Method and apparatus for automatic tissue staining |
| IL125908A (en) * | 1998-08-24 | 2005-05-17 | Nst Neurosurvival Technologies | Peptides and pharmaceutical compositions comprising same |
| US6203989B1 (en) * | 1998-09-30 | 2001-03-20 | Affymetrix, Inc. | Methods and compositions for amplifying detectable signals in specific binding assays |
-
2003
- 2003-06-26 JP JP2003183193A patent/JP3899407B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
2004
- 2004-06-22 US US10/872,462 patent/US20050032129A1/en not_active Abandoned
Cited By (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007127505A (ja) * | 2005-11-02 | 2007-05-24 | Kagoshima Univ | 免疫染色法、及び当該免疫染色法を利用した細胞の評価方法 |
| JP4734636B2 (ja) * | 2005-11-02 | 2011-07-27 | 国立大学法人 鹿児島大学 | 免疫染色法、及び当該免疫染色法を利用した細胞の評価方法 |
| WO2007055302A1 (ja) * | 2005-11-10 | 2007-05-18 | National University Corporation University Of Toyama | 生体物質と生体物質結合性物質との結合性評価方法 |
| JP2013503332A (ja) * | 2009-08-26 | 2013-01-31 | ゼネラル・エレクトリック・カンパニイ | 抗原賦活プロセスのための方法及び装置 |
| CN102539415A (zh) * | 2011-12-27 | 2012-07-04 | 北京富通华投资有限公司 | 一种快速检测鲜奶中植脂末掺假的方法 |
| JPWO2015045961A1 (ja) * | 2013-09-26 | 2017-03-09 | コニカミノルタ株式会社 | 蛍光ナノ粒子標識体、多重免疫染色剤キットおよび多重免疫染色法 |
| WO2015045961A1 (ja) * | 2013-09-26 | 2015-04-02 | コニカミノルタ株式会社 | 蛍光ナノ粒子標識体、多重免疫染色剤キットおよび多重免疫染色法 |
| WO2015093116A1 (ja) * | 2013-12-17 | 2015-06-25 | コニカミノルタ株式会社 | 細胞の蛍光免疫染色方法ならびにそのためのシステムおよびキット |
| JPWO2015093116A1 (ja) * | 2013-12-17 | 2017-03-16 | コニカミノルタ株式会社 | 細胞の蛍光免疫染色方法ならびにそのためのシステムおよびキット |
| JP2015219109A (ja) * | 2014-05-16 | 2015-12-07 | 国立大学法人神戸大学 | 迅速かつ高感度な多重免疫染色法 |
| JP2017129447A (ja) * | 2016-01-20 | 2017-07-27 | コニカミノルタ株式会社 | 酸性水溶液を用いた免疫染色スライドの洗浄方法 |
| JP2019100945A (ja) * | 2017-12-06 | 2019-06-24 | キヤノンメディカルシステムズ株式会社 | タンパク質をイメージングする方法 |
| JP7262922B2 (ja) | 2017-12-06 | 2023-04-24 | キヤノンメディカルシステムズ株式会社 | タンパク質をイメージングする方法 |
| CN109283032A (zh) * | 2018-11-19 | 2019-01-29 | 中山大学肿瘤防治中心（中山大学附属肿瘤医院、中山大学肿瘤研究所） | 一种冷冻切片免疫组织化学自动化染色仪 |
| CN112129946A (zh) * | 2020-08-16 | 2020-12-25 | 陆修委 | 无糖链型惰性蛋白封闭剂的制备方法及应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3899407B2 (ja) | 2007-03-28 |
| US20050032129A1 (en) | 2005-02-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP3899407B2 (ja) | 免疫組織化学的染色方法による抗原の検出方法 | |
| EP3555622B1 (en) | Methods and systems for quantitative immunohistochemistry | |
| Sanderson et al. | 19—Immunohistochemical and immunofluorescent techniques | |
| US8603765B2 (en) | Immunoassay reagents and methods of use thereof | |
| JP3503890B2 (ja) | 改良された免疫組織化学的染色法およびそのための試薬 | |
| KR101554795B1 (ko) | 피리미딘 유사체를 이용하는 색원체의 증강된 침적 | |
| CA3005804C (en) | Methods of identifying immune cells in pd-l1 positive tumor tissue | |
| CN103328979B (zh) | 组合的组织学染色 | |
| Hussaini et al. | Immunohistochemistry and immunofluorescence | |
| CN110320087B (zh) | 一种含色素组织免疫组化染色试剂盒及染色方法 | |
| CN111363789B (zh) | 一种同时检测蛋白质和rna的试剂盒和方法 | |
| JP4292297B2 (ja) | 免疫組織化学的染色による抗原の検出方法 | |
| JPS63501819A (ja) | イムノアッセイ法およびキット | |
| US20130115630A1 (en) | Automated multiplex immunoassay | |
| WO2009117138A2 (en) | Counterstaining method for dual-stain in situ hybridization | |
| JP3857677B2 (ja) | 免疫組織化学的染色による抗原の検出方法 | |
| JP2023526468A (ja) | スライド上にプリントされたバイオマーカーおよびロマノフスキー型染色サンプルを調製するための自動化プラットフォームの使用 | |
| CN110121364A (zh) | 肽核酸缀合物 | |
| Kabir et al. | Immunohistochemistry as an Indispensable Tool in Oncology | |
| Ramos-Vara et al. | Immunohistochemical methods | |
| WO2020053376A1 (en) | Histochemical and cytochemical methods for detecting ntrk fusion proteins | |
| US20070134742A1 (en) | Diagnostic reagent for uterine adenocarcinoma and method of detecting adenocarcinoma cells | |
| Ramos-Vara | 11 Immunohistochemical | |
| Smoller et al. | Immunoperoxidase: The Technique |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20050808 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20051011 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20051209 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20060228 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20060428 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20060815 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20061013 |
|
| RD03 | Notification of appointment of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7423 Effective date: 20061013 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20061013 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20061205 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 3899407 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |