JPH0135840B2

JPH0135840B2 -

Info

Publication number: JPH0135840B2
Application number: JP55501235A
Authority: JP
Inventors: Kurisuchian Biru; Ururitsuhi Shutorenueruku
Original assignee: ORUPEGEN MEDEITSUINISHUUMOREKURAARUBIOROGITSUSHE FUORUSHUNGUSUKEZERUSHAFUTO MBH
Current assignee: ORUPEGEN MEDEITSUINISHUUMOREKURAARUBIOROGITSUSHE FUORUSHUNGUSUKEZERUSHAFUTO MBH
Priority date: 1979-05-15
Filing date: 1980-05-14
Publication date: 1989-07-27
Also published as: WO1980002560A1; NL8020195A; DE2919592C2; US4466918A; GB2065662B; CH649089A5; JPS56500655A; DE2919592A1; EP0028627B1; EP0028627A1; US4353821A; GB2065662A

Description

請求の範囲１一連の保護基含有ペプチドフラグメントの製
造、それらの縮合及び引続く保護基の離脱によ
り、チモシン−α1又はアミノ酸残基Glu（10）、
Asp（15）、Glu（21）、Glu（25）及びAsn（28）の少
なくとも１個の側鎖カルボキシル基がアミド又は
アルキルアミドとして存在し、又は／及びＮ−末
端アミノ基に結合したアセチル基が他のアシル基
１個で換えられているその誘導体を製造するため
に、ａ）Ｎ−末端非保護の、Ｃ−末端エステル化さ
れたか又は支持体結合したＣ−末端ペプチドフ
ラグメントと隣接Ｎ−末端Ddz−保護されたＣ
−末端非保護のペプチドフラグメントとを少な
くとも１：1.5の化学量論的量比で、無水の有
機溶剤中で、ジシクロヘキシルカルボジイミド
及び１−ヒドロキシベンゾトリアゾールを用い
て縮合させ、ｂ）僅かな化学量論的過剰のトリフルオル酢酸
の添加により、縮合したフラグメントDdz−基
を離脱させ、ｃ）過剰の酸を有機塩基で中和し、かつｄ）こうして得たＮ−末端非保護の延長された
Ｃ−末端フラグメントとそれぞれ次のＮ−末端
Ddz−保護フラグメントとを、工程ａ）、ｂ）
及びｃ）の繰り返しのもとにペプチド連鎖が完
全になるまで縮合させ、最後に、残留している
保護基を常法で離脱させ、この際Asp及びGlu
に対する側鎖保護基としてｔ−ブチルエステル
基を、Ser及びThrに対してｔ−ブチル基を、
Lysに対してベンジルオキシカルボニル基をか
つAsnに対して４，4′−ジメトキシベンズヒド
リル基を使用し、かつ、場合により、Ｎ−末端アセチル基を他の
アセチル基で換えることを特徴とする、チモシン
−α1又はその誘導体の製法。

２グルタミン酸残基（10）、（21）、（25）の少な
くとも１個又は／及びアスパラギン酸残基（15）
又は／及びアスパラギン残基（28）の側鎖カルボ
キシル基を、アミド又はアルキルアミドの形で、
もしくはアスパラギン（28）の場合はジアミドの
形で有するペプチドフラグメントを使用する、請
求の範囲第１項記載の方法。

３工程ａ）で溶剤としてジメチルホルムアミド
を使用する、請求の範囲第１項又は第２項記載の
方法。

４工程ｂ）で、ジクロルメタン中のトリフルオ
ル酢酸を添加する、請求の範囲第１項から第３項
までのいずれか１項に記載の方法。

５トリフルオル酢酸の１〜５％の溶液を使用す
る、請求の範囲第４項記載の方法。

６工程ａ）の縮合を、０〜30℃の温度で実施す
る、請求の範囲第１項から第５項までのいずれか
１項に記載の方法。

７ベンジルオキシカルボニル保護基及びＣ−末
端ベンジルエステル基をトリフルオルエタノール
中での水素添加分解により離脱させる、請求の範
囲第１項から第６項までのいずれか１項に記載の
方法。

８ｔ−ブチルエステル基を、アニソールの存在
で、ジクロルメタン中の40〜60％のトリフルオル
酢酸を用いて離脱させる、請求の範囲第１項から
第７項までのいずれか１項に記載の方法。

９４，4′−ジメチルベンズヒドリル保護基を純
粋のトリフルオル酢酸中で離脱させる、請求の範
囲第１項から第８項までのいずれか１項に記載の
方法。

１０ｂ）工程、Ｎ−メチルモルホリンを用いて
中和する、請求の範囲第１項から第９項までのい
ずれか１項に記載の方法。

１１ａ）、ｂ）及びｃ）工程を、支持体結合し
たフラグメントＶ、、、：式： Ddz−25 Glu （OBu^t）−26 Ala −27 Glu （OBu^t）−28 Asn （Mbh）（OBzl）（Ｖ）〔ここで、グルタミン酸残基（25）はアミド又は
アルキルアミドとして、かつアスパラギン残基
（28）はジアミド又はジアルキルアミドとして存
在していてよい〕、式： Ddz−20 Lys （Ｚ）−21 Glu （OBu^t）−22 Val −23 Val −Glu（OBu^t）−25 Glu （OBu^t−26 Ala −27 Glu （OBu^t）−28 Asn −（Mbh）（OBzl）（）〔ここでグルタミン酸残基（21）及び（25）及
び／又はアスパラギン残基（28）はアミド又はア
ルキルアミドとしてもしくはジアミドとして又は
ジアルキルアミドとして存在していてよい〕、式： Ddz−13 Thr （Bu^t）−14 Lys （Ｚ）−15 Asp （OBu^t） −16 Leu −17 Lys （Ｚ）−18 Glu （OBu^t）−19 Lys （Ｚ） −20 Lys （Ｚ）−21 Glu （OBu^t）−22 Val −23 Val −24 Glu （OBu^t）−25 Glu （OBu^t）−26 Ala −27 Glu （OBu^t）−28 Asn （Mbh）（OBzl）（）〔ここでグルタミン酸残基（21）及び（25）、ア
スパラギン酸残基（15）及び／又はアスパラギン
酸（28）はアミド又はアルキルアミドとして、も
しくはジアミド又はジアルキルアミドとして存在
していてよい〕及び、式： Ddz−７ Thr （Bu^t）−８ Ser （Bu^t）−９ Ser （Bu^t） −10 Glu （OBu^t）−11 Ile −12 Thr （Bu^t）−13 Thr （Bu^t） −14 Lys （Ｚ）−15 Asp （OBu^t）−16 Leu −17 Lys （Ｚ） −Glu（OBu^t）−19 Lys （Ｚ）−20 Lys （Ｚ）−21 Glu （OBu^t）−22 Val −23 Val −24 Glu （OBu^t）−25 Glu （OBu^t） −26 Ala −27 Glu （OBu^t）−28 Asn （Mbh）（OBzl）（）〔ここでグルタミン酸残基（10）、（21）、（25）、
アスパラギン酸残基（15）及び／又はアスパラギ
ン残基（28）はアミド又はアルキルアミドとし
て、もしくはジアミド又はジアルキルアミドとし
て存在していてよい〕で実施する、請求の範囲第１項から第１０項まで
のいずれか１項記載の方法。

明細書本発明はペプチドフラグメントからチモシン−
α1及びその特定の誘導体の製法に関する。

チモシン−α1は、配列Ser−Asp−Ala−Ala−
Val−Asp−Thr−Ser−Ser−Glu−Ile−Thr−
Thr−Lys−Asp−Leu−Lys−Glu−Lys−Lys−
Glu−Val−Val−Glu−Glu−Ala−Glu−Asnを
有し、この中のNo.１のアミノ酸セリンがアセチル
化されて存在する胸腺の特に酸性のポリペプチド
である。このチモシン−α1では、癌撲滅及び免
疫学的防御組織の調整の分野でのその使用性が期
待できる重要な生物学的特性がみつけられた
（Cancer Treatment Reports 62巻No.11（1978年）
参照）。例えば、癌治療の分野で照射により生じ
る免疫抑制がチモシン−α1での処置により低減
されることが判明した。

従つて、チモシン−α1の合成法は重要になつ
ている。

チモシン−α1の化学的全合成は、既にJ.A.C.
S.101、１、253〜254頁（1979年）から公知であ
る。この方法では、従来慣用のペプチド合成法に
より、差当り、数種のペプチドフラグメントを合
成し、これらを、引続き、種々の方法で、特にア
ジド法で相互に縮合させている。しかしながらこ
の公知法は、欠点を有し、非常に経費がかかる
が、非常に低い収率で得られるだけである。

本発明は、これらの欠点を有さず、簡単な反応
で良好な収率で所望の生成物を生じるチモシン−
α1の合成法を得ることを目的としている。この
方法は、更に、あまり変えることなしに、チモシ
ン−α1の生物学的に重要な誘導体及び類縁体の
製造をも可能にすることにも役立つ。

この課題は、本発明により、保護基を有する一
連のペプチドフラグメントを製造し、それらを縮
合させ、引続き保護基を離脱させることによる、
チモシン−α1又はアミノ酸残基Glu（10）、Asp
（15）、Glu（21）、Glu（25）およびAsn（28）の少
なくとも１個の側鎖のカルボキシ基がアミド又は
アルキルアミドとして存在しかつ／又はＮ−末端
アミノ基に結合したアセチル基は他のアシル基に
より換えられているその誘導体の製造により解決
され、その特徴とするところは、ａ）Ｎ−末端非保護で、Ｃ−末端エステル化さ
れたか又は支持体結合されたＣ−末端ペプチド
フラグメントと隣接Ｎ−末端Ddz−保護され
た、Ｃ−末端非保護のペプチドフラグメントと
を少なくとも１：1.5の化学量論的量比で、無
水有機溶剤中で、ジシクロヘキシルカルボジイ
ミド及び１−ヒドロキシベンゾトリアゾール
（DCC／１−HOBt）で縮合させ、ｂ）僅かな化学量論的過剰のトリフルオロ酢酸
の添加により、縮合されたフラグメントDdz−
基を離脱させ、ｃ）過剰の酸を有機塩基で中和し、かつｄ）こうして得たＮ−末端非保護の長鎖状Ｃ−
末端フラグメントとそれぞれ次のＮ−末端Ddz
−保護されたフラグメントとをペプチド連鎖が
完全になるまでａ）、ｂ）及びｃ）の工程を繰
り返して縮合させ、かつ最後に、残留している
保護基を常法で離脱させ、この際、Asp及び
Gluの側鎖保護基としてはｔ−ブチルエステル
基を、Ser及びThrにはｔ−ブチル基を、Lys
にはベンジルオキシカルボニル基を、かつAsn
には４，4′−ジメトキシベンズヒドリル基を使
用し、かつ場合によつては、Ｎ−末端アセチル基を他
のアシル基で換える。

ここで使用されている略字はIUPAG−IUB−
提案〔J.Biol.Chem.247巻977〜983頁（1972年）
参照〕に依る。Ddzはα，α−ジメチル−３，６
−ジメトキシベンジルオキシカルボニルを意味
し、ｚはベンジルオキシカルボニル、Acはアセ
チル、DButはｔ−ブチルエステル、Mbhは４，
4′−ジメチルオキシベンズヒドリルを意味する。
アルキル基としては、１〜６個特に１〜４個のＣ
−原子を有する直鎖又は分枝鎖の基がこれに該当
する。支持体としては、当業者に公知の、ペプチ
ド及び蛋白質の固定化に好適な支持体物質が使用
される。

本発明方法で重要なことは、チモシン−α1分
子のＮ−末端端部を作るフラグメントを少なくと
も1.5倍特に〜2.5倍の化学量論的過剰で使用する
ことである。２個のフラグメントの縮合の際に、
それぞれＮ−末端Ddz−保護基を有する新しい大
きいＣ−末端フラグメントを生じ、Ｎ−末端Ddz
−保護基は次の非常に少量の酸との縮合のため
に、予め離脱されうるので、中和のためにも少量
の塩基が必要であるだけである。これに伴ない、
従来公知の方法で、慣用の多くの個々の工程及び
中間処理は、その都度の反応生成物の単離のため
に反応混合物を１カラムでの１回のクロマトグラ
フイ分離を行なうように、簡略化される。溶剤、
メタノール及び２，２，２−トリフルオルエタノ
ール中のセフアデツクスLH20を使用するのが有
利である。支持体結合したフラグメント結合の場
合には、最後に記載のクロマトグラフイによる中
間体単離も余分である。

本発明によれば無水の有機溶剤中で操作される
ので、水を除くための特別な乾燥工程は不必要で
ある。完全保護された最終生成物の有利にクロマ
トグラフイにより実施される精製も、同じ無水の
有機溶剤中で行なうことができる。

工程ａ）のために、溶剤として有利にジメチル
ホルムアミドが使用される。他の好適な溶剤はＮ
−メチルピロリドン及び双方とジメチルアセタミ
ドとからの混合物である。

ｂ）工程では、酸の溶剤としてジクロルメタン
が有利である。他の好適な溶剤は、クロロホル
ム、テトラヒドロフラン及びジオキサンである。

特にジクロルメタン中の１〜約５％のトリフル
オル酢酸溶液を使用するのが有利である。トリフ
ルオル酢酸の特別な利点は、最終的なｔ−ブチル
エステル保護基及び４，4′−ジメトキシベンズヒ
ドリル保護基の離脱の分野でも、これを使用する
ことができる点にあり、この際には単にその濃度
が高められる。

中和のためには、原則的に、有機溶剤中に可溶
な又は支持体結合したすべての有機３級アミンを
使用することができる。特に、ラセミ化を抑制
し、これにより生成物の光学的純度を改良するの
で、Ｎ−メチルモルホリンが有利である。

ａ）工程の終了時に、溶剤を有利に真空中で溜
去し、残分をクロマトグラフイにより、例えば分
子フルイ物質例えば網状化されたデキストラン、
ポリスチロール又は類似物を通して精製する。こ
のクロマトグラフイは、適当な無水の溶剤例えば
アルコール、ハロゲン化された炭化水素等中で行
なう。メタノールが有利である。支持体結合した
フラグメント縮合物の場合には、単に、ジメチル
ホルムアミド及びジクロルメタンで支持体ポリマ
ーを洗浄する。

本発明方法に出発物質として使用されるペプチ
ドフラグメントは、ペプチド合成に公知の方法で
製造できる。その合成は同様にDdz−保護基の使
用下に行なうのが有利である。この場合、Ddz−
アミノ酸とイソブチルオキシカルボニルクロリ
ド／Ｎ−メチルモルホリンとの混合無水物が、Ｎ
−末端段階的配列延長により形成される。特にそ
れぞれDdz−アミノ酸、Ｎ−メチルモルホリン及
びSek−ブチロキシカルボニルクロリド1.5〜２当
量をジクロルメタン中に溶かし、約−10〜−20℃
で、トリフルオル酢酸１〜５％を含有し、1/4〜
１／２時間常温に保持され、次いでＮ−メチルモル
ホリンで中和されるジクロルメタン中の１当量の
Ddz−アミノ酸−ｔ−ブチルエステルもしくは
Ddz−オリゴペプチド−ｔ−ブチルエステルの変
換により得られる溶液と混合するのが有利であ
る。次いで、混合した溶液を室温で約30分〜２時
間反応させる。得られる反応混合物を真空中で蒸
発乾涸させ、クロマトグラフイにより適当なクロ
マトグラフイ材料例えば網状化されたデキストラ
ン例えばセフアデツクスLH20を通し、溶剤例え
ばメタノール中で精製する。この溶剤の除去の後
に、直接、次の縮合工程を、それぞれのペプチド
フラグメントが完成するまで前記の方法で行なう
ことができる。支持体結合したフラグメントの縮
合の場合には、ジメチルホルムアミド及びジクロ
ルメタンとの反応の後に、支持体ポリマーを洗浄
する。

こうして得たフラグメントからのチモシン−
α1の構成を、添付の図面につき詳説する。アミ
ノ酸１〜６（フラグメントＩ）、７〜12（フラグメ
ント）、13〜19（フラグメント）、20〜24（フラ
グメント）並びに25〜28（フラグメントＶ）よ
りなる５フラグメントを作ることが認められる。
Ｃ−末端フラグメントとしてのフラグメントＶ
を、次いで本発明により、フラグメントと反応
させると、この際、延長されたＣ−末端フラグメ
ントが得られる。同様にして、フラグメント
をフラグメントと改めて反応させると、フラグ
メントが新しいＣ−末端フラグメントとして生
じる。この後者をフラグメントと反応させて、
フラグメントを形成させながら、これを最後に
フラグメントＩと反応させて、完成したペプチド
鎖を形成させ、これからは、なお保護基を離脱
させるだけである。アセチル基を他のアシル基で
換えるべき場合には、これはフラグメントＩの形
成の際に行なう。フラグメントＩとＶは、有利に
ベンジルエステルとしては、Ｖは場合により支持
体結合して、、及びはメチルエステルとし
て製造される。このエステルからのカルボキシル
基の遊離は、アルカリ性鹸化により、メチルエス
テルの場合は、水性ジオキサン中で、ベンジルエ
ステルの場合はテトラヒドロフラン／メタノール
中で行なうのが有利である。

縮合反応そのものは、溶剤としてのジメチルホ
ルムアミド中で実施するのが有利である。この
際、個々の縮合工程での収率は優れており、90％
まで達する。フラグメントＩでは、ベンジルエス
テル基を脱水素するのが有利である。好適な溶剤
は、プロパノール及び氷酢酸並びに２，２，２−
トリフルオルエタノールの混合物である。触媒と
しては、パラジウム−炭、パラジウム黒又は白金
黒を使用するのが有利である。

前記のように、本発明の方法は特定のチモシン
−α1−誘導体の合成、即ち、アミノ酸残基Glu
（10）、Asp（15）、Glu（21）、Glu（25）及びAsn
（28）の少なくとも１個の側鎖のカルボキシ基の
代りにアミド−又はアルキル−アミド基を有する
ようなものの合成も行なう。この場合、フラグメ
ントの相応する合成工程で、天然チモシン−α1
中に存在するそれぞれのアミノ酸の代りに、これ
らアミノ酸の既にアミド又はアルキルアミドに変
えられた誘導体を使用する。Asnの場合は、相応
するジアミドを使用する、それというのもAsnは
それ自体既にアミドであるからである。

前記の誘導体は特別な治療上の重要性を有し、
チモシン−α1とは別の作用効果を有する。

作用もしくは作用強度を変えるためにＮ−末端
アセチル基を他のアシル基で換えることもでき
る。この場合、アセチル基の代りにアシルグリシ
ン基を導入するのが有利である。

次の例は、更に添付図面との関連で本発明を説
明している。

例１チモシン−α1の製造フラグメントＩ（１〜６）、（７〜12）、
（13〜19）、（20〜24）及びＶ（25〜28）を、溶
液中で、過剰のDdz−アミノ酸と、イソブチロキ
シカルボニルクロリド／Ｎ−メチルモルホリンと
の混合物の使用下に、Ｎ−末端での段階的配列延
長により全ての側で保護して形成した。この後、
フラグメントＩ及びＶはベンジルエステルとし
て、、及びはメチルエステルとして、次の
すべての段階にわたり計算した収率で存在した：
Ｉ（67％）、（20％）、（31％）、（56％）及
びＶ（39％）。

水性ジオキサン中でのアルカリ性鹸化の後に、
フラグメントをジメチルホルムアミド中でＶと
縮合させ、その後、後者から予め、Ddz−基を、
ジクロルメタン中の１％トリフルオル酢酸（Ｖ／
Ｖ）を用いて離脱させた。縮合は、ジシクロヘキ
シルカルボジイミド／１−ヒドロキシルベンゾト
リアゾール（DCC／HOBt）を用いて、20℃、24
時間で70％の収率で行なつた。こうしてフラグメ
ントを得た。

フラグメントを水性テトラヒドロフラン／メ
タノール中のアルカリ性鹸化の後に、前記の条件
下でジメチルホルムアミド中、室温で66時間内
に、フラグメントと結合させる。フラグメント
が60％の収率で得られた。

次の段階で、フラグメントをＶで行なつた
Ddz−離脱と同様にジメチルホルムアミド中で、
Ｎ−末端で、フラグメント（これは予めジオキ
サン／水８：２（Ｖ／Ｖ）中で鹸化した）と結合
させる。縮合は０℃で18時間かつ20℃で10時間実
施した。フラグメントの収率67％。

最後の縮合の前に、Ｎ−末端アセチルフラグメ
ントＩから、ベンジルエステル基をプロパノー
ル／氷酢酸中で水素添加分解により離脱させた。
Ｉの遊離酸をＮ−メチルピロリドン／ジメチルホ
ルムアミド２：１（Ｖ／Ｖ）中で、予めのDdz−
離脱後のと24時間反応させた。生成物の収率
52％。

を２，２，２−トリフルオルエタノール中で
セフアデツクスLH20を通すクロマトグラフイに
より精製した。アミノ酸分析（括孤内計算値：
6NHCl 110℃、24時間）；Asp4.11(4)、Thr2.64
(3)、Ser2.38(3)、Glu6.80(6)、Lys4.59(4)、Ile1.13
(1)、Leu1.23(1)、Ala2.51(3)、Val2.41(3)。

引続く３反応工程でからすべての保護基を除
いた。２，２，２−トリフルオルエタノール中、
Pd／Ｃを用いて水素添加分解によりすべてのベ
ンジルオキシカルボニル保護基及びＣ−末端ベン
ジルエステルを除去できた（収率96％）。アニソ
ール10％の存在下でのトリフルオル酢酸／ジクロ
ルメタン１：１（Ｖ／Ｖ）の30分間作用により、
主としてＶ−ブチルエステル基が離脱された。真
空中、室温で揮発性成分の除去の後にこのポリペ
プチド／アニソール−残分に４，4′−ジメトキシ
ベンズヒドリル保護基及び残留ｔ−ベンジル基を
離脱させるためにトリフルオル酢酸を加えた
（120分、約20℃）、沈殿及びエーテルでの洗浄の
後に、この合成チモシン−α1をクロマトグラフ
イにより精製した。このために、ビオーゲル
（Bio−Gel）P6を有するカラム（0.6×240cm）
で、１％酢酸中（トリフルオルエタノール10％）
中で差当り、酸化されたインシユリン−Ｂ−鎖
（分子量：3495）に関する保留量を測定し、引続
き。合成チモシン−α1をクロマトグラフイにか
けた。これは、この分子量（3107）に相応する溶
離液量で、カラムから出た（に対する収率90
％）。アミノ酸分析（計算値括孤内：6NHCl／
110℃／24、48、96時間；Asp4.11(4)、Thr2.86
(3)、Ser2.70(3)、Glu5.89(6)、Lys3.98(4)Ile0.97(1)
、
Leu1.00(1)、Ala3.05(3)、Val2.97(3)。薄層クロマ
トグラム（シリカゲルメルク60F−254；0.25
mm）；Rf＝0.16（ｎ−ブタノール／ピリジン／氷酢
酸／水５：５：１：４（Ｖ／Ｖ））単一。

〔α〕²⁵ _o：−96゜（579nm）。

−201.7゜（435nm）、−242.5゜（408nm、−338.5゜
（365nm）、−587.0゜（313nm）、Ｃ＝水中で0.083。

この合成チモシン−α1は、リンパ細胞刺激試
験、Ｅ−ロゼツト−テスト（Ｅ−Rosetten−
Test）及びミトゲン−テスト（mitogen−Test）
で生物学的活性であることが立証された。