JP4629033B2

JP4629033B2 - チモシンα１によるアスペルギルス感染の治療

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Publication number: JP4629033B2
Application number: JP2006509423A
Authority: JP
Inventors: ラシ，グイード; ガラシ，エンリコ; ビストーニ，フランチェスコ; ロマーニ，ルイジーナ; ディ・フランチェスコ，パオロ
Original assignee: Sciclone Pharmaceuticals LLC
Current assignee: Sciclone Pharmaceuticals LLC
Priority date: 2003-03-28
Filing date: 2004-03-29
Publication date: 2011-02-09
Anticipated expiration: 2024-03-29
Also published as: UA80870C2; US8389680B2; NO20054912D0; PL1613340T3; JP2006521406A; NZ542900A; KR101089145B1; EP1613340B1; EA200501414A1; ATE467422T1; CA2520400C; WO2004087067A2; NO20054912L; AU2004226403B2; US20120295840A1; DK1613340T3; MXPA05010391A; EP1613340A2; CA2520400A1; AU2004226403A1

Description

関連出願の相互参照
本願は、２００３年３月２８日出願の仮出願第６０／４５７，９１１号の利益を主張する。

発明の分野
この発明は、真菌感染の治療に関する。特定的には、この発明は、骨髄移植に関連した侵入性アスペルギルス症といったアスペルギルス感染の治療および予防に関する。

発明の背景
侵入性アスペルギルス症（ＩＡ）は、菌糸の侵入、肺組織の破壊そして他の臓器への播種を特徴とし、同種骨髄移植（ＢＭＴ）における院内肺炎および死亡の両方の最も大きな原因であり、その推定感染率は５〜１０％、関連の死亡率は９０〜１００％である。歴史的に、ＩＡについての最も重要な危険因子は好中球減少であったため、骨髄前駆体での再構成が同種ＢＭＴのマウスモデルでのＩＡに対しての防御を提供してきた。しかしながら、ＢＭＴ被移植者におけるＩＡの疫学に関する最近の研究においては、好中球減少に関係する感染の減少および「遅発型（late-onset）」感染の増加、そしてこれに伴い対宿主性移植片病の発生が示されている。

アスペルギルス感染の治療方法が当該技術で必要とされている。

発明の概要
この発明に従うと、哺乳動物におけるアスペルギルス感染を治療または予防するための方法であって、抗真菌性の有効量のチモシンα１（thymosin alpha 1：ＴＡ１）を含む医薬組成物を上記哺乳動物に投与するステップを含む。

発明の詳細な説明
臨床的および実験的証拠では、ＩＡの抑制においてＴｈ１細胞反応の有する役割が示唆されている。樹状細胞（ＤＣ）が、インビボおよびインビトロで真菌に対するＴｈ１初回抗原刺激（priming）を命令する。真菌抗原に対する適当なＴ細胞応答を命令する肺ＤＣの能力は、Toll様受容体（ＴＬＲ）を通じてのシグナリングを含む局所的な免疫制御事象から影響を受ける場合があることが証拠によって示されている。ＤＣは、免疫療法およびワクチン開発における将来有望な介入のターゲットである可能性があり、医薬品による介入についての関心は「アジュバント」の方へとシフトしている。感染と戦うよう最適化された適当な種類の応答を刺激するとともに免疫抑制の各状況下で有効である能力のあるアジュバントであれば有利である。

チモシンα１（ＴＡ１）は、天然の胸腺ペプチドである。ＴＡ１は、合成２８−アミノ酸ペプチドの形態において、或る種のウイルス感染の治療のために単剤療法としてまたはインターフェロンαとの組合せで全世界規模で臨床試験が行なわれている。ＴＡ１のさらなる適応として、或る種の免疫不全、悪性病変およびＨＩＶ／ＡＩＤＳの治療が挙げられる。ＴＡ１の合成ポリペプチドの作用の仕組みは、完全に理解されてはいないが、主にＴ
細胞機能の増強を中心とするその免疫調節活動に関係すると考えられている。生得免疫系における細胞に対する免疫調節機能、たとえばマクロファージにおける有糸分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）および遺伝子発現を活性化する能力などから、ＴＡ１は、ＤＣをアスペルギルスに対するＴｈ１初回抗原刺激へと活性化する能力のあるアジュバントであると発明者は考えてきた。この発明は、アスペルギルス感染の治療であって、ＴＡ１が、ＴＬＲを通じてのシグナリングによって抗真菌Ｔｈ１初回抗原刺激へとＤＣを活性化し得るというものを提供する。

この発明は、アスペルギルスに感染した哺乳動物を治療するための方法であって、抗真菌性の有効量のＴＡ１を上記哺乳動物に投与するステップを含むものを提供する。好ましい一実施の形態においては、ＴＡ１は、侵入性アスペルギルス症（ＩＡ）に対して有効である。ＴＡ１の上記有効用量は、Ｔｈ１細胞促進サイトカインを産生するように樹状細胞を活性化するのに十分なものとする。真菌感染を治療するための好ましい用量は、１日当り２００〜４００マイクログラム／ｋｇ体重の範囲内である。好ましい一実施の形態においては、上記哺乳動物は免疫不全の宿主、特にヒトである。当該方法は、特に免疫不全の患者、具体的には骨髄移植の被移植者である患者の治療に有用である。

この発明はまた、哺乳動物におけるアスペルギルス感染を予防するための方法であって、抗真菌性の有効量のＴＡ１を上記哺乳動物に投与するステップを含むものを提供する。この発明は、特に、免疫不全の宿主でのＩＡの予防に有用である。好ましい一実施の形態においては、当該方法は、免疫不全の患者、具体的には骨髄移植の被移植者である患者における上記感染を予防する。ＴＡ１の上記有効用量は、Ｔｈ１細胞促進サイトカインを産生するように樹状細胞を活性化するのに十分なものとする。真菌感染を予防するための好ましい用量は、１日当り２００〜４００マイクログラム／ｋｇ体重の範囲内である。

いかなる特定の理論にも縛られないが、この発明は、アスペルギルス感染に対する治療または予防のためのＴＡ１の新たな免疫制御活性を発見したことに基づいている。ＴＡ１は、ＭｙＤ８８依存の経路を通じてさまざまな種類のＤＣにおけるＴｈ１促進サイトカインＩＬ−１２ｐ７０、ＩＬ−１０およびＩＦＮ−αの産生を促進すると考えられる。

ＴＬＲトランスフェクト細胞においては、ＴＡ１はＴＬＲ９シグナリングを直接活性化すると考えられるが、このことはＴＬＲ２シグナリングには当てはまらず、後者は該当するリガンドに応答して増強されると考えられる。したがって、ＴＡ１は、ＴＬＲシグナリングを直接的または間接的に活性化すると考えられる。ＴＡ１は、ＩＬ−１２ｐ７０の産生のためには骨髄樹状細胞（ＭＤＣ）でのＴＬＲ２依存の経路を用い、ＩＦＮ−αおよびＩＬ−１０の産生のためには形質細胞様樹状細胞（ＰＤＣ）でのＴＬＲ９−依存の経路を用いるであろうことがデータから示唆されている。

ＤＣによるＩＬ−１０の産生は、記憶保護的な抗真菌免疫の一構成要素であり得るため、ＤＣおよび／または異なるＤＣサブセットにおけるＩＬ−１２／ＩＬ−１０の産生の平衡を保つことが、アスペルギルス症におけるＴＡ１のアジュバント活性の本質そのものの理由であり得る。

ＢＭＴマウスモデルにおいては、アスペルギルス感染後におけるＴＡ１治療の結果、ＣＤ４⁺およびＣＤ８⁺細胞が増加するとともに、好中球の総数が増加した。ＴＡ１での治療後には、Ｔｈ１細胞（ＩＦＮ−γを産生）の頻度は増加したが、一方でＴｈ２細胞（ＩＬ−４を産生）は減少した。

重要なことに、アスペルギルスに感染したＢＭＴマウスをＴＡ１で治療した結果、肺内の真菌成長が用量に応じて減少し、より高い用量においては、感染の完治をもたらすこと
ができた。ＴＡ１はまた、アンフォテリシンＢの治療効力を増大させることができた。

ＤＣに対するＴＡ１の効果は、その抗アポトーシス活性と一致する。ＤＣは、免疫病理、免疫および自己免疫間で平衡を保つ作用において中心的なものであり、かつＴＬＲ９を通じてのＰＤＣシグナリングは胸腺内に存在するので、ＤＣ機能を調節する能力から、ＴＡ１が、ＴＬＲの利用によって作用する生得および適応免疫系の内因性制御物質であることが示される。ここから、ＩＦＮ−αを産生するＰＤＣが中心的な役割を果たすと考えられる、或る種ののウイルス感染でのＴＡ１の治療処方のための或る原理が与えられる。これらＰＤＣにおけるＩＦＮ−αの産生には、ＴＬＲ９が本質的に必要とされる。さらに、ＰＤＣは、造血細胞移植後の免疫応答にも関与すると考えられ、ここからとりわけ、ＢＭＴ哺乳動物での免疫再構成におけるＴＡ１の有益な効果が説明され得る。

ＴＬＲは、生得免疫系を活性化することで、適応免疫系を支援するのみならず、直接的な抗菌エフェクター活性のためにもなると考えられる。ＴＡ１は、アスペルギルスに対するＴｈ１初回抗原刺激へとＤＣを活性化するとともに、エフェクター好中球を抗真菌状態にすると考えられるので、これはＴＡ１による真菌感染の治療での有益な効果をさらに示している。

アスペルギルスは、免疫不全の宿主に棲み付く腐生真菌であるという点で独特の性質を有する。この発明は、細胞媒介免疫における細胞および経路の意図的な標的化を提供してアスペルギルスに対する抵抗力を増加させるものであり、ここでＴＡ１は、ＴＬＲ経路の利用によって真菌に対する適当なＴｈ１反応をプログラミングするアジュバントである。

この発明について以下の実施例によりさらに説明を行なうが、これは限定的なものと解釈されるべきではない。

動物
メス、８〜１０週齢のＢＡＬＢ／ｃおよびＣ５７ＢＬ６マウスは、チャールズ・リバー（Charles River）からのものとした。ＮＯＤ／ＳＣＩＤは、ザ・ジャクソン（The Jackson）からのものとした。Ｃ５７ＢＬ６の環境で育てられた、同型接合のＴＬＲ２、ＴＬＲ９およびＭｙＤ８８欠損マウス、および、ＢＡＬＢ／ｃの環境で育てられた、同型接合のＩＦＮ−γおよびＩＬ−４欠損マウスの繁殖対を、特定病原体のない条件下で繁殖させた。

微生物感染および治療
アスペルギルス・フミガトゥス（A. fumigatus）に感染させるために、分生子２×１０⁷個／２０マイクロリットル塩水の懸濁液を３日間続けてマウスに鼻腔内注入した。肺内の真菌成長の定量化にはキチン質試験が用いられた。キチン質の含有量は、臓器当りでグルコサミンのマイクログラムとして表わされた。非感染マウスの肺のグルコサミン含有量が陰性対照実験として用いられ、グルコサミン０．８０〜２．２５マイクログラム／臓器の範囲内であった。肺を摘出して直ちにホルマリンで固定し、組織分析できるようにした。パラフィンに埋込まれた組織の切片（３〜４ミクロン）を周期的な酸シッフ法で染色した。チモシンα１（ＴＡ１）およびスクランブルされたポリペプチドは、標準的なカブトガニ細胞分解産物試験による、内毒素レベルが０．０３ｐｇ／ｍｌ未満の純化した無菌凍結乾燥アセチル化ポリペプチドである。配列は以下のとおりであった。Ａｃ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｏ（チモシンα１）およびＡｃ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅ
ｒ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−ＯＨ（ｓチモシンα１）。これらを凍結乾燥した粉末を無菌水で戻した。

治療は以下のとおりとした。ＢＭＴマウスにおいて、さまざまな用量で腹腔内投与されるＴＡ１、４００マイクログラム／ｋｇで腹腔内投与されるｓチモシンα１、または２５０マイクログラム／ｋｇで静脈内に投与されるヒト組換Ｇ−ＣＳＦを、骨髄注入の日から始めて毎日与え、感染させさらに３日間継続した。アンフォテリシンＢは、感染を伴なって、腹腔内投与で４０００マイクログラム／ｋｇの用量で３日間毎日与えた。この用量であれば、ＩＡはシクロホスファミド処置マウスにおいて治癒されるであろう。１５０ｍｇ／ｋｇで腹腔内投与されるシクロホスファミドは感染の１日前に与えられた。シクロホスファミド処置マウスにおいて、４００マイクログラム／ｋｇのＴＡ１を、感染の日から始めて５日間続けて腹腔内に与えた。

感染の１日前および後に、静脈内で１ｍｇのＧｒ−１中和ＲＢ６−８Ｃ５抗体で処置することで好中球枯渇が得られた。この処置によって、肺の好中球の数は劇的に減少したが、このことはＤＣの数については当てはまらなかった（処置前および処置後で５〜６×１０⁵のＣＤ１１ｃ⁺、ＭＨＣクラスＩＩ⁺、Ｆ４８０細胞）。対照実験のマウスは、同等の量の純化したラットＩｇＧ２ｂを受けた。シクロホスファミドでの処置の１日後に肺細胞をＦＡＣＳ分析したところ、重大で長期間（最長５日間）にわたる白血球減少が見られた。Ｆ４８０⁺細胞（約２０％）のパーセンテージ、およびＣＤ１１ｃ⁺、ＭＨＣクラスＩＩ⁺、Ｆ４８０−ＤＣ（＜３％）のパーセンテージは処置によって影響を受けなかった。

ＴＬＲリガンド
チモサン（Zymosan）は、サッカロマイセス・セレヴィシアエ（Saccharomyces cerevisiae）からのものとし、リポテイコ酸（ＬＴＡ）はスタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）から、そしてリポ多糖（ＬＰＳ）はサルモネラ・ミネソタ（Salmonella Minnesota）Ｒｅ５９５からのものとした。ＣｐＧオリゴヌクレオチド１８２６および２００６は、過去に実績のある免疫刺激配列であった。

ＢＭＴマウスの作製
Ｃ５７ＢＬ６マウスを致死量の９Ｇｙに晒し、ＢＡＬＢ／ｃマウスからのＴ細胞枯渇ドナー細胞を注入した。９５％超のマウスが生存し、脾臓の細胞でのドナー型ＭＨＣクラスＩ抗原発現で見られるような安定のドナー型造血キメラ現象を呈した。

樹状細胞の分離および培養
ＣＤ１４⁺単核細胞から磁気細胞分離で血液ＣＤ１１ｃ⁺骨髄ＤＣ（ＭＤＣ）を作製し、５０ｎｇ／ｍｌｒヒトＧＭ−ＣＳＦおよび２００Ｕ／ｍｌｒヒトＩＬ−４の存在下で、１０％のウシ胎仔血清、５０マイクロモルの２−メルカプトエタノール、ピルビン酸ナトリウム（１ｍＭ）、２ｍＭのＬ−グルタミン、ＨＥＰＥＳ（１０ｍＭ）、および５０マイクログラム／ｍｌのゲンタマイシンを含むイスコーブ（Iscove）変性培地において５日間培養した。１０００ｎｇ／ｍｌ三量体ヒトＣＤ４０リガンド−ロイシン−ジッパー融合タンパク質で未熟ＭＤＣを２４時間培養して成熟ＤＣを得た。ＢＤＣＡ−４分離キットを用いてＣＤ１２３⁺形質細胞様ＤＣ（ＰＤＣ）を分離した。ＣＤ１２３⁺細胞の純度は＞９６％であった。

成熟ＰＤＣを得るために、上と同様に三量体ヒトＣＤ４０リガンドおよび１０ｎｇ／ｍｌＩＬ−３で未熟ＤＣを培養した。ＦＡＣＳ分析から、ＭＤＣがＣＤ１ａ⁺、ＣＤ１１ｃ⁺、ＣＤ１１ｂ⁺、ＣＤ４⁺、ＣＤ１４^lowおよびＣＤ８^-であることを特徴とするのに対し、ＰＤＣはＣＤ１２３^bright、ＣＤ４⁺、ＣＤ４５ＲＡ⁺およびＣＤ１１ｃ^-であること
がわかった。ＨＬＡクラスＩＩ、ＣＤ８０およびＣＤ８６の発現は、未熟ＤＣおよび成熟ＤＣの両方で高かった。磁気細胞分離によってマウス肺ＣＤ１１ｃ⁺ＤＣ（ＣＤ８αについて５〜７％陽性、Ｇｒ−１について３０〜３５％陽性）を分離した。

貪食作用について、ＤＣを１００ｎｇ／ｍｌのＴＡ１に対して予め６０分間晒した後、さらに６０分間アスペルギルス分生子とともに３７℃でインキュベートした。インターナリゼーションのパーセンテージを算出し、写真撮影した。機能成熟およびサイトカイン決定を評価する際には、純化したＤＣをイスコーブ培地（血清成分および内毒素による非特異的な活性化を避けるために血清は伴わずポリミキシンＢを伴う）で再懸濁させ、単独でまたはＴＬＲリガンドもしくは非オプソニン化アスペルギルス分生子とともに、１００ｎｇ／ｍｌのＴＡ１を２４時間拍動させた。

表現型分析
試料をＦＩＴＣまたはＰＥ複合ラット抗マウス抗体で反応させることによって、細胞表面表現型を評価した。無関係の、アイソタイプ（hisotype）を一致させた抗体を対照実験として用いた。

抗真菌エフェクター活性
貪食作用を決定する際には、気管支肺胞マクロファージおよび周辺の好中球を１００ｎｇ／ｍｌのＴＡ１に対して予め６０分間晒し、非オプソニン化アスペルギルス分生子とともに３７℃で６０分間インキュベートした。これに加え、コロニー形成単位の数と、殺分生子活性と呼ばれるコロニー形成単位阻害のパーセンテージ（平均±ＳＥ）とを求めることによって、殺分生子活性を評価した。

ＨＥＫ２９３トランスフェクト細胞でのアッセイ
野生型または、ヒトＴＬＲ２、ＴＬＲ９およびＴＬＲ４／ＣＤ１４２７を安定にトランスフェクトした、ヒト胚腎臓細胞系ＨＥＫ２９３を、１０％ＦＣＳ、ＨＥＰＥＳ（１０ｎＭ）、Ｌ−グルタミン（２マイクログラム／ｍｌ）およびゲンタマイシン（５０マイクログラム／ｍｌ）を補った低グルコースのダルベッコ（Dulbecco）変性イーグル（Eagle）培地内で培養した。さらに、形質転換体にピューロマイシン（１００マイクログラム／ｍｌ）を補った。刺激実験を行なうために、細胞を、１２ウェル組織培養プレートにおいて、細胞３〜５×１０⁵個／ウェルの密度で一晩中培養した。細胞を、単独またはＴＬＲリガンドとともに５時間１００ｎｇ／ｍｌのＴＡ１に通して刺激し、それから上澄み中でＩＬ−８の産生を評価した。

サイトカインおよびスポット酵素結合免疫吸着剤（ＥＬＩＳＰＯＴ）アッセイ
培養上澄みにおけるＴＮＦ−α、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＦＮ−αおよびＩＬ−８のレベルをキットＥＬＩＳＡで判定した。試験の検出限界（ｐｇ／ｍｌ）は、ＴＮＦ−αについては＜３（ヒト）および＜３２（マウス）、ＩＬ−１０については＜１２（マウス）および＜５（ヒト）、ＩＬ−１２ｐ７０については＜１６（マウス）および＜３（ヒト）、そしてＩＬ−８については＜２５（ヒト）であった。ヒトＩＦＮ−αについては＜３ｎｇ／ｍｌであった。サイトカイン産生細胞の個数を数えるために、肺からの純化したＣＤ４⁺Ｔ細胞およびＤＣに対してＥＬＩＳＰＯＴ試験を採用した。

フローサイトメトリー分析による増殖アッセイ
１０マイクログラム／ｍｌのＣｏｎＡまたは肺ＤＣの存在下の熱不活性化分生子で刺激した肺ＣＤ４⁺Ｔリンパ球の増殖を、ＣＦＳＥ５（６）−カルボキシフルオレセイン・ジアセタート・サクシニミジルエステルで標識することによって評価した。

逆転写酵素（ＲＴ）−ＰＣＲ
初期の実験で示唆されているように、未熟ＤＣを１００ｎｇ／ｍｌのＴＡ１で予め６０分間処置してから非オプソニン化アスペルギルス分生子に対して６０分間晒し、そこから全ＲＮＡを抽出した。順および逆ＰＣＲプライマーで、そしてマウスおよびヒトＴＬＲおよびＨＰＲＴに用いられるサイクルで、ｃＤＮＡの合成およびＰＣＲを実行した。合成されたＰＣＲ産生物を２％アガロースゲルにおいて電気泳動により分離し、臭化エチジウム染色によって視覚化した。

ｐ３８およびＮＦ−ｋＢ活性化の分析
肺ＤＣにおいて、ｐ３８およびＮＦ−ｋＢを、アスペルギルス分生子および／または１００ｎｇ／ｍｌのＴＡ１に対して３７℃で２０分間晒すことによって活性化した。製造元の指示により、細胞溶解物のブロットは、ｐ３８ＭＡＰＫについてのリン酸化されていない形態または二重にリン酸化された（Ｔｈｒ−１８０／Ｔｙｒ−１８２）ｐ３８ＭＡＰＫのいずれかを認識するウサギポリクローナルＡｂｓか、ＲｅｌＡに特異的なＡｂｓ、ヒトＮＦ−ｋＢの６５ｋＤａＤＮＡ結合サブユニットとともにインキュベートし、これにワサビペルオキシダーゼ複合ヤギ抗ウサギＩｇＧが続いた。ブロットは、高感度化学発光検出キットで現像された。このブロットのコダック（Kodak）ＲＸフィルムに対する露出後、バンドが視覚化された。各々のレーンにつき類似のタンパク質のローディングを確実にするために、リンのブロットを剥がして膜をｐ３８およびＮＦ−ｋＢに対しＡｂｓで再び精査した。

チモシンα１（ＴＡ１）が樹状細胞（ＤＣ）を活性化
マウスＤＣは、インビトロおよび感染の部位でアスペルギルスを貪食することが以前から示されている。スクランブルされたペプチドでなくＴＡ１が、（菌糸よりもむしろ）非オプソニン化分生子の貪食、共刺激抗原発現およびサイトカイン産生へと肺ＤＣを活性化する。これとは対照的に、アスペルギルス分生子だけでは、ＤＣの活性化を誘導するのに十分な刺激を表わしておらず、ＴＡ１に対する組合せの露出によって、ＭＨＣクラスＩＩ抗原、ＣＤ８６およびＣＤ４０分子の発現、ならびにＩＬ−１２ｐ７０産生ＤＣの頻度、が顕著に増加した。興味深いことに、ＩＬ−１２ｐ７０産生ＤＣは、チモシンのみでも増加した。ＴＡ１はまた、ヒトＭＤＣおよびＰＤＣサブセットを活性化する。未熟ＤＣおよび成熟ＤＣの両方のサブセットが分生子を貪食する。ＴＡ１は、未熟ＤＣの貪食活動を増大させ、ＤＣ形態に影響を与え（未熟ＭＤＣにおいてより多くの細胞質突起が検出され得る）、分生子に応答してＨＬＡクラスＩＩ抗原および共刺激分子発現をアップレギュレートする。ＴＡ１は、未熟ＭＤＣによる分生子およびチモサンに対する応答としてのＩＬ−１２ｐ７０の放出を大幅に増加させるとともに、未熟ＰＤＣによる分生子に対する応答としてのＩＬ−１０の放出を大幅に増加させる。ＩＮＦ−αは、ＰＤＣにより、ＴＬＲ９リガンドＣｐＧに対する応答として産生され得るが、この産生はＴＡ１によって大幅に増強される。これとは対照的に、スクランブルされたペプチドは、クラスＩＩ抗原および共刺激分子発現をアップレギュレートすることも、分生子に対する応答としてのＤＣによるサイトカイン産生を誘導することもできなかった。

総合的に、これらのデータから、ＤＣの活性化および機能においてＴＡ１が有する新しく従前規定されていなかった免疫調整の役割が示されている。

ＴＡ１がＴＬＲシグナリングを通じてＭｙＤ８８依存の経路を活性化
ＴＬＲシグナリングはアスペルギルス分生子に応答して起こっており、これは真菌に対する機能的応答を媒介する。ＴＡ１は、マウスＤＣにおけるＴＬＲ２、ＴＬＲ５およびＴＬＲ９の発現を強力に活性化する。ＴＬＲ２およびＴＬＲ９は、分生子およびＴＡ１に対する組合せの露出の際になお活性化されるのに対し、ＴＬＲ５の発現については、その発現は阻害される。ここでもまた、スクランブルされたペプチドは、単独でまたは分生子への応答としてＴＬＲ２およびＴＬＲ９の発現を活性化させることができなかった。

ＴＬＲ依存のシグナリングを活性化させるＴＡ１の能力は、ＴＬＲ２、ＴＬＲ９およびＴＬＲ４／ＣＤ１４でトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞における研究において、単独でまたは該当するＴＬＲリガンドとともにＴＡ１に対する応答として起こるＩＬ−８の産生を判断することによって確認されている。このようなＨＥＫ２９３細胞においては、ＴＡ１は、単独でまたはＴＬＲ９リガンドＣｐＧに対する応答として起こる、ＴＬＲ９トランスフェクト細胞によるＩＬ−８の産生を大幅に増大させた。しかしながら、ＴＡ１は、ＴＬＲ２トランスフェクト細胞のみによるＩＬ−８の産生を刺激せず、チモサンに応答してこれらセルにおいてＩＬ−８の産生をわずかに増大させた。さらに、ＴＡ１は、単独でまたはＴＬＲ４リガンドＬＰＳに対する応答としてＴＬＲ４／ＣＤ１４トランスフェクト細胞においてＩＬ−８を誘導しなかった。ＴＡ１はまた、これら微生物ＴＬＲリガンドに対する応答としてＩＬ−１２ｐ７０およびＩＬ−１０を産生するマウスＤＣの能力に影響を与える。ＴＡ１は、ポリ（Ｉ：Ｃ）またはＬＰＳ（ＴＬＲ４）への応答としてのサイトカイン産生に影響を与えず、ＴＡ１はチモサンおよびＬＴＡ（ＴＬＲ２）およびＣｐＧ（ＴＬＲ９）による刺激の後にＩＬ−１２ｐ７０の産生を大幅に増加させ、ＩＬ−１０の産生を減少させる。したがって、ＴＡ１は、ＴＬＲ９を通じて直接シグナリングするとともに該当するリガンドによってＴＬＲ２のシグナリングを増強することができると考えられる。

ＮＦおよびｐ３８ＭＡＰＫの活性化はともに、ＴＬＲ誘導遺伝子発現を引起こす際の早期の事象であり、ＴＡ１は、ＭＡＰＫ導入経路を活性化させることが以前から示されている。ＴＡ１は、ＴＬＲ誘導経路におけるその関与の支援の際、ＮＦ−ｋＢの核転座およびｐ３８のリン酸化を誘導した（これは、分生子のみ、スクランブルされたペプチドまたはスクランブルされたペプチドおよび分生子、では刺激されなかった）。さらに、ＮＦ−ｋＢ核転座（ＳＮ５０）またはｐ３８ＭＡＰＫ（ＳＢ２０２１９０）の阻害剤は、ＤＣにおけるＴＡ１の影響を除去する。

骨髄分解因子８８（ＭｙＤ８８）は、ＮＦ−ｋＢおよびＭＡＰＫの活性化、ならびに、ＴＬＲによるシグナリングの際のＩＬ−１２ｐ７０の産生において本質的なアダプタタンパク質の１つである。ＩＬ−１２ｐ７０の産生に対するＴＡ１および分生子の影響、ならびにＩＬ−１０の産生に対するＴＡ１の影響は、ＭｙＤ８８欠損マウスにおいて劇的に除去された。したがって、ＭｙＤ８８依存の経路は、インビトロにおけるＴＡ１の作用の仕組みに本質的な役割を果たしていると考えられる。ＭｙＤ８８依存の経路がインビボでのＴＡ１作用にも本質的な役割を果たしているかどうかを判断するために、局所的な真菌の成長を野生型の感染後に評価した。

アスペルギルスを持つＴＬＲ２、ＴＬＲ９またはＭｙＤ８８欠損マウス
ＴＬＲ２およびＴＬＲ９欠損マウスにおける真菌の成長は、野生型マウスのそれと同等であり、チモシン治療の際に同様に減退する。ＭｙＤ８８欠損マウスにおいても、真菌成長は同等であるが、これらのマウスにおいてはＴＡ１での治療の際に減退しなかった。よって、或る程度ＴＬＲの使用における冗長があるにもかかわらず、ＭｙＤ８８依存のシグナリング経路は、インビトロおよびインビボの両方でＴＡ１の活動に本質的であると考えられる。

ＴＡ１はＩＡに対してＢＭＴマウスを防御する
肺内の真菌成長の減少と並行した生存率の上昇でわかるように、スクランブルされたペプチドでなくＴＡ１での治療によって、ＩＡを持つＢＭＴマウスを治癒できたと考えられる。防御に対する効果は用量に依存し、完全な防御（６０日超の生存）は、２００〜４００マイクログラム／ｋｇのＴＡ１で治療されたマウスで達成され、アンフォテリシンＢよりも優れている。さらに、両方の薬剤で治療されたマウスの生存率上昇および真菌負荷の
減少に示されるように、ＴＡ１はアンフォテリシンＢの治療効力を増加させる。さらには、ＴＡ１は肺の病状を減少させる。感染したマウスの肺切片においては、肺の実質組織に浸潤した多数のアスペルギルス菌糸の存在が示され、気管支壁の損傷および壊死の重大な兆候があるとともに炎症細胞補充が少なかった。対照的に、これらの特徴は、ＴＡ１で治療されたマウスには認められず、その肺は炎症細胞の治癒浸潤物で特徴付けられ、真菌成長および気管支壁破壊の証拠がなかった。したがって、ＴＡ１は、ＩＡにおける治療効力を有し得て、ＢＭＴ状況において活動が低下することが知られている抗真菌薬との組合せで有益であり得る。

ＴＡ１は、ＩＡを持つマウスにおける骨髄およびＴｈ１細胞回復を加速させる
ＴＡ１治療後、循環するリンパ球および好中球の絶対数は大幅に増加する。より重要なことに、血中好中球レベルでは、アスペルギルス症に対する感染性は予測されない。しかしながら、細胞蛍光測定分析においては、肺ＣＤ４⁺およびＣＤ８⁺細胞ならびに好中球の数は、ＴＡ１でのＢＭＴマウスの治療の際に大幅に上昇した。これら肺ＣＤ４⁺Ｔリンパ球は、抗原に特異的な増殖およびＩＦＮ−γ産生によって示されるように機能的に活性である。ＴＡ１で治療されたマウスにおいては、Ｔｈ１細胞（ＩＦＮ−γを産生）の頻度はより高く、Ｔｈ２細胞（ＩＬ−４を産生）はより低い。さらに、エフェクター食細胞の抗真菌活性に関し、ＴＡ１で治療されたマウスにおいてはマクロファージおよび好中球両方の殺分生子活性がより高くなる。したがって、ＴＡ１は、ＤＣ成熟を促進するばかりでなく、迅速な真菌の貪食および殺菌へと局所的なエフェクター細胞を活性化させると考えられる。

たとえばマウスにおける好中球の回復を加速させることが知られている用量のＧ−ＣＳＦでの治療による、好中球減少からの回復だけでは、ＴＡ１で得られるのと同等の程度の抗真菌抵抗を媒介するには十分ではない。同様に、Ｔ細胞またはＩＦＮ−γ産生Ｔｈ１細胞を持たないマウスにおけるＴＡ１の治療効力は、大幅な好中球の回復にもかかわらず、それほど大きいものではない。さらに、ＩＬ−４欠損マウスで起こるように、増加したＴｈ１細胞の存在下においてＴＡ１の治療効力の上昇が達成される。したがって、好中球は、適応Ｔｈ１依存の免疫がない場合に抗真菌抵抗を媒介することにおいて本質的な役割を果たすにもかかわらず、ＴＡ１での治療で得られると考えられるような真菌に対する完全な防御の状態の達成は、生得エフェクター食細胞と防御Ｔｈ１細胞との協調的な作用に依存し得る。

Claims

抗真菌性の有効量のチモシンα１（thymosin alpha 1：ＴＡ１）を含む、哺乳動物におけるアルペルギルス感染を治療または予防するための医薬組成物。
前記ＴＡ１は、Ｔｈ１細胞促進サイトカインを産生するように樹状細胞を活性化させるのに十分な用量で投与されるものである、請求項１に記載の医薬組成物。
前記ＴＡ１は、２００〜４００マイクログラム／ｋｇ体重／日の用量で投与されるものである、請求項１に記載の医薬組成物。
前記哺乳動物は免疫不全の宿主である、請求項１に記載の医薬組成物。
前記哺乳動物はヒトである、請求項４に記載の医薬組成物。
前記ヒトは骨髄移植の被移植者である、請求項５に記載の医薬組成物。
前記ＴＡ１は、Ｔｈ１細胞促進サイトカインを産生するように樹状細胞を活性化させるために投与されるものである、請求項５に記載の医薬組成物。
前記ＴＡ１は、２００〜４００マイクログラム／ｋｇ体重／日の用量で投与されるものである、請求項５に記載の医薬組成物。
少なくとも１つの追加の抗真菌剤とともに投与されるものである、請求項１に記載の医薬組成物。
前記追加の抗真菌剤はアンフォテリシンＢである、請求項９に記載の医薬組成物。
前記アンフォテリシンＢは、４０００マイクログラム／ｋｇ体重／日の用量で投与され
るものである、請求項１０に記載の医薬組成物。
前記アルペルギルス感染は、侵入性アルペルギルス症である、請求項１に記載の医薬組成物。