ES2345552T3

ES2345552T3 - Tratamiento de infecciones por aspergillus con timosina alfa 1.

Info

Publication number: ES2345552T3
Application number: ES04749495T
Authority: ES
Inventors: Guido Rasi; Enrico Garaci; Francesco Bistoni; Luigina Romani; Paolo Di Francesco
Original assignee: Sciclone Pharmaceuticals LLC
Current assignee: Sciclone Pharmaceuticals LLC
Priority date: 2003-03-28
Filing date: 2004-03-29
Publication date: 2010-09-27
Anticipated expiration: 2024-03-29
Also published as: CN100342907C; CY1110218T1; DE602004027127D1; CN1767847A; PT1613340E

Abstract

Uso de timosina alfa 1 (TA1) en una cantidad antifúngica eficaz en la fabricación de una composición farmacéutica para tratar o prevenir una infección por Aspergillus en un mamífero.

Description

Tratamiento de infecciones por Aspergillus con timosina alfa 1.

Referencia cruzada a solicitudes relacionadas

Esta solicitud reivindica el beneficio de la solicitud provisional 60/457.911, presentada el 28 de marzo de 2003.

Campo de la invención

La presente invención se refiere al tratamiento de infecciones fúngicas. En particular, la presente invención se refiere al tratamiento y la prevención de infecciones por Aspergillus tales como aspergilosis invasiva asociadas a transplantes de médula ósea.

Antecedentes de la invención

La aspergilosis invasiva (AI), caracterizada por invasión de hifas, destrucción del tejido pulmonar y diseminación a otros órganos, es la causa principal de neumonía nosocomial y muerte en transplante alogénico de médula ósea (TMO) con una tasa de infección estimada de 5 a 10% y una tasa de mortalidad asociada de 90 a 100%. El factor de riesgo más importante para AI ha sido históricamente la neutropenia, de tal modo que la reconstitución con progenitores mieloides ofrecía protección ante AI en un modelo de murino de TMO alogénico. Sin embargo, estudios recientes sobre la epidemiología de la AI en receptores de TMO han indicado una reducción en la infección relacionada con neutropenia y un aumento de la infección "de inicio tardío", simultáneamente a la aparición de la enfermedad del injerto frente a huésped.

Existe necesidad en la técnica de procedimientos de tratamiento de infección por Aspergillus.

Resumen de la invención

Según la presente invención, un uso médico para tratar o prevenir la infección por Aspergillus en un mamífero se refiere a una composición farmacéutica que comprende una cantidad antifúngica eficaz de timosina alfa 1 (TA1).

Descripción detallada de la invención

Las evidencias clínicas y experimentales sugieren un papel de la reactividad de células Th1 en el control de la AI. Las células dendríticas (CD) instruyen la sensibilización Th1 ante el hongo in vivo e in vitro. Las evidencias indican que la capacidad de las CD pulmonares de instruir las respuestas de linfocitos T apropiadas ante antígenos fúngicos puede verse afectada por eventos inmunorreguladores locales, incluyendo señalización a través de receptores de tipo Toll (TLR). Las CD pueden ser dianas prometedoras de intervención para inmunoterapia y desarrollo de vacunas, y desplazan el enfoque de la intervención farmacéutica hacia un "coadyuvante". Es ventajoso un coadyuvante que sea capaz tanto de estimular el tipo apropiado de la respuesta mejor adaptada para combatir la infección como de ser eficaz en condiciones de inmunosupresión.

La timosina alfa 1 (TA1) es un péptido tímico de origen natural. En forma de un péptido sintético de 28 aminoácidos, la TA1 está en ensayos clínicos de todo el mundo para el tratamiento de algunas infecciones víricas, como monoterapia o en combinación con interferón alfa. El tratamiento de algunas inmunodeficiencias, malignidades y VIH/SIDA son indicaciones adicionales para TA1. El mecanismo de acción de un polipéptido sintético de TA1 no se comprende completamente, pero se cree que está relacionado con sus actividades inmunomoduladoras, centradas principalmente en el aumento de la función de linfocitos T. Debido a su función inmunomoduladora sobre células del sistema inmunitario innato, incluyendo la capacidad de activar proteína cinasas activadas por mitógeno (MAPK) y la expresión génica en macrófagos, se ha considerado TA1 como un coadyuvante capaz de activar CD para sensibilización de Th1 ante Aspergillus. La presente invención proporciona un tratamiento de infecciones por Aspergillus en el que la TA1 puede activar CD para sensibilización Th1 antifúngica mediante señalización a través de TLR.

La presente invención proporciona un uso médico para tratar un mamífero infectado con Aspergillus, estando dicho uso relacionado con una composición farmacéutica que comprende una cantidad antifúngica eficaz de TA1. En una realización preferida, la TA1 es eficaz contra aspergilosis invasiva (AI). La dosis eficaz de TA1 es suficiente para activar células dendríticas para que produzcan citocinas promotoras de células Th1. La dosis preferida para tratar una infección fúngica está en el intervalo entre 200 y 400 microgramos/kg de peso corporal al día. En una realización preferida, el mamífero es un huésped inmunocomprometido, particularmente un ser humano. La composición farmacéutica es particularmente útil para tratar pacientes inmunocomprometidos, específicamente aquellos pacientes que son receptores de transplante de médula ósea.

La presente invención proporciona también un uso médico para prevenir una infección por Aspergillus en un mamífero, estando relacionado dicho uso con una composición farmacéutica que comprende una cantidad antifúngica eficaz de TA1. La invención es particularmente útil para prevenir AI en un huésped inmunocomprometido. En una realización preferida, la composición farmacéutica previene dicha infección en pacientes inmunocomprometidos, específicamente aquellos pacientes que son receptores de transplante de médula ósea. La dosis eficaz de TA1 es suficiente para activar células dendríticas para producir citocinas promotoras de células Th1. La dosis preferida para prevenir la infección fúngica está en el intervalo entre 200 y 400 microgramos/kg de peso corporal al día.

Sin desear quedar ligado a teoría alguna particular, se cree que la presente invención está basada en el descubrimiento de una actividad inmunoreguladora novedosa de TA1 para el tratamiento o la protección ante una infección por Aspergillus. La TA1 parece promover la producción de las citocinas promotoras de Th1 IL-12 p70, IL-10 e IFN-alfa en diversos tipos de CD a través de una ruta dependiente de MyD88.

En células transfectadas con TLR, la TA1 parece activar directamente la señalización de TLR9 pero no de TLR2, estando potenciada está última en respuesta a ligandos relevantes. Por lo tanto, la TA1 parece activar la señalización de TLR directa o indirectamente. Los datos sugieren que la TA1 puede usar la ruta dependiente de TLR2 en células dendríticas mieloides (CDM) para la producción de IL-12 p70 y la ruta dependiente de TLR9 en células dendríticas plasmacitoides (CDP) para la producción de IFN-alfa e IL-10.

Como la producción de IL-10 por CD puede ser un componente de la inmunidad antifúngica protectora de memoria, equilibrar la producción de IL-12/IL-10 en CD y/o en diferentes subconjuntos de CD puede ser una razón para la acción como coadyuvante de TA1 en aspergilosis.

En un modelo de ratón con TMO, el tratamiento con TA1 después de infección por Aspergillus condujo a un aumento de las células CD4^{+} y CD8^{+}, así como a un aumento de los neutrófilos totales. La frecuencia de células Th1 (productoras de IFN-gamma) aumentó, mientras que las células Th2 (productoras de IL-4) disminuyeron después del tratamiento con TA1.

De forma importante, el tratamiento de ratones con TMO infectados con Aspergillus con TA1 condujo a una reducción del crecimiento fúngico en los pulmones sensible a la dosis, y a las dosis superiores, era capaz de aumentar la eficacia terapéutica de la anfotericina B.

Los efectos de TA1 sobre CD son consistentes con su actividad antiapoptótica. Puesto que las CD son básicas en el equilibrio entre inmunopatología, inmunidad y autoinmunidad y que están presentes en el timo CDP de señalización a través de TLR9, la capacidad de modular el funcionamiento de CD indica que la TA1 es un regulador endógeno de los sistemas inmunitarios innato y adaptativo que actúa a través del uso de TLR. Esto proporciona un fundamento a la prescripción terapéutica de TA1 en algunas infecciones víricas, en las que las CDP productoras de IFN-alfa se considera que desempeñan un papel clave. Para la producción de IFN-alfa en estas CDP, se requiere esencialmente TLR9. Además, las CDP parecen participar también en las respuestas inmunitarias después de transplante de células hematopoyéticas, lo que puede explicar, entre otros, el efecto beneficioso de TA1 en la inmunoreconstitución en mamíferos con TMO.

Las TLR parecen activar el sistema inmunitario innato no sólo para ayudar al sistema inmunitario adaptativo, sino también para actividad efectora antimicrobiana directa. Puesto que la TA1 parece activar las CD para sensibilización Th1 ante Aspergillus, y también neutrófilos efectores a un estado antifúngico, esto indica además el efecto beneficioso en el tratamiento de infecciones fúngicas por TA1.

Aspergillus tiene una naturaleza única porque es un hongo saprofito que coloniza huéspedes inmunocomprometidos. La presente invención proporciona una orientación deliberada a células y rutas de inmunidad mediada por célula y aumenta la resistencia a Aspergillus, en la que TA1 es el coadyuvante que programa la reactividad Th1 apropiada ante el hongo a través del uso de la ruta TLR.

La invención se ilustra adicionalmente mediante el siguiente ejemplo, que no ha de considerarse como limitante.

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Ejemplo 1 Animales

Los ratones BALB/c y C57BL6 hembra de 8 a 10 semanas eran de Charles River. Los NOD/SCID eran de The Jackson. Parejas de reproducción de ratones deficientes en TLR2, TLR9 y MyD88 homocigóticos, criados en fondo C57BL6, y ratones deficientes en IFN-gamma e IL-4 homocigóticos, criados en fondo BALB/c se reprodujeron en condiciones específicas exentas de patógenos.

Infecciones por microorganismos y tratamientos

Para infección con A. fumigatus, se inyectó una suspensión de 2 x 10^{7} conidios/20 \mul de disolución salina por vía intranasal a los ratones durante 3 días consecutivos. Para la cuantificación del crecimiento fúngico en los pulmones se usó el ensayo de quitina. Se expresó el contenido de quitina como \mug de glucosamina por órgano. El contenido de glucosamina de los pulmones de ratones no infectados se usó como control negativo en el intervalo entre 0,80 y 2,25 \mug de glucosamina/órgano. Para análisis histológico, se extirparon los pulmones y se fijaron inmediatamente en formalina. Se tiñeron secciones (3 a 4 \mum) de tejidos embebidos en parafina con el procedimiento de ácido peryódico-Schiff. La timosina alfa 1 (TA1) y el polipéptido permutado se usaron en forma de polipéptidos acetilados liofilizados purificados estériles con niveles de endotoxina menores de 0,03 pg/ml en un ensayo de lisado de Limulus estándar. Las secuencias eran las siguientes: Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-IIe-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-O (timosina alfa 1) y Ac-Ala-Lys-Ser-Asp-Val-Lys-Ala-Glu-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Asp-Thr-Thr-Glu-Leu-Asp-Glu-Lys-Val-Glu-Val-Lys-Ala-Asn-Glu-OH (timosina alfa 1 p.). Se reconstituyeron sus polvos liofilizados en agua estéril.

Los tratamientos fueron los siguientes: en ratones con TMO, se suministraron diariamente TA1 administrada por vía intraperitoneal a diferentes dosis, timosina alfa 1 p. 400 \mug/kg administrada por vía intraperitoneal o G-CSF 250 \mug/kg recombinante humano administrado por vía intravenosa, empezando el día de infusión de MO, simultáneamente con la infección y continuando durante 3 días adicionales. Se suministró anfotericina B diariamente durante 3 días simultáneamente con la infección a una dosis de 4000 \mug/kg, administrada por vía intraperitoneal. Esta dosis curaría la AI en ratones tratados con ciclofosfamida. Se suministró ciclofosfamida 150 mg/kg administrada por vía intraperitoneal un día antes de la infección. En ratones tratados con ciclofosfamida, se suministró por vía intraperitoneal TA1 400 \mug/kg durante 5 días consecutivos empezando el día de la infección.

Se obtuvo el agotamiento de neutrófilos mediante tratamiento con 1 mg de anticuerpo RB6-8C5 neutralizante de Gr-1 por vía intravenosa un día antes y después de la infección. El tratamiento redujo drásticamente el número de neutrófilos pulmonares pero no el de CD (entre 5 y 6 x 10^{5} células F480 CD11c^{+}, MHC de clase II^{+} antes y después del tratamiento). Los ratones de control recibieron una cantidad equivalente de IgG2b de rata purificada. El análisis FACS de células pulmonares un día después del tratamiento con ciclofosfamida reveló una leucopenia profunda y duradera (durante hasta 5 días). Los porcentajes de células F480^{+} (aproximadamente 20%) y de CD F480 CD11c^{+}, MHC de clase II^{+} (<3%) no fueron afectados por el tratamiento.

Ligandos de TLR

El zimosano era de Saccharomyces cerevisiae, el ácido lipoteicoico (LTA) de Staphylococcus aureus y el lipopolisacárido (LPS) de Salmonella Minnesota Re 595. Los oligonucleótidos CpG 1826 y 2006 eran secuencias inmunoestimulantes probadas.

Generación de ratones con TMO

Se expusieron ratones C57BL6 a una dosis letal de 9 Gy y se les infundieron células donantes desprovistas de linfocitos T de ratones BALB/c. Más del 95% de los ratones que sobrevivieron mostraron quimerismo estable hematopoyético de tipo donante, como se reveló por la expresión de antígeno de MHC de clase I de tipo donante en células de bazos.

Aislamiento y cultivo de células dendríticas

Se generaron CD mieloides CD11c^{+} (CDM) a partir de células mononucleares CD14^{+} mediante clasificación celular magnética y se cultivaron durante 5 días en medio modificado de Iscove que contenía 10% de suero fetal bovino, 2-mercaptoetanol 50 \muM, piruvato de sodio (1 mM), L-glutamina 2 mM, HEPES (10 mM) y gentamicina 50 \mug/ml en presencia de rGM-CSF humano 50 ng/ml y rIL-4 humana 200 U/ml. Se cultivaron las CDM inmaduras durante 24 horas con proteína de fusión de ligando de CD40 humano trimérico-cremallera de leucina 1000 ng/ml para obtener CD maduras. Se aislaron CD plasmacitoides CD123^{+} (CDP) usando el kit de aislamiento BDCA-4. La pureza de las células CD123^{+} era > 96%.

Para CDP maduras, se cultivaron CD inmaduras con el ligando de CD40 humano trimérico como anteriormente e IL-3 10 ng/ml. El análisis FACS reveló que las CDP eran CD123^{brillantes}, CD4^{+}, CD45RA^{+} y CD11c^{-} en contraposición a las CDM caracterizadas por ser CD1a^{+}, CD11c^{+}, CD11b^{+}, CD4^{+}, CD14^{bajo} y CD8^{-}. La expresión de HLA de clase II, CD80 y CD86 era alta tanto en CD inmaduras como maduras. Las CD CD11c^{+} de pulmón de murino (entre 5 y 7% positivas de CD8-alfa y entre 30 y 35% positivas de Gr-1) se aislaron mediante clasificación celular magnética.

Para fagocitosis, se expusieron `reviamente las CD a 100 ng/ml de TA1 durante 60 minutos y se incubaron posteriormente a 37ºC con conidios de Aspergillus durante 60 minutos adicionales. Se calculó el porcentaje de internalización y se tomaron fotografías. Para evaluar la maduración funcional y la determinación de citocinas, se resuspendieron CD purificadas en medio de Iscove (sin suero pero con polimixina B para evitar la activación no específica por componentes del suero y endotoxina) y se sometieron a pulsos con TA1 100 ng/ml durante 24 horas sola o junto con ligados de TLR o conidios de Aspergillus no opsonizados.

Análisis fenotípicos

Se evaluó el fenotipo superficial celular haciendo reaccionar muestras con anticuerpos de rata dirigidos contra ratón conjugados con FITC o PE. Se usaron anticuerpos de isotipo coincidente no relacionados como control.

Actividad efectora antifúngica

Para determinar la fagocitosis, se expusieron previamente macrófagos broncoalveolares y neutrófilos periféricos a TA1 100 ng/ml durante 60 minutos y se incubaron a 37ºC con conidios de Aspergillus no opsonizados durante 60 minutos. Además, se evaluó la actividad conidiocida determinando el número de unidades de formación de colonias y el porcentaje de inhibición de las unidades de formación de colonias (media \pm DE), designado como actividad conoidiocida.

Ensayo con células HEK293 transfectadas

Se cultivó la línea celular de riñón embriónico humano HEK293, de tipo silvestre o transfectada establemente con TLR2, TLR9 y TLR4/CD1427 humano, en medio de Eagle modificado por Dulbecco bajo en glucosa suplementado con 10% de FCS, HEPES (10 nM), L-glutamina (2 \mug/ml) y gentamicina (50 \mug/ml). Se suplementaron adicionalmente los transfectantes con puromicina (100 \mug/ml). Para experimentos de estimulación, se cultivaron las células a una densidad de 3 a 5 x 10^{5} células/pocillos en placas de cultivo de tejido de 12 pocillos durante una noche. Se lavaron las células y se estimularon con TA1 100 ng/ml sola o conjuntamente con ligandos de TLR durante 5 h antes de la evaluación de la producción de IL-8 en los sobrenadantes.

Ensayo de inmunosorción ligado a enzima en mancha de citocina (ELISPOT)

Se determinaron los niveles de TNF-alfa, IL-10, IL-12 p70, IFN-alfa e IL-8 en sobrenadantes de cultivo mediante ELISA de kit. Los límites de detección (pg/ml) de los ensayos fueron <3 (humano) y <32 (murino) para TNF-alfa, <12 (murino) y <5 (humano) para IL-10, <16 (murino) y <3 (humano) para IL-12 p70 y <25 (humano) para IL-8. Para IFN-alfa humano, <3 ng/ml. Para la enumeración de las células productoras de citocina, se usó un ensayo ELISPOT con linfocitos T CD4^{+} purificados y CD de pulmones.

Ensayo de proliferación por análisis de citometría de flujo

Se evaluó la proliferación de linfocitos T CD4^{+} pulmonares estimulados mediante Con A 10 \mug/ml o conidios termoinactivados en presencia de CD pulmonares mediante marcado con diacetato de éster succinimidilo de 5(6)-carboxifluoresceína CFSE.

PCR de transcriptasa inversa (TI)

Se extrajo el ARN total de CD inmaduras pretratadas con TA1 100 ng/ml durante 60 minutos seguido de exposición a conidios de Aspergillus no opsonizados durante 60 minutos, como sugerían los experimentos iniciales. Se efectuaron las síntesis y PCR de ADNc con cebadores de PCR de codificación e inversos y los ciclos usados para TLR y HPRT humanos y de murino. Se separaron los productos de PCR sintetizados mediante electroforesis en gel de azarosa al 2% y se visualizaron mediante tinción con bromuro de etidio.

Análisis de la activación de p38 y NF-kB

Se activaron p38 y NF-kB en CD pulmonares mediante exposición durante 20 minutos a 37ºC a conidios de Aspergillus y/o TA1 100 ng/ml. Se incubaron transferencias de lisados celulares con Ab policlonales de conejo que reconocían la forma no fosforilada de p38 MAPK o la p38 MAPK doblemente fosforilada (Thr-180/Tyr-182), o Ab específicos de Rel A, la subunidad de unión a ADN de 65 kDa de NF-kB humano, seguido de IgG de cabra dirigida contra conejo conjugada con peroxidasa de rábano picante según las instrucciones del fabricante. Se revelaron las transferencias con un kit de detección Enhanced Chemiluminescence. Se visualizaron las bandas después de exposición de las transferencias a una película de RX Kodak. Para asegurar una carga de proteína similar en cada carril, se retiraron las transferencias fosforadas y se volvieron a sondear las membranas con Ab contra p38 y NF-kB.

La timosina alfa 1 (TA1) activa células dendríticas (CD)

Anteriormente se ha mostrado que las CD de murino fagocitan Aspergillus in vitro y en el sitio de infección. La TA1, pero no el péptido permutado, activa las CD pulmonares para la fagocitosis de conidios no opsonizados (más que hifas), la expresión de antígeno coestimulante y la producción de citocina. Por el contrario, los conidios de Aspergillus solos no representan un estímulo suficiente para inducir la activación de CD, pero la exposición combinada a TA1 aumentaba notablemente la expresión de antígenos de MHC de clase II, moléculas CD86 y CD40 y la frecuencia de CD productoras de IL-12 p70. De forma interesante, las CD productoras de IL-12 p70 aumentaban también por timosina sola. La TA1 activa también los subconjuntos de CDM y CDP humanas. Tanto los subconjuntos de CD inmaduras como maduras fagocitan conidios. La TA1 aumentó la actividad fagocítica de CD inmaduras, afecta a la morfología de las CD (pueden detectarse más proyecciones citoplasmáticas en CDM inmaduras) y regula positivamente los antígenos de HLA de clase II y la expresión de moléculas coestimulantes en respuesta a los conidios. La TA1 aumenta significativamente la liberación de IL-12 p70 en respuesta a los conidios y al zimosano por CDM inmaduras y la de IL-10 en respuesta a conidios por CDP inmaduros. El IFN-alfa puede producirse por CDP en respuesta al ligando de TLR9 CpG, cuya producción se potencia significativamente por TA1. En contraposición, el péptido permutado no conseguía regular positivamente los antígenos de clase II y la expresión de moléculas coestimulantes ni inducir la producción de citocina por CD en respuesta a los conidios.

Conjuntamente, estos datos apuntan a un papel inmunorregulador novedoso anteriormente no definido de TA1 en la activación y funcionamiento de CD.

La TA1 activa la ruta dependiente de MyD88 mediante la señalización de TLR

La señalización de TLR se produjo en respuesta a conidios de Aspergillus, que media las respuestas funcionales ante el hongo. La TA1 activa fuertemente la expresión de TLR2, TLR5 y TLR9 en CD de murino. TLR2 y TLR9 siguen activados tras la exposición combinada a conidios y TA1, aunque no la expresión de TLR5, cuya expresión se inhibe. De nuevo, el péptido permutado no conseguía activar la expresión de TLR2 y TLR9 solo o en respuesta a los conidios.

La capacidad de TA1 para activar la señalización dependiente de TLR está apoyada por estudios en células HEK293 transfectadas con TLR2, TLR9 y TLR4/CD14 mediante la determinación de la producción de IL-8 en respuesta a TA1 sola o conjuntamente con ligandos de TLR relevantes. En dichas células HEK293, la TA1 aumentaba significativamente la producción de IL-8 por células transfectadas con TLR9 sola o en respuesta al ligando de TLR9 CpG. Sin embargo, la TA1 no estimulaba la producción de IL-8 por células transfectadas con TLR2 sola, aunque aumentaba ligeramente la producción de IL-8 en estas células en respuesta al zimosano. Además, la TA1 no inducía IL-8 en células transfectadas con TLR4/CD14 sola o en respuesta al ligando de TLR5 LPS. La TA1 afecta también a la capacidad de las CD de murino de producir IL-12 p70 e IL-10 en respuesta a estos ligandos de TLR microbianos. La TA1 no afectaba a la producción de citocina en respuesta a poli(I:C) o LPS (TLR4), la TA1 aumentaba significativamente la producción de IL-12 p70 y reduce la de IL-10 después de estimulación con zimosano y LTA (TLR2) y CpG (TLR9). Por lo tanto, la TA1 parece ser capaz de señalizar directamente a través de TLR9 y de potenciar la señalización de TLR2 por el ligando relevante.

Tanto la activación de NF como de p38 MAPK son eventos tempranos en el desencadenamiento de la expresión génica inducida por TLR, y se ha demostrado anteriormente que la TA1 activa las rutas de transducción de MAPK. En apoyo de su implicación en las rutas inducidas por TLR, la TA1 inducía la translocación nuclear de NF-kB así como la fosforilación de p38 (que no se estimulaba por conidios solos, el péptido permutado o el péptido permutado más conidios). Además, los inhibidores de la translocación nuclear de NF-kB (SN50) o p38 MAPK (SB202190) anulan el efecto de la TA1 sobre las CD.

El factor de diferenciación mieloide 88 (MyD88) es una de las proteínas adaptadoras esenciales para la activación de NF-kB y MAPK y la producción de IL-12 p70 tras señalización por TLR. El efecto de TA1 y conidios sobre la producción de IL-12 p70 y el efecto de TA1 sobre la producción de IL-10 se anulan drásticamente en ratones deficientes de MyD88. Por lo tanto, las rutas dependientes de MyD88 parecen desempeñar un papel esencial en el mecanismo de acción de TA1 in vitro. Para determinar si la ruta dependiente de MyD88 desempeña un papel esencial en la acción de TA1 in vivo también, se evaluó el crecimiento fúngico local después de infección de tipo silvestre de ratones deficientes en TLR2, TRL9 o MyD88 con Aspergillus. El crecimiento fúngico en ratones deficientes en TLR2 y TLR9 era comparable al de ratones de tipo silvestre y se debilita de forma similar tras tratamiento con timosina. El crecimiento fúngico es comparable también en ratones deficientes de MyD88, pero en estos ratones no se debilitaba tras tratamiento con TA1. Por tanto, a pesar del grado de redundancia en el uso de TLR, la ruta de señalización dependiente de MyD88 parece ser esencial para la actividad de TA1 tanto in vitro como in vivo.

La TA protege a ratones con TMO de AI

El tratamiento con TA1, pero no con el péptido permutado, parecía ser capaz de curar a ratones con TMO con AI, como se reveló por una supervivencia aumentada que es paralela al crecimiento fúngico reducido en los pulmones. El efecto sobre la protección es conseguir una protección total dependiente de la dosis (>60 días de supervivencia) en ratones tratados con 200 y 400 \mug/kg de TA1 y es superior al de la anfotericina B, como se indica por la supervivencia aumentada y la carga fúngica reducida de ratones tratados con ambos agentes. Además, la TA1 reduce también la patología pulmonar. Las secciones pulmonares de ratones infectados muestran la presencia de numerosas hifas de Aspergillus infiltradas en el parénquima pulmonar, con señales graves de daño de la pared bronquial y necrosis y escasa agrupación de células inflamatorias. En contraposición, no se observan estos rasgos en ratones tratados con TA1, cuyos pulmones se caracterizan por infiltrados curativos de células inflamatorias sin evidencias de crecimiento fúngico ni destrucción de la pared bronquial. Por tanto, la TA1 puede tener eficacia terapéutica en AI y puede ser beneficiosa en combinación con antifúngicos conocidos por tener una actividad reducida en condiciones de TMO.

La TA1 acelera la recuperación mieloide y de células Th1 en ratones con AI

El número absoluto de linfocitos y neutrófilos en circulación aumenta significativamente después del tratamiento con TA1. Lo más importante sin embargo, ya que los niveles de neutrófilos sanguíneos no predicen sensibilidad a la aspergilosis, es que en análisis citofluorimétricos, los números de células CD4^{+} y CD8^{+} y neutrófilos pulmonares aumentaron significativamente tras el tratamiento de ratones con TMO con TA1. Estos linfocitos T CD4^{+} pulmonares son funcionalmente activos como se indica por la proliferación específica de antígeno y la producción de IFN-gamma. La frecuencia de células Th1 (productoras de IFN-gamma) es mayor y la de células Th2 (productoras de IL-4) es menor en ratones tratados con TA1. Además, con respecto a la actividad antifúngica de fagocitos efectores, la actividad conidiocida de macrófagos y neutrófilos es mayor en ratones tratados con TA1. Por lo tanto, la TA1 parece no sólo promover la maduración de CD, sino también activar las células efectoras locales para incitar la fagocitosis y destrucción del hongo.

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La recuperación de neutropenia sola, por ejemplo mediante tratamiento con una dosis de G-CSF conocida por acelerar la recuperación de neutrófilos en ratones, no es suficiente para mediar un grado de resistencia antifúngica comparable al obtenido con TA1. De forma similar, a pesar de una recuperación de neutrófilos significativa, la eficacia terapéutica de TA1 en ratones desprovistos de linfocitos T o células Th1 productoras de IFN-gamma no es tan grande. Además, se consigue una eficacia terapéutica mejorada de TA1 en presencia de células Th1 aumentadas, tal como ocurre en ratones deficientes en IL-4. Por lo tanto, aunque los neutrófilos desempeñan un papel esencial en la medicación de resistencia antifúngica en ausencia de una inmunidad adaptativa dependiente de Th1, el logro de un estado de protección total ante el hongo, como parece obtenerse por el tratamiento con TA1, puede basarse en la acción coordinada entre los fagocitos efectores innatos y las células Th1 protectoras.

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Referencias citadas en la descripción

Esta lista de referencias citadas por el solicitante está prevista únicamente para ayudar al lector y no forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha puesto el máximo cuidado en su realización, no se pueden excluir errores u omisiones y la OEP declina cualquier responsabilidad al respecto.

Documentos de patente citados en la descripción

\bullet US 60457911 B [0001].

Claims

1. Uso de timosina alfa 1 (TA1) en una cantidad antifúngica eficaz en la fabricación de una composición farmacéutica para tratar o prevenir una infección por Aspergillus en un mamífero.

2. Uso según la reivindicación 1, en el que la composición comprende dicha TA1 en una cantidad suficiente para activar las células dendríticas para producir citocinas promotoras de células Th1.

3. Uso según la reivindicación 1, en el que dicha cantidad antifúngica eficaz de TA1 es de 200 a 400 \mug/kg de peso corporal/día.

4. Uso según la reivindicación 1, en el que dicho mamífero es un huésped inmunocomprometido.

5. Uso según la reivindicación 4, en el que dicho mamífero es un ser humano.

6. Uso según la reivindicación 5, en el que dicho ser humano es un receptor de transplante de médula ósea.

7. Uso según la reivindicación 5, en el que dicha TA1 activa las células dendríticas para producir citocinas promotoras de células Th1.

8. Uso según la reivindicación 5, en el que dicha cantidad antifúngica eficaz de TA1 es de 200 a 400 \mug/kg de peso corporal/día.

9. Uso según la reivindicación 1 en combinación con al menos un agente antifúngico adicional.

10. Uso según la reivindicación 9, en el que el agente antifúngico adicional es anfotericina B.

11. Uso según la reivindicación 10, en el que dicha anfotericina B se usa a una dosis de 4000 \mug/kg de peso corporal/día.

12. Uso según la reivindicación 1, en el que dicha infección por Aspergillus es aspergilosis invasiva.