PT1613340E - Tratamento de infecções por aspergillus com timosina alfa 1 - Google Patents

Description

ΕΡ 1 613 340/ΡΤ

DESCRIÇÃO "Tratamento de infecções por Aspergillus com timosina alfa 1"

Referência Cruzada a Pedidos Relacionados 0 presente pedido de patente reivindica a prioridade do pedido provisório 60/457911, apresentado em 28 de Março, 2003.

Campo da Invenção A presente invenção refere-se ao tratamento de infecções fúngicas. Em particular a presente invenção refere-se ao tratamento e prevenção de infecções por Aspergillus tais como a Aspergilose Invasiva associada com as transplantações de medula óssea.

Anterioridade da Invenção A aspergilose invasiva (AI), caracterizada por invasão hifal, destruição de tecido pulmonar e disseminação para outros órgãos, é a principal causa de pneumonia nosocomial e morte na transplantação de medula óssea (TMO) alogénica com uma taxa de infecção estimada de 5 a 10% e uma taxa de mortalidade associada de 90 a 100%. O mais importante factor de risco para a AI tem historicamente sido a neutropenia, de modo que a reconstituição com progenitores mielóides oferecia protecção contra a AI num modelo murino de TMO alogénica. Contudo, estudos recentes sobre a epidemiologia da AI em beneficiários de TMO indicaram uma reduzida infecção relacionada com neutropenia e um aumento da infecção de "inicio tardio", em concomitância com a ocorrência de doença enxerto versus hospedeiro.

Existe uma necessidade na especialidade de métodos de tratamento de infecção por Aspergillus.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

De acordo com a presente invenção, uma utilização médica para o tratamento ou prevenção de uma infecção por Aspergillus 2 ΕΡ 1 613 340/ΡΤ num mamífero refere-se a uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade eficaz do ponto de vista antifúngico de timosina alfa 1 (TA1).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

As evidências clínicas e experimentais sugerem um papel de uma reactividade de células Thl no controlo da AI. As células dendríticas (DC) instruem sensibilização de Thl ao fungo in vivo e in vitro. A evidência indica que a capacidade de DC pulmonares para instruir as respostas de células T apropriadas a antigénios fúngicos pode ser afectada por eventos imunorreguladores locais, incluindo sinalização através de receptores semelhantes a Toll (TLR) . As DC podem constituir alvos promissores para intervenção para imunoterapia e desenvolvimento de vacinas, e desviam o foco da intervenção farmacêutica no sentido de um "adjuvante". Um adjuvante que seja capaz de simultaneamente estimular o tipo apropriado de resposta mais bem adaptado ao combate da infecção e sendo eficaz em condições de imunossupressão é vantajoso. A timosina alfa 1 (TA1) é um péptido tímico de ocorrência natural. Na forma de um péptido sintético de 28 aminoácidos, a TA1 está em ensaios clínicos em todo o mundo para o tratamento de algumas infecções virais, quer como monoterapia quer em combinação com interferão alfa. 0 tratamento de algumas imunodeficiências, malignidades e HIV/SIDA constitui indicações adicionais para a TA1. 0 mecanismo de acção de um polipéptido sintético de TA1 não está completamente entendido mas pensa-se estar relacionado com as suas actividades imunomoduladoras, centradas primariamente no aumento de função de células T. Devido à sua função imunomoduladora em células no sistema imunitário inato, incluindo a capacidade de activar proteína-quinases activadas por mitogénios (MAPK) e a expressão génica em macrófagos, considerámos a TA1 como um adjuvante capaz de activar DC para sensibilização de Thl ao Aspergillus. A presente invenção proporciona um tratamento de infecções por Aspergillus em que a TA1 pode activar DC para sensibilização antifúngica de Thl por sinalização através de TLR. 3 ΕΡ 1 613 340/ΡΤ A presente invenção proporciona uma utilização médica para o tratamento de um mamífero infectado com Aspergillus, estando a referida utilização relacionada com uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade eficaz do ponto de vista antifúngico de TA1. Numa concretização preferida a TA1 é eficaz contra Aspergilose Invasiva (AI). A dose eficaz de TA1 é suficiente para activar células dendríticas para produzir citoquinas promotoras de células Thl. Uma dose preferida para o tratamento da infecção fúngica está na gama entre 200 e 400 microgramas/kg de peso corporal por dia. Numa concretização preferida o mamífero é um hospedeiro imunocomprometido, particularmente um ser humano. A composição farmacêutica é particularmente útil para o tratamento de pacientes imunocomprometidos, especificamente os pacientes que são beneficiários de transplantação de medula óssea. A presente invenção proporciona também uma utilização médica para prevenção de uma infecção por Aspergillus num mamífero, estando a referida utilização relacionada com uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade eficaz do ponto de vista antifúngico de TA1. A invenção é particularmente útil na prevenção de AI num hospedeiro imunocomprometido. Numa concretização preferida a composição farmacêutica previne esta infecção em pacientes imunocomprometidos, especificamente nos pacientes que são beneficiários de transplantação de medula óssea. A dose eficaz de TA1 é suficiente para activar células dendríticas para produzir citoquinas promotoras de células Thl. Uma dose preferida para prevenção da infecção fúngica está na gama entre 200 e 400 microgramas/kg de peso corporal por dia.

Sem estabelecer ligação a nenhuma teoria particular, crê-se que a presente invenção se baseia na identificação de uma nova actividade imunorreguladora da TA1 para o tratamento de, ou protecção contra, uma infecção por Aspergillus. A TA1 parece promover a produção das citoquinas promotoras de Thl, IL-12 p70, IL-10 e IFN-alfa, em vários tipos de DC através de uma via dependente de MyD88.

Em células transfectadas com TLR, a TA1 parece activar directamente a sinalização de TLR9 mas não a de TLR2, sendo esta última potenciada em resposta a ligandos relevantes. 4 ΕΡ 1 613 340/ΡΤ

Portanto, a ΤΑ1 parece activar a sinalização de TLR quer directa quer indirectamente. Os dados sugerem que a TA1 pode utilizar a via dependente de TLR2 em células dendriticas mielóides (MDC) para produção de IL-12 p70 e a via dependente de TLR9 em células dendriticas plasmacitóides (PDC) para a produção de IFN-alfa e IL-10.

Como a produção de IL-10 por DC pode ser uma componente da imunidade protectora antifúngica de memória, equilibrar a produção de IL-12/IL-10 em DC e/ou diferentes subconjuntos de DC pode ser uma razão da essência da qualidade adjuvante da TA1 na Aspergilose.

Num modelo de ratinho de TMO, o tratamento com TA1 após infecção por Aspergillus conduziu a um aumento de células CD4+ e CD8+, assim como a um aumento dos neutrófilos totais. A frequência de células Thl (produtoras de IFN-gama) foi aumentada, enquanto a de células Th2 (produtoras de IL-4) foi diminuída, após tratamento com TA1. É importante que o tratamento com TA1 de ratinhos com TMO infectados com Aspergillus conduziu a uma redução responsiva à dose no crescimento fúngico nos pulmões, e com doses superiores foi capaz de efectuar uma cura completa da infecção. A TA1 foi também capaz de aumentar a eficácia terapêutica da anfotericina B.

Os efeitos da TA1 nas DC são consistentes com a sua actividade anti-apoptótica. Como as DC são centrais no equilíbrio entre imunopatologia, imunidade e auto-imunidade, e a sinalização de PDC através de TLR9 está presente no timo, a capacidade de modular o funcionamento de DC indica que a TA1 é um regulador endógeno dos sistemas imunitários inato e adaptativo actuando através da utilização de TLR. Isto proporciona a base racional para a prescrição terapêutica de TA1 em algumas infecções virais, onde se considera que as PDC que produzem IFN-alfa desempenham um papel central. Para a produção de IFN-alfa nestas PDC, é essencialmente necessário TLR9. Adicionalmente, as PDC parecem também participar em respostas imunitárias após transplantação de células hematopoiéticas, o que pode explicar, entre outros, o efeito benéfico da TA1 na imuno-reconstituição em mamíferos com TMO. 5 ΕΡ 1 613 340/ΡΤ

Os TLR parecem activar o sistema imunitário inato não apenas para ajudar o sistema imunitário adaptativo como também para dirigir a actividade efectora antimicrobiana. Como a TA1 parece activar as DC para sensibilização de Thl ao Aspergillus, e também neutrófilos efectores para um estado antifúngico, isto indica adicionalmente o efeito benéfico da TA1 no tratamento de infecções fúngicas. 0 Aspergillus tem uma natureza única, na medida em que é um fungo saprófita que coloniza hospedeiros imunocomprometidos. A presente invenção proporciona o direccionamento deliberado de células e vias de imunidade mediada por células e aumenta a resistência ao Aspergillus, em que a TA1 é o adjuvante que programa a reactividade de Thl apropriada contra o fungo através da utilização da via de TLR. A invenção é adicionalmente ilustrada pelo exemplo que se segue, que não deve ser entendido como limitante.

Exemplo 1

Animais

Os ratinhos BALB/c e C57BL6 fêmeas, de 8 a 10 semanas de idade, eram de Charles River. Os NOD/SCID eram de The Jackson. Os pares reprodutores de ratinhos homozigóticos deficientes em TLR2, TLR9 e MyD88, criados sobre um fundo C57BL6, e de ratinhos homozigóticos deficientes em IFN-gama e IL-4, criados sobre um fundo BALB/c, foram criados sob condições isentas de patogénios específicos.

Infecções por Microorganismos e Tratamentos

Para a infecção com A. fumigatus, os ratinhos foram injectados por via intranasal durante 3 dias consecutivos com uma suspensão de 2 x 107 conidios/20 microlitros de solução salina. Para a quantificação do crescimento fúngico nos pulmões, utilizou-se o ensaio da quitina. O teor de quitina foi expresso como microgramas de glucosamina por órgão. O teor de glucosamina de pulmões de ratinhos não infectados foi utilizado como um controlo negativo variando entre 0,80 e 6 ΕΡ 1 613 340/ΡΤ 2,25 microgramas de glucosamina/órgão. Para a análise histológica, excisaram-se os pulmões e fixaram-se imediatamente em formalina. Coraram-se secções (3 a 4 micrones) de tecidos embebidos em parafina através do procedimento periódico com ácido de Schiff. A timosina alfa 1 (TA1) e o polipéptido "baralhado" ("scrambled") estão na forma de polipéptidos acetilados, estéreis, liofilizados, purificados, com niveis de endotoxinas inferiores a 0,03 pg/ml medidos por um ensaio padrão de lisado de Limulus. As sequências eram as seguintes: Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-IIe-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-0 (Timosina alfa 1) e Ac-Ala-Lys-Ser-Asp-Val-Lys-Ala-Glu-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Asp-Thr-Thr-Glu-Leu-Asp-Glu-Lys-Val-Glu-Val-Lys-Ala-Asn-Glu-OH (sTimosina alfa 1). Os seus pós liofilizados foram reconstituídos com água estéril.

Os tratamentos foram os seguintes; em ratinhos com TMO, TA1, em diferentes doses administradas intraperitonealmente, s-timosina alfa 1, a 400 microgramas/kg administrada intraperitonealmente ou o G-CSF humano recombinante a 250 microgramas/kg administrado intravenosamente, foram dados diariamente começando no dia da infusão de MO, em concomitância com a infecção e continuando durante mais 3 dias. A anfotericina B foi dada diariamente durante 3 dias em concomitância com a infecção, numa dose de 4000 microgramas/kg, administrada intraperitonealmente. Esta dose curaria a AI em ratinhos tratados com ciclofosfamida. A ciclofosfamida, a 150 mg/kg, administrada intraperitonealmente, foi dada um dia antes da infecção. Em ratinhos tratados com ciclofosfamida, a 400 microgramas/kg, a TA1 foi dada intraperitonealmente durante 5 dias consecutivos começando no dia da infecção.

Obteve-se depleção de neutrófilos por tratamento com 1 mg de anticorpo RB6-8C5 neutralizante de Gr-1, intravenosamente, um dia antes e após a infecção. O tratamento reduziu drasticamente o número de neutrófilos pulmonares mas não o das DC (entre 5 e 6 x 105 células CDllc+, MHC de Classe II+, F48CT antes e após o tratamento). Ratinhos de controlo receberam uma quantidade equivalente de IgG2b de rato purificada. A análise FACS de células pulmonares um dia após o tratamento com ciclofosfamida revelou uma leucopenia profunda e duradoura 7 ΕΡ 1 613 340/ΡΤ (até 5 dias). As percentagens de células F480+ (cerca de 20%) e a de DC CDllc+, MHC de Classe II + , F480^ (<3%) não foram afectadas pelo tratamento.

Ligandos de TLR O zimosano era de Saccharomyces cerevisiae, o ácido lipoteicóico (LTA) de Staphylococcus aureus, e o lipopolissacárido (LPS) de Salmonella Minnesota Re 595. Os oligonucleót idos 1826 e 2006 de CpG eram sequências imunoestimulantes comprovadas.

Geração de Ratinhos com TMO

Expuseram-se ratinhos C57BL6 a uma dose letal de 9 Gy e infundiram-se com células dadoras desprovidas de células T de ratinhos BALB/c. Mais de 95% dos ratinhos sobreviveram apresentando quimerismo hematopoiético estável, do tipo dador, como revelado por expressão de antigénio do MHC de classe I de tipo dador em células dos baços.

Isolamento e Cultura de Células Dendríticas

Geraram-se DC mielóides (MDC) sanguíneas CDllc+ a partir de células mononucleares CD14+ por selecção celular magnética e cultivaram-se durante 5 dias em meio modificado de Iscove, contendo 10% de soro fetal bovino, 2-mercaptoetanol 50 micromolar, piruvato de sódio (1 mM), L-glutamina 2 mM, HEPES (10 mM) , e gentamicina a 50 microgramas/ml na presença de GM-CSF rHumano a 50 ng/ml e IL-4 rHumana a 200 U/ml. Cultivaram-se as MDC imaturas durante 24 horas com 1000 ng/ml de proteína de fusão ligando CD40 trimérico humano-fecho de correr de leucinas para obter DC maduras. As DC plasmocitóides (PDC) CD123+ foram isoladas utilizando o kit de isolamento BDCA-4. A pureza das células CD123+ era >96%.

Para PDC maduras, cultivaram-se DC imaturas com o ligando CD40 trimérico humano como acima e 10 ng/ml de IL-3. A análise FACS revelou que as PDC eram CD123bright, CD4+, CD45RA+ e CDllc' em oposição às MDC caracterizadas como sendo CDla+, CDllc+, CDllb+, CD4+, CD14low e CD8~. A expressão de HLA de Classe II, CD80 e CD86 foi elevada em ambas as DC, imaturas e maduras. As 8 ΕΡ 1 613 340/ΡΤ DC CDllc+ pulmonares murinas (entre 5 a 7% positivas para CD8alfa e entre 30 a 35% positivas para Gr-1) foram isoladas por selecção celular magnética.

Para a fagocitose, as DC foram pré-expostas a 100 ng/ml de TA1 durante 60 minutos e subsequentemente foram incubadas a 37°C com conídios de Aspergillus durante 60 minutos adicionais. A percentagem de internalização foi calculada e foram tiradas fotografias. Para avaliar a maturação funcional e determinação de citoquinas, ressuspenderam-se as DC purificadas em meio de Iscove (sem soro mas com polimixina B, para evitar a activação não específica por componentes séricos e endotoxina) e pulsaram-se com lOOng/ml de TA1 durante 24 horas ou isoladamente ou em conjunto com ligandos de TLR ou conídios de Aspergillus não opsonizados.

Análise Fenotípica O fenótipo da superfície celular foi avaliado por reacção de amostras com anticorpos de rato anti-ratinho conjugados com FITC ou PE. Utilizaram-se como controlo anticorpos de h-isotipo correspondente não relacionados.

Actividade Efectora Antifúngica

Para determinar a fagocitose, macrófagos bronco-alveolares e neutrófilos periféricos foram pré-expostos a 100 ng/ml de TA1 durante 60 minutos e incubados a 37°C com conídios de Aspergillus não opsonizados durante 60 minutos. Em adição, a actividade conidiocida foi avaliada por determinação do número de unidades formadoras de colónias e da percentagem de inibição de unidades formadoras de colónias (média ± EP), referida como actividade conidiocida.

Ensaio com Células Transfectadas com HEK293. A linha celular de rim embrionário humano HEK293, de tipo selvagem ou transfectada estavelmente com TLR2, TLR9 e TLR4/CD1427 humanos, foi cultivada em meio de Eagle modificado por Dulbecco de baixo teor de glucose suplementado com 10% de FCS, HEPES (lOnM), L-glutamina (2 microgramas/ml) e gentamicina (50 microgramas/ml). Os transfectantes foram 9 ΕΡ 1 613 340/ΡΤ adicionalmente suplementados com puromicina (100 microgramas/ml) . Para as experiências de estimulação, as células foram cultivadas a uma densidade de 3 a 5 x 105 células/poço em placas de cultura de tecidos de 12 poços durante a noite. As células foram lavadas e estimuladas com 100 ng/ml de TA1 quer isoladamente quer conjuntamente com ligandos de TLR durante 5 h antes da avaliação da produção de IL-8 nos sobrenadantes.

Ensaios das Citoquinas e imunossorvente com enzimas ligadas por pontos (ELISPOT)

Os níveis de TNF-alfa, IL-10, IL-12 p70, IFN-alfa e IL-8 em sobrenadantes de cultura foram determinados por ELISA em Kit. Os limites de detecção (pg/ml) dos ensaios foram <3 (humano) e <32 (murino) para TNF-alfa, <12 (murino) e <5 (humano) para IL-10, <16 (murino) e <3 (humano) para IL-12 p70 e <25 (humano) IL-8. Para IFN-alfa humano <3 ng/ml. Para a enumeração de células produtoras de citoquinas, utilizou-se um ensaio ELISPOT com células T CD4+ purificadas e DC dos pulmões.

Ensaio de Proliferação por Análise Citométrica de Fluxo A proliferação de linfócitos T CD4+ pulmonares estimulada com 10 microgramas/ml de Con A ou conídios inactivados por calor na presença de DC pulmonares, foi avaliada por marcação com CFSE, éster de succinimidilo de diacetato de 5(6)— carboxifluoresceína.

Transcritase Inversa (RT)-PCR

Extraiu-se o ARN total de DC imaturas pré-tratadas com 100 ng/ml de TA1 durante 60 minutos seguidas de exposição a conídios de Aspergillus não opsonizados durante 60 minutos, como sugerido por experiências iniciais. A síntese e a PCR do ADNc foram realizadas com iniciadores de PCR directos e inversos e os ciclos utilizados para TLR murinos e humanos e HPRT. Os produtos de PCR sintetizados foram separados por electrof orese em gel de agarose a 2% e visualizados por coloração com brometo de etídio. 10 ΕΡ 1 613 340/ΡΤ

Análise de ρ38 e activação de NF-KB

Activaram-se p38 e NF-kB em DC pulmonares por exposição durante 20 minutos a 37°C a conidios de Aspergillus e/ou 100 ng/ml de TA1. Incubaram-se transferências destes lisados celulares com Ab policlonais de coelho que reconhecem a forma não fosforilada da MAPK p3 8, ou a MAPK p38 duplamente fosforilada (Thr-180/Tyr-182), ou Ab específicos para Rei A, a subunidade de ligação ao ADN de 65 kDa de NF-kB humanas seguidos de IgG de cabra anti-coelho conjugada com peroxidase de rábano, conforme as instruções do fabricante. Desenvolveram-se as transferências com um kit de detecção de Quimioluminescência Melhorada. Visualizaram-se as bandas após exposição das transferências a um filme de RX Kodak. Para assegurar uma carga de proteína semelhante em cada pista, as fosfo-transferências foram destacadas e as membranas foram novamente sondadas com Ab contra p38 e NF-kB. A Timosina alfa 1 (TA1) Activa Células Dendríticas (DC)

Foi previamente mostrado que as DC murinas fagocitam Aspergillus in vitro e no local de infecção. A TA1, mas não o péptido scrambled, activa DC pulmonares relativamente a fagocitose de conidios não opsonizados (mais do que hifas), a expressão de antigénios co-estimulantes e a produção de citoquinas. Em contraste, conidios de Aspergillus sozinhos não representam um estímulo suficiente para induzir a activação de DC, mas a exposição combinada a TA1 aumentou marcadamente a expressão de antigénios do MHC de Classe II, moléculas de CD86 e CD40 e a frequência de DC produtoras de IL-12 p70.

Interessantemente, as DC produtoras de IL-12 p70 são também aumentadas por timosina sozinha. A TA1 activa também

subconjuntos de MDC e PDC humanas. Subconjuntos de DC tanto imaturas como maduras fagocitam conidios. A TA1 aumentou a actividade fagocítica de DC imaturas, afecta a morfologias das DC (podem detectar-se mais projecções citoplasmáticas em MDC imaturas) e supra-regula os antigénios HLA de Classe II e a expressão de moléculas co-estimulantes em resposta aos conidios. A TA1 aumenta significativamente a libertação de IL-12 p70 em resposta aos conidios e ao zimosano por MDC imaturas e a de IL-10 em resposta a conidios por PDC imaturas. O IFN-alfa pode ser produzido por PDC em resposta ao ligando 11 ΕΡ 1 613 340/ΡΤ de TLR9 CpG, cuja produção é significativamente potenciada por TA1. Em contraste, o péptido scrambled não conseguiu supra-regular os antigénios da Classe II e a expressão de moléculas co-estimulantes e induzir a produção de citoguinas por DC em resposta a conidios.

Em conjunto, estes dados apontam para um novo papel imunorregulador, previamente não definido, da TA1 na activação e funcionamento de DC.

A TAl activa a via dependente de MyD88 através de sinalização de TLR

Ocorreu sinalização de TLR em resposta a conidios de Aspergillus, que medeia respostas funcionais ao fungo. A TAl activa fortemente a expressão de TLR2, TLR5 e TLR9 em DC murinas. Os TLR2 e TLR9 são ainda activados após a exposição combinada a conidios e TAl, enquanto a expressão de TLR5 é inibida. Novamente, o péptido scrambled não conseguiu activar a expressão de TLR2 e TLR9 nem isoladamente nem em resposta a conidios. A capacidade de TAl para activar a sinalização dependente de TLR é suportada por estudos em células HEK293 transfectadas com TLR2, TLR9 e TLR4/CD14 por determinação da produção de IL-8 em resposta a TAl isoladamente ou em conjunto com os ligandos de TLR relevantes. Nestas células HEK293 a TAl aumentou significativamente a produção de IL-8 por células transfectadas com TLR9 quer isoladamente quer em resposta ao ligando de TLR9 CpG. Contudo, a TAl não estimula a produção de IL-8 por células transfectadas com TLR2 isoladamente mas aumentou ligeiramente a produção de IL-8 nestas células em resposta a zimosano. Adicionalmente, a TAl não induz IL-8 em células transfectadas com TLR4/CD14 nem isoladamente nem em resposta ao ligando de TLR4 LPS. A TAl afecta também a capacidade de DC murinas para produzirem IL-12 p70 e IL-10 em resposta a estes ligandos de TLR microbianos. A TAl não afecta a produção de citoquinas em resposta a Poly(I:C) ou LPS (TLR4). A TAl aumentou significativamente a produção de IL-12 p7 0 e diminui a de IL-10 após estimulação com zimosano e LTA (TLR2) e CpG (TLR9). Portanto, a TAl parece ser capaz de 12 ΕΡ 1 613 340/ΡΤ sinalizar directamente através do TLR9 e potenciar a sinalização de TLR2 pelo ligando relevante.

Tanto a activação de NF-kB como da MAPK p38 são eventos precoces no desencadeamento da expressão génica induzida por TLR, e mostrou-se anteriormente que a TA1 activa as vias de transdução das MAPK. Em suporte do seu envolvimento nas vias induzidas por TLR, a TA1 induziu a translocalização nuclear de NF-kB assim como a fosforilação de p38 (que não foram estimuladas por conidios sozinhos, nem pelo péptido scrambled nem pelo péptido scrambled juntamente com os conidios). Adicionalmente, os inibidores da translocalização nuclear de NF-kB (SN50) ou da MAPK p38 (SB202190) cortam o efeito da TA1 nas DC. 0 factor de diferenciação mielóide 88 (MyD88) é uma das proteínas adaptadoras essenciais para a activação de NF-kB e MAPK e para a produção de IL-12 p70 após sinalização por TLR. 0 efeito de TA1 e de conidios sobre a produção de IL-12 p70, e o efeito de TAI1 sobre a produção de IL-10 são drasticamente cortados em ratinhos deficientes em MyD88. Portanto, a via dependente de MyD88 parece desempenhar um papel essencial no mecanismo de acção da TA1 in vitro. Para determinar se a via dependente de MyD88 desempenha um papel essencial na acção da TA1 in vivo também, avaliou-se o crescimento fúngico local após infecção de ratinhos de tipo selvagem, deficientes em TLR2, TRL9 ou MyD88, com Aspergillus. 0 crescimento fúngico em ratinhos deficientes em TLR2 e TLR9 foi comparável ao dos ratinhos de tipo selvagem e é similarmente impedido após tratamento com timosina. 0 crescimento fúngico é comparável também em ratinhos deficientes em MyD88, mas nestes ratinhos não foi impedido após tratamento com TAl. Assim, apesar de um grau de redundância na utilização dos TLR, a via de sinalização dependente de MyD88 parece ser essencial para a actividade de TAl tanto in vitro como in vivo.

A TAl protege ratinhos com TMO da AI 0 tratamento com TAl, mas não com o péptido scrambled, pareceu ser capaz de curar ratinhos com TMO da AI, como revelado por uma sobrevivência aumentada que encontra paralelo com um reduzido crescimento fúngico nos pulmões. 0 efeito 13 ΕΡ 1 613 340/ΡΤ sobre a protecção é dependente da dose, conseguindo-se uma protecção total (>60 d de sobrevivência) em ratinhos tratados com 200 e 400 microgramas/kg de TA1 e é superior à da anfotericina B. Adicionalmente, a TA1 aumenta a eficácia terapêutica da anfotericina B, como indicado pela sobrevivência aumentada e pela carga fúngica reduzida de ratinhos tratados com ambos os agentes. Adicionalmente, a TA1 também diminui a patologia pulmonar. Secções de pulmão de ratinhos infectados mostram a presença de numerosas hifas de Aspergillus a infiltrar o parênquima pulmonar, com graves sinais de danos na parede brônquica e necrose e fraco recrutamento de células inflamatórias. Em contraste, estas características não são observadas em ratinhos tratados com TA1, cujos pulmões são caracterizados por infiltrados curativos de células inflamatórias sem evidência de crescimento fúngico e de destruição da parede brônquica. Assim, a TA1 pode ter eficácia terapêutica na AI e pode ser benéfica em combinação com antifúngicos que se saiba terem uma actividade reduzida em cenários de TMO. A TAl acelera a recuperação de células mielóides e Thl em

ratinhos com AI O número absoluto de linfócitos e neutrófilos em circulação aumenta significativamente após tratamento com TAl. Mais importante, pois os níveis de neutrófilos no sangue não prevêem a susceptibilidade à aspergilose. Na análise citofluorimétrica contudo os números de células CD4+ e CD8+ nos pulmões e de neutrófilos foram significativamente aumentados pelo tratamento de ratinhos com TMO com TAl. Estes linfócitos T CD4+ dos pulmões são funcionalmente activos como indicado pela proliferação específica dos antigénios e pela produção de IFN-gama. A frequência de células Thl (produtoras de IFN-gama) é superior, e a de células Th2 (produtoras de IL-4) é inferior em ratinhos tratados com TAl. Adicionalmente, em relação à actividade antifúngica de fagócitos efectores, a actividade conidiocida tanto de macrófagos como de neutrófilos é superior em ratinhos tratados com TAl. Portanto, a TAl parece não apenas promover a maturação de DC como também activar células efectoras locais para promover a fagocitose e matar o fungo. 14 ΕΡ 1 613 340/ΡΤ A recuperação de neutropenia apenas, por exemplo por tratamento com uma dose de G-CSF que se sabe acelerar a recuperação de neutrófilos em ratinhos, não é suficiente para mediar um grau de resistência antifúngica comparável ao obtido com TA1. Similarmente, apesar de uma significativa recuperação de neutrófilos, a eficácia terapêutica da TA1 em ratinhos desprovidos de células T ou células Thl produtoras de IFN-gama não é tão grande. Adicionalmente, consegue-se uma eficácia terapêutica melhorada da TA1 na presença de células Thl aumentadas, como a que ocorre em ratinhos deficientes em IL-4. Portanto, embora os neutrófilos desempenhem um papel essencial na medicação da resistência antifúngica na ausência de uma imunidade adaptativa dependente de Thl, o alcançar de um estado de protecção total contra o fungo, como parece ser obtido pelo tratamento com TA1, pode assentar na acção coordenada entre fagócitos efectores inatos e células Thl protectoras.

Lisboa, 2010-08-12

Claims (12)

1. ΕΡ 1 613 340/ΡΤ 1/2 REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de timosina alfa 1 (TA1) numa quantidade eficaz do ponto de vista antifúngico no fabrico de uma composição farmacêutica para tratamento ou prevenção de uma infecção por Aspergillus num mamífero.
2. 2. Utilização de acordo com a reivindicação 1, em que a composição compreende a referida TA1 numa quantidade suficiente para activar células dendríticas para produzirem citoquinas promotoras de células Thl.
3. 3. Utilização de acordo com a reivindicação 1, em que a referida quantidade eficaz do ponto de vista antifúngico de TA1 é de 200 a 400 microgramas/kg de peso corporal/dia.
4. 4. Utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o referido mamífero é um hospedeiro imunocomprometido.
5. 5. Utilização de acordo com a reivindicação 4, em que o referido mamífero é um ser humano.
6. 6. Utilização de acordo com a reivindicação 5, em que o referido ser humano é um beneficiário de transplantação de medula óssea.
7. 7. Utilização de acordo com a reivindicação 5, em que a referida TA1 activa células dendríticas para produzirem citoquinas promotoras de células Thl.
8. 8. Utilização de acordo com a reivindicação 5, em que a referida quantidade eficaz do ponto de vista antifúngico de TA1 é de 200 a 400 microgramas/kg de peso corporal/dia.
9. 9. Utilização de acordo com a reivindicação 1, em combinação com pelo menos um agente antifúngico adicional.
10. 10. Utilização de acordo com a reivindicação 9, em que o agente antifúngico adicional é Anfotericina B. ΕΡ 1 613 340/ΡΤ 2/2
11. 11. Utilização de acordo com a reivindicação 10, em que a referida Anfotericina B é utilizada numa dose de 4000 microgramas/kg de peso corporal/dia.
12. 12. Utilização de acordo com a reivindicação 1, em que a referida infecção por Aspergillus é Aspergilose Invasiva. Lisboa, 2010-08-12