EA008037B1 - ЛЕЧЕНИЕ ИНФЕКЦИЙ, ВЫЗЫВАЕМЫХ ГРИБАМИ p. ASPERGILLUS, С ПОМОЩЬЮ ТИМОЗИНА АЛЬФА 1 - Google Patents

Abstract

В изобретнии описан способ лечения человека, зараженного грибами р. Aspergillus, заключающийся в применении тимозина альфа 1 в качестве иммуностимулятора для активации дендритных клеток. Способ применим прежде всего для предупреждения инфекции, вызываемой грибами р. Aspergillus, у хозяина с ослабленным иммунитетом, подвергнутого лечению с использованием трансплантации костного мозга.

Description

Перекрестная ссылка на родственные заявки

Настоящая заявка претендует на приоритет предварительной заявки 60/457911, поданной 28 марта 2003 г.

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к лечению грибных инфекций. В частности настоящее изобретение относится к лечению и предупреждению инфекций, вызываемых грибами р. ЛкретдШик, таких как инвазивный аспергиллёз, связанный с трансплантациями костного мозга.

Предпосылки создания изобретения

Инвазивный аспергиллёз (ИА), характеризующийся инвазией гифов, разрушением легочной ткани и диссеминацией в другие органы, является основной причиной как нозокомиальной (внутрибольничной) пневмонии, так и смерти при аллогенной трансплантации костного мозга (ТКМ), причем установлено, что коэффициент инфекционного заражения составляет 5-10%, а коэффициент связанной с ним смертности составляет 90-100%. Ранее наиболее важным фактором риска для возникновения ИА была нейтропения, при этом на мышиной модели аллогенной ТКМ было установлено, что восстановление миелоидных предшественников может служить защитой от ИА. Однако современные исследования эпидемиологии ИА у реципиентов, подвергнутых ТКМ, свидетельствуют о снижении количества случаев инфекции, связанной с нейтропенией, и об увеличении количества случаев инфекции с запоздалым началом, сопровождающихся реакцией «трансплантат против хозяина».

Таким образом, в данной области существует необходимость в разработке способов лечения инфекции, вызываемой грибами р. АкрепдШик.

Краткое изложение сущности изобретения

В настоящем изобретении предложен способ лечения или предупреждения инфекции, вызываемой грибами р. АкрепдШик у млекопитающих, заключающийся в том, что млекопитающему вводят фармацевтическую композицию, содержащую количество тимозина альфа 1 (ТА1), которое обладает эффективным противогрибковым действием.

Подробное описание изобретения

В клинических и экспериментальных исследованиях установлено, что для контроля ИА важна реактивность ТЫ-клеток. Дендритные клетки (ДК) обусловливают примирование ТМ-клетками грибами ίη νΐνο и ίη νίίτο. Имеются данные о том, что на способность легочных ДК вызывать соответствующие Тклеточные ответы на грибные антигены могут оказывать влияние локальные иммунорегуляторные каскады, в том числе передача сигнала через Толл-подобные рецепторы (И ПР). ДК могут представлять собой перспективные мишени для воздействия при разработке иммунотерапии и вакцин, и это смещает основное направление фармацевтических разработок в сторону «адъюванта». Предпочтительным является адъювант, который обладает как способностью стимулировать соответствующий тип ответа, наиболее пригодный для борьбы с инфекцией, так и эффективностью в условиях иммуносупрессии.

Тимозин альфа 1 (ТА1) представляет собой встречающийся в естественных условиях тимусный пептид. ТА1 в форме синтетического состоящего из 28 аминокислот пептида применяют во всем мире в клинических условиях для лечения некоторых вирусных инфекций, либо в качестве единственного терапевтического средства, либо в сочетании с интерфероном альфа. ТА1 находит применение также при лечении иммунодефицитных состояний, злокачественных заболеваний и ВИЧ/СПИДа. Механизм действия синтетического полипептида ТА1 в настоящее время не полностью изучен, однако существует мнение, что он связан с присущими полипептиду иммуномодуляторными активностями, направленными в основном на усиление функции Т-клеток. Вследствие его иммуномодуляторного действия на клетки природной иммунной системы, включая способность активировать активируемые митогеном протеинкиназы (МАРК) и экспрессию генов на макрофагах, авторы изобретения рассматривали ТА1 в качестве адъюванта, обладающего способностью активировать ДК для примирования ТЫ -клеток в отношении грибов р. АкретдШик. В настоящем изобретении предложен способ лечения инфекций, вызываемых грибами р. АкретдШш, заключающийся в том, что ТА1 путем передачи сигнала через ТИР может активировать ДК для противогрибкового примирования ТЬ1.

В настоящем изобретении предложен способ лечения млекопитающего, инфицированного грибами р. АкретдШик, заключающийся в том, что такому млекопитающему вводят количество тимозина альфа 1 (ТА1), которое обладает эффективным противогрибковым действием. В предпочтительном варианте осуществления изобретения ТА1 обладает эффективностью в отношении инвазивного аспергиллёза (ИА). Эффективная доза ТА1 является достаточной для активации дендритных клеток для продуцирования стимулирующих ТЫ-клетки цитокинов. Предпочтительная доза для лечения грибковой инфекции составляет от 200 до 400 мкг/кг веса тела в день. В предпочтительном варианте осуществления изобретения млекопитающее представляет собой хозяина с ослабленным иммунитетом, прежде всего человека. Способ применим, прежде всего, для лечения пациентов с ослабленным иммунитетом, прежде всего пациентов, которые являются реципиентами трансплантатов костного мозга.

В настоящем изобретении предложен также способ предупреждения инфекции, вызываемой грибами р. АкретдШш, у млекопитающего, заключающийся в том, что такому млекопитающему вводят количество ТА1, обладающее эффективным противогрибковым действием. Изобретение предпочтительно

- 1 008037 применяют для предупреждения ИА у хозяина с ослабленным иммунитетом. В предпочтительном варианте осуществления изобретения способ предупреждает такие инфекции у пациентов с ослабленным иммунитетом, прежде всего у пациентов, которые являются реципиентами трансплантатов костного мозга. Эффективная доза ТА1 является достаточной для активации дендритных клеток для продуцирования стимулирующих 1Ы-клетки цитокинов. Предпочтительная доза для предупреждения грибковой инфекции составляет от 200 до 400 мкг/кг веса тела в день.

Не вдаваясь в какую-либо конкретную теорию можно считать, что настоящее изобретение основано на открытии новой иммунорегуляторной активности ТА1, позволяющей лечить или предупреждать инфекцию, вызываемую грибами р. АкрегдШик. По-видимому, ТА1 усиливает производство стимулирующих ТЫ цитокинов 16-12 р70, ГЬ-10 и ΙΡΝ-альфа различными типами ДК посредством зависящего от МуБ88 пути.

В трансфектированных ТПР клетках ТА1, по-видимому, непосредственно активирует сигналы, продуцируемые ТЬК9, но не ТЬК2, последний активируется в ответ на соответствующие лиганды. Таким образом, ТА1, по-видимому, активирует продуцируемые ТЬК сигналы либо непосредственно, либо косвенным образом. Имеющиеся данные позволяют предположить, что ТА1 может использовать зависящий от ТЬК.2 каскад для производства 1Ь-12 р70 на миелоидных дендритных клетках (МДК) и зависящий от ТЬК9 каскад для производства ΙΡΝ-альфа и ГЬ-10 на плазмацитоидных дендритных клетках (ПДК).

Поскольку производство ГЬ-10 дендритными клетками (ДК) может представлять собой компонент иммунологической памяти, обеспечивающий защиту от грибков, то баланс производства ГЬ-12/ГЬ-10 на ДК и/или других поднаборах ДК может обусловливать очень большую роль адъювантности ТА1 при аспергиллёзе.

На мышиной модели ТКМ обработка ТА1 после заражения грибами р. АкрегдШик приводила к увеличению количества СБ4' - и СБ8⁺-клеток, а также к увеличению общего количества нейтрофилов. После обработки ТА1 количество ТЫ-клеток (продуцирующих ΙΡΝ-гамма) увеличивалось, в то время как количество Т112-клеток (продуцирующих 1Ь-4) снижалось.

Важно отметить, что лечение мышей с ТКМ, инфицированных грибами р. АкрегдШик, с помощью ТА1 приводило к зависящему от дозы уменьшению роста грибов в легких, а при использовании более высоких доз оказывалось возможным достигать полного излечения инфекции. ТА1 обладал также способностью повышать терапевтическую эффективность амфотерицина В.

Воздействия ТА1 на ДК согласуются с его антиапоптозной активностью. Поскольку ДК играют основную роль в обеспечении баланса между иммунопатологией, иммунитетом и аутоиммунитетом, и в тимусе имеет место передача сигнала к ПДК через ТЬК9, то способность ТА1 осуществлять модуляцию функции ДК является эндогенным регулятором природной и адаптивной иммунных систем, действующих посредством использования ТПР. Это обеспечивает рациональную основу для терапевтического предписания ТА1 при некоторых вирусных инфекциях, для которых считается, что ПДК, продуцирующие ΙΡΝ-альфа, играют основную роль. Для производства ΙΡΝ-альфа в этих ПДК необходимым является присутствие ТЬК9. Кроме того, по-видимому, ПДК участвуют в иммунных ответах после трансплантации гематопоэтических клеток, что может объяснить среди прочего причину благоприятного влияния ТА1 на восстановление иммунитета у млекопитающих, подвергнутых ТКМ.

ТПР, по-видимому, активируют природную иммунную систему, не только помогая адаптивной иммунной системе, но и обеспечивая непосредственную антимикробную эффекторную активность. Поскольку ТА1, по-видимому, активируют ДК для примирования ТЫ в отношении грибов р. АкрегдШик и также противогрибковый статус эффекторных нейтрофилов, то это служит дополнительным доказательством благоприятного действия ТА1 при лечении грибковых инфекций.

Гриб р. АкрегдШик имеет уникальную природу, заключающуюся в том, что он представляет собой сапрофитный гриб, колонизирующий хозяев с ослабленным иммунитетом. В настоящем изобретении предложено целенаправленное воздействие на клетки и пути опосредуемого клетками иммунитета, позволяющее повышать устойчивость к грибам р. АкрегдШик, при котором ТА1 является адъювантом, программирующим соответствующую реактивность ТЫ в отношении гриба посредством использования ТПР-пути.

Ниже изобретение более подробно проиллюстрировано на примере, не ограничивающем его объем.

Пример 1. Животные

Самок мышей линий ВАЬВ/с и С57ВЬ6 возрастом 8-10 недель получали от фирмы Сйаг1ек К1уег. Мышей линии ΝΘΌ/δΟΌ получали от фирмы Тйе 1асккоп. Из линии С57ВЬ6 выводили путем попарного скрещивания гомозиготных мышей с дефицитом ТЬК2, ТЬК9 и МуБ88, а из линии ВАЬВ/с выводили гомозиготных мышей с дефицитом ΙΡΝ-гамма и ГЬ-4, которых содержали в свободных от конкретного патогена условиях.

Заражения микроорганизмами и обработки

Для заражения грибом р. А. ГитщаШк мышам в течение 3 последовательных дней вводили путем интраназальной инъекции суспензию, содержащую 2х10⁷ конидий/20 мкл физиологического раствора. Для количественной оценки роста гриба в легких применяли анализ хитина. Содержание хитина выражали в микрограммах глюкозамина на орган. В качестве отрицательного контроля использовали содер- 2 008037 жание глюкозамина в легких неинфицированных мышей, которое составляло от 0,80 до 2,25 мкг глюкозамина/орган. Для гистологического анализа легкие вырезали и сразу же фиксировали в формалине. Срезы (толщиной 3-4 мкм) тканей, погруженных в парафин, окрашивали методом Шиффа с использованием перйодной кислоты. Тимозин альфа 1 (ТА1) и скрэмблер-полипептид (модифицированный полипептид) представляли собой очищенные стерильные лиофилизированные ацетилированные полипептиды с уровнями эндотоксина менее 0,03 пкг/мл по данным стандартного лимулус-анализа лизата. Они имели следующие последовательности: Ас-8ег-А8р-А1а-А1а-Уа1-А8р-ТЬг-§ег-§ег-61и-11е-ТЬг-ТЬг-Ьу8-А8р-Ьеи-Ьу861и-Ьу8-Ьу8-61и-Уа1-61и-61и-А1а-01и-А8п-0 (тимозин альфа 1) и Ас-А1а-Ьу8-8ег-А8р-Уа1-Ьу8-А1а-О1иТ11г-8ег-8ег-С1и41е-А5р-Т11г-Т11г-С1и-Беи-А5р-С1и-Бу5-Уа1-С1и-Уа1-Бу5-А1а-А5п-С1и-ОН (тимозин альфа 1). Их лиофилизированные порошки восстанавливали в стерильной воде.

Обработки проводили следующим образом: подвергнутым ТКМ мышам (ТКМ-мышам) вводили ежедневно, начиная с дня осуществления инфузии КМ, одновременно с заражением, ТА1 в различных дозах, интраперитонеально, тимозин альфа 1, 400 мкг/кг, интраперитонеально, или человеческий рекомбинантный О-С8Е (гранулоцитарный колониестимулирующий фактор), 250 мкг/кг, внутривенно, и продолжали вводить еще в течение 3 дней. Амфотерицин В вводили ежедневно в течение 3 дней одновременно с заражением, в дозе 4000 мкг/кг, интраперитонеально. Эта доза предназначалась для лечения ИА у обработанных циклофосфамидом мышей. Циклофосфамид, 150 мг/кг, интраперитонеально, вводили за день до осуществления заражения. Обработанным циклофосфамидом мышам в течение 5 последовательных дней, начиная со дня заражения, вводили интраперитонеально 400 мкг/кг ТА1.

Истощение нейтрофилов получали путем внутривенного введения 1 мг нейтрализующего От-1 антитела НВ6-8С5 за день до и через день после осуществления заражения. Обработка существенно снижала количество нейтрофилов в легком, но не снижала количество ДК (5-6 х 10⁵ СИ11с⁺, ГКГ класса 11⁺, Е480^--клеток до и после обработки). Контрольным мышам вводили эквивалентное количество очищенного крысиного 1дО2Ь. ЕАС8-анализ (анализ с использованием клеточного сортера с возбуждением флуоресценции) клеток легкого через день после обработки циклофосфамидом позволил выявить выраженную и долговременную (вплоть до 5 дней) лейкопению. Обработка не влияла на процент Е480⁺-клеток (примерно 20%) и процент СИ11с⁺, ГКГ класса 11⁺, Е480^--ДК (<3%).

Лиганды ТПР

Зимозан получали из 8асс11аготусе5 сетеу^ае, липотеихоевую кислоту (ЛТК) получали из 81арНу1ососсик ашеик и липополисахарид (ЛПС) из штамма Не 595 8а1топе11а тшпеюЩ СрО-олигонуклеотиды 1826 и 2006 представляли собой проверенные иммуностимуляторные последовательности.

Выведение ТКМ-мышей

Мышей линии С57ВБ6 обрабатывали летальной дозой 9 Гр и им вводили путем инфузии донорские клетки, характеризующиеся истощением Т-клеток, полученные от мышей линии ВАЬВ/с. У более чем 95% выживших мышей был обнаружен стабильный гематопоэтический химеризм донорского типа, что подтверждалось экспрессией антигена ГКГ класса I донорского типа на клетках селезенки.

Выделение и культивирование дендритных клеток

Миелоидные ДК (МДК) крови линии СИ11с⁺ получали (выводили) из мононуклеарных клеток линии СИ14⁺ путем магнитной сортировки клеток и культивирования в течение 5 дней в среде Дульбекко, модифицированной по способу Исков, содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки, 50 мкМ 2меркаптоэтанол, пируват натрия (1 мМ), 2 мМ Ь-глутамин, НЕРЕ8 (1 мМ) и 50 мкг/мл гентамицина в присутствии 50 нг/мл рекомбинантного человеческого ОМ-С8Е (колониестимулирующий фактор гранулоцитов и макрофагов) и 200 ед/мл рекомбинантного человеческого 1Ь-4. Для получения зрелых ДК незрелые МДК культивировали в течение 24 ч с 1000 нг/мл слитого протеина: тримерный лиганд человеческого СИ40-лейциновая «застежка». Плазмоцитоидные ДК (ПДК) линии СИ 123 выделяли с помощью набора для выделения ВИСА-4. Чистота СИ123⁺-клеток составляла >96%.

Для получения зрелых ПДК незрелые ДК культивировали с тримерным лигандом человеческого СИ40 согласно описанному выше методу в присутствии 10 нг/мл 1Ь-3. ЕАС8-анализ позволил установить, что ПДК представляли собой С.’И123^Ь|'^|д|. СИ4⁺, СИ45РА' и СИ 11с^- в отличие от МДК, представляющих собой СИ1а⁺, СИ11с⁺, СИ11Ь⁺, СИ4⁺, СИ14^{1о ;} и СИ8^-. Уровень экспрессии главного комплекса гистосовместимости человека (ЧГКГ) класса II, СИ80 и СИ86 был высоким как в незрелых, так и в зрелых ДК. ДК линии СИ11с легкого мыши (от 5 до 7% позитивных в отношении СИ8а1рйа и от 30 до 35% позитивных в отношении От-1) выделяли с помощью магнитной сортировки клеток.

Для исследования фагоцитоза ДК подвергали предварительной обработке 100 нг/мл ТА1 в течение 60 мин и затем инкубировали в течение еще 60 мин при 37°С с конидиями АкретдШик. Рассчитывали процент интернализации и делали фотоснимки. Для оценки функционального созревания и определения цитокинов очищенные ДК ресуспендировали в среде Исков (не содержащей сыворотку, но с добавлением полимиксина В для избежания неспецифической активации компонентами сыворотки и эндотоксином) и вводили путем впрыскивания 100 нг/мл ТА1 в течение 24 ч либо индивидуально, либо в сочетании с лигандами ТПР или неопсонированными конидиями АкретдШик.

- 3 008037

Фенотипический анализ

Фенотип клеточной поверхности оценивали, подвергая образцы взаимодействию с конъюгированными с ФИТЦ (флуоресцеин-изотиоцианат) или ФЭ (фосфатидилэтаноламин) крысиными антимышиными антителами. В качестве контроля использовали антитела, соответствующие неродственному человеческому изотипу.

Противогрибковая эффекторная активность

При оценке фагоцитоза бронхоальвеолярные макрофаги и периферические нейтрофилы подвергали предварительной обработке 100 нг/мл ТА1 в течение 60 мин и инкубировали при 37°С с неопсонированными конидиями АчрегдШич в течение 60 мин. Кроме того, оценивали конидиоцидную активность путем определения количества колониеобразующих единиц и в качестве меры конидиоцидной активности принимали процент ингибирования колониеобразующих единиц (среднее значение УС.К.О.).

Анализ с использованием трансфектированных клеток линии НЕК293

Человеческие эмбриональные клетки почки линии НЕК293 дикого типа или стабильно трансфектированные человеческими ТЬК.2, ТЬК.9 и ТЕЙ.4/СО1427 культивировали в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла с низким содержанием глюкозы, дополненной 10% фетальной телячьей сыворотки (ФТС), НЕРЕ8 (10 нМ), Ь-глутамином (2 мкг/мл) и гентамицином (50 мкг/мл). Кроме того, среду для трансфектантов дополняли пуромицином (100 мкг/мл). Для экспериментов по стимуляции клетки культивировали в течение ночи при плотности 3-5 х 10⁵ клеток/лунку в 12-луночных планшетах для культур тканей. Клетки промывали и стимулировали 100 нг/мл ТА1 либо индивидуально, либо вместе с лигандами ТИР, за 5 ч до осуществления оценки производства 1Ь-8 в супернатантах.

Анализ цитокинов и твердофазный иммуноферментный спот-анализ (ЕЫ8РОТ)

Уровни ΤΝΕ-альфа, 1Б-10, 1Ь-12 р70, ΙΕΝ-альфа и 1Ь-8 в супернатантах культур определяли с помощью набора для ЕЫ8А. Пределы обнаружения (пг/мл) анализа составляли: для ΤΝΕ-альфа: <3 (человеческий) и <32 (мышиный), для ΙΠ-10: <12 (мышиный) и <5 (человеческий), для 1Ь-12 р70: <16 (мышиный) и < 3 (человеческий) и для 1Ь-8: <25 (человеческий). Для человеческого ΙΕΝ-альфа предел обнаружения составлял <3 нг/мл. Для подсчета продуцирующих цитокины клеток проводили анализ ЕЫ8РОТ на очищенных СИ4⁺-Т-клетках и ДК из легких.

Анализ пролиферации методом проточной цитометрии

Пролиферацию легочных СЭ4'-Т-лимфоцитов, стимулированных 10 мкг/мл конкавалина А (Соп А), или инактивированными нагреванием конидиями в присутствии легочных ДК оценивали путем мечения с использованием СЕ8Е (сукцинимидилового эфира 5(6)-карбоксифлуоресцеиндиацетата).

ПЦР с обратной транскриптазой (ОТ-ПЦР)

Общую РНК экстрагировали из незрелых ДК, которые предварительно обрабатывали в течение 60 мин 100 нг/мл ТА1, а затем подвергали воздействию неопсонизированных конидий АчрегдШич в течение 60 мин, процедура была выбрана на основе предварительных экспериментов. Синтез и ПЦР кДНК проводили с использованием прямого и обратного праймеров для ПЦР и циклов, применяемых для мышиных и человеческих ТИР и НРК.Т. Синтезированные ПЦР-продукты разделяли с помощью электрофореза на 2%-ном агарозном геле и визуализировали путем окрашивания этидийбромидом.

Анализ активации р38 и ΝΕ-кВ р38 и ΝΕ-кВ активировали на ДК легкого путем воздействия в течение 20 мин при 37°С конидиями АчрегдШич и/или 100 нг/мл ТА1. Блоты клеточных лизатов инкубировали с кроличьими поликлональными Ат, распознающими либо нефосфорилированную форму МАРК р38, либо дважды фосфорилированную форму (Тйг-180/Туг-182) МАРК р38, или с Ат, обладающими специфичностью к Ие1 А, представляющей собой связывающую ДНК субъединицу с молекулярной массой 65 кДа человеческого ΝΕ-кВ, а затем с конъюгированным с пероксидазой из хрена козьим 1дС к антителу кролика согласно инструкциям производителя. Блоты проявляли с использованием набора для обнаружения типа Епйапееб СйетИиттечеепее. Полосы визуализировали после экспозиции блотов на пленке Кобак ИХ. Для того, чтобы гарантировать одинаковую загрузку белка в каждой дорожке, вырезали полоски фосфорилированных блотов и мембраны подвергали вспомогательному зондированию с использованием Ат к р38 и ΝΕ-кВ.

Тимозин альфа 1 (ТА1) активирует дендритные клетки (ДК)

В предыдущих исследованиях было установлено, что мышиные ДК могут осуществлять фагоцитоз грибов р. АчрегдШич ίη νίΐτο и в месте инфекции. Установлено, что ТА1 в отличие от модифицированного пептида активирует легочные ДК в отношении фагоцитоза неопсонизированных конидий (в большей степени, чем гифов), экспрессии костимулирующего антигена и производства цитокинов. В отличие от этого конидии АчрегдШич индивидуально не представляют собой достаточный стимул для индукции активации ДК, однако их воздействие совместно с ТА1 приводит к значительному повышению экспрессии антигенов ГКГ класса II, молекул СИ86 и СИ40 и количества ДК, продуцирующих 1Б-12 р70. Важно отметить, что количество ДК, продуцирующих 1Б-12 р70, увеличивается также при воздействии только одного тимозина. ТА1 активирует также поднаборы человеческих МДК и ПДК. Поднаборы как незрелых, так и зрелых ДК, обладают способностью к фагоцитозу конидий. ТА1 повышает фагоцитарную активность незрелых ДК, оказывает влияние на морфологию ДК (в незрелых МДК можно выявить большее

- 4 008037 количество цитоплазматических проекций) и осуществляет повышающую регуляцию антигенов ЧГКГ класса II и приводит к экспрессии костимулирующих молекул в ответ на присутствие конидий. ТА1 приводит к существенному увеличению высвобождения 1Ь-12 р70 незрелыми МДК в ответ на конидии и зимозан и высвобождения 1Ь-10 незрелыми ПДК в ответ на обработку конидиями. РДК могут продуцировать ΙΕΝ-альфа в ответ на обработку лигандом СрС ТЬК9, производство которого существенно усиливается под действием ТА1. В отличие от этого модифицированный пептид не обладает способностью осуществлять повышающую регуляцию экспрессии антигенов класса II и костимулирующих молекул и индуцировать производство цитокинов ДК в ответ на обработку конидиями.

В совокупности эти данные свидетельствуют о новой ранее неизвестной иммунорегуляторной роли ТА1 в активации и функционировании ДК.

ТА1 активирует зависящий от МуЭ88 каскад посредством зависящего от ТПР сигнала

В присутствии конидий АзрегдШиз возникает зависящий от ТПР сигнал, который опосредует функциональные ответы на гриб. ТА1 вызывает сильную активацию экспрессии ТЬВ2, ТЬВ5 и ТЬВ9 на мышиных ДК, причем ТЬК2 и ТЬВ9 могут также активироваться при совместном воздействии конидий и ТА1, в то время как экспрессия ТЬР5 при этом ингибируется. И в этом случае модифицированный пептид не обладает способностью активировать экспрессию ТЬР2 и ТШ ни индивидуально, ни в сочетании с обработкой конидиями.

Способность ТА1 активировать зависящий от ТПР сигнал подтверждается результатами исследований на клетках линии НЕК293, трансфектированных ТЬВ2, ТШ и ТЬВ4/СО14. в которых оценивали производство ГЬ-8 в ответ на обработку только ТА1 или на обработку в сочетании с соответствующими ТПР-лигандами. В опытах на таких клетках линии НЕК293 ТА1 существенно повышал производство ГЬ8 клетками, трансфектированными ТЬВ9, как при его применении индивидуально, так и при применении совместно с лигандом ТЬР9 СрС. При этом ТА1 не стимулировал производство [Д-8 трансфектированными ТЬК2 клетками при его применении индивидуально, но несколько повышал производство Ш-8 в этих клетках в ответ на стимуляцию зимозаном. Кроме того, ТА1 не индуцировал производство Ш-8 в клетках, трансфектированных ТПК4-/СО14, как при его применении индивидуально, так и в ответ на обработку лигандом ТЬК.4 ЛПС (липополисахаридом). ТА1 оказывал также влияние на способность мышиных ДК продуцировать Ш-12 р70 и Ш-Ю в ответ на указанные лиганды микробных ТПР. ТА1 не оказывал влияния на производство цитокинов в ответ на Ро1у(ЬС) или ЛПС (ТЬШ4), ТА1 вызывал существенное увеличение производства Ш-12 р70 и снижал производство Ш-Ю р70 после стимуляции зимозаном и ЬТА (ТЬК2) и СрС (ТЬШ9). Следовательно, ТА1, по-видимому, обладает способностью передавать сигнал непосредственно через ТЬШ9 и усиливать ТЬК2-сигнал, стимулированный соответствующим лигандом.

Активация как ΝΕ, так и МАРК р38, представляет собой первые события в стимуляции, индуцируемой ТПР генной экспрессии, причем в предыдущих исследованиях было установлено, что ТА1 активирует пути трансдукции МАРК. Для усиления своего участия в индуцируемых ТПР каскадах ТА1 индуцирует ядерную транслокацию ΝΕ-кВ, а также фосфорилирование р38 (оба процесса не стимулировали ни конидии индивидуально, ни модифицированный пептид, ни модифицированный пептид плюс конидии). Кроме того, ингибиторы ядерной транслокации ΝΕ-кВ (8Ν50) или МАРК р38 (8В202190) устраняли воздействие ТА1 на ДК.

Фактор миелоидной дифференцировки 88 (МуЦ88) представляет собой один из адаптерных белков, необходимый для активации ΝΕ-кВ и МАРК и производства Ш-12 р70 после возникновения ТПРсигнала. Влияние ТА1 и конидий на производство Ш-12 р70 и влияние ТАП на производство Ш-Ю в значительной степени устраняется у мышей с дефицитом МуЭ88. Таким образом, зависящий от МуЭ88 каскад, по-видимому, играет существенную роль в механизме действия ТА1 ίη νίίτο. Для оценки того, играет ли зависящий от МуЭ88 каскад существенную роль также и в механизме действия ТА1 ίη νίνο, производили оценку местного роста грибов после заражения грибами р. АзрегдШиз мышей дикого типа и мышей с дефицитом ТЬК2, ТКЬ9 или МуЭ88. Рост гриба у мышей с дефицитом ТЬВ2 и ТЬВ9 был сравним с ростом гриба у мышей дикого типа и на него оказывала аналогичное влияние обработка тимозином. Рост гриба был сравним также с ростом гриба у мышей с дефицитом МуЦ88, однако у этих мышей на него не оказывала влияние обработка ТА1. Таким образом, несмотря на то, что употребление ТПР до некоторой степени является излишним, зависящий от МуЭ88 каскад сигнала, по-видимому, является необходимым для проявления активности ТА1 как ίη νίίτο, так и ίη νίνο.

ТА1 защищает ТКМ-мышей от ИА

Обработка ТА1, в отличие от обработки модифицированным пептидом, по-видимому, позволяет лечить ТКМ-мышей с ИА, о чем свидетельствует повышение выживаемости и соответствующее уменьшение роста гриба в легких. Критерием защитного действия является зависящая от дозы полная защита (выживаемость в течение >60 дней), которая достигается у мышей, обработанных 200 и 400 мкг/кг ТА1, и оно превосходит защитное действие амфотерицина В. Кроме того, ТА1 повышает терапевтическую эффективность амфотерицина В, о чем свидетельствует повышение выживаемости и уменьшение роста гриба у мышей, обработанных обоими агентами. Кроме того, ТА1 уменьшает также легочную патологию. На срезах легкого инфицированных мышей видно наличие многочисленных гифов АзрегдШиз, ин

- 5 008037 фильтрующихся в паренхиму легкого, сопровождающееся выраженными признаками повреждения бронхиальной стенки и некрозом и недостаточным рекрутментом воспалительных клеток. В противоположность этому указанные особенности не наблюдаются у мышей, обработанных ТА1, легкие которых характеризуются заживляющими инфильтратами воспалительных клеток, при этом отсутствуют рост гриба и разрушения бронхиальной стенки. Таким образом, ТА1 может обладать терапевтической эффективностью в отношении ИА и может оказывать благоприятное действие в сочетании с противогрибковыми лекарственными средствами, в отношении которых известно, что они обладают пониженной активностью при ТКМ.

ТА1 ускоряет восстановление миелоидов и ТЫ-клеток у мышей с ИА

После обработки ТА1 существенно увеличивается абсолютное количество лимфоцитов и нейтрофилов в кровотоке. Важно отметить, что уровни нейтрофилов в крови не позволяют предсказать наличие чувствительности к аспергиллёзу. Однако по данным цитофлуорометрического анализа количество СЭ4 - и СЭ8 -клеток и нейтрофилов в легких существенно возрастало после обработки ТКМ-мышей ТА1. Указанные легочные ΟΌ4 -Т-лимфоциты обладают функциональной активностью, которая проявляется в антигенспецифической пролиферации и производстве ΙΡΝ-гамма. Концентрация ТЫ-клетокпродуцентов (которые продуцируют ΙΡΝ-гамма) является более высоким, а ТЬ2-клеток-продуцентов (продуцирующих 1Ь-4) более низким у мышей, обработанных ТА1. Кроме того, с точки зрения противогрибковой активности эффекторных фагоцитов конидиоцидная активность как макрофагов, так и нейтрофилов является более высокой у мышей, обработанных ТА1. Таким образом, по-видимому, ТА1 не только стимулирует созревание ДК, но также активирует местные эффекторные клетки в отношении немедленного фагоцитоза и уничтожения гриба.

Восстановление после нейтропении, например, с помощью обработки только дозой О-С8Р, который, как известно, ускоряет восстановление нейтрофилов у мышей, недостаточно для обеспечения степени противогрибковой устойчивости, сравнимой с той, которая достигается с помощью ТА1. Аналогично этому, несмотря на значительное восстановление нейтрофилов, терапевтическая эффективность ТА1 у мышей, лишенных Т-клеток или ТЫ-клеток, продуцирующих ΙΡΝ-гамма, является не столь высокой. Кроме того, повышение терапевтической эффективности ТА1 достигается в присутствии увеличенного количества ТЫ-клеток, которое имеет место у мышей с дефицитом 1Ь-4. Таким образом, хотя нейтрофилы играют существенную роль в обеспечении противогрибковой устойчивости с помощью лекарственной терапии в отсутствие адаптивного ТЫ-зависимого иммунитета, достижение состояния полной защиты от гриба, которое, по-видимому, может быть получено путем обработки ТА1, может быть обусловлено скоординированным действием природных эффекторных фагоцитов и защитных ТЫ-клеток.

Claims (12)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Способ лечения или предупреждения инфекции, вызываемой грибом р. АкрегдШик, у млекопитающего, заключающийся в том, что млекопитающему вводят фармацевтическую композицию, содержащую количество тимозина альфа 1 (ТА1), которое обладает эффективным противогрибковым действием.
2. 2. Способ по п.1, в котором ТА1 вводят в дозе, достаточной для активации дендритных клеток для продуцирования стимулирующих ТЫ-клетки цитокинов.
3. 3. Способ по п.1, в котором ТА1 вводят в дозе, составляющей от 200 до 400 мкг/кг веса тела/день.
4. 4. Способ по п.1, в котором млекопитающее представляет собой хозяина с ослабленным иммунитетом.
5. 5. Способ по п.4, в котором млекопитающее представляет собой человека.
6. 6. Способ по п.5, в котором человек является реципиентом трансплантата костного мозга.
7. 7. Способ по п.5, в котором ТА1 вводят для активации дендритных клеток для продуцирования стимулирующих ТЫ-клетки цитокинов.
8. 8. Способ по п.5, в котором ТА1 вводят в дозе, составляющей от 200 до 400 мкг/кг веса тела/день.
9. 9. Способ по п.1, который дополнительно заключается в том, что пациенту вводят по меньшей мере один дополнительный противогрибковый агент.
10. 10. Способ по п.9, в котором дополнительный противогрибковый агент представляет собой амфотерицин В.
11. 11. Способ по п.10, в котором амфотерицин В вводят в дозе 4000 мкг/кг веса тела/день.
12. 12. Способ по п.1, в котором инфекция, вызываемая грибами р. АкрегдШик представляет собой инвазивный аспергиллёз.