DE2813327A1

DE2813327A1 - Peptide

Info

Publication number: DE2813327A1
Application number: DE19782813327
Authority: DE
Inventors: Marvin Ross Brown; Jean Edouard Frederic P Rivier; Jun Wylie Walker Prof Vale
Original assignee: Salk Institute for Biological Studies
Current assignee: Salk Institute for Biological Studies
Priority date: 1977-03-28
Filing date: 1978-03-28
Publication date: 1978-10-05
Also published as: FR2385688A1; FR2385688B1; NL7803289A; AU3430778A; ES468241A1; FI780907A; CA1102314A; IT7848586A0; IT1105152B; IE780511L; GB1564191A; SE446190B; BE865380A; ZA781599B; AU519122B2; AT366026B; JPS6141920B2; DE2813327C2; CH639361A5; JPS53130687A

Description

Patentanwälte Dipl.-Ing H. We'ckmann, Dipl.-Phys. Dr. K. Fincke

Dipl.-Ing. F. A.Weickmann, Dipl.-Chem. B. Huber Dr. Ing. H. LiSKA 2813

8000 MÜNCHEN 86, DEN

POSTFACH 860820

MÖHLSTRASSE 22, RUFNUMMER 98 39 21/22

THE SALK INSTITUTE FOR BIOLOGICAL STUDIES, La Jolla, Calif., USA

Peptide

Die Erfindung betrifft Peptide mit biologischer Aktivität als Sekretionsinhibitoren für das Wachstumshormon, Insulin und Glucagon.

In der US-PS 3 904 594 ist ein Peptid mit inhibierender Wirkung auf die Sekretion . des Wachstumshormons beschrieben, das als "Somatostatin" bezeichnet wird. Somatostatin (auch bekannt als: Somatotropin release inhibiting factor) ist ein Tetradecapeptid

-Ser-Cys-C

H-Ala-Gly-'Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-OH

Somatostatin, die lineare Form von Somatostatin (Dihydrosomatostatin) und verschiedene acylierte Derivate von Somatostatin und Dihydrosomatostatin sind ebenfalls in dem US-Patent beschrieben.

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Somatostatin und zahlreiche seiner Analoga inhibieren in vitro die Wachstumshormon (STH)-Sekretion aus kultivierten und dispergierten Hypophysen-Vorderlappenzellen von Ratten und hemmen in vivo die Insulin- und Glucagonsekretion bei Ratten. Bei der Verwendung von Somatostatin wäre es hoch erwünscht, selektiv ausschliesslich die Sekretion von STH, Insulin oder Glucagon zu inhibieren. Es wurden bereits Versuche unternommen, Analoga von Somatostatin zu entwickeln, die selektive biologische Aktivität besitzen und nur die STH-, Insulin- oder Glucagonsekretion inhibieren. Obwohl in der Literatur Unterschiede in den Somatostatinmengen beschrieben wurden, die beim Menschen und am perfundierten Rattenpankreas in vitro zur Inhibierung von Insulin bzw. Glucagon erforderlich sind, zeigen Somatostatin und einige Somatostatinanaloga in vivo ähnliche Aktivitäten bei der Inhibierung dieser beiden Hormone.

Es wurde nun gefunden, dass in den Somatostatin- und Dihydrosomatostatinmolekülen bestimmte Aminosäuren entfernt und/oder umgelagert werden können, wobei neuartige Peptide mit weniger Aminosäuregruppen entstehen, die biologische Aktivität hinsichtlich der Inhibierung der STH-, Insulin- oder Glucagonsekretion aufweisen. Einige dieser neuen Peptide besitzen dissoziierte Aktivität. Die erfindungsgemässen Peptide, die weniger Aminosäuregruppen als Somatostatin oder Dihydrosomatostatin enthalten, haben vor allem den Vorteil, dass sie relativ einfach hergestellt werden können.

Die Peptide der Erfindung haben die Formeln:

I Cy S-R₁-PhG-PUe-P^-I-y s-Rs-Ph-J-R^-R₅-

II CyS-R₁-PhO-PhC-R₂-LyI-J-R₃-PhG-Rz₁-R₅-CyS

wobei R₁ Asn oder desR. bedeutet, R₃ Trp oder D-Trp ist, R₃ Phe oder Thr bedeutet, R. Thr oder desR. ist und R₅ Ser, Phe oder bedeutet, mit der Massgabe, dass mindestens eine derGruppen

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R₁ , R. bzw. R₁- wegfällt.

Die zur Beschreibung der erfindungsgemässen Peptide verwendete Nomenklatur entspricht der üblichen Praxis, die ersten drei Buchstaben des Trivialnamens zu verwenden. Dementsprechend ist auch die L-Form der Aminosäure gemeint, falls nichts anderes angegeben ist. Unter der Cys-Aminosäuregruppe werden sowohl D-Cys als auch L-Cys verstanden.

Gegenstand der Erfindung sind ferner die pharmazeutisch verträglichen Säureadditionssalze der Peptide. Beispiele für diese Säureadditionssalze sind die Hydrochloride, Hydrobromide, Sulfate, Phosphate, Maleate, Acetate, Citrate, Benzoate, Succinate, Malte, Ascorbate und Tartrate.

Gegenstand der Erfindung sind ausserdem Zwischenprodukte der Formel

1 2 3 ₄ 5

III X-Cyc (X¹ ) -R₁-PhC-PlIe-R₂-LyS (X ) -R₃ (X ) -Phe-R4 (X ) -1*5 (X)-Cys(X^G)-R_S.

wobei X Wasserstoff oder eine c/L -Aminoschutzgruppe bedeutet. Als ch -Aminoschutzgruppen X können solche verwendet werden, wie sie üblicherweise zur stufenweise Synthese von Polypeptiden angewandt werden. Beispiele hierfür sind (1) Acylschutzgruppen, wie Formyl, Trifluoracetyl, Phthalyl, Toluolsulfonyl (Tosyl), Benzolsulfonyl, Nitrophenylsulfenyl, Tritylsulfenyl, o-Nitrophenoxyacetyl, Chloracetyl, Acetyl und ^''-Chlorbutyryl, (2) aromatische Urethanschutzgruppen, z.B. Benzyloxycarbonyl und substituierte Benzyloxycarbonylgruppen, wie p-Chlorbenzyloxycarbonyl , p-Nitrobenzyloxycarbonyl, p-Brombenzyloxycarbonyl und p-Methoxybenzyloxycarbonyl, (3) aliphatisch^ Urethanschutzgruppen, wieX-t-Butyloxycarbonyl, Diisopropylmethoxycarbonyl, Isopropyl-

oxycarbonyl, Äthoxycarbonyl und Allyloxycarbonyl, (4) Cycloalkylurethanschutzgruppen, wie Cyclopentyloxycarbonyl, Adamantyloxycarbonyl und Cyclohexyloxycarbonyl, (5) Thiourethanschutzgruppen, wie Phenylthiocarbonyl, (6) Alkylschutzgruppen, wie Triphenylmethyl (Trityl) und Benzyl, sowie (7) Trialkylsilangruppen, wie Trimethylsilan. Die bevorzugte co-Aminoschutzgruppe χ ist tert. -Butyloxycarbony 1.809840/098*

- 7 <: ^imL "MSPEQJED

X und X sind Schutzgruppen für Cys, z.B. S-p-Methoxybenzyl, S-p-Methylbenzyl, S-Acetamidomethyl, S-Trityl und S-Benzyl. Die bevorzugte Schutzgruppe ist S-p-Methoxybenzyl. X und/oder X können Wasserstoff sein, d.h. die Schwefelgruppe weist keine Schutzgruppe auf.

2
X ist eine Schutzgruppe für den Seitenketten-Aminosubstituenten von Lysin oder Wasserstoff, d.h. der Seitenketten-Aminosubstituent weist keine Schutzgruppe auf. Beispiele für geeignete Seitenketten-Aminoschutzgruppen sind Benzyl, Chlorbenzyloxycarbonyl, Benzyloxycarbonyl, Tosyl, t-Amyloxycarbonyl und t-Butyloxycarbonyl. Die Wahl der Seitenketten-Aminoschutzgruppe ist nicht kritisch, jedoch muss eine Gruppe verwendet werden, die beim Abspalten der Schutzgruppen von den zL/ -Aminogruppen während der Synthese nicht entfernt wird. Die cC-Aminoschutzgruppe und die Seitenketten-Aminoschutzgruppe müssen daher verschieden sein.

3 4 5
X , X und X sind Schutzgruppen für die Hydroxylgruppe von Thr und Ser aus der Reihe: Acetyl, Benzoyl, tert.-Butyl, Trityl, Tetrahydropyranyl, Benzyl, 2,6-Dichlorbenzyl und Benzyloxycarbonyl. Die bevorzugte Schutzgruppe ist Benzyl.

3 4 5

X und/oder X und/oder X können Wasserstoff sein, d.h. die Hydroxylgruppe weist keine Schutzgruppe auf.

R-, R„, R₃, R. und R₅ haben die vorstehende Bedeutung. R_fi ist eine Hydroxyl-, Methoxy-, Ester-, Amid- oder Hydrazidgruppe oder eine Benzylester- oder Hydroxymethylester-Verankerungsbindung, wie sie bei der Festphasensynthese zur Bindung an einen festen Kunstharzträger verwendet wird, der folgenden Formeln:

-0-CH2~Polystyrolharzträger

und
-0-CEU-Benzyl-Polystyrolharzträger

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Das Polymere ist vorzugsweise ein Copolymerisat von Styrol mit etwa 0,5 bis 2,0 % Divinylbenzol als Vernetzungsmittel, das das Polystyrolharz in bestimmten organischen Lösungsmitteln vollständig unlöslich macht. In der Formel III ist mindestens eine de:
eine Schutzgruppe.

mindestens eine der Gruppen X, X , X , X , X , X bzw. X

Bei der Auswahl einer bestimmten Seitenketten-Schutzgruppe zur Synthese der Peptide der Formeln I oder II sollten folgende Regeln beachtet werden:

(a) die Schutzgruppe muss gegenüber dem Reagens und unter den Reaktionsbedingungen, die zur Abspaltung der oG-Aminoschutzgruppe in den einzelnen Synthesestufen abgewandt werden, stabil sein;

(b) die Schutzgruppe muss ihre Schutzwirkung beibehalten und unter den Kopplungsbedingungen nicht abgespalten werden; und

(c) die Seitenketten-Schutzgruppe muss nach beendeter Synthese , d.h. bei Erhalt der gewünschten Aminosäuresequenz, unter Reaktionsbedingungen abspaltbar sein, die die Peptidkette nicht ändern.

Die Peptide der Formeln I und II können in fester Phase hergestellt werden. Die Synthese wird am C-Ende des Peptids unter Verwendung eines oG-aminogeschützten Harzes begonnen. Ein derartiges Ausgangsmaterial kann dadurch hergestellt werden, dass man X-Amino- und S-geschütztes Cys an ein chlormethyliertes oder hydroxymethyliertes Harz ankoppelt. Die Herstellung eines hydroxymethylierten Harzes ist bei Bodanszky et al., Chem. Ind. (London), Bd. 38, S. 1597-98 (1966) beschrieben. Ein chlormethyliertes Harz ist von den Bio Rad Laboratories, Richmond, California, im Handel und seine Herstellung ist bei Stewart et al., "Solid Phase Peptide Synthesis" (Freeman & Co., San Francisco 1969) , Kapitel 1, S. 1-6, beschrieben.

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Das <</-Amino- und S-geschützte Cys wird an das chlorraethylierte Harz nach dem Verfahren von Monahan und Gilon, Biopolymer, Bd. 12, S. 2513-19(1973) gekoppelt. Nach der Kopplung des ö^> -Amino- und S-geschützten Cys an den Kunstharzträger spaltet man die oG-Aminoschutzgruppe ab, z.B. mit Trifluoressigsäure in Methylenchlorid, Trifluoressigsäure allein oder HCl in Dioxan. Die Abspaltung erfolgt bei einer Temperatur von etwa 0⁰C bis Raumtemperatur.

Andere übliche Spaltungsreagenzien und Bedingungen zum Abspalten von spezifischen oG-Aminoschutzgruppen können ebenfalls angewandt werden; vgl. Schröder & Lübke, "The Peptides", Bd. 1, S. 72-75, Academic Press, (1965).

Nach dem Abspalten der -^C-Aminoschutzgruppe von Cys werden die übrigen .,<Ü,-Amino- und Seitenketten geschützten Aminosäuren stufenweise in der gewünschten Reihenfolge angekoppelt, so dass eine Verbindung der Formel III erhalten wird. Anstatt die einzelnen Aminosäuren getrennt der Synthese zuzuführen, können einige von ihnen auch gekoppelt werden, bevor man sie dem Festphasenreaktor zusetzt. Die Auswahl geeigneter Kopplungsreagenzien ist dem Fachmann geläufig. Ein besonders geeignetes Kopplungs:reagens ist N,N -Dicyclohexylcarbodiimid.

Die zur Festphasensynthese von Peptiden verwendeten Aktivierungsreagenzien sind in der Peptidchemie bekannt. Beispiele für geeignete Aktivierungsreagenzien sind (1) Carbodiimide, wie N-N-Diisopropylcarbο diimid und N-Äthyl-N -($-dimethylaminopropylcarbodiimid); (2) Cyanamide, wie Ν,Ν-Dibenzylcyanamid; (3) Ketimine; (4) Isoxazoliumsalze, wie N-Äthyl-5-phenylisoxazolium-3 -sulfonat; (5) einkernige stickstoffhaltige heterocyclische Amide mit aromatischem Charakter, die 1 bis 4 Ringstickstoffatome enthalten, z.B. Imidazolide, Pyrazolide und 1,2,4-Triazolide, wie N,N -Carbonyldiimidazol und N,N -Carbonyl-di-1,2,4-triazol; (6) alkoxylierte Acetylene, wie

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Äthoxyacetylen; (7) Reagenzien, die mit der Carboxylgruppe der Aminosäure ein gemischtes Anhydrid bilden, wie Chlorameisensäureäthylester und -isobutylester, und (8) stickstoffhaltige Heterocyclen, die an einem Ringstickstoffatom eine Hydroxylgruppe aufweisen, wie N-Hydroxyphthalimid, N-Hydroxysuccinimid und 1-Hydroxybenzotriazol. Andere Aktivierungsreagenzien und ihre Verwendung zur Peptidsynthese sind bei Schröder & Lübke, a.a.O, Kapitel III und Kapoor, J. Pharm. Sei., Bd. 59, S. 1-27 (1970) beschrieben.

Jede geschützte Aminosäure oder Aminosäuresequenz wird in den Festphasenreaktor in einem etwa 4-fachen Überschuss eingeführt und die Kopplung erfolgt in einem Medium aus Dimethylformamid/Methylenchlorid (1:1) oder Dimethylformamid/Methylenchlorid (1:1) oder in Dimethylformamid oder Methylenchlorid allein. Falls die Kopplung unvollständig verläuft, wird sie wiederholt, bevor die ocz-Aminoschutzgruppe abgespalten und die nächste Aminosäure angekoppelt wird. Die Vollständigkeit der Kopplungsreaktion wird in jeder Synthesestufe durch die Ninhydrinreaktion überprüft; vgl. E. Kaiser et al., Analyt. Biochem, Bd. 34, S. 595 (1970).

Nachdem die gewünschte Aminosäuresequenz der Formel III hergestellt worden ist, entfernt man das Peptid von dem Kunstharzträger durch Behandeln mit einem Reagens, wie flüssigem Fluorwasserstoff, das nicht nur das Peptid von dem Kunstharz,

1 2 sondern auch alle übrigen Seitenketten-Schutzgruppen X , X , X , X , X und X sowie die oG-Aminoschutzgruppe X abspaltet, so dass direkt ein Peptid der Formel I erhalten wird. Peptide der Formel II werden durch übliche Oxidation von Peptiden der Formel I erhalten. In einem alternativen Verfahren kann man das an den Kunstharzträger gebundene Peptid durch Alkoholyse von dem Harz abtrennen und den erhaltenen C-endständigen Methylester dann durch Hydrolyse in die Säure überführen. Etwa vorhandene Seitenketten-Schutzgruppen können hierauf auf die

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" ¹¹ " 28Ή327

vorstehend beschriebene Weise oder nach anderen Methoden abgespalten werden, z.B. durch katalytische Reaktion mit Pd-auf-BaSO., unter Bedingungen, bei denen die Trp-Gruppe intakt bleibt. Bei Verwendung von Fluorwasserstoff als Abspaltreagens wird dem Reaktionsgefäss Anisol als Abfangsubstanz zugesetzt.

Die vorstehend beschriebene Festphasensynthese ist an sich bekannt und z.B. bei Merrifield, J. Am.Chem. Soc., Bd. 85, S. 2149 (1964) beschrieben.

Die erfindungsgemässen Peptide enthalten weniger Aminosäuregruppen als Somatostatin und inhibieren die Ausschüttung von STH durch die Hpyophyse bzw. von Glucagon oder Insulin durch den Pankreas. Verschiedene erfindungsgemässe Peptide zeigen eine dissoziierte biologische Aktivität hinsichtlich der Inhibierung der STH-, Insulin- und Glucagonsekretion.

Erfindungsgemässe Peptide mit dissoziierter Wirkung hinsichtlich der Inhibierung der STH-, Insulin- und Glucagonsekretion haben besondere Bedeutung bei der Dxabetesbehandlung. Traditionell wird Diabetes als Krankheit betrachtet, die allein auf einer verschlechterten Insulinproduktion beruht. In jüngerer Zeit hat sich jedoch gezeigt, dass neben der Verringerung der Insulinsekretion ein weiterer Faktor beim Diabetes eine Rolle spielt. Bekanntlich liegt beim Diabetes einerseits ein Insulinmangel vor, während andererseits Glucagon normalerweise im Überschuss vorhanden ist. Es wird nun vermutet, dass die Anwesenheit von Glucagon ein mindest genau so wichtiger Faktor beim Diabetes ist wie die Abwesenheit von Insulin.

Die Tatsache, dass der Insulinmangel normalerweise durch einen Überschuss an Glucagon begleitet wird, hat Untersuchungen über die Rolle des Glucagons beim Diabetes erschwert. Es ist zwar sehr einfach, zusätzliche Mengen eines Hormons, wie Insulin, zu geben, jedoch hat es sich als äusserst schwierig erwiesen, die Konzentration von Glucagon zu senken. Die Entdeckung von Somatostatin hat die Untersuchungen über die Rolle von Glucagon beim Diabetes wesentlich erleichtert. Somatostatin inhibiert

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die Ausschüttung sowohl von Insulin als auch von Glucagon. Die Rolle von Somatostatin in der Diabetesforschung ist im einzelnen in Science, Bd. 188, S. 920-923 (30. Mai 1975) beschrieben. Bei Verwendung von Somatostatin zur Behandlung von Diabetes haben sich jedoch verschiedene Probleme ergeben. Somatostatin inhibiert die Ausschüttung von Insulin zusätzlich zu der von Glucagon. Daraus ergibt sich das Bedürfnis für ein Peptid, das bei der Diabetesbehandlung eine dissoziierte Wirkung hinsichtlich der Inhibierung der Insulin- bzw. Glucagonausschüttung besitzt. Die erfindungsgemässen Peptide haben eine derartige dissoziative Wirkung. Bestimmte erfindungsgemässe Peptide inhibieren nämlich wirksam die Sekretion von Glucagon, während sie hinsichtlich der Inhibierung der Insulinsekretion geringere Wirkung besitzen.

Die Peptide der Erfindung vereinen in sich die Vorteile von Somatostatin und bekannten Somatostatinanaloga, enthalten jedoch weniger Aminosäurekomponenten, z.B. 8 bis 10 Aminosäuregruppen, im Vergleich zu 12 bis 14 Aminosäuregruppen bei den meisten bekannten Somatostatinanaloga. Ein bedeutender wirtschaftlicher Vorteil der erfindungsgemässen Peptide besteht daher darin, dass sie relativ leicht herstellbar sind.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

Die erfindungsgemässen Peptide werden nach Festphasenmethoden hergestellt, die im wesentlichen dem Verfahren der US-PS 3 904 5 95 entsprechen. Die Synthese erfolgt stufenweise auf einem chlormethylierten Harz. Das Harz besteht aus feinen Perlen (20 bis 70 Mikron Durchmesser) eines Copolymerisate aus Styrol und 1 bis 2 % Diviny!benzol. Die Benzolringe wurden in einer Friedel-Crafts-Reaktion mit Chlormethylmethyläther und Zinnchlorid chlorine thy liert. Das auf diese Weise eingeführte Chlor ergibt reaktive Benzylchloridbindungen. Die Friedel-Crafts-

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Reaktion wird solange durchgeführt, bis das Harz 0,5 bis 2 mMol Chlor/g enthält.

Bei der folgenden Beschreibung der Peptidsynthese werden die verwendeten Reagenzien zunächst mit ihrem chemischen Namen sowie ihrer üblichen Abkürzung in Klammern bezeichnet. Im Anschluss wird dann nur noch die Abkürzung verwendet.

Ein Peptid, der Struktur:

H-CyS-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Phe-Phe-Cys-OH

wird nach dem Festphasenverfahren hergestellt. Andere Peptide lassen sich auf ähnliche Weise erhalten.

Das tert.-Butyloxycarbonyl-S-p-methoxybenzyl-(Boc-SpOMe-Bzl)-derivat von Cys wird nach einem der drei folgenden bekannten Verfahren an das Harz gekoppelt: (1) Rückfluss in Äthanol in Gegenwart von Triäthylamin, (2) das Cäsiumsalz der Bocgeschützten Aminosäure wird über Nacht in Dimethylformamid (DMF) bei 50⁰C gehalten , (3) das Kaliumsalz der Boc-geschützten Aminosäure wird 2 Stunden in Dimethylsulfoxid (DMSO) bei 80⁰C gehalten. Es wird nur 1 mÄq des geschützten Cys pro mÄq Cl in dem Harz verwendet.

Das Verfahren (3) wird im folgenden näher erläutert:

Eine Aufschlämmung des Harzes und des gelösten geschützten Cys in DMSO wird mit 0,9 mÄq Kalium-tert.-butoxid (KOtBut) pro mÄq der Aminosäure versetzt. Das Reaktionsgemisch wird der Luft so wenig wie möglich ausgesetzt, so dass keine bernsteinfarbene Verfärbung zu beobachten ist. Nach 2-stündiger Umsetzung bei 8 0⁰C erhält man ein geeignet substituiertes Harz für die Peptidsynthese (etwa 2 mÄq Aminosäurederivat/g Harz). Nach dem Abspalten der Schutzgruppen und Neutralisieren wird die Peptidkette auf dem Harz aufgebaut. Das Abspalten der Schutzgruppen, Neutralisieren und die Zugabe der Aminosäuren erfolgen nach dem Schema I. Es wird jeweils das N* -t-Butyloxycarbonyl-(Boc)

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derivat der Aminosäuren verwendet. Nach dem Abspalten der Schutzgruppen von dem ersten Rest (d.h. SpOMe·BzI"Cys) entsprechend dem Schema I (Stufen 3 bis 8) gibt man das N-Boc-derivat von Thr zusammen mit Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) als Kopplungsmittel zu (Stufe 9 in dem Schema I). Die Seitenkette von Thr wird mit O-Benzyläther (OBzI) geschützt. Als Schutzgruppe für die Lys-Seitenkette verwendet man Benzyloxycarbonyl (Z) oder Benzyloxycarbonyl-2C1 fZ (2-Cl) J.

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I. Schema für die Kopplung der Aminosäuren bei der Festphasensynthese (5-10 g Harz)

Stufe Reagenzien und Verfahrensweise Mischzeiten

min

1 Waschen mit 8 0 ml CH₂Cl₂ (2 x) 3

2 Waschen mit 30 ml Methanol (MeOH)

(2 x) 3

3 Waschen mit 80 ml CH₂Cl₂ (3 x) 3

4 50 % Trifluoressigsäure (TFA),
die 5 % 1,2-Äthandithiol enthält,

in 70 ml CH₃Cl₂ (2 x) 10

5 Waschen mit 8 0 ml CH₂Cl₂ (2 x) 3

6 12,5 % Triäthylamin (Et-,Ν) in

70 ml CH₂Cl₂ (2 x) 5

7 Waschen mit 4 0 ml MeOH ( 2 x) 2

8 Waschen mit 80 ml CH₂Cl₃ (3 x) 3

9 10 mMol Boc-Aminosäure in 10 ml
DMF ( 1 x) und 30 ml CH₃Cl₉ plus

10 mMol DCC in CH₂Cl₂ (2 xf 30 bis 120

10 Waschen mit 4 0 ml MeOH ( 2 x) 3

11 12,5 % Et₃N in 70 ml CH₃Cl₂ (2 x) 3

12 Waschen mit 30 ml MeOH (2 x) 3

13 Waschen mit 80 ml CH₂Cl₂ (2 x) 3

Nach Stufe 13 wird ein Aliquot für einen Ninhydrintest entnommen: falls der Test negativ ist, geht man zurück zur Stufe 1 für die Kopplung der nächsten Aminosäure; falls der Test positiv oder etwas positiv ist, geht man zurück zu den Stufen 9 bis Das Schema I wird zur Kopplung aller Aminosäuren des Peptids an Cys angewandt.

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Die Abspaltung der Peptide von dem Harz (5 g) und die Abspaltung der Seitenketten-Schutzgruppen des Peptids erfolgen in 75 ml Fluorwasserstoffsäure in Gegenwart von 8 ml Anisol. Nach dem Abtrennen der Fluorwasserstoffsäure unter Hochvakuum wäscht man den Harz-Peptid-Komplex mit Äther. Das getrockene Harz wird sofort mit 150 ml 25 %-iger Essigsäure extrahiert und mit entgastem Wasser (N₂) auf 3000 ml verdünnt. Hierauf stellt man den pH der Lösung mit NH.OH auf 6,6 bis 7,0 ein und titriert die Lösung tropfenweise unter Rühren mit Kaliumferricyanidlösung (1 g/500 ml H₃O), bis eine bleibende Gelbfärbung auftritt. Die Lösung wird 10 Minuten stehengelassen, worauf man mit Eisessig einen pH von 5,0 einstellt. Die trübe Lösung wird mit 10 bis 15 g Bio Rad AG 3-X4A-Harz in der Chloridform (100 bis 200 Mesh) versetzt und 15 Minuten gerührt. Anschliessend filtriert man die Lösung über Celite und gibt nacheinander auf zwei Säulen auf: a) Bio Rad AG 3-X4A-Harz in der Chloridform (10 ml); b) Bio Rex-79-Harz in der Kationform (100 ml) . Der Celite + Harz-Kuchen wird gründlich mit 500 ml Wasser gewaschen, worauf man die Waschlösung auf die Säulen a) und b) aufgibt. Das Peptidmaterial wird dann aus der Bio Rex-70-Harzsäule mit Pyridin/Essigsäure/Wasser (30:4:66) oder 50 %iger Essigsäure eluiert. Die Fraktionen werden aufgefangen, wobei man nur die peptidhaltigen (Ninhydrinreaktion positiv) mit Wasser verdünnt und sofort gefriertrocknet. Es werden 950 mg eines rohen cremfarbigen Materials erhalten, das man auf eine Sephadex G-25 F-Gelsäule (3 χ 200 cm) aufbringt, äquilibriert und mit 2n Essigsäure eluiert.

Das bei 280 nm beobachtete Elutioftsspektrum zeigt einen symmetrischen Hauptpeak. Durch Gefriertrocknen der mittleren Fraktion erhält man 550 mg, die einer Gegenstromverteilung unterworfen werden (Lösungsmittelsystem : n-Butanol/Essigsäure/Wasser

= 4/1/5) und hierbei 10 ml untere Phase pro Röhrchen ergeben. Nach Durchführung von 100 Übertragungen wird der Hauptpeak in den Röhrchen 57 bis 68 gefunden. Die Verbindung (250 mg) erweist sich bei der Dünnschichtchromatographie als homogen.

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23 Die spezifische optische Drehung beträgt /~oC7 = -67,8 +_ 2 (c = 1 in 1 % Essigsäure). Die Aminosäureanalyse des Materials ergibt das erwartete Verhältnis der verschiedenen Aminosäuren.

Für die Festphasensynthese können aktive Ester verwendet werden und die erfindungsgemässen Peptide können auch nach klassischen Syntheseverfahren hergestellt werden.

In vitro Bioassay

Die Wirkung der verschiedenen erfindungsgemässen Peptide auf die Wachstumshormonsekretion wird in vitro an Primärkultüren von enzymatisch dissoziierten Hypophysen-Vorderlappenzellen von Ratten nach der Methode von Vale et al., Endocrinology, Bd. 91, S. 562-571 (1972) geprüft. Hierzu behandelt man aus Ratten entfernte Hypophysen, um Zellen daraus abzutrennen. Die Zellen werden in Dulbecco-Modified-Eagle-Medium (Dulbecco et al., Virology, Bd. 8, S.396 (1949) in Kulturschälchen eingebracht. Die Zellkulturen werden mit Kohlendioxid und Sauerstoff versorgt und 4 bis 5 Tage bei 37°C gehalten, bevor sie in dem Assay eingesetzt werden. Nach dem Wechsel des Mediums inkubiert man die Zellkulturen 4 Stunden und versetzt mit bestimmten Somatostatinpeptiden. Mit Hilfe der Radioimmunoassayanalyse bestimmt man das Ausmass der Wachstumshormonsekretion, die in Nanogramm/Stunde ausgedrückt wird.

Die inhibierende Wirkung von Somatostatin und Dihydrosomatostatin (als Vergleichssubstanzen) sowie der erfindungsgemässen Peptide auf die Ausschüttung von Glucagon und Insulin wird folgendermassen untersucht.:

In vivo Bioassay

Männliche Sprague-Dawley-CD-Ratten mit einem Körpergewicht von 180 bis 200 g, die in temperatur- und feuchtigkeitskontrollierten Quartieren mit 14 Stunden Helligkeit und 10 Stunden Dunkelheit (Licht 0700-21100) gehalten werden, werden

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in allen Versuchen verwendet. Die Tiere erhalten eine Standardnahrung und Leitungswasser ad libitum Die Versuche werden mindestens 5 Tage nach Bezug der Ratten vom Lieferanten zwischen der 1400. bis 1600. Stunde durchgeführt. Nach dem Betäuben mit Äther werden 0,2 ml der Peptide bzw. Kochsalzlösung über die äussere Jugularvene verabfolgt. Bis zur Blutentnahme aus der Portalvene bleiben die Tiere betäubt. Die Blutproben werden in gekühlte Röhrchen eingebracht, die 10 mg EDTA und 50 μΐ m-Benzamidin pro ml Blut enthalten.

Zur Insulin- und GlucagonbeStimmung wird Plasma bei -20⁰C gehalten. Der Insulinspiegel wird nach der Methode von Herbert et al., J. Chem, Endocr. Metab. Bd. 25, S. 1375

(1965) unter Verwendung von Schweine-Insulinantiserum und

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einem J-jodierten Insulintracer bestimmt. Der Menschen-Insulinstandard wird von Schwarz-Mann, Orangeburg, New York, bezogen. Glucagon wird nach der Methode von Faloona und Unger, in Jaffe et al ed., Methods of Hormone Radioimmunoassay, Academic Press, New York, (1974) S. 317, unter Verwendung von Glucagon-Antiserum 3OK bestimmt. Cellulose wird nach der Glucoseoxidasemethode unter Verwendung eines Beckmann Glucose-Analysators bestimmt.

Die STH-Bestimmungen erfolgen an Gewebekulturmedien unter Verwendung der folgenden Reagenzien: NIAMDD-Ratten-STH-Standard (GH-RP-1), NIAMDD-Affen-Antiratten-STH (GH-Serum-3) und hoch-reinem Ratten-STH für die Jodierung.

Alle Versuche werden nach einem stastischen Blockschema durchgeführt. Nach der Varianzanalyse wird der Unterschied zwischen den Behandlungen mit Hilfe der Mehrbereichstests von Dunnett und Duncan ermittelt. Die Wirkungswerte werden aus A- bzw. 6-Punkt -Bioassays errechnet.

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Verschiedene erfindungsgemässe Peptide werden nach der vorstehend beschriebenen Festphasenmethode hergestellt. Die Zusammensetzung dieser Peptide ist in Tabelle I wiedergegeben. Tabelle I zeigt auch die prozentuale Wirksamkeit der Peptide hinsichtlich der Hemmung der STH-, Insulin- und Glucagonsekretion, wobei Somatostatin als Bezugsgrösse dient.

Tabelle I

Somatostatin (Vergleich)

Wachstums	Insulin	Glucagon
hormon
100	100	100

erfindungsgemässe Peptide

R₁ R₂ R₃ R₄ R₅

desR. D-Trp Phe

Asn D-Trp Phe

Asn Trp Phe

Asn D-Trp Phe Thr

desR.	desR	6	80	1	00
desR₄	desR₅	(D-Cys)¹¹ 14	100	1	00
Thr	desR₅	35	10-100	1	00
desR.	desRj.	<11	100		-11
Thr	desR[-	3	100		*1
Thr	desR,.	10	200	10-1	00

Claims

Patentanwälte Dipl.-Ing. H. ~Wn< ckmann, Dipl.-Phys. Dr. K. Fincke

Dipl.-Ing. F. A.Weickmann, Dipl.-Chem. B. Huber Dr. Ing. H. Li ska

28Ί3327

Ba/ht 8000 MÜNCHEN 86, DEN -p ..'',.fi

POSTFACH 860S20 ' ' " '

MÖHLSTRASSE 22, RUFNUMMER 983921/22

THE SALK INSTITUTE FOR BIOLOGICAL STUDIES, La Jolla, Calif., USA

10010 North Torrey Pines Road

Peptide

PATENTANSPRÜCHE

I . Peptide der allgemeinen Formeln

I C^s-R, -Phe-Phe-R₉-Lys-R₃-Phe-R,j-R₅-Cys

II Cys-R₁-Phe-Phe-R₂-Lys-R₃-Phe-R₄-R₅-Cys

III X-Cys (X¹) -R^Phe-Phe-R^Lys (X²) -R₃ (X³) -PtIe-R₄ (X⁴)

R₅(X⁵)-Cys (X⁶)-R₆

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OP INSPECTED

in denen R₁ Asn oder desR₁ bedeutet, R Trp oder D-Trp ist, R₃ Phe oder Thr bedeutet, R₄ Thr oder desR₄ ist, R₅ Ser, Phe oder desRj- bedeutet, mit der Massgabe, dass mindestens eine der Gruppen R₁ , R. bzw. R₁- wegfällt, X H oder eine

o^-Aminoschutzgruppe ist, X und X H oder Schutzgruppen für Cys aus der Reihe: S-p-Methoxybenzyl, S-Acetamidomethyl, S-Trityl und S-Benzyl bedeuten, X H oder eine Seitenketten-

3 4 5 Aminoschutzgruppe ist, X , X und X H oder Hydroxylschutzgruppen aus der Reihe: Acetyl, Benzoyl, tert.-Butyl, Trityl, Benzyl und Benzyloxycarbonyl bedeuten, mit der_Massgabe, dass mindestens eine der Gruppen X,X,X,X,X,X bzw. X kein H ist, und R, eine Hydroxy-, Methoxy-, Ester-, Amid- oder Hydrazidgruppe oder eine Verankerungsbindung, wie sie bei der Festphasensynthese zur Bindung an eine festen Kunstharzträger verwendet wird, aus der Reihe: -0-CH₂-Polystyrolharzträger und -0-CH₂-Benzyl-Polystyrolharzträger bedeutet.
2. Peptide nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass R₁ desR₁, R„ D-Trp, R₃ Phe, R₄ desR₄ und Rj- desRj- bedeuten.
3. Peptide nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , dass R₁ desR.. , R„ D-Trp, R^ Phe, R. desR.

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und Rr desRj- bedeuten und Cys durch D-Cys ersetzt ist.
4. Peptide nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , dass R₁ desR₁, R₂ D-Trp, R₃ Phe, R₄ desR₄ und R₁. desR,- bedeuten.
5. Peptide nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , dass R₁ Asn, R₀ D-Trp, R_ Phe, R. desR und R₅ desR₅ bedeuten.
6. Peptide nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , dass R₁ Asn, R~ Trp, R₃ Phe, R₄ Thr und R_g desR^ bedeuten.

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7. Peptide nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass R. Asn, R D-Trp, R- Phe, R. Thr und R₁- desR^ bedeuten.

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