SE446190B - Forfarande for framstellning av somatostatinanaloger - Google Patents

Description

RO 7803318-0 2 Somatostatin och många analoger till somatostatin uppvisar aktivitet med avseende på inhiberíngen av sekretion av tillväxt- hormon (GH) från in vitro odlade, disporgerade celler från fram- loben av råtthypofys och med avseende på inhiberingen av insulin- och glukagonsekretionen in vivo i råttor. Vid användningen av somatostatin hardet ansetts vara höggradigt önskvärt att selektiv inhibering av endast sekretionen av tillväxthormon, insulin eller glukagon skulle vara möjlig. Man har därför försökt utveckla ana- loger av somatostatin som uppvisar dissocierad biologisk aktivitet och som inhiberar enbart sekretion av tillväxthormon, insulin eller glukagon. Fastän det har rapporterats att olika mängder av somato- statin skulle fordras för inhibering av insulin i jämförelse med inhibering av glukagon i människa och perfuserad râttpancreas in vitro uppvisar somatostatin och vissa somatostatinanaloger likar- tad verkan med avseende på inhiberingen av dessa tvä hormoner in vivo.

Enligt föreliggande uppfinning har det visat sig att vissa aminosyror kan avlägsnas och/eller omordnas i somatostatin- och dihydrosomatostatinpeptider så att nya peptider erhålles uppvisan- de färre aminosyrakomponenter och vilka uppvisar biologisk aktivi- tet med avseende på inhiberingen av tillväxthormon-, insulin- eller glukagonsekretíon. En del av de nya peptiderna som framställes enligt uppfinningen uppvisar dissocierad aktivitet. De enligt upp- finningen framställda nya peptiderna som uppvisar färre aminosyra- komponenter än somatostatin eller dihydrosomatostatin anses vara av stort värde på grund av att dessa peptider kan framställas rela- tivt enkelt.

Föreliggande uppfinning avser sålunda ett förfarande för framställning av en peptid användbar såsom farmaceutika, känne- tecknat av koppling av Cys-aminosyra till ett klorometylerat harts eller ett hydroximetylharts genom framställning av en ester av hartset och Na-skyddad Cys-aminosyra och av efterföljande stegvis koppling på i sig känt sätt av Na-skyddade aminosyror till Cys-aminosyran, varvid en peptid bildas uppvisande strukturen cys-Rl-Phe-Pne-Rz -Lys-Thr--Pne-Ru-cys (I) vari R1 betecknar Asn eller des-H1; R2 betecknar Trp eller D-Trp; och Ru betecknar Thr eller Des-Ru; och vari Cys utgöres av antingen D-Cys eller L-Cys; varefter erhållen hartskopplad peptid, vilken peptid har formeln (I), avspjälkas från hartset på i sig känt sätt, och erhållen peptid med formeln (I) even- 7803318-Û tuellt oxideras varvid en peptid erhålles med formel dyšlfil-Phe-Pne-H2-Lys-Tnr-Phe-RÅ-cys (II) Nomenklaturen som används för beskrivning av föreliggande peptider överensstämmer med konventionell praxis varvid de första tre bokstäverna i trivialnamnet användes. Enligt sådan praxis av- _ses också L-formen av aminosyran om inte annat uttryckligen indi- keras. I detta sammanhang bör det påpekas att var och en av Cys- aminosyragrupperna kan vara antingen D-Cys eller L-Cys. f Farmaceutiskt godtagbara syraadditionssalter av peptiderna kan också framställas enligt uppfinningen. Sådana syraadditions- salter innefattar, men begränsas ej till, hydroklorid, hydrobromid, sulfat, fosfat, maleat, acetat, citrat, bensoat, succinat, malat, askorbat, tartrat och dylika.

I förfarandet enligt uppfinningen erhålles mellanprodukter med formeln: X-cys(X1)-H1-Pne-Pne-H2-Lys(X2)-Thr(x5)-Phe-Ru(x4)-cys(X6)~R6 III vari X antingen betecknar väte eller en Afaminoskyddande grupp.

De aêaminoskyddande grupperna som avses med X är sådana man känner till kan användas inom tekniken för stegvis syntes av polypeptider.

Bland sådana grupper av kêaminoskyddande grupper som omfattas av X innefattas (1) acyl-typ-skyddsgrupper såsom formyl, trifluoro- acetyl, ftalyl, toluensulfonyl (tosyl), bensensulfonyl, nitrofenyl- sulfenyl, tritylsulfenyl, o-nitrofenoxiacetyl, kloroacetyl, acetyl, y-klorobutyryl, etc.; (2) aromatisk-uretan-typ-skyddsgrupper såsom bensyloxikarbonyl och substituerad bensyloxikarbonyl, såsom p-kloro~ bensyloxikarbonyl, p-nitrobensyloxikarbonyl, p-bromobensyloXikar- bonyl, p-metoxibensyloxikarbonyl3 (3) alifatiska uretan-skyddsgrup- per; såsom met-butyloxikarbonyl, diisopropylmetoxikarbonyl, iso- propyloxikarbonyl, etoxikarbonyl, allyloxikarbonyl; (Ä) cykloalkyl~ uretan-typ-skyddsgrupper, såsom cyklopentyloxikarbonyl, adamantyl- oxikarbonyl, cyklohexyloxikarbonyl; (5) tiouretan-typ-skyddsgrupper, såsom fenyltiokarbonyl; (6) alkyl-typ-skyddsgrupper, såsom trife- nylmetyl (trityl), bensy1;(7) trialkylsilangrupper, såsom trimetyl- níhm. I-“tön-efln-.flgvzx OC-amlnoaskydriarzwle: grupp :som definieras gerxom li är t-butyloxikarbonyl.

X1 och X betecknar var och en skyddande grupper för Cys och utgöres av S-p-metoxibensyl, S~p-metylbensyl, S-acetamidometyl, S-trityl, S~bensyl och liknande. Föredragen skyddsgrupp är S-p-met- BO H0 17303318-0 6 kan beteckna väte vilket innebär att oxibensyl. X1 och/eller X det ej finns någon skyddsgrupp på svavelgruppen.

X2 betecknar en skyddande grupp för sidokedje-aminosubstitu- enten i lysin eller X2 betecknar väte vilket innebär att det ej finns någon skyddande grupp på sidokedje-aminosubstituenten. Bely- sande för lämpliga sidokedje-aminoskyddande grupper är bensyl, klorobensyloxikarbonyl, bensyloxikarbonyl, tosyl, t-amyloxikarbo- nyl, t-butyloxikarbonyl, etc. Utväljandet av sådana sidokedjeamino- skyddande grupper är ej kritiskt förutom att det måste vara en grupp som ej kan avlägsnas under avlägsnandet av skyddande grupper på aßaminogrupperna under syntesen. Följaktligen kan den aêamino- skyddande gruppen och sidokedje-aminoskyddande gruppen ej vara densamma.

X5 och Xu betecknar skyddande grupper för hydroxigruppen i Thr och utgöres av acetyl, bensoyl, t~butyl, trityl, tetrahydropyranyl, bensyl, 2,6-diklorobensyl och bensyloxikarbo- nyl. Föredragen skyddande grupp är bensyl. X3 och/eller Xu kan beteckna väte vilket innebär att det ej finns någon skyddande grupp på hydroxigruppen.

R1, R¿ oßh Ru har tidigare angiven betydelse. R 6 utgöres av OH, OCHB, estrar, amider, hydrazider el1er=enbensyl- ester- eller hydroximetylesterförankringsbindning som användes vid syntes i fast fas och är bunden till en fast hartsbärare som representeras av formlerna: -O-CH2-polystyrenhartsbärare och 0-CH2-bensyl-polystyrenhartsbärare.

Polymeren utgöres företrädesvis av en sampolymer av styren med cirka 0,5-2,0 % divinylbensen såsom bryggbildare som medför att polystyrenpolymeren är fullständigt olöslig i vissa organiska lös- ningsmedel. I formel III är åtminstone en av X, X1, X2, X3, Xu och X6 en skyddande grupp.

Vid utväljandet av en speciell sidokedjeskyddande grupp som skall användas i syntesen av peptiderna med formel I eller formel II bör följande regler följas: I (a) den skyddande gruppen måste vara stabil gentemot reagen- sen och under-reaktionsbetingelserna som utväljes för avlägsnande av den. kêaminoskyddande gruppen i varje steg av syntesen; (b) den skyddande gruppen måste bibehålla sina skyddande egenskaper och får ej avspjälkas under kopplingsbetingelser; och (c) den sidokedjeskyddande gruppen måste vara avlägsningsbar H0 7803318-0 efter fullbordandet av syntesen omfattande den önskvärda aminosyra- sekvensen under reaktionsbetingelser som ej förändrar peptidkedjan.

Peptiderna med formel I och formel II kan framställas med användning av syntes i fast fas. Syntesen påbörjas från peptidens C-ände med användning av ett nëaminoskyddande harts. Ett sådant utgångsmaterial kan framställas genom att en kêamino- och S-skyd- dad Cys bindes till ett klormetylerat harts eller ett hydroximetyl- harts. Framställningen av hydroximetylhartset beskrives av Bodanszky et al., Chem. Ind. (London) 38, 1597-98 (1966). Ett klor- metylerat harts är kommersiellt tillgängligt från Bio Rad Labora- tories, Richmond, Kalifornien och framställningen av ett sådant harts beskrives av Stewart et al., "Solid Phase Peptide Synthesis" (Freeman & Co., San Francisco 1969), kap. 1, sid. 1-6. aßamino- och S-skyddad Cys kopplas till det klorometylerade hartset enligt förfarandet som beskrives av Monahan och Gilon, Biopolymer 12, sid. 2515-19, 1973. Efter kopplingen av aeamino- och S~skyddad Cys till hartsbäraren avlägsnas den aéaminoskyddande gruppen, exempelvis med användning av trifluoroättiksyra i metylenklorid, trifluoroättiksyra enbart eller HCl i dioxan. Avblockeringen genom- föres vid en temperatur av mellan cirka OOC och rumstemperatur.

Andra spjälkningsreagens och betingelser för avlägsnande av specifika Gåaminoskyddande grupper som utgör standard kan använ- das såsom beskrives av Schröder & Lübke, "The Peptides", 1, sid. 72-75 (Academic Press 1965).

Efter avlägsnandet av den aeaminoskyddande gruppen från Cys kopplas de återstående qfamino- och sidokedjeskyddade aminosyror- na stegvis i önskvärd ordning för erhållande av en förening med formel III ellen såsom ett alternativ till att varje aminosyra sättes separat till syntesen,kan en del av dem kopplas före till- satsen till fast-fas-reaktorn. Fackmannen kan lätt utvälja lämp- ligt kopplingsreagens. Speciellt lämplig såsom kopplingsreagens är N,N1-dicyklohexylkarbodiimid.

Aktiveringsreagensen som användes i syntesen i fast fas av peptiderna är sådana som är välkända inom peptidtekniken. Exempel på lämpliga aktiveringsreagens är (1) karbodiimider, såsom N,N-di- isopropylkarbodiimid, N-etyl-N1-(y-dimetylaminopropylkarbodiimid); (2) cyanamider, såsom N,N-dibensylcyanamid; (3) keteniminer; (U) isoxazoliumsalter, såsom N-etyl-5-fenylisoxazolium-31-sulfonat; (5) heterocykliska amider av aromatisk karaktär innehållande mono- cykliskt kväve och 1-4 kväve i ringen, såsom imidazolider, pyra- zolider, 1,2,M-triazolider. Specifika heterocykliska amíder, som är æi gw _återstående sidokedjeskyddande grupper X1,_X _“7803318-Û 6 användbara innefattar N,N1-karbonyldiimidazol, N,N1-karbonyl-di- 1,2,4-triazol; (6) alkoxylerad acetylen, såsom etoxíacetylen; (7) reagens som bildar en blandad anhydrid med karboxigruppen i ' aminosyran, såsom etylklorformiat och isobutylkloroformiat, och (8) kväveinnehâllande heterocykliska föreningar uppvisande en hydroxigrupp på ett ringkväve, såsom N-hydroxiftalimid, N-hydroxí- succinimid och 1-hydroxibensotriazol. Andra aktiverande reagens och användningen av dessa vid peptidkoppling beskrives av Schröder & Lfibke, supra, kap. III och av Kapoor, J. Pharm. Soi., 59, sid. 1-27 (1970).

Varje skyddad aminosyra eller aminosyrasekvens införes i reaktorn för fast fas i ungefär fyrfaldigt överskott och koppling- en genomföres i ett medium av dimetylformamíd: metylenklorid (lzl) eller i dimetylformamid:metylenklorid (1:1) eller i enbart dime- tylformamid eller metylenklorid. När ofullständig koppling inträf- far upprepas kopplingsförfarandet innan den åéaminoskyddande grup- pen avlägsnas och före kopplingen av nästa aminosyra. Framgången av kopplingsreaktionen i varje stadium av syntesen övervakas genom ninhydrinreaktionen såsom beskrives av E. Kaiser et al., Analyt.

Biochem, BH, 595 (1970).

Efter det att önskvärd aminosyrasekvens med formel III har syntetiserats avlägsnas peptiden från hartsbäraren genom behand- ling med ett reagens, såsom vätskeformig vätefluorid, som ej en- dast avspjälkar peptiden från hartset utan också avspjälkar alla 2, X3, Xnoch X6 och den, Aêaminoskyddande gruppen X så att en peptid med formel I direkt erhålles. Peptider med formel II erhålles genom oxidering av peptider med formel I i enlighet med kända förfaranden. Alter- nativt kan peptiden bunden till hartsbäraren avspjälkas från hart- set genom alkoholys varefter utvunnen C-avslutad metylester över- föres till syran genom hydrolys. Eventuella sidokedjeskyddande I grupper kan därefter avspjälkas såsom beskrivits tidigare eller med andra metoder, exempelvis katalytisk reduktion (exempelvis Pd på BaS0u) med användning av betingelser som bibehåller Trp-grup- pen intakt. När vätefluorid användes för avspjälkning ínföres ani- sol i reaktionskärlet såsom ett inaktiveringsmedel för föroreningar.

Förfarandet för syntes i fast fas som diskuterats ovan är välkänt inom denna teknik och har väsentligen beskrivits av Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85, sid. 21ü9 (1964).

Föreliggande peptider som uppvisar dissocierade effekter med avseende på inhibering av frigöring av tillväxthormon, insulin och 50 40 7803318-0 7 glukagon anses vara speciellt betydelsefulla i samband med behand- ling av diabetes. Den traditionella synen på diabetes har varit att detta är en sjukdom som enbart uppstår till följd av skadad insulinproduktion. När den kliniska erfarenheten och erfarenheter från forskning har blivit mer omfattande har det visat sig att någon faktor förutom skadad insulinsekretion medverkar till diabetes. Det är känt att fastän insulin normalt utgör en brist vid diabetes förekommer glukagon normalt i överskott. Man antar därför för närvarande att närvaron av glukagon är en åtminstone lika betydelsefull faktor vid diabetes som frånvaron av insulin.

Det faktum att insulinbrist normalt åtföljes av ett över- skott av glukagon har gjort det svårt att studera glukagonens roll vid diabetes. Fastän det är lätt att tillsätta extra mängder av ett hormon, såsom insulin, har det visat sig vara mycket svårt att sänka koncentrationen av glukagon. Upptäckten avsomatostatin har underlättat forskning med avseende på glukagonens roll vid diabe- tes. Somatostatin inhiberar frigörandet av både insulin och gluka- gon. Somatostatins roll vid diabetesforskning beskrives närmare i Science, Vol. 188, sid. 92H-925, 50 maj 1975. Emellertid finns det åtskilliga problem med avseende på användningen av somatostatin för behandling av diabetes. Somatostatin inhiberar frigöringen av insulin förutom av glukagon. Följaktligen finns det ett behov av en peptid uppvisande dissocierad effekt med avseende på inhibering~ en av frigöring av insulin och glukagon i samband med behandling av diabetes. Föreliggande nya peptider uppvisar en sådan dissocie- rad effekt. Mer speciellt är vissa av peptiderna som kan framstäl- las enligt uppfinningen effektiva med avseende på inhibering av glukagonsekretion under det att de uppvisar mindre effekt på inhi- beringen av insulinsekretion.

Peptiderna som kan framställas enligt uppfinningen uppvisar fördelarna med somatostatin och kända somatostatinanaloger men uppvisar färre aminosyrakomponenter, exempelvis 8-10 aminosyra- grupper i jämförelse med-12-lä aminosyragrupper för de flesta kän- da somatostatinanalqgflma.Följaktligen är peptiderna som framstäl- les enligt uppfinningen signifikant fördelaktiga i ekonomiskt hän- seende på grund av att de är relativt enkla att framställa.

Följande exempel belyser föreliggande uppfinning närmare.

Exempel 1. Enligt föreliggande uppfinning framställes peptider med fast-fas-teknik, i allmänhet i enlighet med förfarandet som beskrives i den amerikanska patentskriften 3 QOM 595. Syntesen genomfördes stegvis på klorometylerat harts. Hartset bestod av 7303518-o 8 fina pärlor (20-70 pm diameter) av ett syntetharts framställt ge- nom sampolymerísation av styren och 1-2 % divínylbensen. Bensen- ringarna i hartset var klorometylerade enligt en Friedel-Crafts- reaktion med klorometylmetyleter och tenn(IV)klorid. Sålunda in- fört klor utgör en bindning av typ reaktiv bensylklorid. Friedel- -Crafts-reaktionen fortsattes tills hartset innehöll 0,5-2 mmol ' klor per gram harts. Vid beskrivning av syntesen av peptiderna kommer i det följande de använda reagensen först beskrivas med kemiskt namn med gängse förkortningar inom parentes. Därefter kom- mer reagenset att betecknas med den gängse förkortningen.

En peptíd med strukturen: H-Gys-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe~Cys-OH framställdes med följande fast-fas-metodik. Övriga peptíder som beskrives i det följande framställdes med likartad teknik.

Till hartset bands t-butyloxikarbonyl-S-parametoxibensyl- (Boo-SpOMe-Bzl) derivatet av Cys genom någon av tre kända metoder: (1) återloppskokning i etanol i närvaro av trietylamin; (2) ett cesiumsalt av den Boc-skyddade aminosyran hölls vid 5000 i dimetylformamid (DMF) över natten; (3) kaliumsaltet av den Boc- skyddade aminosyran hölls vid 8000 i dimetylsulfoxid (DMSO) under 2 timmar. Endast en milliekvivalent av skyddad Cys per milliekvi- valent Cl på hartset användes.

Metod (5) beskrives närmare nedan. Till en uppslamning av hartset och löst skyddad Cys i DMSO sattes 0,9 mekv kalium-t- butoxid (K0tBut) per mekv aminosyra. Reaktionsblandningen utsat- tes för luft i så liten utsträckning som möjligt så att ingen bärnstensfärg iakttogs. Reaktion vid 8000 under 2 timmar ger ett lämpligt substituerat harts för syntes av peptiderna (cirka 0,2 mekv aminosyraderivat per g harts). Efter avblockering odineutra- lisation byggs peptidkedjan på hartset. Avblockering, neutralisa- tion och tillsats av varje aminosyra genomföres i enlighet med schema I. NN-t-butyloxikarbonyl-(Boc) derivat av varje aminosyra användes.~Efter avblockering av den första resten (dvs SpOMe.Bzl.

Cys) enligt schema I (steg 3-8) tillsättes därefter N-Boc-deriva- tet av Thr tillsammans med ett kopplingsmedel som utgöres av di- cyklohexylkarbodiimid (DCC) (steg 9 i schema I). Sidokedjan av Thr är skyddad med O-bensyleter (0Bzl). Bensyloxikarbonyl (Z) el- ler bensyloxikarbonyl-2Cl [Z(2-Cl)] användes såsom skyddande grupp för Lys-sidokedjan. 9 7803318-'0 I. Schema för koppling av aminosyror i fast-fas-syntes (5-10 g harts) ßteg Reagens och operationer Blandnings- tid min. 1 CH2Cl,-tvättning, 80 ml (2 gånger) 5 2 Metanol-(MeOH) tvättning, 30 ml (2 gånger) 3 - 3 CHZCI2-tvättning, 80 ml (5 gånger) 3 4 50-procentig trifluoroättiksyra (TFA) inne- hållande 5 % 1,2-etanditiol i CHiClD, 70 ml (2 gånger) " 6 “ 10 CH2Cl2-tvättning, 80 ml (2 gånger) 6 Trietylamin (EcBN) 12,5 % i CH2Cl2, 70 ml (2 gånger) 5 7 Me0H-tvättning, HO ml (2 gånger) ' 2 CH2Cl2-tvättning, 80 ml (5 gånger) 3 Boc-aminosyra (10 mmol) i 10 ml DMF (1 gäng) och ml CH2Cl2 plus DCC HDlmwl)i ÜÉßl2(2 M) BG-120 MeOH-tvättning, H0 ml (2 gånger) 3 11 Et3N, 12,5 % i CH2Cl2, TO ml (2 gånger) 3 12 MeOH~tvättning, 30 ml (2 gånger) 3 13 CH2Cl2-tvättning, 80 ml (2 gånger) 3 Efter steg 15 uttogs en alikvot del för ett ninhydrintest: Om testet är negativt återvänder man till steg 1 för koppling av nästa aminosyra; om testet är positivt eller något positivt åter- vänder man till stegen 9-13. Schema I användes för koppling av var och en av aminosyrorna i peptiden till Cys.

Avspjälkning av peptiderna från hartset (5 g) och avspjälk- ning av sidokedjeskyddande grupper i peptiden genomfördes i fluor- vätesyra (75 ml) i närvaro av anisol (8 ml). E ter eliminering av fluorvätesyra under högvakuum tvättades hartset-peptiden med eter.

Det torkade hartset extraherades omedelbart med 25-procentig ättiksyra (150 ml) och späddes till 3000 ml med avgasad H20 (N2).

Lösningens pH-värde justerades till 6,6-7,0 med NHMOH. Lösningen titrerades droppvis under omröríng med kaliumferricyanidlösning (1 g/500 ml H90) tills en permanent gul färg iakttogs. Lösningen Fick stå under 10 minuter och pH-värdet justerades till 5,0 medelst ättika; Bio Rad AG 5~XUA harts (100-300 mwsh, klorldførm, 10-15 g) sattes till den turbida lösningen och det hela omrördes under 15 minuter. Lösningen filtrerades över celíte och anbringades succee~ BO H0 7803318-0 10 sivt på två kolonner; a) Bio Rad AG 3-XÄA harts i kloridform (10 ml); b) Bio Rex-70 harts (100 ml) i katjonform. Kakan av I celite och harts tvättades noggrant med vatten (500 ml) som påför- des kolonnerna a) och b) såsom en tvättning. Peptidmaterialet elu- erades därefter från kolonnen av Bio Rex~70 harts med pyridin: ättiksyra:vatten (30:H:66) eller 50-PP0@¶Wïg ättiksyra. Fraktio- ner tillvaratogs; endast sådana innehållande peptíd (ninhydrin- positiva) späddes med vatten och lyofilíserades omedelbart. 950 mg av ett rått gräddfärgat material erhölls. Detta påfördes en Sephadex G-25 F gelkolonn (3x200 cm) ekvilibrerad och eluerad med 2-N ättiksyra.

Elueringsmönstret som iakttogs vid 280 nm visar en övervägan- de symmetrisk topp. Efter lyofilisering gav centrumfraktionen 550 mg som utsattes för motströmsfördelning (lösningsmedelssystem n-butanol:ättiksyrazvatten, U:1:5) med 10 ml lägre fas per rör. 100 överföringar genomfördes och den övervägande toppen erhölls i rören 57-68. Föreningen (250 mg) föreföll homogen med tlc.

Den specifika optiska rotationen var ÄK723 = -67,8 É 2 (c=1 i 1-procentig ättiksyra). Aminosyraanalys av detta material bekräftade förväntat förhållande med avseende på de olika amino- syrorna.

'Aktiva estrar kan användas i fast-fas~syntes och de klassis- ka syntesmetoderna kan också användas för framställning av före- liggande peptider.

Biotest in vitro: Effekterna av de olika peptíderna som framställes enligt uppfinningen testades in vitro på sekretionen av tillväxthormon genom primära kulturer av enzymatiskt dissocie- rade hypofysframlobsceller från råtta med metoden enligt Vale et al., Endocrinology 91: sid. 562-571 (1972). Testet genomfördes genom behandling av hypofysen som avlägsnats från råttor till se- parata celler därav. Cellerna placeras i odlingsskâlar i Dulbeccc's Modified Eagle Medium (Dulbecco et al., Virology, vol. 8, sid. 595, 1949). Koldioxidgas och syre tillfördes cellkulturerna som hölls vid 5700 under M-5 dagar före användning vid testet. Efter medium- ändringar inkuberades cellkulturer under en period av H timmar och speciella somatostatinpeptider sattes därtill. Radioimmunotest- analys användes för bestämning av graden av tillväxthormonsekre- tion som uttrycktes i ng/h.

En undersökning av effekten av somatostatín, dihydrosomato- statin (såsom kontroller) och för~liggande pcphidnr med avseende \Fl 11 7803518-0 på inhiberíng av frigöringen av glukagon och insulin genomfördes på följande sätt: Biotest in vivo: Sprague-Dawley-CD-råttor (hanar) vägande 180-200 g förvarades vid reglerade temperatur- och fuktighetsbe- tingelser varvid 1U h ljus och 10 h mörker (ljus 0700-21100) an- vändes i alla experiment. Djuren utfodrades med standardportioner och fri tillgång till kranvatten. Experimenten genomfördes åtmins- tone 5 dagar efter det att råttorna erhållits från uppfödaren mel- lan kl 14.00 och 16.00. Efter eteranestesi adminístrerades pepti- der eller salin i en volym av 0,2 ml via den yttre jugularvenen.

Djuren förblev anesteserade tills tidpunkten för bloduppsamling från portådern. Blodproverna placerades i kylda rör innehållande mg EDTA och 50¿fl.1M bensamidin per ml blod.

Plasma förvarades vid -2000 för insulin- och glukagonbestäm- ningar. Insulinhalter bestämdes genom förfarandet enligt Herbert et al., J.Chem. Endocr. Metab. 25:1375, 1965, med användning av Porcin-ínsulinantisera och (1251) joderat ínsulínspårämne. Human- insulinstandard erhölls från Schwarz-Mann, Orangeburg, New York.

Glukagonen hstämdes med förfarandet enligt Faloona och Unger, Jaffe et al., Methods of Hormone Radioimmunoassay, Academic Press, New York,197H, sid. 317, med användning av glukagon-antisera 30K.

Cellulosa bestämdes med glukosoxidasförfarandet med användning av en Beckman glukosanalysator.

Tillväxthormon-bestämningar genomfördes på vävnadsodlings- medier med användning av följande reagens: NIAMDD rått-til1växt- hormon-standard (GH-RP-1), NIAMDD ap-anti(rått-tillväxthormon) (GH-serum-3) och höggradigt renat rått-tillväxthormon för jodering.

Alla försök genomfördes enligt ett slumpvis blockgenomföran- de. Efter analys bestämdes variansskillnaden mellan behandlingar enligt Dunnett och Duncan ("multiple range tests"). Potensvärden beräknades med H- eller 6-pumms biotester.

Olika peptider enligt uppfinningen framställdes med ovan beskriven fast-fas-metodik. Peptidernas komposition anges i ta- bell I nedan. Tabell I anger också procent effektivitet av peptíden med avseende på inhibering av sekretion av tillväxthormon (GH), insulin och glukagon varvid somatostatin utgör basis. 12 7 80351 8 - 0 Tabell I sømarosratfin (konrmn) Tillväxr- Insulin Glukagon - 154723 hormon 100 100 100 Peptíder franuställda enligt uppfinningen R :S111 í :Trp aâsk4 e so 100 -44,04° desk] D-Trp desR4 (n-cysflï 14 100 100 -4z,e° desnï n-Trp nu- ss 10-100 100 -ss,09° Asn n-Trp desR4 <1 100 <1 -44,7° A511 Trp Thr 3 100 <1 -46,0° Asn D-Trp- Thr * 10 _ 7 200 10-100 -58,85O

Claims (6)

13 7803318-0 Patentkrav

1. Förfarande för framställning av en peptid användbar såsom farmaceutika, k ä n n e t e c k n a t av koppling av Cys-amínosyra till ett klorometylerat harts eller ett hydroxir metylharts genom framställning av en ester av hartset och Nq- skyddad Cys~aminosyra och av efterföljande stegvis koppling på i sig känt sätt av Nu-skyddade aminosyror till Cys-aminosyran, varvid en peptid bildas uppvisande strukturen Cys-R1-Phe-Phe-R2-Lys-Thr-Phe-R4-Cys (I) vari R1 betecknar Asn eller des-R1; R2 betecknar Trp eller D-Trp; och R4 betecknar Thr eller Des-R4; och vari Cys utgöres av antingen D-Cys eller L-Cys; varefter erhållen hartskopplad peptid, vilken peptid har formeln (I), avspjälkas från hartset på i sig känt sätt, och erhållen peptid med formeln (I) even- tuellt oxideras varvid en peptid erhålles med formel T Cys-R 1-Phe-Phe-R2-Lys-Thr-Phe-R4-C;s (II)

2. Förfarande enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t därav, att R1 är des-R1, R2 är D~Trp och R4 är des-R4.

3. Förfarande enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t därav, att R1 är des-R1, R2 är D-Trp, R4 är des-R4, och Cys utgöres av D-Cys.

4. Förfarande enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t därav, att R1 är Asn, R2 är D-Trp och R4 är des-R4.

5. Förfarande enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t därav, att R1 är Asn, R2 är Trp och R4 är Thr.

6. Förfarande enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t därav, att R1 är Asn, R2 är D-Trp och R4 är Thr.