CN117858892A - 用于治疗和/或预防蛋白质病的组合物和方法 - Google Patents
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Abstract
提供了蛋白质病、例如阿尔茨海默氏病中所涉及的蛋白质的非聚集蛋白类似物。所述蛋白质具有β‑折叠聚集结构域，并且所述非聚集蛋白类似物具有在所述β‑折叠聚集结构域中的β‑折叠不稳定修饰，但基本上保留了野生型蛋白质功能。所述β‑折叠不稳定修饰可以是天然存在的氨基酸对非天然存在的氨基酸的取代。提供了使用所述非聚集蛋白类似物治疗蛋白质病的方法和设计非聚集蛋白类似物的方法。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求于2021年5月26日提交的美国临时专利申请第63/193258号的优先权和权益，所述美国临时专利申请通过引用以其整体并入本文。
技术领域
一些方面涉及用于预防蛋白质病中的蛋白质聚集的组合物。一些方面涉及用于提供蛋白质的天然功能同时限制和/或预防所述蛋白质在体内聚集的组合物。一些方面涉及可用于治疗和/或预防蛋白质病的组合物和/或方法。
背景技术
淀粉样蛋白是在某些蛋白质从天然折叠构象转变为交叉β构象时形成的原纤维蛋白聚集物。在这种构象中，蛋白质分子以两个相对堆叠的β-折叠的形式布置，所述两个相对堆叠的β-折叠之间不包括水分子，并且具有叉指状的大体上疏水的侧链，从而形成干燥的空间拉链。这种细长的交叉β构象构成了基本的淀粉样蛋白原纤维亚基，即原丝。交叉β架构可以由一个折叠分子或两个单独分子提供，并且β-折叠可以以平行、反向平行、面对面或面对背朝向堆叠。
原丝一旦形成就可以通过多种不同的方式缔合，以产生与各种病症相关的不同超结构多晶型物，包含具有不同数量的水平堆叠的原丝的扁平原纤维结构。这些扁平原纤维结构可以演变为淀粉样蛋白晶体或单个或多个交织的原丝的不同扭曲带结构，所述淀粉样蛋白晶体或不同扭曲带结构可以进一步演变为纳米管。
许多病症已经被确定为淀粉样蛋白相关疾病或淀粉样蛋白病，其可以更通常地被称为蛋白质病，包含阿尔茨海默氏病(Alzheimer's disease，AD)、帕金森氏病(Parkinson's disease)、路易体病(Lewy body disease)、皮克氏病(Pick's disease)、由朊病毒引起的传染性海绵状脑病(TSE)，如克罗伊茨费尔德-雅各布病(Creutzfeldt-Jakob disease)或库鲁病(Kuru)、亨廷顿氏病(Huntington's disease)、II型糖尿病、甲状腺髓样癌、肺泡蛋白沉积症和由降钙素、表面活性蛋白C和心房利钠因子积聚引起的心房淀粉样变性、肌萎缩侧索硬化症、唐氏综合征(Down syndrome)、多系统萎缩、神经变性伴I型脑铁积聚(哈勒沃登-施帕茨病(Hallervorden-Spatz disease))、轻度认知障碍(MCI)、脑淀粉样蛋白血管病(CAA)等。蛋白质病的实例包含tau蛋白病(tauopathy)、突触核蛋白病(synucleinopathy)、声音失常(phonopathy)、TDP-43等。tau蛋白病的实例包含：皮克氏病、进行性核上性麻痹、皮质基底节变性、嗜银颗粒病、球状神经胶质tau蛋白病、年龄相关性tau星形胶质细胞病变、慢性创伤性脑病变、原发性年龄相关性tau蛋白病(PART)(或缠结显性痴呆)、关岛帕金森病痴呆复合体(Parkinsonism-Dementia complex of Guam)、脑炎后帕金森病、瓜德罗普岛非典型帕金森病(atypical Parkinsonism of Guadeloupe)、弥漫性神经丝缠结伴钙化、额颞叶痴呆、与染色体tau蛋白病相关的帕金森病等。突触核蛋白病的实例包含：帕金森氏病痴呆、单纯自主神经衰竭(PAF)、多系统萎缩(MSA)等。声音失常的实例包含致命性家族性失眠症(FFI)、格斯特曼-斯特劳斯勒-申克病(Gerstmann-Straussler-Scheinker，GSS)等。TDP-43的实例包含：伴TDP43包涵体的额颞叶变性(FTLD)、伴运动神经元疾病的FTLD(FTLD-MND)、海马硬化症、肌萎缩侧索硬化、额颞叶痴呆、与17号染色体3R、4R或3R+4R tau蛋白病相关的帕金森病等。
已知蛋白质病中涉及的示范性蛋白质包含淀粉样蛋白β(阿尔茨海默氏病)、α-突触核蛋白(帕金森氏病)、胰岛淀粉样蛋白多肽(IAPP，II型糖尿病)、tau(与额颞叶痴呆伴帕金森病和皮克氏病有关的微管相关蛋白)、p53(肿瘤抑制因子转录因子，与许多癌症有关)、亨廷顿氏病中的亨廷顿蛋白、克罗伊茨费尔德-雅各布病中的prion蛋白等。下表1列出了示范性蛋白质病和已知与此些蛋白质病有关或其中涉及的蛋白质。
表1.已知的蛋白质病和与蛋白质病有关的对应蛋白质。
淀粉样β肽是一种由淀粉样前体蛋白(APP)经蛋白水解衍生的39-43个氨基酸的肽。淀粉样前体蛋白(APP)被β-分泌酶切割，以产生99个残基的跨膜片段C99，所述跨膜片段C99然后经历由γ-分泌酶进一步切割，以产生淀粉样β肽。淀粉样β蛋白的主要循环形式是Aβ-40，即使在淀粉样β斑块中也发现了Aβ-42和Aβ-43。淀粉样β蛋白的功能尚不清楚，但其似乎在正常的突触可塑性和记忆中发挥作用。越来越多的文献表明，Aβ肽通过α-7烟碱乙酰胆碱受体信号传导在记忆和突触可塑性中发挥作用。
将阿尔茨海默氏病考虑为示例蛋白质病，存在许多不同类型和原因的阿尔茨海默氏病。阿尔茨海默氏病可以包含由任何原因引起的阿尔茨海默氏病或任何其它类型的阿尔茨海默氏病，包含家族性阿尔茨海默氏病(也称为常染色体显性阿尔茨海默氏病)、散发性阿尔茨海默氏病或早发性散发性阿尔茨海默氏病。轻度认知障碍除了本身是一种病状外，还可以被视为阿尔茨海默氏病的早期。因此，轻度认知障碍的出现可能预示着需要启动疗法，以避免进展为阿尔茨海默氏病典型的更严重的认知障碍。换句话说，患有轻度认知障碍的受试者患阿尔茨海默氏病的风险增加。
家族性阿尔茨海默氏病病例的子集是由早老素1(PSEN1)、早老素2(PSEN2)或淀粉样β蛋白前体(APP)基因中的特定遗传缺陷引起的。PSEN1用作γ分泌酶的催化亚基，而PSEN2中的突变可能会增加γ分泌酶的活性。许多研究已经确定，各种类型的家族性阿尔茨海默氏病(包含由PSEN1、PSEN2或APP中的突变引起的阿尔茨海默氏病)中的可溶性Aβ42的水平在疾病发作前许多年就开始下降。因此，Aβ42的可溶性水平降低与阿尔茨海默氏病相关，并且早在疾病发展前就出现。
家族性阿尔茨海默氏病的子集是由Aβ-42肽中的突变引起的，特别是在肽的残基19-24处。另外，据信Aβ42肽的残基10-15处的YEVHHQ结构域对肽的天然功能而言也很重要。
除了阿尔茨海默氏病之外，在其它病症中也鉴定到可溶性Aβ42肽的减少，包含肌萎缩侧索硬化症(ALS)、额颞叶痴呆、帕金森氏病、帕金森氏病痴呆、进行性核上性麻痹、皮质基底节变性、路易体痴呆、多系统萎缩和神经退行性痴呆。参见例如米勒豪尔(Mllenhauer)等人,神经化学杂志(J.Neurochem.)(2016)139(增刊1),290-317，所述文献通过引用以其整体并入本文。
α-突触核蛋白是一种在脑中含量丰富并且主要发现于突触前末端中的神经元尖端处的蛋白质。α-突触核蛋白的功能尚不清楚，但据信其在突触小泡再循环中发挥作用，并且其也可能有助于调节多巴胺的释放。患有帕金森氏病或路易体痴呆的患者通常会在其脑中形成路易体，其是α-突触核蛋白的聚集体。
朊病毒蛋白是与克罗伊茨费尔德-雅各布病有关的细胞糖蛋白。据信呈其天然构象的可溶性朊病毒蛋白涉及髓鞘维持和细胞增殖过程。
常规观点认为，由蛋白质病引起的许多疾病状态是由蛋白质聚集时所涉及的蛋白质的毒性功能获得引起的。大多数常规疗法旨在使蛋白质聚集最小化或去除聚集的蛋白质(例如，通过减少蛋白质表达，或通过如旨在从细胞中清除聚集的蛋白质的免疫疗法等技术)。然而，此些疗法并不是特别成功的，并且在一些情况下，即使在不存在相关蛋白质和其聚集形式的情况下，停止蛋白质病中涉及的蛋白质的表达(例如，通过敲除或敲低相关蛋白质)实际上可能产生疾病表型。另外，例如在阿尔茨海默氏病中，已经示出斑块负荷与疾病严重程度并不总是相关。
新出现的证据表明，由蛋白质病引起的疾病状态实际上可能是由在此些疾病中聚集的天然蛋白质的功能丧失引起的，特别是在疾病的较早期。已知或怀疑大多数淀粉样蛋白形成蛋白在其天然折叠状态下执行各种功能。当此些蛋白质展开成交叉β构象并形成原纤维时，蛋白质的天然功能可能会丧失。此蛋白质的功能丧失可能对至少作为疾病过程的部分的细胞产生有害影响。
通常期望用于蛋白质病的经改进的治疗剂。期望用于涉及蛋白质病的病症的可以解决天然蛋白质的功能丧失的经改进的治疗剂。
上述相关技术的实例和与其相关的限制旨在是说明性的而非排他性的。在阅读说明书并研究附图后，相关技术的其它限制对本领域的技术人员而言将是显而易见的。
发明内容
以下实施例和其各方面用意指示例性和说明性而其范围不受限制的系统、工具和方法进行描述和说明。在各个实施例中，已经减少或消除了上文所描述的问题中的一个或多个问题，而其它实施例涉及其它改进。
一些方面提供了一种Aβ42肽的非聚集肽类似物。所述Aβ42肽具有对应于SEQ IDNO:1的位置1-28的N末端结构域和对应于SEQ ID NO:1的位置29-42的β-折叠聚集结构域。所述非聚集肽类似物具有在所述β-折叠聚集结构域中的β-折叠不稳定修饰，并且基本上保留了所述Aβ42肽的除非聚集性之外的天然功能。在一些方面，所述非聚集肽类似物用于治疗和/或预防阿尔茨海默氏病或轻度认知障碍或与可溶性Aβ42肽水平降低相关的另一种病症。在一些方面，提供了一种筛选受试者以确定所述受试者是否是使用如上文所公开的非聚集肽类似物治疗和/或预防阿尔茨海默氏病或与可溶性Aβ42肽水平降低相关的另一种病症的候选者的方法。确定所述受试者的脑脊液样品中的Aβ42的浓度，并且如果所述脑脊液样品中的Aβ42的测得浓度小于约500pM、优选地小于约400pM、优选地小于约300pM、更优选地小于200pM，则将所述受试者鉴定为通过施用如本文所述的非聚集肽类似物进行治疗和/或预防的候选者。在一些方面，所述方法进一步包括向所述受试者施用所述非聚集肽类似物。
除了上文所描述的示范性方面和实施例之外，通过参考附图和通过研究以下详细描述，另外的方面和实施例将变得显而易见。
附图说明
在附图的参考图中展示了示范性实施例。意图是，本文所公开的实施例和附图被视为说明性的，而非限制性的。
具有小图1.1、1.2、1.3、1.4、1.5和1.6的图1示出了示范性工程化的蛋白质，所述蛋白质具有在淀粉样β蛋白的β-折叠聚集结构域中的β-折叠不稳定突变。表格中的空白阴影块的存在指示缺失突变。
图2示出了用于设计与蛋白质病有关的蛋白质的非聚集类似物的方法的示例实施例。
图3示出了工程化的蛋白质的示例实施例，所述工程化的蛋白质是与蛋白质病有关的蛋白质的非聚集类似物。
图4A示出了阿尔茨海默氏病动物模型5XFAD中的表型恢复，其表明静脉内施用工程化的肽在施用五周后恢复野生型行为。图4B和4C示出了另外的实验的并行结果。
图5A示出了媒剂处理的(左侧)5XFAD小鼠相较于用工程化的肽(其为Aβ42的非聚集类似物)处理五周的5XFAD小鼠的皮质中的相对斑块负荷。图5B示出了小鼠海马体中的斑块累积的对应水平。
图6A示出了Aβ42肽和其两种非聚集类似物的如使用硫黄素-T动力学测定测量的聚集倾向。图6B示出了并入非天然存在的氨基酸取代的Aβ42肽和其两种另外的示范性非聚集类似物的聚集倾向。
图7A和图7B示出了对表达具有瑞典突变的淀粉样前体蛋白基因的SH-SY5Y神经元细胞系进行的测定的结果。图7A示出了相对于未经处理的细胞的细胞增殖，而图7B示出了相对于野生型细胞的细胞增殖。图7C和7D示出了另外的类似实验的数据，其示出了相对于未经处理的细胞的沿较短的y轴绘制的细胞增殖以更好地示出比较。
图8示出了对用10μM的γ-分泌酶抑制剂处理的SH-SY5Y神经元细胞进行的测定的结果。
图9A和9B示出了区分健康个体(认知正常或CN)与患有轻度认知障碍(MCI)或阿尔茨海默氏病(AD)的个体的可溶性Aβ42水平。
图10示出了在基线CSF Aβ42水平下CDR非进展的调整的预测。
图11A-11D示出了皮质神经元中的α7烟碱乙酰胆碱受体相较于示例非聚集肽类似物的控制前应答和控制后应答的易化百分比。
图12A-12D和13示出了皮质神经元中的α7烟碱乙酰胆碱受体相较于另外的示例非聚集肽类似物的控制前应答和控制后应答的易化百分比。
图14示出了皮质神经元中的α7烟碱乙酰胆碱受体相较于Aβ42的控制前应答和控制后应答的易化百分比。
图15A-15D示出了皮质神经元中的α7烟碱乙酰胆碱受体相较于对照乱序肽的控制前应答和控制后应答的易化百分比。
图16示出了RT88在pM浓度下诱导下游ERK1/2磷酸化。
图17示出了对接模拟，其示出了Aβ42的示范性非聚集肽类似物通过其N末端结构域与α7烟碱乙酰胆碱受体结合。
图18示出了分子间β-折叠形成的模型，其中位置35处的由蛋氨酸占据的位置被圈出。
具体实施方式
在以下详细描述中，陈述了具体细节以便向本领域技术人员提供对本发明的彻底理解。然而，为了避免不必要地模糊本公开，可能没有详细示出或描述众所周知的要素。因此，说明书和附图应被认为是说明性的而不是限制性的。
发明人现已确定，施用工程化的肽/蛋白质可以治疗和/或预防蛋白质病，所述工程化的肽/蛋白质提供与蛋白质病有关的肽/蛋白质的有益野生型功能，但其已被修饰以避免或最小化交叉β-折叠结构的形成。在不受理论约束的情况下，据信此些蛋白质的施用提供与天然蛋白质等效或类似的功能，以解决此蛋白质的据信由蛋白质病引起的功能丧失，而不会进一步促进蛋白质聚集。
如本文所使用的，术语“工程化的肽”可以与术语“工程化的蛋白质”可互换地使用，本领域技术人员应当理解，肽和蛋白质两者均由肽键连接的氨基酸构成，其中相较于肽，蛋白质是更长的氨基酸链。蛋白质病中涉及的蛋白质有时可能是肽，并且因此参考蛋白质病中涉及的蛋白质也涵盖蛋白质病中涉及的肽。
如本文所使用的，提供了肽的氨基酸序列，包含所述序列内的每个氨基酸残基的位置编号，例如Aβ42肽(SEQ ID NO:1)的位置1-42。本领域技术人员将认识到，对于对应的肽类似物，如果一或多个氨基酸残基缺失，则肽的位置的假设编号将改变，例如，如果在特定肽类似物中缺失Aβ42肽的第一残基，则所述特定类似物将仅具有残基1-41。如本文所使用的，术语“对应”在指代肽序列内的氨基酸的位置编号时是指如本文所提供的肽的共有序列的编号，并且因此是指当两个肽序列对准时，相对于参考序列的氨基酸残基的对应编号。因此，其中上述Aβ42肽的第一残基将含有对应于如本文所描述的Aβ42肽的残基2-42的氨基酸残基的特定类似物。
如本文所使用的，术语“β-折叠聚集结构域”是指与蛋白质病有关的蛋白质的交叉β构象的形成中涉及的肽或蛋白质的结构域。虽然β-折叠聚集结构域在健康受试者中可能与β-折叠结构的形成无关或在患有或患蛋白质病的个体中可能与聚集无关，但是β-折叠聚集结构域的集合性分子内和分子间相互作用使得促进形成蛋白质或肽的淀粉样蛋白沉积物的交叉β折叠形成。对于Aβ42肽，β-折叠聚集结构域位于对应于SEQ ID NO:1的残基29-42的位置处。
术语“治疗(treat)”、“治疗(treating)”和“治疗(treatment)”是指用于获得期望的临床结果的方法。期望的临床结果可以包含但不限于减少或减轻疾病的至少一种症状。例如，治疗可以是减轻疾病的至少一种症状、减轻疾病的程度、稳定疾病状态、预防疾病传播、延迟或减缓疾病进展、缓和疾病、减少疾病复发、缓解疾病、延长带病生存期或完全根除疾病。术语“预防(prophylaxis)”包含用于预防疾病发生或从早期发展到后期的方法。在本发明的上下文中的术语“预防(prevention)”是指使得患所预防病状的可能性降低任何程度的预防措施，包含患病状的可能性的轻微、实质性或重大降低以及完全预防。优选地，可能性降低的程度至少为轻微降低。
如本文所使用的，术语蛋白质病用于指由蛋白质或肽聚集成促进蛋白质或肽的纤维聚集物形成的交叉β-折叠结构所引起的疾病或病症。蛋白质病的实例包含淀粉样蛋白病、突触核蛋白病、tau蛋白病等。
如本文所使用的，术语“天然存在的氨基酸残基”不仅包含通常在蛋白质或肽的特定位置处发现的野生型氨基酸残基，而且还包含可能在特定病症或具有遗传突变的个体受试者中在所述特定位置处出现的突变氨基酸，所述突变氨基酸引起所述特定位置处的氨基酸序列的差异。“氨基酸类似物”是天然存在的氨基酸残基的任何非天然存在的类似物，无论是通过合成还是通过翻译后修饰在体内产生。非天然存在的氨基酸类似物可以是包括氨基酸的类似物。可替代地，氨基酸类似物还可能缺乏氨基酸部分，即非天然存在的类似物可以包括可以并入工程化的肽中的任何化学部分，只要工程化的肽维持除非聚集性之外的其天然功能即可。
如本文所使用的，氨基酸残基用其单字母代码表示如下：丙氨酸(A)、精氨酸(R)、天冬酰胺(N)、天冬氨酸(D)、半胱氨酸(C)、谷氨酸(E)、谷氨酰胺(Q)、甘氨酸(G)、组氨酸(H)、异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、赖氨酸(K)、蛋氨酸(M)、苯丙氨酸(F)、脯氨酸(P)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、色氨酸(W)、酪氨酸(Y)、缬氨酸(V)。除非另有说明，否则本文对氨基酸残基的所有引用均是指由真核生物通常产生的L-氨基酸。在一些替代性实施例中，可以使用对应的D-氨基酸代替对应的L-氨基酸中的一些或全部，包含在β-折叠聚集结构域内和/或作为β-折叠不稳定突变的L-氨基酸。在替代性实施例中，可以使用其它非天然存在的氨基酸或氨基酸类似物，包含例如氨基酸的N-烷基类似物。含有D-氨基酸或其它非天然存在的氨基酸残基的肽在体内的半衰期可能大于仅含有天然存在的氨基酸的肽的半衰期，例如由于血清蛋白结合和/或对在体内遇到的蛋白酶的增强的稳定性。
如本文所使用的，术语“保守氨基酸取代”是指相对于参考分子与参考序列相差一或多个氨基酸残基的一或多个保守取代的氨基酸序列，无论此氨基酸取代发生在何处(即无论此取代是在本文所描述的β-折叠聚集结构域内还是在此结构域外)。被认为是“保守”的氨基酸取代包含以下中的任何一种：
●交换A、V、L或I中的任何一个，或与其基本上类似的氨基酸类似物；
●交换S、C、U、T或M中的任何一个，或与其基本上类似的氨基酸类似物；
●交换F、Y或W中的任何一个，或与其基本上类似的氨基酸类似物；
●交换D或E中的任何一个，或与其基本上类似的氨基酸类似物；
●交换N或Q中的任何一个，或与其基本上类似的氨基酸类似物；和/或
●交换H、K或R中的任何一个，或与其基本上类似的氨基酸类似物。
在一些实施例中，提供了一种工程化的蛋白质，所述工程化的蛋白质是与蛋白质病有关的蛋白质的非聚集类似物，所述非聚集类似物可以用作蛋白质病的治疗剂和/或预防剂。在一些实施例中，工程化的蛋白质包含在β-折叠聚集结构域中的一或多个β-折叠不稳定修饰。β-折叠不稳定修饰是一种干扰和/或破坏β-折叠结构形成，由此干扰或预防可能促成蛋白质病的交叉β折叠结构形成的修饰。例如，在一些实施例中，β-折叠不稳定修饰可能破坏对形成可能促成蛋白质病的堆叠的β-折叠结构和/或交叉β折叠结构而言重要的一或多个氢键。在一些实施例中，β-折叠不稳定修饰可能改变β-折叠聚集结构域的构象(例如，通过使肽主链扭结和/或引起与其它残基的相互作用)以干扰可能促成蛋白质病的堆叠的β-折叠结构和/或交叉β折叠结构的形成。在一些实施例中，β-折叠不稳定修饰不干扰或仅最低程度地干扰蛋白质的天然功能，使得工程化的蛋白质保留或基本上保留蛋白质的野生型活性。
在一些实施例中，当β-折叠不稳定修饰使得在硫黄素-T测定中聚集的稳态水平是野生型蛋白聚集的稳态水平的至多1/2、至多1/3或至多1/4时，蛋白质病中涉及的蛋白质的工程化的非聚集类似物被认为是非聚集的。在一些实施例中，工程化的非聚集类似物是Aβ42肽的类似物，并且在硫黄素-T测定中聚集的稳态水平是具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的野生型Aβ42聚集的稳态水平的至多1/2、至多1/3或至多1/4。
β-折叠不稳定修饰的实例包含：
●用β-折叠聚集结构域内的带电荷或亲水性氨基酸(例如，K、R、H、E、D、S、T、N、Q或C)取代天然存在的氨基酸；
●用β-折叠聚集结构域内的脯氨酸(P)残基取代天然存在的氨基酸；
●用β-折叠聚集结构域内的甘氨酸(G)残基取代天然存在的氨基酸；
●用干扰β-折叠聚集结构域内的β-折叠形成的氨基酸类似物取代天然存在的氨基酸，所述干扰β-折叠形成的氨基酸类似物的实例包含3-羟基脯氨酸、4-羟基脯氨酸、硒代半胱氨酸、焦谷氨酸、羧基谷氨酸、辛烯基丙氨酸、吡咯赖氨酸、棕榈酰天冬氨酸盐、D-氨基酸(包含D-脯氨酸)、β-氨基酸、γ-氨基酸、高氨基酸、β-高氨基酸、α-甲基氨基酸、N-甲基氨基酸、N-乙基氨基酸、N-烷基化氨基酸衍生物、丙酮酸衍生物、支链氨基酸衍生物、硝基氨基酸衍生物、卤化氨基酸衍生物、环取代的氨基酸衍生物、芳香族氨基酸衍生物、线性核心氨基酸、类肽衍生物、羟基化氨基酸衍生物、环状氨基酸、双环氨基酸、3-氨基-3-芳基-丙酸、3-氨基-4-芳基-丁酸、具有芳香族间隔子的氨基酸、脂环族氨基酸、α-苯基甘氨酸衍生物等。
●缺失β-折叠聚集结构域内的一或多个天然存在的氨基酸残基，任选地包含缺失至多和包含整个β-折叠聚集结构域；和/或
●在β-折叠聚集结构域内插入一或多个氨基酸残基，例如在β-折叠聚集结构域内插入1、2、3、4或5个氨基酸残基。在一些实施例中，所插入的氨基酸残基中的一或多个氨基酸残基是脯氨酸(P)残基。在一些实施例中，所插入的氨基酸残基中的一或多个氨基酸残基是甘氨酸(G)残基。在一些实施例中，所插入的氨基酸残基中的一或多个氨基酸残基是带电荷的和/或亲水性氨基酸(例如，K、R、H、E、D、S、T、N、Q或C)。在一些实施例中，所插入的氨基酸残基中的一或多个氨基酸残基是干扰如上所述的β-折叠形成的氨基酸类似物，所述干扰β-折叠形成的氨基酸类似物的实例包含3-羟基脯氨酸、4-羟基脯氨酸、硒代半胱氨酸、焦谷氨酸、羧基谷氨酸、辛烯基丙氨酸、吡咯赖氨酸、棕榈酰天冬氨酸盐、D-氨基酸(包含D-脯氨酸)、β-氨基酸、γ-氨基酸、高氨基酸、β-高氨基酸、α-甲基氨基酸、N-甲基氨基酸、N-乙基氨基酸、N-烷基化氨基酸衍生物(优选地在烷基部分中具有1、2或3个碳)、丙酮酸衍生物、支链氨基酸衍生物、硝基氨基酸衍生物、卤化氨基酸衍生物、环取代的氨基酸衍生物、芳香族氨基酸衍生物、线性核心氨基酸、类肽衍生物、羟基化氨基酸衍生物、环状氨基酸、双环氨基酸、3-氨基-3-芳基-丙酸、3-氨基-4-芳基-丁酸、具有芳香族间隔子的氨基酸、脂环族氨基酸、α-苯基甘氨酸衍生物等。
在不受理论约束的情况下，据信在蛋白质病中涉及的蛋白质的β-折叠聚集结构域内取代此些氨基酸残基或缺失或插入至少一个氨基酸残基会干扰交叉β折叠结构的有效形成，由此限制或预防蛋白质聚集，同时使蛋白质保持可溶并可用于执行其野生型功能。因此，工程化的蛋白质可以用于恢复可能与蛋白质病相关的功能丧失缺陷，而不会加重或增加蛋白质病中涉及的蛋白质的聚集。为了实现此目的，在一些实施例中，在β-折叠聚集结构域内并入一或多个β-折叠不稳定修饰的工程化的蛋白质完全或基本上保留其天然功能，例如，工程化的蛋白质能够以天然可溶性蛋白水平的至少50％执行其天然功能(包含例如天然可溶性蛋白水平的至少55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)。
在一些实施例中，非聚集肽类似物是Aβ42的类似物，并且Aβ42的天然功能是增强或诱导α7烟碱乙酰胆碱受体(α7nAChR)介导的Ca2+流入。通常，α7nAChR介导的Ca2+流入可以使用激动剂(例如，小分子激动剂，如PNU 282987)触发，但在存在增强分子(如本文所描述的Aβ42肽的非聚集肽类似物)的情况下，流入增加。本文所描述的肽还可以自身诱导流入。在一些实施例中，增强α7nAChR介导的Ca2+流入意指在存在肽的情况下，α7nAChR介导的Ca2+流入的水平是控制前Ca2+流入水平的至少130％、至少150％或至少170％。在一些此些实施例中，非聚集肽类似物能够以天然可溶性Aβ42肽水平的至少50％的水平(包含例如天然可溶性Aβ42肽水平的至少55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)来执行增强α7nAChR介导的Ca2+流入的天然功能。在一些实施例中，当以≤3000pM的浓度(包含例如≤300pM，包含例如≤30pM，包含例如≤3pM)存在于皮质神经元中时，Aβ42的非聚集类似物能够增强α7nAChR介导的Ca2+流入。在一些实施例中，当以≤3000pM的浓度(包含例如≤300pM，包含例如≤30pM，包含例如≤3pM)存在于神经元细胞系(如N2a和SH-SY5Y细胞)中时，Aβ42的非聚集类似物能够增强α7nAChR介导的Ca2+流入。在一些实施例中，Aβ42的非聚集肽类似物能够比具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的野生型Aβ42肽在更大程度上增强α7nAChR介导的Ca2+流入，例如，α7nAChR介导的Ca2+流入还可以通过测量下游事件(如ERK1/2磷酸化、细胞增殖或神经发生)间接地检测或定量。ERK1/2磷酸化在α7nAChR介导的Ca2+流入几分钟内发生，并且可以使用ELISA进行测量。检测或定量天然功能的又另一种替代性方法是使用γ-分泌酶抑制剂评估在Aβ42药理学耗竭后的神经元细胞的挽救。检测或定量天然功能的仍另一种替代性方法是评估表达非功能性突变淀粉样蛋白前体蛋白(APP)的神经元细胞的增殖。
在一些实施例中，除β-折叠聚集结构域之外的蛋白质部分可能对蛋白质的天然功能而言是重要的。例如，在Aβ42肽的情况下，在不受理论约束的情况下，据信肽的残基10-15处的YEVHHQ结构域和肽的位置19-24处的残基对于天然蛋白质功能而言是重要的，例如用于与α7烟碱乙酰胆碱受体(α7nAChR)恰当结合。因此，在一些实施例中，据信位于β-折叠聚集结构域的N末端(即肽的位置1-28)的Aβ42部分对天然肽功能而言是重要的。在本说明书中，在Aβ42肽的位置1-28处或对应于其的这些残基被称为“N末端结构域”。
非聚集肽类似物的N-末端结构域可以包括与SEQ ID NO:1的残基1-28相差不超过6个(优选地5个、更优选地4个、甚至更优选地3个、又更优选地2个、仍更优选地1个、最优选地0个)缺失、插入和/或取代、优选地保守取代的氨基酸序列。在一些实施例中，作为Aβ42的非聚集类似物的工程化的肽保留了N末端结构域的野生型氨基酸序列，或仅包含N末端结构域内的保守氨基酸取代。在一些实施例中，作为Aβ42的非聚集类似物的肽具有在N末端结构域中的零个或至多一个、至多两个、至多三个、至多四个、至多五个、至多六个、至多七个、至多八个或至多九个保守氨基酸取代。非聚集类似物的β-折叠聚集结构域包括与对应于SEQID NO:1的残基29-42相差不超过6个(优选地5个、更优选地4个、甚至更优选地3个、又更优选地2个、仍更优选地1个、最优选地0个)缺失、插入和/或取代、优选地保守取代的氨基酸序列。优选地，除β-折叠不稳定修饰外，所定义的非聚集肽类似物包括相对于SEQ ID NO:1在β-折叠聚集结构域中的至多三个(优选地两个、更优选地一个)保守氨基酸取代。
在一些实施例中，为蛋白质病的疾病或病症是阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、路易体病或路易体痴呆、皮克氏病、克罗伊茨费尔德-雅各布病、亨廷顿氏病、肌萎缩侧索硬化症(ALS)、唐氏综合征、神经变性伴I型脑铁积聚(哈勒沃登-施帕茨病)、库鲁病或其它传染性海绵状脑病(TSE)、轻度认知障碍(MCI)、脑淀粉样蛋白血管病(CAA)、血管性痴呆、以异常淀粉样蛋白沉积为特征的任何神经退行性疾病、表1中列出的任何其它疾病或病症等。
在一些实施例中，工程化的蛋白质是与蛋白质病有关的蛋白质的非聚集类似物，所述蛋白质包含但不限于淀粉样蛋白前体蛋白(APP)、淀粉样蛋白β(包含Aβ-39、Aβ-40、Aβ-42或Aβ-43同种型)、α-突触核蛋白、朊病毒蛋白、亨廷顿蛋白、p53、表1中列出的任何蛋白质或肽等。
在一些实施例中，提供了一种编码工程化的肽的核酸。所述核酸可以是例如DNA或RNA(如mRNA)，其可以通过细胞机制转录和/或翻译，以在体内产生期望的工程化的蛋白质。可以使用任何合适的基因工程化方法(例如，转染从体内获得的细胞并且然后将其重新引入到体内、CRISPR-Cas基因编辑、将合适的表达载体引入到靶细胞中等)和/或核酸递送系统(例如，脂质纳米颗粒，其可以用于将CRISPR-Cas基因编辑系统、mRNA或表达载体递送到靶细胞)来将编码工程化的蛋白质的核酸供应到期望的靶细胞。任何用于使期望的细胞表达期望的蛋白质的现在已知或将来开发的方法可以用于各个实施例中，以使细胞表达期望的非聚集工程化的肽。在一些实施例中，包含其中工程化的肽并入非天然存在的氨基酸类似物的实施例，所述工程化的肽是化学合成的。
在一些实施例中，包括如本文所述的工程化的肽(其为非聚集类似物)或编码此些肽的核酸的治疗组合物以现在已知或将来开发的任何合适的方式施用，包含直接施用、基因工程化技术、脂质体介导的递送(包含脂质纳米颗粒递送)等。直接施用模式可以包含皮下、静脉内、脑室内、大脑内、鞘内、腹膜内、肌肉内或静脉内注射、输注或局部、鼻、口(包含舌下或颊)、直肠、眼部或耳部，或其它形式的递送，包含泵送或直接注射到受试者的脑中。脂质体介导的递送模式可以包含用合适的机制(例如，CRISPR-Cas基因编辑系统)或使用DNA载体作为期望的肽的表达模块的任何其它机制一起直接递送工程化的肽或编码工程化的肽的核酸(例如，mRNA)以供细胞表达、或编码工程化的肽的DNA，以将DNA整合到细胞的基因组中，从而促进由细胞表达工程化的蛋白质。
在一些实施例中，待施用或引起表达的工程化的肽的量可以由本领域技术人员根据待治疗的病状和施用模式来确定。在一些实施例中，工程化的肽的施用间隔可以由本领域技术人员根据待治疗的病状和施用模式来确定。在工程化的肽为Aβ42的非聚集类似物的一些实施例中，待施用或引起表达的工程化的肽的量足以使受试者的脑脊液中的工程化的肽的浓度介于约200与600pg/mL之间，包含其间的任何值或子范围，例如250、300、350、400、450、500或550pg/mL。受试者的脑脊液中的Aβ42和/或工程化的肽的浓度可以使用液相色谱法-串联质谱法或免疫测定、优选地ELISA免疫测定(例如，Elecsys、AlzBio3)来确定。工程化的肽的精确靶浓度可以根据测量方法、具体工程化的肽和具体条件而变化，但可以通过涉及来自患病/有风险个体的样品相较于健康对照的常规实验来建立(参见实例4)。
在一些实施例中，提供了一种筛选受试者以确定所述受试者是否是使用工程化的肽治疗和/或预防蛋白质病的候选者的方法，所述工程化的肽是蛋白质病中涉及的蛋白质的非聚集类似物。在一些实施例中，蛋白质病是阿尔茨海默氏病，并且蛋白质病中涉及的蛋白质是Aβ42肽，或者蛋白质病是与可溶性Aβ42肽水平降低相关的另一种疾病或病症。在一些实施例中，所述筛选受试者以确定受试者是否是治疗和/或预防阿尔茨海默氏病的候选者的方法涉及确定受试者的脑脊液中的Aβ42的浓度。如果脑脊液中的Aβ42的测得浓度小于约500pM、小于约400pM、小于约300pM或小于约200pM，包含例如小于约175、150、125或100pM，则将受试者鉴定为通过施用如本文所述的Aβ42肽的非聚集类似物治疗和/或预防阿尔茨海默氏病的候选者。在一些此些实施例中，使用液相色谱法-串联质谱法或免疫测定(例如，Elecsys、AlzBio3)确定受试者的脑脊液中的Aβ42的浓度。
在一些实施例中，受试者患有家族性阿尔茨海默氏病，包含由PSEN1、PSEN2或AβPP中的突变引起的家族性阿尔茨海默氏病。在不受理论约束的情况下，据信与家族性阿尔茨海默氏病相关的突变可能会降低可溶性Aβ42肽的水平和/或干扰所述肽的正常功能。因此，通过施用如本文所述的工程化的肽(其为Aβ42的非聚集类似物)来补充受试者体内的功能性Aβ42肽的水平可能对此类受试者特别有益。
在一些实施例中，受试者是哺乳动物受试者。在一些实施例中，受试者是人类受试者。
具体参考与阿尔茨海默氏病和其它病症有关的淀粉样β肽的实例，人Aβ-42的野生型序列如SEQ ID NO:1所示，并且这在图1中示出。据信Aβ-42的β-折叠聚集结构域是其羧基末端残基29-42。因此，在一些实施例中，工程化的肽是在其位置29-42中的一或多个位置处具有β-折叠不稳定修饰的淀粉样β肽的形式。β-折叠不稳定修饰可以是用干扰β-折叠形成的氨基酸(如P、G、K、R、H、E、D、S、T、N、Q、C)或干扰β-折叠形成的氨基酸类似物取代位置29-42(包含其间的任何位置，例如位置29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41或42)处的一或多个氨基酸，所述氨基酸类似物包含例如3-羟基脯氨酸、4-羟基脯氨酸、硒代半胱氨酸、焦谷氨酸、羧基谷氨酸、辛烯基丙氨酸、吡咯赖氨酸、棕榈酰天冬氨酸盐、D-氨基酸(包含D-脯氨酸)、β-氨基酸、γ-氨基酸、高氨基酸、β-高氨基酸、α-甲基氨基酸、N-甲基氨基酸、N-乙基氨基酸、N-烷基化氨基酸衍生物(优选地在烷基部分中具有1、2或3个碳)、丙酮酸衍生物、支链氨基酸衍生物、硝基氨基酸衍生物、卤化氨基酸衍生物、环取代的氨基酸衍生物、芳香族氨基酸衍生物、线性核心氨基酸、类肽衍生物、羟基化氨基酸衍生物、环状氨基酸、双环氨基酸、3-氨基-3-芳基-丙酸、3-氨基-4-芳基-丁酸、具有芳香族间隔子的氨基酸、脂环族氨基酸、α-苯基甘氨酸衍生物等。β-折叠不稳定修饰可以是缺失所述位置处的天然存在的氨基酸残基，或在所述位置处插入1至5个氨基酸残基(任选地其中所插入的氨基酸残基中的至少一个氨基酸残基是P、G、K、R、H、E、D、S、T、N、Q或C，或如上所述的干扰β-折叠形成的氨基酸类似物)。具有β-折叠不稳定修饰的蛋白质的实例包含图1中所示的SEQ ID NO:2-193或SEQ ID NO:194-207或SEQ ID NO:712-742的氨基酸序列(其中X指示β-折叠不稳定修饰的位置)或其任何组合。另外的实例包含与SEQ ID NO:2-207中的任一者至少90％相同的任何序列，包含与其至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.9％相同的任何序列。在一些实施例中，工程化的蛋白质不包含具有SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5或SEQID NO:15的序列的肽。在图1所展示的优选的实施例中，SEQ ID NO:187的位置36处的X代表辛烯基丙氨酸；SEQ ID NO:188的位置35处的X代表D-脯氨酸，SEQ ID NO:189的位置35处的X代表焦谷氨酸；SEQ ID NO:190的位置35处的X代表N-甲基蛋氨酸，SEQ ID NO:191的位置35处的X代表羧基谷氨酸，SEQ ID NO:192的位置35处的X代表吡咯赖氨酸，并且SEQ ID NO:193的位置1处的X代表棕榈酰天冬氨酸盐。根据SEQ ID NO:190或192的肽类似物是最优选的。
在一些实施例中，工程化的肽是具有针对Aβ-42描述的前述序列中的任一序列的Aβ-43，其中在肽的羧基末端处提供另外的T残基以提供Aβ-43同种型。
在一些实施例中，工程化的肽是具有针对Aβ-42描述的前述序列中的任一序列的Aβ-40，其中去除两个羧基末端氨基酸以提供Aβ-40同种型。
在一些实施例中，工程化的肽是具有针对Aβ-42描述的前述序列中的任一序列的Aβ-39，其中去除三个羧基末端氨基酸以提供Aβ-39同种型。
具体参考与帕金森氏病有关的α-突触核蛋白的实例，人α-突触核蛋白的野生型序列如SEQ ID NO:208所示。据信α-突触核蛋白的β-折叠聚集结构域是其残基61-95。因此，在一些实施例中，工程化的蛋白质是在其位置61-95中的一或多个位置处具有β-折叠不稳定修饰的α-突触核蛋白的形式。在一些实施例中，β-折叠不稳定修饰是用干扰β-折叠形成的氨基酸或用如上文所述的干扰β-折叠形成的氨基酸类似物取代位置61-95(包含其间的任何位置，例如位置61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94或95)处的一或多个氨基酸，或通过缺失所述位置处的天然存在的氨基酸残基，或通过在所述位置处插入1至5个氨基酸残基(任选地其中所插入的氨基酸残基中的至少一个氨基酸残基是P、G、K、R、H、E、D、S、T、N、Q或C，或干扰β-折叠形成的氨基酸类似物)，包含例如具有SEQ ID NO:209-663的任何序列或SEQ ID NO:664-698的任何序列(其中X指示β-折叠不稳定修饰的位置)或其任何组合的蛋白质，或与其至少90％相同的任何序列，包含与其至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.9％相同的任何序列。
具体参考与克罗伊茨费尔德-雅各布病有关的朊病毒蛋白的实例，人朊病毒蛋白的野生型序列如SEQ ID NO:699所示。据信人朊病毒蛋白的β-折叠聚集结构域是其残基109-121。因此，在一些实施例中，工程化的蛋白质是在其位置109-121中的一或多个位置处具有β-折叠不稳定修饰的朊病毒蛋白的形式。在一些实施例中，β-折叠不稳定修饰是用干扰β-折叠形成的氨基酸或用如上文所述的干扰β-折叠形成的氨基酸类似物取代其位置109-121(包含其间的任何位置，例如位置109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120或121)处的一或多个氨基酸，或通过缺失所述位置处的天然存在的氨基酸残基，或通过在所述位置处插入1至5个氨基酸残基(任选地其中所插入的氨基酸残基中的至少一个氨基酸残基是P、G、K、R、H、E、D、S、T、N、Q或C，或干扰β-折叠形成的氨基酸类似物)，包含例如具有SEQ ID NO:700-710中的任一者的氨基酸序列或其任何组合的蛋白质，或与其至少90％相同的任何序列，包含与其至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.9％相同的任何序列，其中X表示β-折叠不稳定修饰的位置。
参考图2，在一些实施例中，描述了设计与蛋白质病有关的蛋白质的非聚集类似物的方法100。在102处，选择与蛋白质病有关的靶蛋白。例如，在蛋白质病是阿尔茨海默氏病的情况下，基于可用的科学文献，可以选择淀粉样蛋白β作为与蛋白质病有关的靶蛋白(或肽)。在蛋白质病是帕金森氏病的情况下，基于可用的科学文献，可以选择α-突触核蛋白作为与蛋白质病有关的靶蛋白。在蛋白质病是克罗伊茨费尔德-雅各布病的情况下，基于可用的科学文献，可以选择朊病毒蛋白作为与蛋白质病有关的靶蛋白。在其它实施例中，在与蛋白质病有关的蛋白质未知的情况下，可以进行合适的实验以确定蛋白质病中聚集的蛋白质的特性，从而选择用于另外的步骤的相关蛋白质。
在104处，鉴定所选蛋白质的β-折叠聚集结构域。例如，结构生物学研究(例如，X射线晶体学或其它研究)或此些研究的文献综述可以用于评估所选蛋白质的淀粉样蛋白结构，以鉴定聚集中涉及的结构域。
在106处，鉴定一或多种β-折叠不稳定修饰，其可以预防所选蛋白质形成交叉β-折叠结构。在一些实施例中，通过修饰和/或缺失β-折叠聚集结构域内的某些天然存在的氨基酸残基来制备β-折叠不稳定修饰。例如，可以选择β-折叠聚集结构域内的一或多个天然存在的氨基酸残基，以用G、P、K、R、H、E、D、S、T、N、Q或C或如上文所述的破坏β-折叠形成的氨基酸类似物等缺失或取代。
一旦已经通过应用方法100鉴定到β-折叠不稳定修饰，则就可以制备用于体内施用的合适构建体(例如，工程化的肽或编码此肽的核酸)，并将其施用于患有或有风险患如上文所述的蛋白质病的受试者。
图3示出了工程化的蛋白质200的示例实施例，所述工程化的蛋白质是蛋白质病中涉及的蛋白质的非聚集类似物。工程化的蛋白质200具有N末端202、C末端204和β-折叠聚集结构域206。在β-折叠聚集结构域206内，β-折叠不稳定修饰被工程化到肽序列中，使得工程化的蛋白质200将为蛋白质病中涉及的蛋白质的非聚集类似物。
具体参考可用于治疗阿尔茨海默氏病的工程化的肽，在一些实施例中，Aβ42的位置29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41或42处的一或多个氨基酸被破坏β-折叠形成的非天然存在的氨基酸取代。在一些实施例中，破坏β-折叠形成的非天然存在的氨基酸是天然存在的氨基酸的N-烷基类似物，例如天然存在的氨基酸的N-甲基类似物或N-乙基类似物。在不受理论约束的情况下，据信在β-折叠聚集结构域内的天然存在的氨基酸的N-烷基类似物的取代可能破坏聚集肽之间的分子间氢键的形成，而保持氨基酸侧链并且因此保持肽的正常功能。
在一些具体实施例中，在Aβ42肽中进行破坏β-折叠形成的非天然存在的氨基酸的以下取代中的一或多种以提供工程化的非聚集肽类似物：G29是N-甲基甘氨酸或N-乙基甘氨酸，A30是N-甲基丙氨酸或N-乙基丙氨酸，I31是N-甲基异亮氨酸或N-乙基异亮氨酸，I32是N-甲基异亮氨酸或N-乙基异亮氨酸，G33是N-甲基甘氨酸或N-乙基甘氨酸，L34是N-甲基亮氨酸或N-乙基亮氨酸，M35是N-甲基蛋氨酸或N-乙基蛋氨酸，V36是N-甲基缬氨酸或N-乙基缬氨酸，G37是N-甲基甘氨酸或N-乙基甘氨酸，G38是N-甲基甘氨酸或N-乙基甘氨酸，V39是N-甲基缬氨酸或N-乙基缬氨酸，V40是N-甲基缬氨酸或N-乙基缬氨酸，I41是N-甲基异亮氨酸或N-乙基异亮氨酸，和/或A42是N-甲基丙氨酸或N-乙基丙氨酸。在一些实施例中，非聚集肽类似物维持或基本上维持Aβ42的野生型功能。
在一些具体实施例中，在Aβ42肽的工程化的非聚集类似物中的非天然存在的氨基酸的取代是在位置35和36中的一个或两个处进行。在不受理论约束的情况下，据信M35位于Aβ42的交叉β淀粉样蛋白构象中的战略位置中，因此该残基和相邻残基可能代表用非天然存在的氨基酸进行修饰的特别期望的靶位点以帮助战略性地破坏分子间氢键合，由此降低肽的聚集倾向。在一些实施例中，Aβ42肽的工程化的非聚集类似物具有取代M35的非天然存在的氨基酸N-甲基蛋氨酸或N-乙基蛋氨酸。在一些实施例中，Aβ42肽的工程化的非聚集类似物具有取代V36的非天然存在的氨基酸N-甲基缬氨酸或N-乙基缬氨酸。
实例
参考以下实例进一步描述具体实施例，这些实例旨在是说明性的而非限制性的。
小鼠研究方法
将雌性野生型和5xFAD转基因小鼠(杰克逊实验室(Jackson laboratories))用于小鼠行为实验。将小鼠单独圈养在受控的湿度、温度和光照条件下，并且可随意获取食物和水。通过使用GraphPad QuickCalcs(GraphPad软件，美国加利福尼亚州圣地亚哥(SanDiego,CA,USA))对处理组进行随机分组，并且对实验组的所有数据进行盲法分析。所有动物实验均遵循欧洲委员会关于动物保护的立法和法规，并获得芬兰国家动物实验委员会(the National Animal Experiment Board of Finland)的批准。尽最大努力使动物的伤害和痛苦最小化。从1月龄开始，每周一次用媒剂或肽制剂经静脉内处理小鼠直到3月龄为止。行为测试：5xFAD小鼠在3月龄时开始在筑巢测试中存在缺陷。简而言之，将柔软的垫料和塑料庇护管移至笼子的一端，并将柔软的纸巾(17cm x 17cm)置于笼子的另一端。24小时后，拍摄笼子的照片，并根据设定的比例给出分数。如果纸巾保持未触动过的，则得0分，如果动物将纸巾并入巢中，则得5分。处死和样品处理：处死时，使用250mg/kg(美国密苏里州圣路易斯的西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA))对小鼠进行麻醉，并用含有2500IU/L肝素(肝素LEO 5000IU/ml，丹麦巴勒鲁普的利奥制药公司(LeoPharma A/S,Ballerup,Denmark))的盐水进行经心脏灌注。在处死时，使用1:10稀释的3.8％柠檬酸钠作为抗凝剂，采集终末血液样品(大约300μl的血液)。首先将1500g血液样品离心6分钟，之后将上清液移至新管中，并进一步离心12000g且持续3分钟。将所得血浆在-80℃下以两个单独等分试样储存以供进一步分析。将脑解剖出来，并且沿中矢状面切成左半球和右半球。随后将左半球在4％多聚甲醛(PFA，美国密苏里州圣路易斯的西格玛-奥德里奇公司)中固定20小时，在含30％蔗糖的PB中冷冻保护2天，并在液氮中冷冻。将右半球的皮质和海马体新鲜冷冻。
免疫组织化学：随后将脑在4％多聚甲醛(PFA，美国密苏里州圣路易斯的西格玛-奥德里奇公司)中固定20小时，随后在30％蔗糖中冷冻保护48小时。将脑在液氮上冷冻，并用低温恒温器(德国韦茨拉尔的徕卡显微系统公司(Leica Microsystems,Wetzlar,Germany))在防冻溶液中沿冠状面切成20μm厚的切片。在六个连续切片上以400μm的间隔进行WO2、GFAP和Iba1的免疫组织化学染色。将脑切片在室温下与初级抗体(Iba-11:250稀释，日本东京光化学品公司(Wako Chemicals,Tokyo,Japan))一起温育过夜。在含0.05％20(美国密苏里州圣路易斯的西格玛-奥德里奇公司)的PBS中洗涤三次后，在切片上施涂次级抗体。荧光Alexa 488或568-缀合的次级抗体(1:200稀释，英国剑桥的艾博抗公司(Abcam,Cambridge,UK))用于使免疫反应性可视化。为了定量免疫反应性，使用运行分析软件(软件成像系统公司(Soft Imaging System))的邻近数码相机(Color View 12或F-View，德国明斯特的软件成像系统公司)，在AX70显微镜(日本东京的奥林巴斯公司(Olympus corporation,Tokyo,Japan))上使用4或10x放大率对海马体区进行成像。使用ImagePro Plus软件(美国马里兰州洛克维尔的Media Cybernetics公司(MediaCybernetics Inc.,Rockville,MD,USA))在预定义范围内进行免疫反应性的定量，并以相对免疫反应区表示。对所有研究组进行盲法分析。
THT方法：在MQ水中以4mM制备ThT(西格玛-奥德里奇公司)。将50μL的500μg/ml肽(在生理盐水中)与250μL的2.4mM ThT溶液(在水中)一起温育。在黑色透明底96孔板(美国康宁公司(Corning,USA))中在440nm激发和480nm发射下在SpectraMax i3酶标仪(美国分子装置公司(Molecular Devices，USA))上以10-15分钟的时间间隔(从底部开始定期振荡)在12-24小时内测量ThT荧光。使用GraphPad Prism软件拟合曲线。
体外方法：使WT SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞系和稳定地表达具有瑞典突变(APP-SH-SY5Y)的淀粉样前体蛋白的SH-SY5Y细胞在含有5％ FBS(胎牛血清)(美国赛默飞世尔公司(ThermoFisher,USA))、1％青霉素/链霉素(美国赛默飞世尔公司)的生长培养基杜氏改良的伊格尔氏培养基(Dulbecco's modified Eagle's medium，DMEM)中在37℃和5％CO2下生长。处理前一天，将细胞接种在不含FBS的DMEM培养基中的96孔细胞培养板中。处理当天，用10μMγ-分泌酶抑制剂(醛2-萘甲酰基-VF-CHO)和不同浓度的肽一起处理WT SH-SY5Y持续48小时。仅用肽处理APP-SH-SY5Y持续72小时。然后根据制造商的方案，使用WST-1测定(西格玛-奥德里奇公司)测量细胞增殖。
临床方法：为了找到正常认知所需的最低所需Aβ42水平，发明人研究了阿尔茨海默氏病神经成像倡议(Alzheimer's Disease Neuroimaging Initiative，ADNI)的数据，这是一项对2700多名介于55与90岁之间的参与者进行的研究(韦纳(Weiner)等人,阿尔茨海默氏病和老年痴呆(Alzheimers Dement.)2013年9月；9(5):e111-94)。发明人研究了ADNI参与者样品内的脑脊液(CSF)Aβ42水平，基于正电子发射断层扫描测试，这些参与者均对淀粉样蛋白斑块呈阳性。发明人发现，具有正常认知(CN)的淀粉样蛋白阳性个体的平均CSF Aβ42水平为900pg/ml，这显著(星号表示显著差异，**P<0.01，并且***P<0.001)高于患有轻度认知障碍(MCI)和阿尔茨海默氏病(AD)的个体的CSF Aβ42水平。发明人得出结论，使用活性Aβ42类似物使受试者脑脊液中的CSF浓度达到900pg/ml或等效水平是替代疗法的合理治疗目标。
实例1-替代疗法的体内演示
图4A、4B和4C中示出的结果表明，使用具有SEQ ID NO:3的由于β-折叠聚集结构域的残基41和42的缺失而具有β-折叠不稳定修饰的工程化的版本的Aβ42(Aβ40)的替代疗法在成熟的AD动物模型(5XFAD小鼠)中产生表型恢复。
简而言之，以5毫克/千克/天的剂量向小鼠静脉内施用具有SEQ ID NO:3的序列的肽(Aβ-40)，持续五周。
如从图4A所示的结果可以看出，野生型小鼠表现出的行为评分为大约5/5，而未经处理的5XFAD小鼠表现出的平均行为评分为4/5。通过缺失β-折叠聚集结构域的残基41和42，施用工程化的肽Aβ-40(其为Aβ-42的非聚集类似物)持续五周的时间段使小鼠的行为评分恢复到大约5/5(最右边)。图4B和4C中分别示出了施用乱序肽(具有SEQ ID NO:711的序列)的野生型小鼠和施用乱序肽的作为对照的5XFAD小鼠的并行结果，以及通过施用非聚集肽RT3(具有SEQ ID NO:3的序列(Aβ-40))和RT88(具有SEQ ID NO:88的序列)所证明的表型挽救。
如从图5A可以看出，与媒剂处理的动物相比，用工程化的肽(其为Aβ42(SEQ IDNO:3)的非聚集类似物)处理的5XFAD小鼠表现出在皮质中的斑块负荷也减少。图5B示出了经处理的动物的海马体中的斑块累积水平也对应降低。
实例2-Aβ42类似物的聚集倾向的评估
对具有以下五个不同序列的肽进行硫黄素-T动力学研究：SEQ ID NO:88，其具有在位置35处替代蛋氨酸(M)的脯氨酸(P)取代；野生型Aβ42(SEQ ID NO:1)；Aβ40(SEQ IDNO:3)，其具有在Aβ42缺失的β-折叠聚集结构域中的最后两个C末端残基；SEQ ID NO:190，其具有在位置35处取代天然存在的蛋氨酸的非天然存在的氨基酸N-甲基蛋氨酸；以及SEQID NO:192，其具有在位置35处取代天然存在的蛋氨酸的非天然存在的氨基酸吡咯赖氨酸。如在图6A中示出的，具有SEQ ID NO:88的肽的聚集倾向比具有SEQ ID NO:3的肽的聚集倾向更低，所述具有SEQ ID NO:3的肽的聚集倾向比具有SEQ ID NO:1的野生型Aβ42的聚集倾向更低。如在图6B中示出的，具有SEQ ID NO:190和SEQ ID NO:192的肽的聚集倾向也比野生型Aβ42(SEQ ID NO:1)的聚集倾向更低。
实例3-SH-SY5Y神经元细胞系中的细胞增殖的评估
进行实验以证明Aβ42的非聚集类似物可以增强表达突变淀粉样蛋白前体蛋白(APP)的神经元细胞的增殖，并在使用γ-分泌酶抑制剂在药理学上耗尽Aβ42后挽救神经元细胞。
图7A示出了对表达具有瑞典突变(APP-SH-SY5Y)的淀粉样蛋白前体蛋白基因的SH-SY5Y神经元细胞系进行的测定中的相对于未经处理的细胞的细胞增殖百分比。在无血清条件下，用不同浓度的Aβ42或其非聚集类似物或乱序对照肽(YHAGVDKEVVFDEGAGAEHGLAQKIVRGFGVSDVSMIHINLF，SEQ ID NO:711)处理细胞72小时，然后使用WST-1测定测量细胞增殖。结果表示以四倍体进行的两个实验的平均值，其中星号表示显著差异(使用单向ANOVA与邓尼特多重比较测试(Dunnetts's multiple comparison test)评估相较于未经处理的APP-SH-SY5Y细胞的显著差异，并且通过*P<0.05、**P<0.01和***P<0.001表示，ns：不显著)。0001肽是具有SEQ ID NO:1的野生型Aβ42。0003肽是具有SEQ ID NO:3的Aβ40肽。0088肽是具有SEQ ID NO:88(M35P修饰)的Aβ42类似物，并且0100肽是具有SEQ ID NO:100(V36P)的Aβ42类似物。
图7B示出了对表达具有瑞典突变(APP-SH-SY5Y)的淀粉样蛋白前体蛋白基因的SH-SY5Y神经元细胞系进行的测定中的相对于野生型细胞的细胞增殖百分比。在无血清条件下，用不同浓度的Aβ42或其非聚集类似物或具有SEQ ID NO:711的乱序对照肽处理细胞72小时，然后使用WST-1测定测量细胞增殖。结果表示以四联进行的两个实验的平均值，其中星号表示显著差异(使用单向ANOVA与邓尼特多重比较测试评估相较于未经处理的野生型SH-SY5Y细胞的显著差异，并且通过*P<0.05、**P<0.01和***P<0.001表示，ns：不显著)。0001肽是具有SEQ ID NO:1的野生型Aβ42。0003肽是具有SEQ ID NO:3的Aβ40肽。0088肽是具有SEQ ID NO:88(M35P修饰)的Aβ42类似物，并且0100肽是具有SEQ ID NO:100(V36P)的Aβ42类似物。
图7C和7D示出了另外的类似实验的数据，其示出了相对于未经处理的细胞的沿较短的y轴绘制的细胞增殖以更好地示出比较。
图8示出了用10μM的γ-分泌酶抑制剂(醛2-萘甲酰基-VF-CHO)处理，然后用不同浓度的Aβ42或其非聚集类似物或乱序对照肽(如上的序列)在无血清条件下处理48小时的SH-SY5Y神经元细胞，然后使用WST-1测定测量细胞增殖。结果表示四联处理的平均值，其中星号表示相较于经γ-分泌酶抑制剂处理的细胞的显著差异。使用单向ANOVA与邓尼特多重比较测试评估显著差异，并通过*P<0.05、**P<0.01和***P<0.001表示，ns：不显著。
实例4-确定可溶性Aβ42对认知功能的重要性
图9A和图9B示出，脑脊液中的可溶性Aβ42肽水平的降低与认知功能的降低相关，即使在斑块负荷增加的患者中也是如此(图9B)。在这项研究中，根据由阿尔茨海默氏病神经成像倡议(ADNI)提供的数据，使用ELISA免疫测定(Elecsys)确定脑脊液(CSF)中的Aβ42水平。图9A中示出了跨每个诊断类别中的所有受试者的可溶性Aβ42，而图9B示出了每个诊断类别中的跨CL三分位数的可溶性Aβ42水平，其中CL三分位数是通过定量淀粉样蛋白沉积症的PET扫描的标准摄取值比(SUVR)、定量跨皮质灰质的SUVR、通过整个小脑归一化并分为SUVR三分位数来确定的；使用如由ADNI提供的每种示踪剂的特定方程将SUVR水平转换为百分位数(CL)。较低水平的可溶性Aβ42与轻度认知障碍相关，其中甚至更低的水平与阿尔茨海默氏病的存在相关。还参考电子临床医学(EClinical Medicine)(2021)第38卷100988，所述文献的全部内容通过引用并入本文。因此，可溶性Aβ42水平的降低与认知功能水平的降低相关。
图10示出了在参与显性遗传阿尔茨海默氏病网络(DIAN)群组研究的突变携带者中，在回顾性纵向研究中，PiB-PET阳性群组(即出现淀粉样蛋白斑块的患者)中的非进展型与进展型之间的脑脊液Aβ42水平与临床痴呆评定量表(CDR)的比较。在这项研究中，使用来自宾夕法尼亚州马尔文的富吉瑞必欧公司(Fujirebio,Malvern,PA)的AlzBio3测定评估CSF中的Aβ42水平。非CDR进展型的CSF中的Aβ42值(297.73±13.66)高于CDR进展型的CSF中的Aβ42值(218.73±17.22)；总体群组：非CDR进展型(380.83±14.5)相对于CDR进展型(313.35±26.46)。误差条表示平均值的标准误差。CDR进展被定义为研究随访时段内CDR的任何增加。如果患者的匹兹堡化合物B PET(PiB-PET)的标准摄取率(SUVR)大于或等于1.42，则将其定义为淀粉样蛋白PiB-PET阳性。不同的测定可能会产生CSF中的可溶性Aβ42水平的不同绝对值，但可溶性Aβ42水平较低与预后较差相关的总体趋势是一致的。
各个实施例中的替代疗法将旨在使用非聚集类似物将可溶性功能性蛋白的水平恢复到这一水平。
实例5-非聚集肽类似物对皮质神经元中的α7烟碱乙酰胆碱受体的效应
在PC驱动的快速应用α7激动剂PNU 282987(1μM)和α7PAM PNU 120596(10μM)的阳性变构调节剂(PAM)的组合的情况下，对经培养的WT小鼠皮质神经元进行活细胞钙成像。此组合揭示了α7nAChR的完整活性范围。用α7nAChR阻断剂MLA和α-BungTX验证α7介导的效应的特异性。如下所述，确定用非聚集的Aβ42类似物处理增强α7nAChR介导的Ca+2流入，其示出了以pM浓度共应用非聚集的Aβ42类似物推进/促进/增强PAM PNU 120596激活α7受体的能力，这表明非聚集的Aβ42类似物作为受体活性的正调节剂发挥作用。每个图中的中间条(PNU4)表示与应用前的基线信号(PNU3)和应用后的基线信号(PNU5)相比，由非聚集肽类似物介导的Ca+2流入的增强百分比。
图11A-11D示出了皮质神经元中的α7烟碱乙酰胆碱受体相较于在指定浓度下的示例非聚集肽类似物的控制前应答和控制后应答的易化百分比，所述示例非聚集肽类似物具有SEQ ID NO:88的氨基酸序列。图12A-12D和13示出了皮质神经元中的α7烟碱乙酰胆碱受体相较于在指定浓度下的另外的示例非聚集肽类似物的控制前应答和控制后应答的易化百分比，所述另外的示例非聚集肽类似物分别具有SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:190的氨基酸序列。图14示出了皮质神经元中的α7烟碱乙酰胆碱受体相较于具有SEQ ID NO:1的Aβ42的控制前应答和控制后应答的易化百分比，并且图15A-15D示出了皮质神经元中的α7烟碱乙酰胆碱受体相较于具有SEQ ID NO:711的氨基酸序列的对照乱序肽的控制前应答和控制后应答的易化百分比。
这些结果表明，在pM浓度下共应用非聚集类似物促进PAM PNU 120596激活α7受体的能力，在不受理论约束的情况下，这表明所述类似物作为受体活性的正调节剂发挥作用。
图16示出，在以pM浓度用肽处理5分钟后，具有SEQ ID NO:88或SEQ ID NO:190的氨基酸序列的非聚集肽类似物诱导SHSY-5Y细胞中的下游ERK1/2磷酸化。ERK磷酸化对细胞增殖、神经发生和突触可塑性而言是重要的，并且位于钙离子流入穿过α7受体的下游。为了获得图16中示出的数据，用30pM肽处理SH-SY5Y细胞5分钟，然后裂解，并且通过商用ELISA试剂盒定量ERK磷酸化。图16中示出的结果表明，被测的Aβ42的非聚集类似物激活了通过α7结合和Ca+2流入介导的神经原性信号传导通路。虽然Aβ42在图16中没有用作对照，但比较Aβ42与非聚集肽类似物的活性的并行实验表明，非聚集肽类似物部分上的活性更高。
实例6-结构研究
图17示出了对接模拟的结果，其示出了具有SEQ ID NO:88的氨基酸序列的肽通过肽类似物的N-末端结构域与α7烟碱乙酰胆碱受体结合。肽在图的右手侧可见，其中肽的N-末端部分被收容于在α7受体的细胞外结构域内形成的结合袋内。在不受理论约束的情况下，与α7受体的结合通过肽类似物的N-末端结构域发生而C-末端结构域是β-折叠聚集结构域的事实被认为支持在肽的C-末端部分进行修饰不太可能干扰Aβ42肽的正常生物功能。
图18示出了Aβ42肽的反向堆叠的β-折叠的结构表示，据信所述β-折叠形成了在阿尔茨海默氏病中形成淀粉样蛋白沉积物的原丝。在每个反向堆叠的β-折叠中，由蛋氨酸35占据的位置被圈出并由箭头指示，以示出此残基在稳定交叉β淀粉样蛋白构象中的位置。
上述实例表明，在接受的阿尔茨海默氏病动物模型中，可以施用非聚集的Aβ42类似物来改善所述疾病的症状。基于这些结果，可以合理地预测，使用与各种蛋白质病有关的其它蛋白质的非聚集类似物可以用于治疗和/或预防此些蛋白质病。
虽然上文讨论了一些示范性方面和实施例，但本领域的技术人员将认识到其某些修改、排列、添加和子组合。因此，以下所附的权利要求和此后引入的权利要求旨在被解释为包含所有此些修改、排列、添加和子组合，这与作为整体的本说明书的最宽泛的解释是一致的。
参考文献
以下参考文献与本文所描述的主题可能有关。以下参考文献中的每个参考文献通过引用以其整体并入本文。
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●授予加埃塔(Gaeta)等人的US 5686411。
参考以下方面进一步定义了某些实施例，这些方面是说明性的并且不限制范围。
A.一种蛋白质病中涉及的蛋白质的非聚集蛋白类似物，所述蛋白质具有β-折叠聚集结构域，并且所述非聚集蛋白类似物包括在所述β-折叠聚集结构域中的β-折叠不稳定突变，所述非聚集蛋白类似物基本上保留所述蛋白质的野生型功能。
B.根据前述方面所述的非聚集蛋白类似物，其包括在所述β-折叠聚集结构域中的两个或更多个β折叠不稳定突变。
C.根据前述方面中任一方面所述的非聚集蛋白类似物，其中所述β-折叠不稳定突变包括用带电荷或极性氨基酸残基、甘氨酸残基、脯氨酸残基或氨基酸的β-折叠不稳定类似物取代所述蛋白质病中涉及的所述蛋白质的天然存在的氨基酸残基。
D.根据前述方面所述的非聚集蛋白类似物，其中所述带电荷或极性氨基酸残基或其类似物包括K、R、H、E、D、S、T、N、Q、C或干扰所述β-折叠聚集结构域内的β-折叠形成的氨基酸类似物，其中所述干扰β-折叠形成的氨基酸类似物任选地为3-羟基脯氨酸、4-羟基脯氨酸、硒代半胱氨酸、焦谷氨酸、羧基谷氨酸、辛烯基丙氨酸、吡咯赖氨酸、棕榈酰天冬氨酸盐、D-氨基酸(包含D-脯氨酸)、β-氨基酸、γ-氨基酸、高氨基酸、β-高氨基酸、α-甲基氨基酸、N-甲基氨基酸、N-乙基氨基酸、N-烷基化氨基酸衍生物(优选地在烷基部分中具有1、2或3个碳)、丙酮酸衍生物、支链氨基酸衍生物、硝基氨基酸衍生物、卤化氨基酸衍生物、环取代的氨基酸衍生物、芳香族氨基酸衍生物、线性核心氨基酸、类肽衍生物、羟基化氨基酸衍生物、环状氨基酸、双环氨基酸、3-氨基-3-芳基-丙酸、3-氨基-4-芳基-丁酸、具有芳香族间隔子的氨基酸、脂环族氨基酸或α-苯基甘氨酸衍生物。
E.根据前述方面中任一方面所述的非聚集蛋白类似物，其中所述β-折叠不稳定突变包括所述蛋白质病中涉及的所述蛋白质的一或多个天然存在的氨基酸残基的缺失，任选地包含至多或包含所述β-折叠聚集结构域的所有天然存在的氨基酸残基的缺失。
F.根据前述方面中任一方面所述的非聚集蛋白类似物，其中所述β-折叠不稳定突变包括一与五个氨基酸残基之间的插入。
G.根据前述权利要求所述的非聚集蛋白类似物，其中所插入的氨基酸残基中的至少一个包括K、R、H、E、D、S、T、N、Q、C、P或G或干扰β-折叠形成的氨基酸类似物。
H.根据前述方面中任一方面所述的非聚集蛋白类似物，其中所述蛋白质病中涉及的所述蛋白质包括淀粉样蛋白前体蛋白(APP)、淀粉样蛋白β(包含Aβ-39、Aβ-40、Aβ-42或Aβ-43同种型)、α-突触核蛋白、朊病毒蛋白、亨廷顿蛋白、p53或表1中列出的任何蛋白质或肽。
I.根据前述方面中任一方面所述的非聚集蛋白类似物，其中所述蛋白质病中涉及的所述蛋白质包括淀粉样蛋白β，其中任选地：
所述β-折叠聚集结构域包括所述淀粉样蛋白β的位置29-42；
所述β-折叠不稳定突变包括以下氨基酸残基之一对所述天然存在的氨基酸残基的缺失或取代：G、P、K、R、H、E、D、S、T、N、Q、C或干扰β-折叠形成的氨基酸类似物；
所述β-折叠不稳定突变包括在邻近所述天然存在的氨基酸的一与五个氨基酸残基之间的插入，任选地其中所插入的氨基酸残基中的至少一个包括G、P、K、R、H、E、D、S、T、N、Q、C或干扰β-折叠形成的氨基酸类似物；
所述非聚集蛋白类似物包括具有SEQ ID NO:2-193中的任一者所示的氨基酸序列的蛋白质；和/或
所述非聚集蛋白类似物包括具有SEQ ID NO:194-207或SEQ ID NO:712-742中的任一者所示的氨基酸序列的蛋白质，其中X表示在一与五个氨基酸残基、任选地G、P、K、R、H、E、D、S、T、N、Q、C或干扰β-折叠形成的氨基酸类似物之间的缺失、插入或以下氨基酸残基之一对所述天然存在的氨基酸的取代：G、P、K、R、H、E、D、S、T、N、Q、C或干扰β-折叠形成的氨基酸类似物。
J.根据前述方面中任一方面所述的非聚集蛋白类似物，其中所述蛋白质病中涉及的所述蛋白质包括α-突触核蛋白，其中任选地：
所述β-折叠聚集结构域包括所述α-突触核蛋白的位置61-95；
所述β-折叠不稳定突变包括以下氨基酸残基之一对所述天然存在的氨基酸残基的缺失或取代：G、P、K、R、H、E、D、S、T、N、Q、C或干扰β-折叠形成的氨基酸类似物；
所述β-折叠不稳定突变包括在邻近所述天然存在的氨基酸的一与五个氨基酸残基之间的插入，任选地其中所插入的氨基酸残基中的至少一个包括G、P、K、R、H、E、D、S、T、N、Q、C或干扰β-折叠形成的氨基酸类似物；
所述非聚集蛋白类似物包括具有SEQ ID NO:209-698中的任一者所示的氨基酸序列的蛋白质，其中X表示在一与五个氨基酸残基、任选地G、P、K、R、H、E、D、S、T、N、Q、C或干扰β-折叠形成的氨基酸类似物之间的缺失、插入或以下氨基酸残基之一对所述天然存在的氨基酸的取代：G、P、K、R、H、E、D、S、T、N、Q、C或干扰β-折叠形成的氨基酸类似物。
K.根据前述方面中任一方面所述的非聚集蛋白类似物，其中所述蛋白质病中涉及的所述蛋白质包括朊病毒蛋白，其中任选地：
所述β-折叠聚集结构域包括所述朊病毒蛋白的位置109-121；
所述β-折叠不稳定突变包括以下氨基酸残基之一对所述天然存在的氨基酸残基的缺失或取代：G、P、K、R、H、E、D、S、T、N、Q、C或干扰β-折叠形成的氨基酸类似物；
所述β-折叠不稳定突变包括在邻近所述天然存在的氨基酸的一与五个氨基酸残基之间的插入，任选地其中所插入的氨基酸残基中的至少一个包括G、P、K、R、H、E、D、S、T、N、Q、C或干扰β-折叠形成的氨基酸类似物；和/或
所述非聚集蛋白类似物包括具有SEQ ID NO:700-710中的任一者所示的氨基酸序列的蛋白质，其中X表示在一与五个氨基酸残基、任选地G、P、K、R、H、E、D、S、T、N、Q、C或干扰β-折叠形成的氨基酸类似物之间的缺失、插入或以下氨基酸残基之一对所述天然存在的氨基酸的取代：G、P、K、R、H、E、D、S、T、N、Q、C或干扰β-折叠形成的氨基酸类似物。
L.一种核酸，其编码根据前述方面中任一方面所述的非聚集蛋白类似物。
M.根据前述方面所述的核酸，其包括mRNA。
N.一种基于脂质体的颗粒，其包括根据前述方面中任一方面所述的核酸，所述基于脂质体的颗粒被设计用于将所述核酸递送到靶细胞以引起所述非聚集蛋白类似物的表达。
O.一种用于治疗和/或预防蛋白质病的方法，所述方法包括向患有所述蛋白质病或有风险患所述蛋白质病的受试者施用根据前述方面中任一方面所述的肽或核酸。
P.根据前述权利要求所述的方法，其中所述蛋白质病包括阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、路易体病或路易体痴呆、皮克氏病、克罗伊茨费尔德-雅各布病、亨廷顿氏病、肌萎缩侧索硬化症(ALS)、唐氏综合征、神经变性伴I型脑铁积聚(哈勒沃登-施帕茨病)、库鲁病或其它传染性海绵状脑病(TSE)、轻度认知障碍(MCI)、脑淀粉样蛋白血管病(CAA)、血管性痴呆、或以异常淀粉样蛋白沉积为特征的任何神经退行性疾病或表1中列出的任何疾病或病症。
Q.根据前述方面中任一方面所述的方法，其中施用是通过以下进行的：静脉内、脑室内、大脑内、鞘内、腹膜内、肌肉内或静脉内注射、输注或局部、鼻、口(包含舌下或颊)、肛门、眼部或耳部递送；通过脂质体介导的递送，包含通过用合适的机制(例如，CRISPR-Cas基因编辑系统)一起直接递送根据前述权利要求中任一权利要求所述的非聚集蛋白类似物、直接递送编码根据前述权利要求中任一权利要求所述的非聚集蛋白类似物的mRNA或递送编码根据前述权利要求中任一权利要求所述的非聚集蛋白类似物的DNA，以将所述DNA整合到所述细胞的基因组中，从而促进由所述细胞表达所述非聚集蛋白类似物。
R.一种设计与蛋白质病有关的蛋白质的非聚集类似物的方法，所述方法包括以下步骤：
选择与所述蛋白质病有关的所述蛋白质；
鉴定与所述蛋白质病有关的所述蛋白质的β-折叠聚集结构域；以及
鉴定所述β-折叠聚集结构域内的一或多个β-折叠不稳定突变。
S.根据前述方面所述的方法，其中所述鉴定与所述蛋白质病有关的所述蛋白质的β-折叠聚集结构域的步骤包括进行结构生物学研究。
T.根据前述方面中任一方面所述的方法，其中所述鉴定所述β-折叠聚集结构域内的一或多个β-折叠不稳定突变的步骤包括以下中的一或多项：
从所述β-折叠聚集结构域中缺失天然存在的氨基酸残基；和/或
用损害交叉β-折叠结构形成的氨基酸残基替换所述β-折叠聚集结构域中的天然存在的氨基酸残基。
U.根据前述方面所述的方法，其中用损害交叉β折叠结构形成的氨基酸残基替换所述β-折叠聚集结构域中的所述天然存在的氨基酸残基包括用干扰β-折叠形成的氨基酸类似物替换具有G、P、K、R、H、E、D、S、T、N、Q或C之一的所述天然存在的氨基酸残基。
V.根据前述方面中任一方面所述的非聚集蛋白类似物或方法，其中所述干扰β-折叠形成的氨基酸类似物任选地为3-羟基脯氨酸、4-羟基脯氨酸、硒代半胱氨酸、焦谷氨酸、羧基谷氨酸、辛烯基丙氨酸、吡咯赖氨酸、棕榈酰天冬氨酸盐、D-氨基酸(包含D-脯氨酸)、β-氨基酸、γ-氨基酸、高氨基酸、β-高氨基酸、α-甲基氨基酸、N-甲基氨基酸、N-乙基氨基酸、N-烷基化氨基酸衍生物(优选地在烷基部分中具有1、2或3个碳)、丙酮酸衍生物、支链氨基酸衍生物、硝基氨基酸衍生物、卤化氨基酸衍生物、环取代的氨基酸衍生物、芳香族氨基酸衍生物、线性核心氨基酸、类肽衍生物、羟基化氨基酸衍生物、环状氨基酸、双环氨基酸、3-氨基-3-芳基-丙酸、3-氨基-4-芳基-丁酸、具有芳香族间隔子的氨基酸、脂环族氨基酸或α-苯基甘氨酸衍生物。
Claims (38)
1.一种Aβ42肽的非聚集肽类似物，所述Aβ42肽具有对应于SEQ ID NO:1的位置1-28的N末端结构域和对应于SEQ ID NO:1的位置29-42的β-折叠聚集结构域，所述非聚集肽类似物包括所述β-折叠聚集结构域中的β-折叠不稳定修饰；并且
所述非聚集肽类似物基本上保留了所述Aβ42肽的除非聚集性之外的天然功能。
2.根据前述权利要求所述的非聚集肽类似物，其中保留的天然肽功能包括增强或诱导α7烟碱乙酰胆碱受体(α7nAChR)介导的Ca2+流入的能力。
3.根据前述权利要求中任一权利要求所述的非聚集肽类似物，其中所述保留的天然肽功能是在≤3000pM的浓度下、优选地在≤300pM下、更优选地在≤30pM下、最优选地在≤3pM下增强或诱导皮质神经元中α7nAChR介导的Ca2+流入的能力。
4.根据前述权利要求中任一权利要求所述的非聚集肽类似物，其中所述肽类似物能够以天然可溶性Aβ42肽水平的至少90％执行Aβ42的所述保留的天然功能。
5.根据前述权利要求中任一权利要求所述的非聚集肽类似物，其中所述β-折叠不稳定修饰使得所述类似物在硫黄素-T测定中聚集的稳态水平是野生型Aβ42(具有SEQID NO:1的氨基酸序列)聚集的稳态水平的至多1/2(优选地至多1/3、最优选地至多1/4)。
6.根据前述权利要求中任一权利要求所述的非聚集肽类似物，其中所述类似物的所述N末端结构域包括与SEQ ID NO:1的残基1-28相差不超过3个(优选地2个、更优选地1个、最优选地0个)缺失、插入和/或取代、优选地保守取代的氨基酸序列。
7.根据前述权利要求中任一权利要求所述的非聚集肽类似物，其包括相对于SEQ IDNO:1在所述N末端结构域中的至多三个(优选地两个、更优选地一个)保守氨基酸取代。
8.根据前述权利要求中任一权利要求所述的非聚集肽类似物，其中所述类似物的所述β-折叠聚集结构域包括与SEQ ID NO:1的残基29-42相差不超过5个(优选地3个、更优选地1个、最优选地0个)缺失、插入和/或取代、优选地保守取代的氨基酸序列。
9.根据前述权利要求中任一权利要求所述的非聚集肽类似物，除所述β-折叠不稳定修饰外，所述非聚集肽类似物包括相对于SEQ ID NO:1在所述β-折叠聚集结构域中的至多三个(优选地两个、更优选地一个)保守氨基酸取代。
10.根据前述权利要求中任一权利要求所述的非聚集肽类似物，其中所述β-折叠不稳定修饰包括用氨基酸类似物取代所述肽的天然存在的氨基酸残基。
11.根据前述权利要求中任一权利要求所述的非聚集肽类似物，其中所述β-折叠不稳定修饰包括用氨基酸类似物取代相对于SEQ ID NO:1在三个单独位置处的至多三个天然存在的氨基酸残基。
12.根据前述权利要求中任一权利要求所述的非聚集肽类似物，其中所述氨基酸类似物是以下各项之一：3-羟基脯氨酸、4-羟基脯氨酸、硒代半胱氨酸、焦谷氨酸、羧基谷氨酸、辛烯基丙氨酸、吡咯赖氨酸、棕榈酰天冬氨酸盐、D-氨基酸、β-氨基酸、γ-氨基酸、高氨基酸、β-高氨基酸、α-甲基氨基酸、N-烷基化氨基酸衍生物、丙酮酸衍生物、具支链氨基酸衍生物、硝基氨基酸衍生物、卤化氨基酸衍生物、环取代的氨基酸衍生物、芳香族氨基酸衍生物、线性核心氨基酸、类肽衍生物、羟基化氨基酸衍生物、环状氨基酸、双环氨基酸、3-氨基-3-芳基-丙酸、3-氨基-4-芳基-丁酸、具有芳香族间隔子的氨基酸、脂环族氨基酸、α-苯基甘氨酸衍生物。
13.根据前述权利要求中任一权利要求所述的非聚集肽类似物，其中所述氨基酸类似物是以下各项之一：N-烷基化氨基酸衍生物(N-甲基、N-乙基、N-丙基)、β-氨基酸、γ-氨基酸、线性核心氨基酸或环状氨基酸。
14.根据前述权利要求中任一权利要求所述的非聚集肽类似物，其中所述氨基酸类似物包括N-烷基化氨基酸类似物、优选地在烷基部分中具有1-3个碳。
15.根据前述权利要求中任一权利要求所述的非聚集肽类似物，其中所述氨基酸类似物包括所述肽的所述天然存在的氨基酸残基的N-甲基或N-乙基类似物。
16.根据权利要求1所述的非聚集肽类似物，其中所述非聚集肽类似物包括具有SEQ IDNO:2-193中的任一者所示的氨基酸序列的肽。
17.根据权利要求1所述的非聚集肽类似物，其中所述非聚集肽类似物包括具有SEQ IDNO:194-207或SEQ ID NO:712-742中的任一者所示的氨基酸序列的肽，其中X是用非天然存在的氨基酸进行的取代。
18.根据前述权利要求中任一权利要求所述的非聚集肽类似物，其中所述β-折叠不稳定修饰包括M35的取代、优选地用氨基酸类似物取代。
19.根据前述权利要求中任一权利要求所述的非聚集肽类似物，其中所述β-折叠不稳定修饰包括V36的取代、优选地用氨基酸类似物取代。
20.根据前述权利要求中任一权利要求所述的非聚集肽类似物，其中所述β-折叠不稳定修饰包括M35变为脯氨酸、N-甲基蛋氨酸或吡咯赖氨酸、优选地N-甲基蛋氨酸的取代。
21.根据前述权利要求中任一权利要求所述的非聚集肽类似物，其中所述β-折叠不稳定修饰包括V36变为脯氨酸、N-甲基缬氨酸或吡咯赖氨酸、优选地吡咯赖氨酸的取代。
22.根据前述权利要求中任一权利要求所述的非聚集肽类似物，其中所述β-折叠不稳定修饰包括以下各项中的一或多种：
用甲基甘氨酸或N-乙基甘氨酸替换G29；
用N-甲基丙氨酸或N-乙基丙氨酸替换A30；
用N-甲基异亮氨酸或N-乙基异亮氨酸替换I31；
用N-甲基异亮氨酸或N-乙基异亮氨酸替换I32；
用N-甲基甘氨酸或N-乙基甘氨酸替换G33；
用N-甲基亮氨酸或N-乙基亮氨酸替换L34；
用N-甲基蛋氨酸或N-乙基蛋氨酸替换M35；
用N-甲基缬氨酸或N-乙基缬氨酸替换V36；
用N-甲基甘氨酸或N-乙基甘氨酸替换G37；
用N-甲基甘氨酸或N-乙基甘氨酸替换G38；
用N-甲基缬氨酸或N-乙基缬氨酸替换V39；
用N-甲基缬氨酸或N-乙基缬氨酸替换V40；
用N-甲基异亮氨酸或N-乙基异亮氨酸替换141；和/或
用N-甲基丙氨酸或N-乙基丙氨酸替换A42。
23.根据前述权利要求中任一权利要求所述的非聚集肽类似物，其中所述β-折叠不稳定修饰包括用N-甲基蛋氨酸或N-乙基蛋氨酸替换M35。
24.根据前述权利要求中任一权利要求所述的非聚集肽类似物，其中所述β-折叠不稳定修饰是用N-甲基缬氨酸或N-乙基缬氨酸替换V36。
25.根据前述权利要求中任一权利要求所述的非聚集肽类似物，其具有SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:190或SEQ ID NO:192之一的氨基酸序列，在所述N末端结构域和所述β-折叠聚集结构域中的任一者或两者中具有至多三个保守氨基酸取代。
26.根据前述权利要求中任一权利要求所述的非聚集肽类似物，其具有SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:190或SEQ ID NO:192之一的氨基酸序列。
27.根据前述权利要求中任一权利要求所述的非聚集肽类似物，其用于疗法中。
28.根据前述权利要求中任一权利要求所述的非聚集肽类似物，其用于治疗和/或预防阿尔茨海默氏病或轻度认知障碍。
29.根据前述权利要求中任一权利要求所述的非聚集肽类似物，其用于治疗和/或预防常染色体显性阿尔茨海默氏病、散发性阿尔茨海默氏病或早发性散发性阿尔茨海默氏病。
30.根据前述权利要求中任一权利要求所述的非聚集肽类似物，其用于治疗和/或预防常染色体显性阿尔茨海默氏病。
31.根据前述权利要求中任一权利要求所述的非聚集肽类似物，其用于治疗和/或预防由PSEN1、PSEN2或APP中的突变引起的常染色体显性阿尔茨海默氏病。
32.根据前述权利要求中任一权利要求所述的非聚集肽类似物，其用于治疗和/或预防肌萎缩侧索硬化症(ALS)、额颞叶痴呆、帕金森氏病、帕金森氏病痴呆、进行性核上性麻痹、皮质基底节变性、遗传性脑出血伴淀粉样变性、路易体痴呆或多系统萎缩。
33.根据权利要求27至32中任一权利要求所述的供使用的非聚集肽类似物，其中所述肽类似物被施用于脑脊液中的Aβ42水平小于约500pM、优选地小于约400pM、优选地小于约300pM、更优选地小于200pM的受试者。
34.根据权利要求27至33中任一权利要求所述的供使用的非聚集肽类似物，其中所述肽是通过以下方式施用的：皮下、静脉内、脑室内、大脑内、鞘内、腹膜内或肌肉内注射或输注；或局部、鼻、口(包含舌下或颊)、直肠、眼部或耳部递送。
35.一种用于治疗和/或预防阿尔茨海默氏病的方法，所述方法包括向患有阿尔茨海默氏病或有风险患阿尔茨海默氏病的受试者施用根据权利要求1至26中任一权利要求所述的非聚集肽类似物。
36.一种用于治疗和/或预防受试者的肌萎缩侧索硬化症(ALS)、额颞叶痴呆、帕金森氏病、帕金森氏病痴呆、进行性核上性麻痹、皮质基底节变性、遗传性脑出血伴淀粉样变性、路易体痴呆或多系统萎缩的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据权利要求1至26中任一权利要求所述的非聚集肽类似物。
37.一种筛选受试者以确定所述受试者是否是使用根据前述权利要求中任一权利要求所述的非聚集肽类似物治疗和/或预防阿尔茨海默氏病或与可溶性Aβ42肽水平降低相关的另一种病症的候选者的方法，所述方法包括：
确定所述受试者的脑脊液样品中的Aβ42的浓度；以及
如果所述脑脊液样品中的Aβ42的测得浓度小于约500pM、优选地小于约400pM、优选地小于约300pM、更优选地小于200pM，则将所述受试者鉴定为通过施用如前述权利要求中任一权利要求所定义的肽治疗和/或预防阿尔茨海默氏病的候选者；
其中所述方法任选地进一步包括向所述受试者施用所述非聚集肽类似物。
38.根据权利要求37所述的方法，其中使用液相色谱法-串联质谱法或免疫测定(例如Elecsys、AlzBio3.)来确定所述脑脊液样品中的Aβ42浓度。
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