JP2022537914A - アポリポタンパク質e断片 - Google Patents
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Abstract
Description
本開示は、アポリポタンパク質E(ApoE)の断片に関する。本明細書に報告されるとおり、アルツハイマー病(AD)患者、特にAPOE ε4アレルを有するAD患者では、ApoE断片が有意に増加する。
本明細書に記載されるApoE断片は、ワクチン、特に、神経学的障害又は病態、例えばアルツハイマー病の予防又は治療に用いられるワクチンに取り込まれてもよい。
本明細書には更に、本明細書に記載される新規ApoE断片に基づきスクリーニングする方法が提供される。
更なる態様において、本明細書には、対象における配列番号1~3のうちのいずれか1つのアミノ酸配列からなるアポリポタンパク質E(ApoE)断片の存在又は量を検出する方法が提供される。特定の実施形態において、本方法は、配列番号1のアミノ酸配列からなるApoE断片の存在又は量を検出する方法である。特定の実施形態において、本方法は、配列番号2のアミノ酸配列からなるApoE断片の存在又は量を検出する方法である。特定の実施形態において、本方法は、配列番号3のアミノ酸配列からなるApoE断片の存在又は量を検出する方法である。
本願には様々な文献が引用され、それらの各々は、全体として参照により本明細書に援用される。
アルツハイマー病患者及び対照からのヒト脳抽出物におけるApoE断片の分析
本実施例は、ヒト脳組織のホモジナイゼーションと、それに続く2%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)を含有する放射性免疫沈降アッセイ(RIPA)緩衝液中の脳抽出物からのApoE断片のウエスタンブロット分析について記載する。
脳組織ホモジナイゼーション及び試料調製:様々なAPOE遺伝子型を持つアルツハイマー病(AD)患者(n=24)及び対照(n=14)からの新鮮凍結ヒト脳組織をRIPA 2%SDS抽出緩衝液中1:5の重量:体積でホモジナイズし、続いて16000×gで1時間遠心した。得られた上清は、分析時まで-80℃で凍結した。
ヒト脳RIPA 2%SDS抽出物(n=38)のウエスタンブロット分析により、完全長ApoE並びに数種の低分子量(LMW)ApoE断片が同定された。図1は、ウエスタンブロット分析からの代表し得る膜を示す。LMW ApoE断片は、10、12、14~15及び17kDaのサイズと推定された(図2)。
アルツハイマー病患者のヒト脳抽出物からのApoE断片の抽出及び単離
本実施例は、アミノ酸配列分析に十分なタンパク質濃度の高純度ApoE試料を調製するための、ヒト脳抽出物からの完全長ApoE並びに12及び15kDa ApoE断片の単離及び濃縮手順について記載する。
様々なAPOE遺伝子型を持つAD患者のヒト脳抽出物からのApoEの単離:ヒト脳抽出物からのApoEの免疫沈降(IP)プロトコルを作成した。プロトコルを最適化したことにより、アミノ酸配列分析に十分なタンパク質濃度の高純度ApoE試料が得られた。このワークフローの概略図については、図5を参照のこと。1.5mgの総タンパク質濃度のヒト脳RIPA 2%SDS抽出物をIP緩衝液(1×PBS、0.05%Tween(登録商標)20、0.1%トリトンX-100、プロテアーゼ阻害薬カクテル)と混合し、アミノ酸237~299の範囲内に結合エピトープを有する200μgの抗ApoE C末端抗体(Thermo Scientific、カタログ番号PA5-27088)を加えることにより、ApoEを免疫沈降させた。上下に回転させながら室温で2時間インキュベートする間に、IP抗体と脳抽出物中のApoEとの間で複合体を形成させた。このIP混合物に500μlのプロテインA Dynabeads(Dynal、Thermo Scientific、カタログ番号10002D)を加え、上下に回転させながら室温で1時間インキュベートした後、プロテインA Dynabeadsを洗浄して、ビーズへの非特異的結合を除去した。プロテインA Dynabeadsに(IP抗体を介して)結合したApoEタンパク質を250μl溶離緩衝液(1.25mMトリス pH6.8、0.005%SDS)で溶離させて、900rpmで振盪しながら95℃で5分間インキュベートした。手早くスピンした後、試料をDynaMag(商標)-2磁石上に置き、液体を新しいチューブに移し替えた。
作成したIPプロトコル(図5)を用いて、様々なAPOE遺伝子型(ε2/ε3、ε3/ε3、ε3/ε4及びε4/ε4)のヒトAD脳からApoEを単離し、溶離したタンパク質をSDS-PAGE上で泳動させた。
12kDa ApoE断片におけるトリプシン切断部位の同定
試料調製
組換えヒト完全長ApoE4(rhApoE4)及び/又は免疫沈降からの34kDaのバンド、免疫沈降からの15kDaのバンド、及び免疫沈降からの12kDaのバンドを含む、1.5ml PPチューブ内にある実施例2からの銀染色したゲルストリップを十分な水で洗浄し、続いて500μlアセトニトリル(ACN;供給元Wako)を用いて脱水した。各ゲルが白色になった後、溶媒を全て除去し、続いて500μlの水を加えて各ゲルを膨潤させた。水を除去した後、各ゲルに500μlのSilver Quest脱染剤(Invitrogen)を加え、室温で15分間インキュベートした。脱染溶媒を全て除去した後、1000μlの水を加え、次に室温で10分間インキュベートした。水を除去した後、再び1000μlの水を加えて各ゲルを洗浄し、次にチューブから溶媒を全て除去した。各ゲルに500μl ACNを加え、次に各ゲルが白色になった後、過剰のACNを除去した。
入手した試料はナノフローLC-MS/MSシステムで分析し、これにはQ Exactive HF質量分析計(Thermo Fisher Scientific)をオンラインUltiMate 3000 Rapid Separation LC(Dionex)及びHTC PAL試料インジェクター(CTC Analytics)と結合し、それにマイクロキャピラリーカラム(360nm外径(OD)×100μm ID)を装着したものを使用し、カラムは20cm未満のReproSil C18-AQ 3μmビーズ(Dr.Maisch GmbH)を充填したもので、集積エレクトロスプレーエミッターチップ(P-2000レーザーベースのプラー、Sutter Instruments)を備えていた。各試料をキャピラリーカラムに4μlフルループモード注入によってロードした。LC分離については、4%ACN及び0.5%酢酸(Wako)の移動相A並びに80%アセトニトリル及び0.5%酢酸の移動相Bを使用して、60分で1~40%のB、10分で40~70%のB、及び5分で70~99%のB、次に99%のBで10分間保持する500nl/分の多重直線グラジエント溶離を行った。各試料の総分析時間は120分であった。
DDA質量スペクトルは全て、Proteome Discoverer バージョン2.1(Thermo Fisher Scientific)でヒトApoE4 FASTAファイルを使用して分析した。データセットのMS/MS検索には、SEQUEST-HTアルゴリズムを以下のパラメータで:メチオニンの酸化を可変修飾とし、システインのカルバミドメチル化を固定修飾とし、及びトリプシンを消化酵素として使用した。ペプチド1個当たり2つの切断の見逃しは許容した。プリカーサイオンのマストレランスは10ppmに設定し、プロダクトイオンのマストレランスは20mDaに設定した。ペプチドの同定には1%の最大偽発見率(FDR)を適用した。タンパク質の同定には、タンパク質1個当たり2個より多いペプチドが必要であった。次に、ApoE4のみに焦点を置く詳細な分析を行い、12kDaバンドの切断部位が同定された(ApoE4断片)。
この12kDa ApoE断片をトリプシン消化に供して、ApoEの切断部位をペプチドベースで調べた。参照としてrhApoE4及び15kDaバンドを分析した。結果(図8)が示すところによれば、12kDaバンドからのトリプシンペプチドには、ApoEのアミノ酸残基192~206に対応するペプチドとアミノ酸残基207~213に対応するペプチドとの間に「存在量の崖(abundance cliff)」があった。「207~213ペプチド」は高いMS強度で明確に検出されたため、これはつまり、アミノ酸残基190~アミノ酸残基206の領域に少なくとも1つの切断部位があることを意味する。短鎖ペプチド(5残基未満のアミノ酸)は分析から除外しており、そのため、例えば190~191位のVRジペプチドは観察されなかった。
12kDa ApoE断片におけるLysC切断部位の同定
材料及び方法
試料調製、LC/MS分析及びデータ解析は、上記に実施例3について記載するとおり実施した。
12kDa ApoE断片の切断部位をアミノ酸ベースで絞り込むため、別の酵素、リシルエンドペプチダーゼ(LysC)による消化を行った。12kDaバンドの標準的なLysCプロテオーム解析(リジンC末端での切断は固定)の結果、検出された唯一のペプチドは、ApoEのアミノ酸残基234~299に対応するペプチドであった(図9)。このことから、190~206位の間に少なくとも1つの切断部位があるという旨の実施例3の結果が確認される。特に、rhApoE4の切断時にApoEのアミノ酸残基158~233に対応するペプチドが検出されたが(図示せず)、12kDaバンドを切断したときは検出されなかったことから、190~206位の間に少なくとも1つの切断部位が存在することが更に裏付けられる。
12kDa ApoE断片におけるLysC切断部位の更なる特徴付け
材料及び方法
試料調製及びLC/MS分析は、上記に実施例4について記載するとおり実施した。データ解析は、上記に実施例4について記載するとおり実施したが、但し、予想外の領域で切断された特定のペプチドについては、抽出イオンクロマトグラム(XIC)からのターゲット分析(ピーク及び積分を記述する)を実施した。このピーク適格性評価分析は、Xcalibur 4.0ソフトウェア(Thermo Fisher Scientific)のQual Browserによって行った。
同定された12kDa断片を生じさせる予想切断部位の詳細な分析の前に、rhApoE4バンド、免疫沈降からの34kDaバンド、及び免疫沈降からの12kDaバンドのいずれかに、LysC消化によって得られたApoEのアミノ酸残基158~233に対応するペプチド(RLAVYQAGAR EGAERGLSAIR ERLGPLVEQG RVRAATVGSL AGQPLQERAQ AWGERLRARM EEMGSRTRDR LDEVK)が検出されるかどうかを調べた。これは、理論上のm/z(z=10~15、5ppmマストレランス)で各XICを記述することにより行った。これらの結果は、rhApoE4及び34kDaバンドからの溶液に158~233ペプチドが明確に検出されることを示したが、これはつまり、試料調製ステップにアーチファクトの切断がないことを意味している。他方で、12kDaバンドからの試料溶液には、158~233ペプチドは観察されなかった。このことから、12kDa ApoE4断片には158~233の間に少なくとも1つの切断部位があることが指摘された。要約すれば、実施例3に記載されるトリプシン法のLC/MS結果から、190~205位の間の予備的な切断部位が解明され、次に、実施例4及び上記に記載されるとおり、その部位がLysC法によって確認された。190~205の間の可能性のある切断部位をアミノ酸ベースで絞り込むため、12kDaバンドのLysC消化によって提供されるあらゆる理論上の「非従来型」ペプチド(即ち、190~233、191~233、192~233、193~233、194~233、195~233、196~233、197~233、198~233、199~233、200~233、201~233、202~233、203~233、204~233、205~233、及び206~233)について、各XICを記述してフラグメントピークが検出されるか否かを確かめることにより調べた。図10は、ApoEのアミノ酸残基200~233に対応する「非従来型LysCペプチド」を探したときの、これらの結果の一例を示す(GQPLQERAQA WGERLRARME EMGSRTRDRL DEVK;[M]=4054.04490)。200~233ペプチドの理論上のモノアイソトピックm/z値(電荷6、7及び8)は、それぞれ、676.68143、580.15655及び507.76289である。各m/z値についての抽出クロマトグラムは、同じ保持時間でシングルピークを提供し、観察される質量は、いずれの場合も2ppm未満の質量精度で理論値と合致する。これらの結果は、非従来型LysCペプチドが同定されたことを強力に補強するもので、12kDa ApoE断片を生じる具体的な切断部位の肯定的な同定につながった(図11A)。別の試料(ApoE e3/e4アレル)でデュプリケート実験を行ったところ、再現性のある結果が示され(図11B)、切断部位の決定が確認された。
ε4/ε4、ε2/ε3及びε3/ε3アレルを有するヒト脳の12kDa ApoE断片における切断部位の同定
材料及び方法
試料調製、LC/MS分析及びデータ解析は、上記に実施例3~5について記載するとおり実施した。
N末端198L、199A及び200Gが、ApoE ε3/ε4からの12kDa ApoE断片を生じる主要な切断部位と同定された。これらの切断部位が、ε2又はε3ではなく、ε4アレルのみに特異的かどうかを明らかにするため、前節と同じ方法を用いてApoE ε4/ε4、ε2/ε3及びε3/ε3保因者の脳からの12kDaバンドを分析した。
同定されたApoE断片の神経細胞毒性
材料及び方法
細胞培養:24ウェルプレート(Falcon)にNeuro2A細胞(ATCC)を5.0×104細胞/ウェルで播種し、10%ウシ胎仔血清を含有するD-MEM高グルコース(WAKO)で培養した。播種の翌日、リポフェクタミンLTX及びPlus Reagent(Invitrogen)を使用して、ヒトApoE4(完全長)又は同定されたApoE断片(198~299、199~299、200~299)をコードするpAAV-CMVベクターのトランスフェクションを行った。2日後、ベクターをトランスフェクトした細胞をウエスタンブロット分析用に回収し、又はミトコンドリア呼吸測定の4時間前にSeahorse XF96細胞培養マイクロプレート(Agilent Technologies)に2.0×104細胞/ウェルで再び播種した。
Neuro2A細胞及びラット初代海馬ニューロンの両方で、同定されたApoE断片(198~299、199~299、200~299)のいずれか1つを発現する群は予備呼吸能の減少を示したことから(図13A及び図13B)、これらの断片がミトコンドリア損傷を負わせることが示唆される。加えて、これらの断片は、ApoE4完全長と比べてはるかに低い発現レベルでミトコンドリア機能不全を引き起こした(図13A~図13C)。これらの結果は、ヒト脳から同定されたApoEのC末端断片が神経毒性を持つことを示している。
神経毒性のある12kDa ApoE断片の産生を調節する化合物を入手するためのスクリーニング方法
材料及び方法
細胞培養:妊娠時期が調整されたウィスターラット(Charles River Laboratories)からの胎生期(E)18で入手した胎仔の解剖した海馬をトリプシン処理及び機械的解離を用いて消化した。解離したニューロンを24ウェルプレート(Falcon)に1.0×105細胞/ウェルで播種した。7インビトロ日数(DIV)で、完全長ヒトApoE4のAAV-DJ感染を実施した。感染4日後(11DIV)に、4-{4-[2-(3-メチル-4-オキソ-3,4-ジヒドロ-フタラジン-1-イル)-アセチルアミド]-ベンジル}-ピペラジン-1-カルボン酸tert-ブチルエステル(以下、PH-002とも称する)(Merck)を処理した。感染7日後(14DIV)に、ウエスタンブロット及び細胞毒性分析用の試料回収を実施した。
このアッセイでは、細胞毒性を示さないPH-002による神経毒性12kDa ApoE断片の量の減少が濃度依存的に観察されたことから(図14A及び図14B)、この減少がPH-002の細胞毒性に起因するものではなく、この方法がApoE断片化阻害薬の同定に有効であることが指摘される。
Claims (19)
- 配列番号2及び配列番号3からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、アポリポタンパク質Eの断片。
- 配列番号2のアミノ酸配列からなる、請求項1に記載の断片。
- 配列番号3のアミノ酸配列からなる、請求項1に記載の断片。
- 神経毒性を呈する、請求項1~3のいずれか一項に記載の断片。
- 請求項1~4のいずれか一項に記載の断片をコードする単離核酸。
- 請求項5に記載の単離核酸を含むベクター。
- 請求項6に記載のベクターを含む宿主細胞。
- 請求項6に記載のベクターを含むトランスジェニック非ヒト動物。
- 配列番号1~3のうちのいずれか1つのアミノ酸配列からなるアポリポタンパク質E断片を含むワクチン。
- それを必要としている対象の神経学的疾患を予防又は治療する方法であって、請求項9に記載のワクチンを前記対象に投与することを含む方法。
- 配列番号1~3のうちのいずれか1つのアミノ酸配列からなるアポリポタンパク質E断片の神経細胞毒性を調節する能力のある薬理作用物質をスクリーニングする方法であって、
前記断片の存在下で神経細胞又は非ヒト動物を候補薬理作用物質と接触させること、及び神経細胞毒性又は神経細胞死を検出することを含む方法。 - 配列番号1~3のうちのいずれか1つのアミノ酸配列からなるアポリポタンパク質E断片の産生を調節する能力のある薬理作用物質をスクリーニングする方法であって、
アポリポタンパク質Eを発現する神経細胞を候補薬理作用物質と接触させること、及び前記断片の量を検出することを含む方法。 - 前記神経細胞が前記アポリポタンパク質E断片を発現する、請求項12に記載の方法。
- 前記神経細胞が完全長アポリポタンパク質Eを発現する、請求項12に記載の方法。
- 前記アポリポタンパク質Eがアポリポタンパク質E4(ApoE4)である、請求項14に記載の方法。
- 前記アポリポタンパク質E断片又は完全長タンパク質を発現する前記神経細胞が、遺伝子修飾された細胞である、請求項12~15のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
- 対象における配列番号1~3のうちのいずれか1つのアミノ酸配列からなるアポリポタンパク質E断片の存在又は量を検出する方法であって、
前記対象から入手された試料を、前記断片に結合するアプタマーと接触させること、及び前記試料中の前記断片の存在又は量を検出することを含む方法。 - 前記試料が、アルツハイマー病(AD)又は軽度認知障害(MCI)を有する又は有する疑いがある対象から入手される、請求項17に記載の方法。
- 前記アポリポタンパク質E断片の前記存在又は量を用いてAD又はMCIが検出され、診断され、又はその診断が支援される、請求項17又は18に記載の方法。
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