CN114008072A - 载脂蛋白e片段 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及新颖的载脂蛋白E(ApoE)片段。这些ApoE片段具有多种用途，包括作为疫苗组合物的组分、特别是用于预防或治疗诸如阿尔茨海默病等神经系统障碍的疫苗。这些ApoE片段还可以用于筛选方法和检测方法中。

Description

载脂蛋白E片段
技术领域
本发明涉及新颖的载脂蛋白E(ApoE)片段。这些ApoE片段具有多种用途，包括作为疫苗组合物的组分、特别是用于预防或治疗诸如阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease)等神经系统障碍的疫苗。这些ApoE片段还可以用于如本文所述的筛选方法和检测方法中。
背景技术
载脂蛋白E(ApoE)是一种通过与低密度脂蛋白(LDL)受体家族的高亲和力结合在脂蛋白代谢中起核心作用的蛋白质。ApoE在血液中循环，并且还发现其在脑脊液和中枢神经系统间质液中与高密度脂蛋白相结合。
全长人ApoE是由两个结构域组成的34kDa蛋白质。N-末端结构域(残基1-191)主要负责ApoE的LDL-受体结合活性，而C-末端结构域(残基216-299)以高亲和力与脂蛋白结合。
ApoE以三种不同的异形体ApoE2、ApoE3和ApoE4存在，这三种不同的异形体分别由APOEε2、ε3和ε4等位基因编码。APOEε4等位基因是迟发型阿尔茨海默病(AD)的最强已知遗传风险因子。
阿尔茨海默病(AD)是一种进行性神经变性痴呆障碍，其以较常见的迟发型形式和早发型家族性形式存在。AD以记忆和认知功能的逐渐丧失为特征。目前，AD治疗局限于对症治疗且AD患者的预后较差。据估计，目前全世界约有1800万人罹患AD，并且由于人口老龄化，预计罹患AD的人数将增加。AD的患病率从60岁起大约每5年增加一倍，从65岁个体的10％增至85岁或更大年龄个体的50％(Solomon,Expert Opin.Investig.Drugs[临床试验药物专家见解](2007)16(6):819-828)。
Mahley和Huang(Neuron[神经元](2012)76:871-885)综述了认为ApoE4导致AD以及其他神经系统障碍的病理学的不同机制。这些机制包括在淀粉样蛋白斑块形成层面的作用，包括调节β淀粉样蛋白(Aβ)的代谢、清除、聚集和沉积。据报道，ApoE4及其片段与Aβ结合，从而直接影响Aβ周转(turnover)和Aβ原纤维的形成(Garai等人Biochemistry[生物化学](2014)53:6323-6331；Jones等人PLoS ONE[公共科学图书馆综合卷](2011)6(1):e14586；Mouchard等人Sci.Rep.[科学报告](2019)9(1):3989；和Wellnitz等人J.Neurochem.[神经化学杂志](2005)94:1351-1360)。
一些研究已报道了ApoE通过抑制与神经系统疾病进展相关的Aβ活性的保护作用。Aβ的C-末端结构域展现出与病毒融合蛋白的活性类似的促融合特性。已提出Aβ的这些促融合特性至少部分导致Aβ通过直接破坏神经元膜的稳定性而产生细胞毒性(Pillot等人,J.Biol.Chem.[生物化学杂志](1996)271:28757-28765)。研究已显示，ApoE的C-末端结构域可以介导与Aβ的C-末端结构域的相互作用，从而抑制Aβ的促融合特性。在Lins等人(J.Neurochemistry[神经化学杂志](1999)73:758-769)报道的研究中，使用分子建模技术研究了Aβ的C-末端结构域与ApoE的C-末端结构域之间的相互作用。在Pillot等人(J.Neurochemistry[神经化学杂志](1999)72:230-237)报道的研究中，使用人工生成的ApoE C-末端脂质结合结构域片段(残基200-299)研究了这两种蛋白质之间的相互作用。该研究揭示了ApoE的C-末端片段能够抑制Aβ的促融合特性，从而表明ApoE的C-末端在诸如阿尔茨海默病等神经系统疾病中具有保护作用。
也有报道称ApoE在引起神经病理学方面具有直接作用。在正常生理条件下，脑中的ApoE主要由星形胶质细胞合成以支持脂质转运和膜修复过程。然而，响应于神经元损害或损伤，ApoE由神经元合成。由神经元产生的ApoE易受蛋白水解影响，并且研究揭示了由胰凝乳蛋白酶样丝氨酸蛋白酶产生的神经毒性C-末端截断片段的积累(Harris等人,PNAS[美国国家科学院院刊](2003)100(19):10966-10971)。
这些C-末端片段的进一步表征揭示，ApoE4(1-272)片段引起线粒体功能障碍并且具有神经毒性，但全长ApoE4(1-299)和较短ApoE4(1-240)片段不会产生这些影响。此外，截断含有LDL受体结合区(氨基酸135-150)的N-末端区(1-170)消除了使用ApoE4(1-272)片段所见的影响，从而指示ApoE的N-末端受体结合区与C-末端脂质结合区协同作用引起线粒体功能障碍和神经毒性(Chang等人PNAS[美国国家科学院院刊](2005)102(51):18694-18699)。
研究揭示了患有AD的人的脑和脑脊液中存在ApoE片段，并且最近，
Figure BDA0003399849350000031
等人在Neurochem Res[神经化学研究杂志](2019)44(6):1297-1305中综述了ApoE片段在AD中的作用。
Figure BDA0003399849350000032
等人描述的大多数ApoE片段是蛋白质的N-末端片段。归因于ApoE的这些N-末端片段的功能包括(尤其)增加的细胞死亡、增加的Aβ42积累、增加的炎症、增加的神经毒性、增加的τ磷酸化和增加的线粒体功能障碍。这些研究指出了来源于蛋白质N-末端的ApoE片段的致病作用。然而，对于来自C-末端脂质结合结构域的ApoE片段来说，
Figure BDA0003399849350000033
等人的表2和图2指示，先前已经对一个这样的片段进行了研究，并且经证明其对Aβ原纤维形成具有抑制作用并对Aβ肽的六聚体具有稳定作用。Wellnitz等人在J Neurochem[神经化学杂志](2005)94:1351-1360中报道了所讨论的研究，并且描述了ApoE的13kDa片段，其N-末端起始于ApoE的第187位氨基酸。
最近，Mouchard等人(Sci Rep[科学报告](2019)9(1):3989)的一项研究报道了ADe患者死后脑中ApoE片段的鉴定。该研究报道，在AD患者的皮质中存在12kDa、16kDa和18kDa ApoE形式。发现只有18kDa片段在AD患者中显著增加。发现同时缺少ApoE的NH2半末端与C-末端的16kDa和18kDa形式的ApoE与Aβ相结合并提出二者为AD病理学的介体。相比之下，未发现小的12kDa ApoE片段与Aβ结合。
发明内容
显然，ApoE在各种神经系统障碍、特别是诸如阿尔茨海默病(AD)等神经变性病症的病理学方面起关键作用。因此，有必要了解这种蛋白质的生物学以便制定有效的治疗策略。本申请报告了从AD患者获得的脑组织中新颖的ApoE片段的鉴定。本文所述的新颖的ApoE片段包含来自ApoE蛋白的C-末端结构域的残基。如上文所报告，研究早已表明ApoE的C-末端结构域在神经系统疾病的发展中起保护作用，例如通过抑制Aβ的促融合特性以及抑制Aβ原纤维形成。本文所述的结果显示，在AD患者脑中发现的新颖的ApoE C-末端片段可具有神经毒性活性。鉴于之前将神经毒性作用归因于ApoE的N-末端片段，这是令人惊讶的。
因此，在第一方面，本文提供了载脂蛋白E(ApoE)片段，其由选自由SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3组成的组的氨基酸序列组成。
进一步涵盖：编码这些ApoE片段的分离的核酸；包含这些分离的核酸的载体；以及包含这些载体的宿主细胞和转基因非人类动物。
在第二方面，本文提供了一种疫苗组合物，其包含由SEQ ID NO:1-3中任一者的氨基酸序列组成的载脂蛋白E(ApoE)片段。进一步提供了预防或治疗受试者的神经系统疾病、特别是神经变性疾病的方法，其中这些方法包括向该受试者施用ApoE疫苗。在优选的实施例中，施用疫苗以便预防或治疗阿尔茨海默病。
在另一方面，本文提供了一种筛选具有调节载脂蛋白E片段的神经元毒性的能力的药理剂的方法，该载脂蛋白E片段由SEQ ID NO:1-3中任一者的氨基酸序列组成，其中该方法包括在该片段存在的情况下使神经细胞或非人类动物与候选药理剂接触以及检测神经元毒性或神经元死亡。
在另一方面，本文提供了一种筛选具有调节载脂蛋白E片段的产生的能力的药理剂的方法，该载脂蛋白E片段由SEQ ID NO:1-3中任一者的氨基酸序列组成，其中该方法包括使表达载脂蛋白E的神经细胞与候选药理剂接触以及检测该片段的量。
在另一方面，本文提供了一种用于检测受试者中由SEQ ID NO:1-3中任一者的氨基酸序列组成的载脂蛋白E片段的存在或量的方法，
其中该方法包括使从该受试者获得的样品与结合该片段的适体接触以及检测该样品中该片段的存在或量。
附图说明
图1显示如实例1中所述的人脑提取物的蛋白质印迹分析结果。
图2显示如实例1中所述在足以显示单个低分子量ApoE片段的高分辨率下，来自基因型APOEε4/ε4的AD脑的人脑提取物的蛋白质印迹分析结果。
图3是显示如实例1中所述量化的AD(实心圆圈)和对照(空心方块)中12kDa ApoE片段与全长ApoE的比率的图。
图4是显示如实例1中所述量化的不具有APOE E4基因型(-E4；实心圆圈)或具有APOE E4基因型(+E4；空心方块)的AD中12kDa ApoE片段与全长ApoE的比率的图。
图5是实例2中所述的免疫沉淀实验的工作流程的示意性概述图。
图6显示如实例2中所述的免疫沉淀样品的蛋白质印迹分析结果。
图7显示如实例2中所述的免疫沉淀样品的银染结果。
图8显示如实例3中所述所指示的12kDa、15kDa和rhApoE4凝胶的胰蛋白酶消化物的LC-MS/MS分析结果。
图9显示如实例4中所述的ApoE序列的LysC切割位点分析结果。
图10显示如实例5中所述的理论ApoE切割位点的提取离子色谱图(XIC)的研究结果。左边：使用5ppm质量准确度的可能肽之一(200-233)在三种电荷态的理论值时的提取离子色谱图，其中在相同保留时间下三者全部观察到峰。右边：每个提取峰的质谱。
图11显示如实例5中所述使用鸟枪蛋白质组学方法(shotgun proteomic method)检测切割位点周围肽的纳米LC-MS/MS结果。在对来自同一供体的样品(ApoEε3/ε4，A和B)的重复分析中，检测到在198L、199A或200G处具有ApoE的N末端且具有完整C末端的肽。
图12是显示如实例6中所述所指示的来自ApoEε4/ε4、ε2/ε3和ε3/ε3携带者的样品中N末端在198L、199A或200G处的肽的MS强度的图。
图13显示在(A)Neuro2A细胞和(B)大鼠原代海马神经元中于进行实例7中所述实验之后由人ApoE4和ApoE C-末端片段诱导的线粒体损伤；以及(C)如通过蛋白质印迹分析所测量的人ApoE4或ApoE C-末端片段的蛋白质表达。
图14显示在进行实例8中所述实验之后来自经PH-002处理的大鼠海马神经元的样品的蛋白质印迹分析(A)和细胞毒性分析(B)的结果。
具体实施方式
ApoE片段
本披露内容涉及载脂蛋白E(ApoE)片段。如本文所报告，ApoE片段在阿尔茨海默病(AD)患者、特别是具有APOEε4等位基因的AD患者中显著增加。
本披露内容的ApoE片段来源于全长人ApoE蛋白的C-末端。全长人ApoE蛋白示于下文表1中(ApoE2、ApoE3和ApoE4)。表1中还示出了由人ApoE的氨基酸200-299(SEQ ID NO:1)、氨基酸199-299(SEQ ID NO:2)和氨基酸198-299(SEQ ID NO:3)组成的C-末端片段。从不同ApoE异形体的全长序列可以明显看出，C-末端片段(如SEQ ID NO:1-3所表示)是所有异形体共有的。因此，本文所述的ApoE片段可以在具有选自ε2、ε3和ε4的任一APOE等位基因的个体中产生或出现。如本文所报告，ApoE片段在具有至少一个ε4等位基因的AD患者中以较高水平出现。
表1
Figure BDA0003399849350000071
在一个实施例中，本文提供了由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成的载脂蛋白E(ApoE)片段。在某些实施例中，本文提供了由与SEQ ID NO:1具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的氨基酸序列组成的ApoE片段。在一个实施例中，本文提供了由人ApoE的氨基酸200-299组成的载脂蛋白E(ApoE)片段。
在一个实施例中，本文提供了由SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成的载脂蛋白E(ApoE)片段。在某些实施例中，本文提供了由与SEQ ID NO:2具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的氨基酸序列组成的ApoE片段。在一个实施例中，本文提供了由人ApoE的氨基酸199-299组成的载脂蛋白E(ApoE)片段。
在一个实施例中，本文提供了由SEQ ID NO:3的氨基酸序列组成的载脂蛋白E(ApoE)片段。在某些实施例中，本文提供了由与SEQ ID NO:3具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的氨基酸序列组成的ApoE片段。在一个实施例中，本文提供了由人ApoE的氨基酸198-299组成的载脂蛋白E(ApoE)片段。
如本文所报告，ApoE片段展现出神经毒性，如在体外通过测定培养物中神经元细胞的呼吸能力所测量。因此，在某些实施例中，本文所述的ApoE片段展现出神经毒性。可以使用适于检测神经元细胞中毒性作用的任何测定来测量神经毒性。合适的测定例示于本文中(参见实例7)并且可用于评估本文所述的ApoE片段的神经毒性特性。
本披露内容还涵盖编码本文所述的ApoE片段的核酸。编码ApoE片段的核酸包括例如重组DNA分子。术语“核酸”在本文中可与“多核苷酸”或“多核苷酸分子”互换使用且是指任何单链或者双链的DNA或RNA分子，并且如果是单链的，则是指其互补序列的分子。在讨论核酸时，特定核酸的序列或结构可以根据提供5'至3'方向序列的常规惯例来描述。在某些实施例中，核酸编码由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成的ApoE片段。在某些实施例中，核酸编码由SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成的ApoE片段。在某些实施例中，核酸编码由SEQ IDNO:3的氨基酸序列组成的ApoE片段。
在一些实施例中，核酸或多核苷酸是“分离的”。当应用于核酸时，该术语是指如下核酸分子，该核酸分子与在其所来源的生物体的天然存在的基因组中与其紧密相邻的序列分离。例如，“分离的核酸”可包含插入到诸如质粒或病毒载体等载体中的DNA分子，或者整合到原核或真核细胞或非人类宿主生物体的基因组DNA中的DNA分子。当应用于RNA时，术语“分离的多核苷酸”主要是指由如上文所定义的分离的DNA分子编码的RNA分子。替代性地，该术语可以指如下RNA分子，该RNA分子已经从与其在其天然状态下(即，在细胞或组织中)相结合的其他核酸中纯化/分离。分离的多核苷酸(DNA或者RNA)可以进一步代表通过生物或合成手段直接产生并与在其产生期间存在的其他组分分离的分子。
还涵盖包含编码ApoE片段的核酸的载体。载体可以是适于在特定宿主细胞或无细胞表达系统中表达ApoE片段的可复制载体。载体(包括适用于各种不同表达系统的表达载体)是本领域已知的。可使用任何标准分子生物学技术制备掺入编码本文所述的ApoE片段的核酸的载体。
可以将包含编码ApoE片段的核酸的载体掺入宿主细胞中。合适的宿主细胞可以是原核细胞、酵母或高等真核细胞，具体是哺乳动物细胞。可用的哺乳动物宿主细胞系的实例是经SV40转化的猴肾CV1细胞系(COS-7，ATCC CRL 1651)；人胚肾细胞系(293细胞或悬浮培养生长的亚克隆293细胞，Graham等人,J.Gen.Virol.[普通病毒学杂志](1977)36:59)；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊](1980)77:4216)；小鼠塞托利细胞(sertoli cell)(TM4，Mather,Biol.Reprod.[生殖生物学](1980)23:243-251)；小鼠骨髓瘤细胞SP2/0-AG14(ATCC CRL 1581；ATCC CRL 8287)或NS0(HPA培养物保藏中心编号85110503)；猴肾细胞(CV1 ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)；布法罗(buffalo)大鼠肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝细胞(Hep G2，HB8065)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；TRI细胞(Mather等人,AnnalsN.Y.Acad.Sci.[纽约科学院年报]383:44-68(1982))；MRC 5细胞；FS4细胞；和人肝癌细胞系(Hep G2)，以及DSM PERC-6细胞系。
应注意，术语“宿主细胞”通常是指经培养的细胞系。已引入编码ApoE片段的表达载体的全部人类被明确排除在“宿主细胞”的定义之外。
在某些实施例中，可以将包含编码ApoE片段的核酸的载体掺入转基因非人类动物中。此类动物可包括但不限于小鼠、大鼠、兔、猪。
本披露内容还涵盖产生本文所述的ApoE片段的方法，这些方法包括在允许ApoE片段表达的条件下培养含有编码该片段的核酸(例如表达载体)的宿主细胞(或无细胞表达系统)，以及回收所表达的片段。此重组表达方法可用于ApoE片段的大规模产生，例如用于如本文别处所述的疫苗或筛选方法中。用于大规模制造重组多肽的合适的载体、细胞系和产生方法通常在本领域中是可获得的并且可以是技术人员所公知的。
疫苗
可将本文所述的ApoE片段掺入疫苗、特别是用于预防或治疗神经系统障碍或病症(例如阿尔茨海默病)的疫苗中。
在某些实施例中，疫苗包含一种或多种ApoE片段和至少一种佐剂。在某些实施例中，疫苗包含由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成的ApoE片段和至少一种佐剂。在某些实施例中，疫苗包含由SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成的ApoE片段和至少一种佐剂。在某些实施例中，疫苗包含由SEQ ID NO:3的氨基酸序列组成的ApoE片段和至少一种佐剂。在某些实施例中，疫苗包含至少两种或至少三种选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3的ApoE片段，以及至少一种佐剂。
疫苗或疫苗组合物可包含两种或更多种佐剂。一种或多种佐剂的目的是增加或刺激受试者的免疫应答。各种佐剂是本领域已知的并且可用于本文所述的疫苗中。可以使用的特定的佐剂包括但不限于氢氧化铝(Alum)和/或CpG等。
疫苗可预防性地使用，即它们可施用给无疾病症状的受试者，以便诱导旨在预防神经系统障碍或病症发展的免疫应答。疫苗可用于使受试者免疫以便预防神经变性疾病或障碍的发展。疫苗可用于使受试者免疫以便预防以认知记忆能力丧失为特征的疾病或障碍的发展。此类疾病或障碍包括但不限于阿尔茨海默病(AD)、轻度认知损害(MCI)、路易体痴呆(dementia with Lewy body)、唐氏综合征(Down’s syndrome)和遗传性脑出血伴淀粉样变性(荷兰型)。在某些实施例中，疫苗可用于预防与淀粉形成性蛋白相关的疾病或障碍，诸如脑淀粉样血管病、帕金森病(Parkinson’s disease)和因β淀粉样蛋白沉积引起的白内障。在优选的实施例中，疫苗用于预防MCI或AD、优选AD。受试者通常是哺乳动物并且优选是人。
替代性地或此外，疫苗可治疗性地使用，即它们可施用给患有神经系统疾病或病症或者疑似患有神经系统疾病或病症的受试者以便诱导旨在减轻与该疾病相关的症状的免疫应答。疫苗可用于治疗神经变性疾病或障碍。疫苗可用于治疗以认知记忆能力丧失为特征的疾病或障碍。此类疾病或障碍包括但不限于阿尔茨海默病(AD)、轻度认知损害(MCI)、路易体痴呆、唐氏综合征和遗传性脑出血伴淀粉样变性(荷兰型)。在某些实施例中，疫苗可用于治疗与淀粉形成性蛋白相关的疾病或障碍，诸如脑淀粉样血管病、帕金森病和因β淀粉样蛋白沉积引起的白内障。在优选的实施例中，疫苗用于治疗MCI或AD、优选AD。受试者通常是哺乳动物并且优选是人。
由上文可知，本发明涵盖预防或治疗有需要的受试者的神经系统疾病或病症的方法，这些方法包括向受试者施用包含如本文所述的ApoE片段的疫苗。在优选的实施例中，这些方法用于预防或治疗MCI和/或AD、优选AD。本文进一步提供了根据任一所述实施例的疫苗，其用于预防或治疗有需要的受试者的神经系统疾病或病症。在优选的实施例中，疫苗用于预防或治疗MCI和/或AD、优选AD。
疫苗可以通过任何适当的施用途径施用给受试者。如技术人员所知，可以通过局部、经口、直肠、经鼻或肠胃外(诸如静脉内、皮内、皮下或肌内)途径施用疫苗组合物。此外，可以将疫苗掺入诸如可生物降解的聚合物等缓释基质中，将这些聚合物在邻近或紧邻需要递送处植入。在优选的实施例中，经肌内或皮下施用疫苗。
可以对受试者单次施用疫苗以产生免疫应答。在一些实施例中，对同一受试者多次施用疫苗。因此，可以采用所谓的初免-加强方案(prime-boost regimen)。
本文进一步提供了含有如本文所述的疫苗的药盒。此类药盒可提供有合适的使用说明书。使用说明书可以解释疫苗的施用方案。因此，药盒可包含用于施用给受试者的多(单独)剂次疫苗。使用说明书可以进一步解释疫苗的储存条件，特别是在多剂次疫苗施用之间的时间段期间的储存条件。
筛选方法
本文进一步提供了基于本文所述的新颖的ApoE片段的筛选方法。
在一个方面，本文提供了筛选具有调节ApoE片段的神经元毒性的能力的药理剂的方法，其中这些ApoE片段选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3中任一者所表示的片段。在某些实施例中，使用这些筛选方法来鉴定具有调节ApoE片段的神经元毒性的能力的药理剂，这些ApoE片段选自SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所表示的片段。
在优选的实施例中，进行这些方法以便筛选具有降低ApoE片段的神经元毒性的能力的药理剂，这些ApoE片段选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3中任一者所表示的片段。可以进行这些方法以便筛选具有降低ApoE片段的神经元毒性的能力的药理剂，这些ApoE片段选自SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所表示的片段。
筛选具有调节神经元毒性的能力的药理剂的方法包括如下步骤：在至少一种ApoE片段存在的情况下使神经细胞或非人类动物与候选药理剂接触，以及测量或检测所产生的毒性。
对于其中使候选药理剂与神经细胞接触以便评估神经毒性的实施例，该测定通常可以使用神经细胞培养物在体外进行。神经细胞优选为神经元细胞。这些细胞可以代表原代神经元细胞，例如，大鼠海马细胞培养物。替代性地或此外，神经细胞或神经元细胞可以代表已建立的细胞系，例如，诸如Neuro2A或N2a细胞等神经母细胞瘤细胞系。
作为对细胞的外源施用，例如经由细胞培养基施用的结果，ApoE片段可以存在于神经细胞培养物中。替代性地或此外，ApoE片段可以作为培养物的神经细胞重组表达ApoE片段的结果而存在。更具体地，培养物的神经细胞或神经元细胞可以经过工程改造以便重组表达如SEQ ID NO:1-3中任一者所表示的Apo片段，并且可以使用表达该片段的细胞来评估候选药理剂的作用。
可以通过任何合适的测定技术来评估候选药理剂调节例如降低ApoE片段的神经毒性作用的能力。监测细胞死亡的技术是本领域技术人员已知的并且可用于检测神经元细胞死亡作为神经元毒性的量度。还可以使用任一本文所述的示例性技术或测定来评估神经毒性。例如，可以通过测量细胞代谢来间接检测或监测神经毒性。可以根据实例7中描述的技术测量线粒体呼吸。
为了评估候选药理剂调节ApoE片段的神经元毒性的能力，可以将在候选药理剂存在的情况下看到的作用与对照进行比较。对照可以简单地为在任何候选药理剂不存在的情况下的神经或神经元细胞培养物。替代性地，可以测量暴露于已知对ApoE片段诱导的毒性没有影响的对照药理剂的神经元细胞培养物的神经毒性。在某些实施例中，候选药理剂的作用可以与已知降低或抑制ApoE片段的神经毒性作用的对照药理剂一起确定。在此类实施例中，可以评估候选药理剂相对于已知降低或抑制ApoE片段的神经毒性作用的药剂的功效。
对于其中使候选药理剂与非人类动物接触以便评估神经毒性的实施例，可以经由任何合适的施用途径将药理剂施用给非人类动物。非人类动物可以选自小鼠、大鼠、兔或任何其他合适的实验动物。ApoE片段可以先于药理剂或与之同时提供给非人类动物。替代性地，非人类动物可以经过基因工程改造以便重组表达神经毒性ApoE片段。例如，实验动物可以在脑中重组表达神经毒性ApoE片段，从而能够确定候选药理剂对神经毒性的影响。
对于其中在非人类动物中测试候选药理剂的实施例，候选药理剂的作用可以通过用于测量神经毒性的任何合适的测定技术来确定。在某些实施例中，通过动物脑的体内成像来评估神经毒性。替代性地或此外，可在测试期结束时处死动物并检查脑组织以寻找神经毒性作用的证据。可以如上文针对体外测定所述的那样使用合适的对照。
本文所述的筛选方法可引导选择具有调节ApoE片段的神经毒性的能力的特定药理剂。例如，如果发现药理剂使一种或多种本文所述的ApoE片段的神经毒性降低或抑制至少10％、至少20％、至少50％、至少80％或至少90％，则可选择该药理剂。
在另一方面，本文提供了筛选具有调节ApoE片段的产生的能力的药理剂的方法，其中这些ApoE片段选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3中任一者所表示的片段。在某些实施例中，这些方法包括筛选具有调节ApoE片段的产生的能力的药理剂，这些ApoE片段选自SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所表示的片段。在某些实施例中，进行这些方法以便筛选具有抑制ApoE片段的产生的能力的药理剂，这些ApoE片段选自SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2或SEQ ID NO:3中任一者所表示的片段。在某些实施例中，进行这些方法以便筛选具有抑制ApoE片段的产生的能力的药理剂，这些ApoE片段选自SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所表示的片段。
这些方法包括使表达载脂蛋白E的神经细胞与候选药理剂接触以及检测所产生的片段的量。这些方法典型地可包括使表达载脂蛋白E的神经细胞群与候选药理剂接触以及检测该细胞群所产生的ApoE片段的量。典型地可以在候选药理剂与神经细胞群接触的限定时间段之后测量ApoE片段的量。
在某些实施例中，表达载脂蛋白E的神经细胞在体外与候选药理剂接触。在此类实施例中，可以将候选药理剂施加至神经细胞培养物中。培养物的神经细胞可以是神经元细胞并且可以是如上文所述的原代神经元细胞或神经元细胞系。
在某些实施例中，可以使表达载脂蛋白E的神经细胞在体内与候选药理剂接触。在此类实施例中，可以将候选药理剂施用给具有表达载脂蛋白E的神经细胞的动物、优选非人类动物，并且可以检测在体内由神经细胞产生的ApoE片段的量。药理剂可以经由任何合适的施用途径施用给动物。在药理剂存在的情况下产生的ApoE片段的量可以通过动物的体内成像、例如动物脑的成像来检测。替代性地或此外，可在从动物获得的样品中检测所产生的ApoE片段的量，从而在体外进行检测步骤。从动物获得的样品可以是任何疑似含有ApoE片段的样品，例如脑组织或脑脊液。
可以基于与对照的比较来确定候选药理剂调节或抑制ApoE片段的产生的能力。例如，可以将在候选药理剂存在的情况下测量的ApoE片段的量与在表达载脂蛋白E的对照神经细胞群中测量的ApoE片段的量进行比较，其中该对照神经细胞群未暴露于任何药理剂。替代性地，可以用已知不影响ApoE片段的产生的对照药理剂处理对照神经细胞群。
可以在mRNA或蛋白质水平上确定由神经细胞群产生的ApoE片段的量。用于检测/定量转录产物的合适技术和用于评估蛋白质水平的合适技术是本领域已知的。例如，可以通过诸如RNA印迹或微阵列技术等杂交技术和/或诸如RT-PCR或基于核酸序列的扩增(NASBA)等基于扩增的技术来确定ApoE片段的mRNA水平。可以通过诸如免疫印迹分析、ELISA、放射免疫测定、Elispot等免疫测定技术来确定ApoE片段的蛋白质水平。
在某些实施例中，与候选药理剂接触的一个或多个神经细胞表达全长载脂蛋白E蛋白、优选全长人载脂蛋白E蛋白。在优选的实施例中，神经细胞表达全长人ApoE4。神经细胞可以经过基因修饰以便重组表达载脂蛋白E蛋白。对于其中神经细胞表达全长载脂蛋白E蛋白的实施例，本文所述的方法可用于筛选具有抑制全长载脂蛋白E的转录、翻译和/或分泌的能力的药理剂以及具有抑制载脂蛋白E翻译后加工成本文所述的神经毒性ApoE片段的能力的药理剂。在某些实施例中，本文所述的筛选方法筛选具有抑制全长载脂蛋白E加工或切割成神经毒性ApoE片段的能力的药理剂。
在某些实施例中，与候选药理剂接触的一个或多个神经细胞表达如本文所述的载脂蛋白E片段。神经细胞可以经过基因修饰，以便它们表达重组ApoE片段，作为全长载脂蛋白E的补充或替代。对于其中神经细胞表达ApoE片段的实施例，本文所述的方法可用于筛选具有抑制此类神经毒性片段的直接表达的能力的药理剂。
用于在任一本文所述筛选方法中进行测试的药理剂可以选自任何种类的药剂。可根据这些方法测试的药理剂包括但不限于小分子、有机或无机分子、包括抗体及其抗原结合片段的生物分子、天然或合成的多肽或肽、包括反义RNA种类和双链RNA种类(用作RNA干扰剂)的核酸治疗剂(例如siRNA分子)。
通过本文所述的筛选方法鉴定的药理剂可用作用于预防和/或治疗患有如本文别处定义的与认知衰退相关的神经系统疾病或病症的受试者的药剂。这些药理剂可用于治疗神经变性疾病或障碍。在某些实施例中，通过本文所述的筛选方法鉴定的药理剂可用于预防或治疗轻度认知损害(MCI)或阿尔茨海默病(AD)。
检测方法
在另一方面，本文提供了用于检测受试者中由SEQ ID NO:1-3中任一者的氨基酸序列组成的载脂蛋白E(ApoE)片段的存在或量的方法。在某些实施例中，这些方法用于检测由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成的ApoE片段的存在或量。在某些实施例中，这些方法用于检测由SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成的ApoE片段的存在或量。在某些实施例中，这些方法用于检测由SEQ ID NO:3的氨基酸序列组成的ApoE片段的存在或量。
这些方法包括使从受试者获得的样品与结合该片段的适体接触，从而检测该样品中该ApoE片段的存在或量。这些方法在体外进行。
从受试者获得的样品可以是预计含有一种或多种ApoE片段的任何样品。样品可以取自血液，例如血清、外周血、全血或用诸如肝素等抗凝血剂预处理的全血、血浆或血清。样品可以从受试者的脑或中枢神经系统的区域获得，包括脑脊液。
通过使样品与适体接触来检测从受试者获得的样品中ApoE片段的存在或量。如本文所用，术语“适体”是指对特定靶标展现出结合特异性的单链寡核苷酸(DNA或RNA)，在本案中特定靶标为一种或多种如本文所述的ApoE片段。用于本文所述的检测方法中的适体可以具有任何寡核苷酸序列或三级结构，只要它们与至少一个如本文所述的ApoE片段特异性结合即可。如本文所用，术语“特异性结合”是指分子(适体)优先结合给定靶标的能力。
可以通过任何合适的技术来测量适体与样品中ApoE片段之间的结合以便确定样品中ApoE片段的存在或量。
在某些实施例中，从患有或疑似患有神经系统疾病或障碍(例如神经变性障碍)的受试者获得样品。在某些实施例中，从患有或疑似患有MCI或AD的受试者获得样品。受试者可能先前已被诊断为患有神经系统或神经变性疾病或障碍，例如阿尔茨海默病。替代性地或此外，受试者可能正在接受或已经接受过神经系统或神经变性疾病或障碍、例如阿尔茨海默病的治疗。
可以进行根据本披露内容的该方面的方法以便检测、诊断或协助诊断受试者的神经系统或神经变性疾病。例如，可以进行该方法以便检测、诊断或协助诊断阿尔茨海默病。
对于其中检测ApoE片段的量以便诊断或协助诊断疾病的实施例，可以将样品中ApoE片段的量与预先确定的阈值或截止值进行比较，以便评估受试者的疾病的可能性。例如，预先确定的阈值或截止值可为已确定的或可基于在健康受试者队列中检测到的相应ApoE片段的水平来确定。如果从受试者获得的样品中ApoE片段的量超过健康受试者队列的预先确定的阈值，则受试者可被诊断为患有疾病(例如阿尔茨海默病)。
在某些实施例中，可以检测从受试者获得的样品中的ApoE片段以便监测受试者对治疗的临床应答。治疗可以是对任何神经系统或神经变性障碍的治疗，但优选是对阿尔茨海默病的治疗。在一段时间内(例如与疗程相一致的一段时间内)，在从受试者获得的多个样品中测量的ApoE片段水平的下降可以指示对治疗的临床应答。
援引并入
在本申请中援引了各种出版物，其各自通过援引以其全文并入本文。
实例
参考以下非限制性实例将进一步理解本发明。
实例1
来自阿尔茨海默病患者和对照的人脑提取物中ApoE片段的分析
本实例描述了人脑组织的均质化以及之后在含2％十二烷基硫酸钠(SDS)的放射免疫沉淀测定(RIPA)缓冲液中来自脑提取物的ApoE片段的蛋白质印迹分析。
材料和方法
脑组织均质化和样品制备：将新鲜冷冻的来自具有不同APOE基因型的阿尔茨海默病(AD)患者(n＝24)和对照(n＝14)的人脑组织按1:5的重量:体积在RIPA 2％SDS提取缓冲液中均质化，接着以16000×g离心1h。在-80℃下冷冻所得上清液直至分析。
人脑提取物中ApoE片段的分析：将含有10μg总蛋白的RIPA 2％SDS脑提取物与2×利姆里样品缓冲液(Laemmli sample buffer)混合，在95℃下煮沸5min并上样到SDS-PAGE凝胶(BoltTM12％Bis-Tris Plus，10孔，赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher))上。使凝胶在180V下跑胶30-40min，此后使用
Figure BDA0003399849350000194
TurboTM系统(伯乐公司(BioRad))将蛋白质从凝胶转移到硝酸纤维素膜上。使膜在
Figure BDA0003399849350000195
封闭缓冲液中封闭1h且然后与以1:2000稀释于含0.1％
Figure BDA0003399849350000196
20的
Figure BDA0003399849350000197
封闭缓冲液中的多克隆抗ApoE抗体(Calbiochem，目录号178479)一起在室温下孵育过夜。洗涤膜并与以1:25000稀释于含0.1％
Figure BDA0003399849350000192
20的
Figure BDA0003399849350000193
封闭缓冲液中的检测抗体抗山羊-800CW(LI-COR，目录号925-32214)一起在室温下孵育1h。洗涤膜并使用
Figure BDA0003399849350000191
FC(LI-COR)获取图像。使用Image Studio软件(5.2版本)在所获取的蛋白质印迹图像中按与全长ApoE的量的比率来量化ApoE片段的相对量。
结果
通过人脑RIPA 2％SDS提取物(n＝38)的蛋白质印迹分析鉴定全长ApoE以及数种低分子量(LMW)ApoE片段。图1显示来自蛋白质印迹分析的具有代表性的膜。LMW ApoE片段的大小估计为10kDa、12kDa、14-15kDa和17kDa(图2)。
按与全长(FL)ApoE的比率对ApoE片段的分析证明，与对照组(n＝14)相比，AD组(n＝24)中的12kDa ApoE片段显著增加，参见图3。此外，在AD组的APOEε4携带者中观察到12kDa ApoE片段的显著增加(图4)。
实例2
从来自阿尔茨海默病患者的人脑提取物中提取和分离ApoE片段
本实例描述了从人脑提取物中分离并浓缩全长ApoE以及12kDa和15kDa ApoE片段以制备具有足以进行氨基酸序列分析的蛋白质浓度的纯ApoE样品的程序。
材料和方法
从具有不同APOE基因型的AD患者的人脑提取物中分离ApoE：建立来自人脑提取物的ApoE的免疫沉淀(IP)方案。对方案进行优化，产生具有足以进行氨基酸序列分析的蛋白质浓度的纯ApoE样品。关于工作流程的示意性概述图参见图5。将总蛋白浓度为1.5mg的人脑RIPA 2％SDS提取物与IP缓冲液(1×PBS、0.05％
Figure BDA0003399849350000201
20、0.1％Triton X-100、蛋白酶抑制剂混合物)混合，并通过添加200μg在氨基酸237-299内具有结合表位的抗ApoE C-末端抗体(赛默飞世尔科技公司，目录号PA5-27088)来对ApoE进行免疫沉淀。以颠倒(head-over-tail)旋转的方式在室温下孵育2h期间允许IP抗体与脑提取物中的ApoE之间形成复合物。将500μl蛋白质A Dynabeads(Dynal，赛默飞世尔科技公司，目录号10002D)添加至IP混合物中并以颠倒旋转的方式在室温下孵育1h，此后洗涤蛋白质A Dynabeads以去除与珠粒的非特异性结合。将结合到蛋白质A Dynabeads(经由IP抗体)的ApoE蛋白在250μl洗脱缓冲液(1.25mM Tris pH 6.8，0.005％SDS)中洗脱并在95℃下以900rpm振荡孵育5min。快速旋转后，将样品置于DynaMagTM-2磁力架上并将液体转移到新管中。
浓缩分离的ApoE，接着通过SDS-PAGE进行分析：为了浓缩ApoE蛋白，将经洗脱的IP样品在旋转真空浓缩器中以1300rpm在40℃下离心大约2h以将体积从250μl减少到大约15μl。将2×利姆里缓冲液添加至浓缩样品中并将样品在95℃下以900rpm孵育5min。快速旋转后，将样品上样到SDS-PAGE凝胶(BoltTM12％Bis-Tris Plus，10孔，赛默飞世尔科技公司，目录号NW04120BOX)上。使凝胶在180V下跑胶30-40min，此后将一块凝胶用于通过蛋白质印迹分析确认ApoE片段，并且将一块凝胶进行银染并用于切取ApoE。
SDS-PAGE凝胶的蛋白质印迹分析：使用
Figure BDA0003399849350000202
TurboTM系统(伯乐公司)将蛋白质从凝胶转移到硝酸纤维素膜上。使膜在
Figure BDA0003399849350000203
封闭缓冲液中封闭1h且然后与以1:2000稀释于含0.1％
Figure BDA0003399849350000204
20的
Figure BDA0003399849350000205
封闭缓冲液中的抗ApoE C-末端抗体(赛默飞世尔科技公司，目录号PA5-27088)一起在室温下孵育过夜。洗涤膜并与以1:25000稀释于含0.1％
Figure BDA0003399849350000212
20的
Figure BDA0003399849350000211
封闭缓冲液中的检测抗体抗兔-800CW(LI-COR，目录号925-32211)一起在室温下孵育1h。洗涤膜并使用
Figure BDA0003399849350000213
FC(LI-COR)获取图像。
SDS-PAGE凝胶的银染：将凝胶固定并根据制造商的说明书(用于质谱分析的皮尔斯银染药盒(Pierce Silver Stain)，赛默飞世尔科技公司，目录号24600)采用银染进行染色。银染完成后，将终止缓冲液更换为Milli-Q H2O并冲洗2次，每次10min。从凝胶切取全长ApoE条带以及12kDa和15kDa ApoE条带并置于干净的Eppendorf管中的Milli-Q H2O中。
结果
使用已建立的IP方案(图5)，从具有不同APOE基因型(ε2/ε3、ε3/ε3、ε3/ε4和ε4/ε4)的人AD脑中分离ApoE，并使经洗脱的蛋白质在SDS-PAGE上跑胶。
通过蛋白质印迹分析来证实ApoE的提取。图6显示代表性蛋白质印迹膜，其展示了几个具有ApoE片段以及全长ApoE的条带。此外，通过SDS-PAGE凝胶的银染对经分离并浓缩的ApoE蛋白进行染色，如图7所示。大小为大约12kDa和15kDa的ApoE片段显现出来并将它们从经银染的凝胶切取下来。还将重组全长ApoE蛋白和来自人脑IP样品的全长ApoE从经银染的凝胶切取下来作为参考样品。
实例3
12 kDa ApoE片段中胰蛋白酶切割位点的鉴定
样品制备
将1.5ml PP管中来自实例2的经银染的凝胶条(包括重组人全长ApoE4(rhApoE4)条带和/或来自免疫沉淀的34kDa条带、来自免疫沉淀的15kDa条带和来自免疫沉淀的12kDa条带)用足够的水洗涤且接着使用500μl乙腈(ACN；来自和光纯药工业株式会社(Wako))脱水。在各凝胶变白后，去除任何溶剂且接着添加500μl水以使各凝胶溶胀。去除水后，将500μl Silver Quest脱色液(英杰生命技术有限公司(Invitrogen))添加至各凝胶中并在室温下孵育15min。去除任何脱色液溶剂后，添加1000μl水，然后在室温下孵育10min。去除水后，再次添加1000μl水以洗涤各凝胶，然后从管中去除任何溶剂。向各凝胶中添加500μl ACN，然后在各凝胶变白后去除过量ACN。
将500μl 10mM二硫苏糖醇(DTT；来自和光纯药工业株式会社)添加至凝胶中，接着在56℃下孵育30min。去除DTT溶液后，添加500μl ACN以使各凝胶收缩并在室温下轻轻混合孵育10min。去除ACN后，将55mM碘乙酰胺(IAA；来自和光纯药工业株式会社)添加至各管中，然后在室温下避光孵育30min。去除IAA溶液后，再次向各管中添加500μl ACN，并不时地涡旋混合10min以获得收缩凝胶。去除ACN后，将300μl在含10％ACN的10mM碳酸氢铵中的13μg/ml胰蛋白酶添加至凝胶中，然后在5℃下孵育6小时。然后，将凝胶置于37℃室中以促进各凝胶中蛋白质的消化，接着孵育过夜。
将600μl含5％甲酸的水/ACN的1/2(v/v)溶液添加至各管中，并通过涡旋充分混合。然后，在37℃下进行孵育并轻轻旋转以获得包含来自各凝胶的胰蛋白酶肽的溶液。通过SpeedVac系统(赛默飞世尔科技公司)干燥所获得的溶液，接着使用300μl含5％甲醇的0.1％TFA-水复溶。根据供应商的说明手册通过Monospin C18固体提取柱(技尔科学株式会社(GL Sciences))对溶液进行脱盐，此后通过SpeedVac系统干燥洗脱液。将30μl含5％甲醇的0.1％TFA-水添加至各管中以获得最终复溶溶液。对该溶液进行LC-MS分析。
LC/MS分析
在纳米流LC-MS/MS系统中分析所获得的样品，该系统采用Q Exactive HF质谱仪(赛默飞世尔科技公司)，该质谱仪与在线UltiMate 3000快速分离型LC(戴安公司(Dionex))和HTC PAL进样器(思特斯分析仪器有限公司(CTC Analytics))耦联，安装有微毛细管柱(360nm外径(OD)×100μm ID)，该柱装有<20cm的ReproSil C18-AQ 3μm珠粒(迈可股份有限公司(Dr.Maisch GmbH))并配备有集成电喷雾发射器尖端(P-2000基于激光的拉拔器，苏特仪器公司(Sutter Instruments))。通过4μl满环模式进样(full-loop modeinjection)将各样品上样到毛细管柱上。对于LC分离，使用4％ACN和0.5％乙酸(和光纯药工业株式会社)的流动相A以及80％乙腈和0.5％乙酸的流动相B以500nl/min进行如下多线性梯度洗脱：在60min内1％-40％B，在10min内40％-70％B，且在5min内70％-99％B，且然后保持99％B持续10min。每个样品的总分析时间为120min。
使用数据依赖性分析(DDA)模式来分析各样品，该模式针对从m/z 300至3000的每个全扫描MS(分辨率60000)的前15个丰度最高的离子使用较高能量碰撞解离(HCD)MS/MS扫描(分辨率30000)，其中全扫描MS离子靶为3×106个离子且MS/MS离子靶为2×105个离子。MS/MS扫描的最大离子注入时间为100ms。将HCD归一化碰撞能量设置为27，动态排除时间设置为20s，并且启用肽匹配和同位素排除功能。
数据分析
所有DDA质谱均使用人ApoE4 FASTA文件利用Proteome Discoverer 2.1版本(赛默飞世尔科技公司)进行分析。使用SEQUEST-HT算法以下列参数进行数据集的MS/MS搜索：甲硫氨酸的氧化作为可变修饰，半胱氨酸的脲甲基化作为固定修饰，且胰蛋白酶作为消化酶。每个肽允许错过切割两次。前体离子的质量容差设置为10ppm，且产物离子的质量容差设置为20mDa。应用于肽鉴定的最大错误发现率(FDR)为1％。蛋白质鉴定要求每个蛋白质超过两个肽。然后，仅针对ApoE4进行详细分析以鉴定12kDa条带(ApoE4片段)的切割位点。
结果
对12kDa ApoE片段进行胰蛋白酶消化以在肽基础上勘测ApoE的切割位点。将rhApoE4条带和15kDa条带作为参照进行分析。结果(图8)显示，在对应于ApoE的氨基酸残基192-206的肽与对应于氨基酸残基207-213的肽之间来自12kDa条带的胰蛋白酶肽中存在“丰度悬崖(abundance cliff)”。这意味着在从氨基酸残基190至氨基酸残基206的区域中存在至少一个切割位点，因为可以清楚地检测到具有高MS强度的“207-213肽”。从分析中排除短肽(少于5个氨基酸残基)，故未观察到例如在位置190-191处的VR二肽。
实例4
12 kDa ApoE片段中LysC切割位点的鉴定
材料和方法
如上文针对实例3所述进行样品制备、LC/MS分析和数据分析。
结果
为了在氨基酸基础上缩小12kDa ApoE片段的切割位点范围，进行另一种酶赖氨酰内肽酶(LysC)的消化。作为12kDa条带(在赖氨酸C-末端处固定切割)的标准LysC蛋白质组学分析的结果，检测到的唯一肽是对应于ApoE的氨基酸残基234-299的肽(图9)。这证实了实例3的结果，即在位置190-206之间存在至少一个切割位点。值得注意的是，在切割rhApoE4后检测到对应于ApoE的氨基酸残基158-233的肽(未示出)，但在切割12kDa条带时未检测到，从而进一步支持在位置190-206之间存在至少一个切割位点。
实例5
12 kDa ApoE片段中LysC切割位点的进一步表征
材料和方法
如上文针对实例4所述进行样品制备和LC/MS分析。如上文针对实例4所述进行数据分析，不同之处在于对在意外区域切割的特定肽进行提取离子色谱图(XIC)的目标分析(描述峰和积分)。通过Xcalibur 4.0软件(赛默飞世尔科技公司)中的Qual Browser进行该峰定性分析。
结果
在详细分析产生所鉴定的12kDa片段的可能切割位点之前，研究了通过LysC消化获得的对应于ApoE的氨基酸残基158-233的肽(RLAVYQAGAR EGAERGLSAIR ERLGPLVEQGRVRAATVGSL AGQPLQERAQ AWGERLRARM EEMGSRTRDR LDEVK)是否在rhApoE4条带、来自免疫沉淀的34kDa条带和来自免疫沉淀的12kDa条带中的任一者中被检测到。这通过用理论m/z(z＝10-15，5ppm质量容差)描述每个XIC来进行。结果显示，在rhApoE4和34kDa条带的溶液中清楚地检测到158-233肽，这意味着在样品制备步骤中没有人为切割。另一方面，在12kDa条带的样品溶液中未观察到158-233肽。这指示在12kDa ApoE4片段中的158-233之间存在至少一个切割位点。总之，实例3中描述的胰蛋白酶处理的LC/MS结果阐明了初始切割位点在位置190-205之间，然后通过如实例4和上文中描述的LysC处理证实了该位点。为了在氨基酸基础上缩小在190-205之间的可能切割位点范围，通过描述每个XIC来搜索通过LysC消化12kDa条带所提供的所有理论“非常规”肽(即190-233、191-233、192-233、193-233、194-233、195-233、196-233、197-233、198-233、199-233、200-233、201-233、202-233、203-233、204-233、205-233和206-233)以检查是否检测到片段峰。图10显示在寻找对应于ApoE的氨基酸残基200-233的“非常规LysC肽”(GQPLQERAQA WGERLRARME EMGSRTRDRL DEVK；[M]＝4054.04490)时的结果的实例。200-233肽的理论单一同位素m/z值(电荷数6、7和8)分别为676.68143、580.15655和507.76289。每个m/z值的提取色谱图在相同保留时间下皆提供单峰，并且在每种情况下观察到的质量与理论值一致，且质量准确度小于2ppm。这些结果有力地进一步证实已鉴定出非常规LysC肽，从而阳性鉴定出产生12kDa ApoE片段的特定切割位点(图11A)。对另一个样品(ApoE e3/e4等位基因)的重复实验显示可重复结果(图11B)，从而证实了切割位点的确定。
总之，来自三个个体供体(ApoEε3/ε4)的脑样品的纳米LC-MS/MS分析证明，产生12kDa ApoE片段的主要切割位点在N-末端198L、199A和200G处(图11)。
实例6
具有ε4/ε4、ε2/ε3和ε3/ε3等位基因的人脑中12 kDa ApoE片段中切割位点的鉴定
材料和方法
如上文针对实例3-5所述进行样品制备、LC/MS分析和数据分析。
结果
将N-末端198L、199A和200G鉴定为从ApoEε3/ε4产生12kDa ApoE片段的主要切割位点。为了查明这些切割位点是否仅对ε4等位基因而非ε2或ε3具有专一性，通过与前面部分相同的方式分析来自ApoEε4/ε4、ε2/ε3和ε3/ε3携带者的脑的12kDa条带。
结果呈现于图12中且显示ε4/ε4携带者在N-末端198L、199A和200G(主要为199A和200G)处展现出预期切割，而ε2/ε3和ε3/ε3携带者所表现出的位点切割信号远远低于ε4/ε4携带者。这些结果指示，N-末端198L、199A和200G处的切割在ε3/ε4和ε4/e4等位基因携带者中丰度更大。
实例7
经鉴定的ApoE片段的神经元毒性
材料和方法
细胞培养：将Neuro2A细胞(ATCC)以5.0×104个细胞/孔接种于24孔板(Falcon)中并在含有10％胎牛血清的高葡萄糖D-MEM(和光纯药工业株式会社)中培养。在接种后1天，使用Lipofectamine LTX和Plus试剂(英杰生命技术有限公司)转染编码人ApoE4(全长)或经鉴定的ApoE片段(198-299、199-299、200-299)的pAAV-CMV载体。2天后，将经载体转染的细胞收集用于蛋白质印迹分析或在线粒体呼吸测量前4小时以2.0×104个细胞/孔再次接种于Seahorse XF96细胞培养微孔板(安捷伦科技有限公司(Agilent Technologies))中。
对于使用大鼠海马神经元的测定，使用胰蛋白酶消化和机械解离消化从定时怀孕的威斯塔(Wistar)大鼠(查尔斯河实验室(Charles River Laboratories))获得的18天胎龄(E)的胎儿的经解剖海马。将解离的神经元以1.5×104个细胞/孔接种于Seahorse XF96细胞培养微孔板(安捷伦科技有限公司)中用于线粒体呼吸测量或以1.0×105个细胞/孔接种于24孔板(Falcon)中用于蛋白质印迹分析。在7DIV(体外天数)时对具有全长人ApoE4或经鉴定的ApoE片段(198-299、199-299、200-299)的AAV6进行感染。在感染后7天(14DIV)时进行线粒体呼吸测量或样品收集用于蛋白质印迹分析。
蛋白质印迹分析：通过含有完全(不含EDTA)蛋白酶抑制剂混合物(罗氏制药公司(Roche))和PhosSTOP蛋白磷酸酶抑制剂(西格玛公司(Sigma))的RIPA缓冲液(50mM Tris-HCl pH 7.6、5mM EDTA、1mM EGTA、1％NP40、0.25％脱氧胆酸钠、0.1M NaCl、0.5mM PMSF)裂解细胞，并进行超声处理。在SDS-PAGE前添加含还原剂的样品缓冲溶液(6×)(半井株式会社(Nacalai Tesque))。对于SDS-PAGE，使用XV PANTERA MP凝胶(DRC)15％。对于转移，使用Trans-Blot Turbo(伯乐公司)。对于免疫印迹，使用iBind Western系统(赛默飞世尔科技公司)以及以下抗体：抗ApoE PA5-27088(赛默飞世尔科技公司)；178479(Calbiochem)。
线粒体呼吸测量：使用XFe96细胞外通量分析仪(安捷伦科技有限公司)进行耗氧率(OCR)的实时测量。在测量前，将培养基更换为37℃预热的XF基础培养基(安捷伦科技有限公司)，其含有10mM丙酮酸钠(西格玛公司)、10mM D-葡萄糖(西格玛公司)、2mM谷氨酰胺(西格玛公司)。将该测量培养基的pH调节至7.4。在测定前将培养板在37℃下孵育60min。对于线粒体功能分析，使用XF细胞线粒体压力测试药盒(安捷伦科技有限公司)。在测量基础OCR后，将线粒体复合物抑制剂依次注射至各个细胞中。以下列浓度使用各抑制剂：寡霉素1μM；羰基氰化物4-(三氟甲氧基)苯腙(FCCP)，对于Neuro2A细胞为0.25μM，对于大鼠海马神经元为2μM；鱼藤酮/抗霉素A 0.5μM。OCR值通过XFe96软件自动计算、记录并绘图。将备用呼吸能力测量为(FCCP呼吸-基础呼吸)。
结果
在Neuro2A细胞和大鼠原代海马神经元二者中，表达任一个经鉴定的ApoE片段(198-299、199-299、200-299)的组显示备用呼吸能力降低(图13A和图13B)，从而指示这些片段造成线粒体损伤。此外，这些片段在比全长ApoE4低得多的表达水平下引起线粒体功能障碍(图13A至图13C)。结果显示，从人脑中鉴定出的ApoE的C-末端片段具有神经毒性。
实例8
用于获得调节神经毒性12 kDa ApoE片段的产生的化合物的筛选方法材料和方法
细胞培养：使用胰蛋白酶消化和机械解离消化从定时怀孕的威斯塔大鼠(查尔斯河实验室)获得的18天胎龄(E)的胎儿的经解剖海马。将解离的神经元以1.0×105个细胞/孔接种于24孔板(Falcon)中。在7DIV(体外天数)时对具有全长人ApoE4的AAV-DJ进行感染。在感染后4天(11DIV)时将4-{4-[2-(3-甲基-4-氧代-3,4-二氢-酞嗪-1-基)-乙酰氨基]-苄基}-哌嗪-1-甲酸叔丁酯(下文也称为PH-002)(默克公司(Merck))进行处理。在感染后7天(14DIV)时进行样品收集用于蛋白质印迹和细胞毒性分析。
蛋白质印迹分析：通过含有完全(不含EDTA)蛋白酶抑制剂混合物(罗氏制药公司)和PhosSTOP蛋白磷酸酶抑制剂(西格玛公司)的RIPA缓冲液(50mM Tris-HCl pH 7.6、5mMEDTA、1mM EGTA、1％NP40、0.25％脱氧胆酸钠、0.1M NaCl、0.5mM PMSF)裂解细胞，并进行超声处理。在SDS-PAGE前添加含还原剂的样品缓冲溶液(6×)(半井株式会社)。对于SDS-PAGE，使用XV PANTERA MP凝胶(DRC)15％。对于转移，使用Trans-Blot Turbo(伯乐公司)。对于免疫印迹，使用iBind Western系统(赛默飞世尔科技公司)以及抗ApoE PA5-27088抗体(赛默飞世尔科技公司)。对于检测，使用Fusion FX7(威尔勃公司(Vilber Lourmat))。
细胞毒性分析：通过CytoTox-GloTM细胞毒性测定(普洛麦格公司(Promega))评价经处理的化合物的细胞毒性。简言之，将50uL条件培养基和50uL制备的CytoTox-GloTM细胞毒性测定试剂在白壁96孔板(住友电木株式会社(Sumitomo Bakelite))中混合。在室温下孵育15min后，通过SpectraMax iD5(分子仪器公司(Molecular Devices))测量发光。
结果
在该测定中，观察到显示无细胞毒性的PH-002造成的神经毒性12kDa ApoE片段量的减少呈浓度依赖性方式(图14A和图14B)，从而指示这种减少不是由于PH-002的细胞毒性且此方法可有效鉴定ApoE片段化抑制剂。
Figure IDA0003399849400000011
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Figure IDA0003399849400000081

Claims (19)

1.一种载脂蛋白E片段，其由选自由SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3组成的组的氨基酸序列组成。
2.根据权利要求1所述的片段，其由SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成。
3.根据权利要求1所述的片段，其由SEQ ID NO:3的氨基酸序列组成。
4.根据前述权利要求中任一项所述的片段，其展现出神经毒性。
5.一种分离的核酸，其编码根据权利要求1-4中任一项所述的片段。
6.一种载体，其包含根据权利要求5所述的分离的核酸。
7.一种宿主细胞，其包含根据权利要求6所述的载体。
8.一种转基因非人类动物，其包含根据权利要求6所述的载体。
9.一种疫苗，其包含由SEQ ID NO:1-3中任一者的氨基酸序列组成的载脂蛋白E片段。
10.一种预防或治疗有需要的受试者的神经系统疾病的方法，该方法包括向该受试者施用根据权利要求9所述的疫苗。
11.一种筛选具有调节载脂蛋白E片段的神经元毒性的能力的药理剂的方法，该载脂蛋白E片段由SEQ ID NO:1-3中任一者的氨基酸序列组成，
其中该方法包括在该片段存在的情况下使神经细胞或非人类动物与候选药理剂接触以及检测神经元毒性或神经元死亡。
12.一种筛选具有调节载脂蛋白E片段的产生的能力的药理剂的方法，该载脂蛋白E片段由SEQ ID NO:1-3中任一者的氨基酸序列组成，
其中该方法包括使表达载脂蛋白E的神经细胞与候选药理剂接触以及检测该片段的量。
13.根据权利要求12所述的方法，其中该神经细胞表达该载脂蛋白E片段。
14.根据权利要求12所述的方法，其中该神经细胞表达全长载脂蛋白E。
15.根据权利要求14所述的方法，其中该载脂蛋白E是载脂蛋白E4(ApoE4)。
16.根据权利要求12-15中任一项所述的筛选方法，其中表达该载脂蛋白E片段或全长蛋白的该神经细胞是经基因修饰的细胞。
17.一种用于检测受试者中由SEQ ID NO:1-3中任一者的氨基酸序列组成的载脂蛋白E片段的存在或量的方法，
其中该方法包括使从该受试者获得的样品与结合该片段的适体接触以及检测该样品中该片段的存在或量。
18.根据权利要求17所述的方法，其中该样品是从患有或疑似患有阿尔茨海默病(AD)或轻度认知损害(MCI)的受试者获得。
19.根据权利要求17或权利要求18所述的方法，其中将该载脂蛋白E片段的存在或量用于检测、诊断或协助诊断AD或MCI。
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