JP6864364B2 - 融合タンパク質又は複合タンパク質、細胞内送達用担体、部分ペプチド、細胞膜透過促進剤、dna、及びベクター - Google Patents
融合タンパク質又は複合タンパク質、細胞内送達用担体、部分ペプチド、細胞膜透過促進剤、dna、及びベクター Download PDFInfo
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Description
該部分ペプチドと直接的又は間接的に結合され、かつ、細胞表面に対する結合能を有するリガンドと、
を有する、融合タンパク質又は複合タンパク質。
(a)配列番号1、2、又は3に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するDNA
(b)配列番号1、2、又は3に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる塩基配列を有するDNA
(c)配列番号1、2、又は3に記載のアミノ酸配列において1もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失及び/又は付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するDNA
(d)配列番号1、2、又は3に記載のアミノ酸配列と90%以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるDNA
(a)配列番号1、2、又は3に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するDNA
(b)配列番号1、2、又は3に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる塩基配列を有するDNA
(c)配列番号1、2、又は3に記載のアミノ酸配列において1もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失及び/又は付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するDNA
(d)配列番号1、2、又は3に記載のアミノ酸配列と90%以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるDNA
本発明の融合タンパク質又は複合タンパク質は、以下の(a)から(d)のいずれかに記載のDNAがコードするアミノ酸配列のうち少なくとも7個の連続するアミノ酸残基からなる部分ペプチドと、該部分ペプチドと直接的又は間接的に結合され、かつ、細胞表面に対する結合能を有するリガンドとを有する。
(a)配列番号1、2、又は3に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するDNA
(b)配列番号1、2、又は3に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる塩基配列を有するDNA
(c)配列番号1、2、又は3に記載のアミノ酸配列において1もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失及び/又は付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するDNA
(d)配列番号1、2、又は3に記載のアミノ酸配列と90%以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるDNA
本発明の融合タンパク質又は複合タンパク質における部分ペプチドは、上記(a)から(d)のいずれかに記載のDNAがコードするアミノ酸配列のうち少なくとも7個の連続するアミノ酸残基からなるペプチドである。
本発明の融合タンパク質又は複合タンパク質におけるリガンドは、細胞表面に対する結合能を有するものである。
本発明の融合タンパク質又は複合タンパク質は、生理活性を有する有効成分(以下、本明細書において、「有効成分」ということがある。)を、その分子中に含んでもよい。あるいは、本発明の融合タンパク質又は複合タンパク質が、有効成分を分子中に含まなくてもよく、この場合、例えば、細胞内送達に用いる場合に、本発明の融合タンパク質又は複合タンパク質と、有効成分(例えば、核酸等)との複合体を形成してもよい。
本発明の細胞内送達用担体は、上記の融合タンパク質又は複合タンパク質からなる。
本発明は、上記部分ペプチドからなる細胞膜透過促進剤を含む。本発明における「細胞膜透過促進」は、エンドソーム離脱性の促進を含む。
本発明は、上記(a)から(d)のいずれかに記載のDNAがコードするアミノ酸配列のうち少なくとも7個の連続するアミノ酸残基からなる部分ペプチドと、該部分ペプチドと直接的又は間接的に結合され、かつ、細胞表面に対する結合能を有するリガンドとを有する融合タンパク質、又は、上記部分ペプチドをコードするDNAを包含する。
本発明は、上記(a)から(d)のいずれかに記載のDNAがコードするアミノ酸配列のうち少なくとも7個の連続するアミノ酸残基からなる部分ペプチドと、該部分ペプチドと直接的又は間接的に結合された、細胞表面に対する結合能を有するリガンドとを有する融合タンパク質、又は、上記部分ペプチドをコードするDNAが組み込まれたベクターを包含する。
ヒト由来の細胞膜透過性を有する部分ペプチド(以下、本明細書において「ヒト由来細胞膜透過性ペプチド」ということがある。)の候補として、受精時に配偶子の認識及び融合に関係する精子側因子のタンパク質IZUMO1のN末端付近の融合コアヘリックスペプチドである「IZUMO157−113」(配列番号12)、卵子側因子のタンパク質CD9のC末端付近のテトラスパニンファミリーの特徴である3アミノ酸配列(CCG)が含まれる第2細胞外ループペプチドである「CD9113−194」(配列番号2)、及び、胎盤の合胞体性栄養膜細胞の形成に関わるタンパク質Syncytin1のヘプタッドリピート構造を含むコイルドコイル構造の部分ペプチドである「Syncytin1345−422」(配列番号13)、「Syncytin1320−340(FP)」(以下、本明細書において、「Syncytin1(FP)」ということがある。)(配列番号3)、「Syncytin1352−392(NHR)(以下、本明細書において、「Syncytin1(NHR)」ということがある。)」(配列番号14)、及び「Syncytin1407−440(CHR)(以下、本明細書において、「Syncytin1(CHR)」ということがある。)」(配列番号15)を選択した。更に、ヒト由来細胞膜透過性ペプチドの候補として、「Syncytin1(FP−NHR)」(配列番号16)、「Syncytin1(NHR−CHR)」(配列番号17)、「Syncytin1(FP−NHR−CHR)」(配列番号18)を選択した。なお、各ペプチド名に付された下付きの数字は、それぞれのペプチドを構成するアミノ酸残基について、それぞれの由来となるタンパク質においてN末端側から数えた場合のアミノ酸残基の番号である。
まず、ヒト由来細胞膜透過性ペプチドの候補が細胞膜に非選択的に結合しないことを確認するために、上記の各部分ペプチドとeGFP(高感度緑色蛍光タンパク質)との融合タンパク質(以下、本明細書において、eGFPを含む融合タンパク質を「eGFP融合タンパク質」ということがある。)を大腸菌で発現・精製し、培養細胞に添加した後のeGFPの局在を蛍光顕微鏡で観察した。作製した各種eGFP融合タンパク質のDNAコンストラクトの模式図を図2に示す。図2中、(a)は、ヒト由来膜作用性ペプチド候補のeGFP融合タンパク質(Syncytin1の部分ペプチドについては、「Syncytin1345−422」のeGFP融合タンパク質)のDNAコンストラクトの模式図を示す。(b)は、各Syncytin1ドメインの部分ペプチドのeGFP融合タンパク質のDNAコンストラクトの模式図を示す。「6xHis」、「FLAG」は、eGFP融合タンパク質の精製時に使用するTagをコードする塩基配列を示し、「TCS」は、トロンビン認識配列を示す。「(G4S)3」は、eGFPとSyncytin1(FP)との間に挿入したGGGGSをコードする塩基配列を3回繰り返したフレキシブルリンカーを示す。なお、「IZUMO157−113」をコードする塩基配列を配列番号20に示し、「CD9113−194」をコードする塩基配列を配列番号21に示し、「Syncytin1345−422」をコードする塩基配列を配列番号22に示し、「Syncytin1(FP)」をコードする塩基配列を配列番号23に示し、「Syncytin1(NHR)」をコードする塩基配列を配列番号24に示し、「Syncytin1(CHR)」をコードする塩基配列を配列番号25に示し、「Syncytin1(FP−NHR)」をコードする塩基配列を配列番号26に示し、「Syncytin1(NHR−CHR)」をコードする塩基配列を配列番号27に示し、「Syncytin1(FP−NHR−CHR)」をコードする塩基配列を配列番号28に示した。
上記「eGFP融合タンパク質の調製」において、得られた各eGFP融合タンパク質をHeLa細胞に添加し、24時間後に4%パラホルムアルデヒドで固定し、共焦点顕微鏡 FV−1000(Olympus社製)を用いてeGFPの局在の観察を行った。その結果、eGFP−B55融合タンパク質とeGFP−Syncytin1345−422融合タンパク質においては、細胞膜への強い結合が観察された。また、eGFP−CD9113−194融合タンパク質、eGFP−Syncytin1(FP)融合タンパク質、eGFP−Syncytin1(CHR)融合タンパク質、及びeGFP−Syncytin1(NHR−CHR)融合タンパク質では細胞膜への弱い結合が観察された。それ以外の融合タンパク質(eGFP−IZUMO157−113融合タンパク質、eGFP−Syncytin1(NHR)融合タンパク質、eGFP−Syncytin1(FP−NHR)融合タンパク質、及びeGFP−Syncytin1(FP−NHR−CHR)融合タンパク質)については、細胞膜への結合は全く見られなかった。
上記結合性の観察試験において、eGFP−Syncytin1345−422以外のヒト由来細胞膜透過性ペプチドの融合タンパク質については、細胞膜への強い結合が見られなかった。これを踏まえて、細胞膜と相互作用するカチオン性のTATペプチド(配列番号29、YGRKKRRQRRR)をC末端に付加したeGFP融合タンパク質(以下、本明細書において、eGFPを含み、かつ、C末端にTATが付加された融合タンパク質を「eGFP−TAT含有融合タンパク質」ということがある。)を調製し、TATを介して非選択的に細胞に取り込まれたeGFPのエンドソーム離脱をヒト由来ペプチドが促進するかどうかの検証を行った。なお、細胞膜透過性ペプチドのポジティブコントロールとしてインフルエンザウイルス由来のHA2ペプチド(配列番号30、GLFEAIEGFIENGWEGMIDGWYG)を、調製した。作製したeGFP−TAT含有融合タンパク質のDNAコンストラクトの模式図を図3に示す。図3中、(a)は、eGFP−TAT融合タンパク質、及び、HA2、又は、ヒト由来細胞膜透過性ペプチド候補(Syncytin1以外)を含むeGFP−TAT含有融合タンパク質のDNAコンストラクトの模式図を示す。(b)は、各Syncytin1ドメインの部分ペプチドのeGFP−TAT含有融合タンパク質のDNAコンストラクトの模式図を示す。図3中、「6xHis」、「FLAG」は、eGFP融合タンパク質の精製時に使用するTagをコードする塩基配列を示し、「TCS」は、トロンビン認識配列を示す。「(G4S)3」は、eGFPとSyncytin1(FP)との間に挿入したGGGGSをコードする塩基配列を3回繰り返したフレキシブルリンカーを示す。これらのeGFP−TAT含有融合タンパク質は、上記「eGFP融合タンパク質の調製」と同じ条件で発現を行った。その後、eGFP−TAT融合タンパク質、eGFP−HA2−TAT融合タンパク質、eGFP−CD9113−194−TAT融合タンパク質、eGFP−Syncytin1(NHR)−TAT融合タンパク質、及びeGFP−Syncytin1(CHR)−TAT融合タンパク質については、可溶性画分を、上記「eGFP融合タンパク質の調製」における「eGFP」と同じ条件で精製した。また、eGFP−IZUMO157−113−TAT融合タンパク質及びeGFP−Syncytin1(FP)−TAT融合タンパク質については、不溶性画分を、上記「eGFP融合タンパク質の調製」における「eGFP−B55」と同じ条件で精製した。なお、本明細書及び図面において、eGFP−TAT融合タンパク質を対照例、eGFP−HA2−TAT融合タンパク質を参考例、eGFP−IZUMO157−113−TAT融合タンパク質を実施例1、eGFP−CD9113−194−TAT融合タンパク質を実施例2、eGFP−Syncytin1(FP)−TAT融合タンパク質を実施例3、eGFP−Syncytin1(NHR)−TAT融合タンパク質を比較例1、eGFP−Syncytin1(CHR)−TAT融合タンパク質を比較例2ということがある。また、eGFP−TAT融合タンパク質(対照例)のアミノ酸配列を配列番号31に、eGFP−HA2−TAT融合タンパク質(参考例)のアミノ酸配列を配列番号32に、eGFP−IZUMO157−113−TAT融合タンパク質(実施例1)のアミノ酸配列を配列番号33に、eGFP−CD9113−194−TAT融合タンパク質(実施例2)のアミノ酸配列を配列番号34に、eGFP−Syncytin1(FP)−TAT融合タンパク質(実施例3)のアミノ酸配列を配列番号35に、eGFP−Syncytin1(NHR)−TAT融合タンパク質(比較例1)のアミノ酸配列を配列番号36に、eGFP−Syncytin1(CHR)−TAT融合タンパク質(比較例2)のアミノ酸配列を配列番号37にそれぞれ示す。
上記「eGFP−TAT含有融合タンパク質の調製」において、得られた各eGFP−TAT含有融合タンパク質をHeLa細胞へ添加し、1時間後に固定し、トリパンブルーを用いて細胞膜表面の蛍光を消光後、共焦点顕微鏡で観察した。この際、eGFP−TAT融合タンパク質は終濃度が10μMとなるように、eGFP−HA2−TAT融合タンパク質は終濃度が10μMとなるように、eGFP−IZUMO157−113−TAT融合タンパク質は終濃度が0.2μMとなるように、eGFP−CD9113−194−TAT融合タンパク質は終濃度が5μMとなるように、eGFP−Syncytin1(FP)−TAT融合タンパク質は終濃度が10μMとなるように、eGFP−Syncytin1(NHR)−TAT融合タンパク質は終濃度が10μMとなるように、eGFP−Syncytin1(CHR)−TAT融合タンパク質は終濃度が10μMとなるようにHeLa細胞へ添加した。
上記「eGFP−TAT含有融合タンパク質の細胞内への送達後の共焦点顕微鏡による観察及び蛍光強度の測定」により、IZUMO157−113、CD9113−194及びSyncytin1(FP)について細胞膜透過促進ペプチドとしての機能が示唆された。これらのeGFP−TAT含有融合タンパク質が、エンドソームを離脱していることを確認するために、エンドソームをLysoTracker Red DND−99(Life Technologies)により染色し、各eGFP−TAT含有融合タンパク質との共局在解析を行った。なお、トリパンブルーによる消光を行うと細胞全体が赤色の蛍光を発し、LysoTrackerによるエンドソームの標識はできないため、heparin/PBSで洗浄することで細胞膜表面のeGFP−TAT含有融合タンパク質の除去を行った。具体的な操作を以下に説明する。
ヒト由来細胞膜透過促進ペプチドとして使用するペプチドは、操作性の観点ではより短い方が好ましいため、最も細胞膜透過効率が高かったIZUMO157−113について、更に短く断片化したペプチドIZUMO157−75(配列番号38)、IZUMO176−94(配列番号4)、IZUMO195−113(配列番号6)及びIZUMO181−113(配列番号5)について各eGFP−TAT含有融合タンパク質を上記「eGFP−TAT含有融合タンパク質の調製」における「eGFP−IZUMO157−113−TAT融合タンパク質」と同様の方法で調製し、HeLa細胞内に、それぞれの融合タンパク質を送達し、細胞内に取り込まれたeGFPの蛍光強度を定量した。より具体的には、eGFP−TAT融合タンパク質は終濃度が10μMとなるように、eGFP−IZUMO157−113−TAT融合タンパク質は終濃度が1μMとなるように、eGFP−IZUMO195−113−TAT融合タンパク質は終濃度が1μMとなるように、eGFP−IZUMO157−75−TAT融合タンパク質は終濃度が1μM、又は10μMとなるように、eGFP−IZUMO176−94−TAT融合タンパク質は終濃度が1μM、又は10μMとなるように、eGFP−IZUMO181−113−TAT融合タンパク質は終濃度が1μM又は10μMとなるように、Hela細胞に添加した。HeLa細胞へ添加してから1時間後に固定し、細胞膜表面の蛍光をトリパンブルーにより消光した後、共焦点顕微鏡で観察を行った。それぞれの融合タンパク質のHela細胞内に送達後に、1細胞ごとに関心領域(ROI)を取り、eGFPの蛍光強度を定量化した。その結果を図7、8に示す。なお、本明細書及び図面において、eGFP−IZUMO181−113−TAT融合タンパク質を実施例4、eGFP−IZUMO176−94−TAT融合タンパク質を実施例5、eGFP−IZUMO195−113−TAT融合タンパク質を実施例6、eGFP−IZUMO157−75−TAT融合タンパク質を比較例3ということがある。また、eGFP−IZUMO181−113−TAT融合タンパク質(実施例4)を配列番号39に、eGFP−IZUMO176−94−TAT融合タンパク質(実施例5)を配列番号40に、eGFP−IZUMO195−113−TAT融合タンパク質(実施例6)を配列番号41に、eGFP−IZUMO157−75−TAT融合タンパク質(比較例3)を配列番号42に、それぞれ示す。
3種類のヒトタンパク質由来の細胞膜透過促進ペプチドを含む領域IZUMO157−113、CD9113−194、及びSyncytin1320−440について、二次構造予測サーバJPred4(http://www.compbio.dundee.ac.uk/jpred4/)を用いて、ヘリックスやβシート、コイル等の二次構造の予測を行った。その結果を、図9に示す。図9中、Hはそれぞれのペプチドにおいてヘリックスを構成する部分である。図9に示すように、IZUMO1は2本のヘリックス、CD9とSyncytin1は3本のヘリックスに分かれたことが確認された。上記のIZUMO1のペプチド配列の断片化の実験では、IZUMO1については後半のアミノ酸残基である81−110残基のヘリックス部分と、Syncytin1については前半のアミノ酸残基である321−334残基(配列番号10)のヘリックス部分を含む断片が高い細胞膜透過効率を示したことから、これらのヘリックス構造が細胞膜との相互作用に重要であることが示唆された。更に、IZUMO1とSyncytin1と同様に、CD9についても115−133(配列番号7)、138−151(配列番号8)又は182−190残基(配列番号9)のヘリックスを含む断片が重要であることが示唆された。
上記「エンドソーム離脱能検証」のとおり、eGFP−TAT含有融合タンパク質は、エンドソームから離脱していることが確認された。更に、eGFP−TAT含有融合タンパク質のエンドソーム離脱効率を定量するために、下記試験を行った。
eGFP−TAT含有融合タンパク質がHeLa細胞以外のヒト培養細胞にも取り込まれることを確認した。まず、eGFP−TAT含有融合タンパク質として、eGFP−Syncytin1322−340−TAT(配列番号45、表3)を、上記「eGFP−TAT含有融合タンパク質の調製」における「eGFP−IZUMO157−113−TAT融合タンパク質」と同様の方法で調製した。得られた融合タンパク質を、終濃度が5μMとなるように、HeLa(ヒト子宮頸癌細胞)、HA431(ヒト上皮様細胞癌細胞)、HepG2(ヒト肝癌細胞)、及び、SK−N−SH(ヒト神経芽腫細胞)に添加した。添加の1時間後に細胞を固定してから、細胞膜表面の蛍光をトリパンブルーにより消光した後、共焦点顕微鏡で観察を行った。それぞれの細胞内に送達後に、1細胞ごとに関心領域(ROI)を取り、eGFPの蛍光強度を定量化した。その結果を図11に示す。なお、本明細書及び図面において、eGFP−Syncytin1322−340−TAT融合タンパク質を実施例10ということがある。
Syncytin1322−340(配列番号44)がeGFP以外のタンパク質のエンドソーム離脱を促進できるかどうか検証した。具体的には、eGFPの代わりに、SNAPタグ(分子量19.4kDa)[Nat. Biotechnol. 21(2003)86−89]又はβ−ガラクトシダーゼ(分子量116kDa)を使用し、TAT融合タンパク質を上記「eGFP−TAT含有融合タンパク質の調製」における「eGFP−IZUMO157−113−TAT融合タンパク質」と同様の方法で調製した。得られた各融合タンパク質を、終濃度が5μMとなるように、HeLa細胞に添加し、細胞内に取り込まれたSNAPタグ及びβ−ガラクトシダーゼ(β−Gal)を下記の方法にしたがい、定量した。
Claims (8)
- 以下の(a)又は(d)のいずれかに記載の部分ペプチドと、
該部分ペプチドと直接的又は間接的に結合され、かつ、細胞表面に対する結合能を有するリガンドと、
を含む、融合タンパク質又は複合タンパク質。
(a)配列番号1〜10又は44に記載のアミノ酸配列からなる部分ペプチド
(d)配列番号1〜10又は44に記載のアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、細胞膜透過性及びエンドソーム離脱性を有する部分ペプチド - 前記リガンドが、抗体である、請求項1に記載の融合タンパク質又は複合タンパク質。
- 請求項1又は2に記載の融合タンパク質。
- 請求項1又は2に記載の融合タンパク質又は複合タンパク質からなる、細胞内送達用担体。
- 以下の(a)又は(d)のいずれかに記載の部分ペプチド。
(a)配列番号1〜10又は44に記載のアミノ酸配列からなる部分ペプチド
(d)配列番号1〜10又は44に記載のアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、細胞膜透過性及びエンドソーム離脱性を有する部分ペプチド - 請求項5に記載の部分ペプチドからなる細胞膜透過促進剤。
- 請求項1又は2に記載の融合タンパク質又は請求項5に記載の部分ペプチドをコードするDNA。
- 請求項7に記載のDNAが組み込まれたベクター。
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