CN112494427B - 一种聚乳酸-多肽胶束及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种聚乳酸‑多肽胶束及其应用，所述聚乳酸‑多肽胶束由两亲性聚乳酸‑多肽聚合物自组装形成，所述两亲性聚乳酸‑多肽聚合物包括含有精氨酸的亲水性多肽和提供组装驱动力的疏水性聚乳酸；所述亲水性多肽形成聚乳酸‑多肽胶束的外壳，所述疏水性聚乳酸形成聚乳酸‑多肽胶束的内核；所述两亲性聚乳酸‑多肽聚合物上还连接有靶向肿瘤细胞的适配体。本发明的聚乳酸‑多肽胶束结构稳定，肿瘤治疗药物包载于疏水性内核中，利用多肽适配体靶向肿瘤细胞，到达酸性肿瘤环境中发生解聚，缓慢释放包载的药物，安全性高、毒性低，在肿瘤的联合治疗领域具有重要意义。

Description

一种聚乳酸-多肽胶束及其应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，涉及一种聚乳酸-多肽胶束及其应用。
背景技术
纳米载体是一种非常有效的药物递送载体，已经广泛应用于疾病治疗。纳米结构增强了纳米载体的渗透性和保留效应(EPR)，使得纳米载体能够被动积累于肿瘤组织中，与传递药物产生协同作用，具有显著增强的抗肿瘤效果。
目前，纳米载体通常负载一种或一类药物，Tai等报道了基于含有精氨酸和组氨酸的二硫键交联的聚乳酸的阳离子还原反应载体，所述载体可在体内外有效传递基因药物(Tai Z,Wang X,Tian J,Gao Y,Zhang L,Yao C,Wu X,Zhang W,Zhu Q,Gao S:Biodegradable stearylated peptide with internal disulfide bonds for efficientdelivery of siRNA in vitro and in vivo.Biomacromolecules 2015,16(4):1119-1130.)。然而，该阳离子还原反应载体仅装载了基因药物，不能装载、传递和靶向释放化合物药物。
在实际临床应用中，单一的治疗策略对疾病并不能达到良好的治疗效果，需要联合多种治疗方案才能提高对疾病的疗效，因此，目前的负载一种或一类药物的纳米载体在临床应用中具有一定的局限性。
CN109568595A公开了核酸-药物结合物、药物递送系统及其制备方法和应用，所述核酸-药物结合物是由硫代磷酸酯修饰核酸中的硫代磷酸酯基团与修饰在药物分子上、可与硫代磷酸酯基团发生亲电反应的基团反应结合而成，并且，通过选择包括功能性核酸在内的不同核酸序列，所述核酸-药物结合物可自组装为各种形式的含药纳米载体进行药物递送。但是，该药物递送系统中的核酸仅作为药物递送系统的骨架自组装形成含药纳米载体，不具有治疗效果，且该药物递送系统改变了核酸和药物的结构和功能，治疗效果和安全性均受到影响。
因此，有必要构建新的纳米载体，可以共载不同类型的药物，在疾病的联合治疗领域具有重要意义。
发明内容
针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供了一种聚乳酸-多肽胶束及其应用，所述聚乳酸-多肽胶束结构稳定、载药量高、肿瘤靶向性好，对包载的药物具有缓释作用，为疾病的联合治疗提供了有效手段。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种聚乳酸-多肽胶束，所述聚乳酸-多肽胶束由两亲性聚乳酸-多肽聚合物自组装形成，所述两亲性聚乳酸-多肽聚合物包括含有精氨酸的亲水性多肽和提供组装驱动力的疏水性聚乳酸；
所述亲水性多肽形成聚乳酸-多肽胶束的外壳，所述疏水性聚乳酸形成聚乳酸-多肽胶束的内核；
所述两亲性聚乳酸-多肽聚合物上还连接有靶向肿瘤细胞的适配体。
本发明中，基于两亲性物质的自组装原理，以两亲性聚乳酸-多肽单体为单位，通过二硫键聚合形成两亲性聚乳酸-多肽聚合物，其中，聚乳酸作为疏水性部分提供组装驱动力，在水溶液中将聚乳酸-多肽聚合物自组装形成聚乳酸-多肽胶束，多肽作为亲水性部分促进细胞对聚乳酸-多肽胶束的有效摄取，连接于所述两亲性聚乳酸-多肽聚合物上的适配体具有对肿瘤细胞的靶向性和渗透性，构建的聚乳酸-多肽胶束有利于实现对肿瘤的高效治疗。
优选地，所述亲水性多肽由精氨酸和组氨酸组成，精氨酸位于所述亲水性多肽的羧基端，作为两亲性聚乳酸-多肽聚合物的亲水部分，促进细胞对聚乳酸-多肽胶束的有效摄取，组氨酸位于所述亲水性多肽的氨基端，连接亲水性精氨酸和疏水性聚乳酸，具有酸响应性，组氨酸在还原性环境中发生质子化，促进了聚乳酸-多肽胶束释放包载于内核中的物质(药物)。
优选地，所述亲水性多肽包括SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；
SEQ ID NO:1：HHHRRRRRRRR。
优选地，所述适配体通过二硫键连接在所述亲水性多肽的氨基酸端。
优选地，所述适配体包括靶向黑色素瘤细胞的多肽适配体，对黑色素瘤细胞具有靶向和促渗透双重功能，用于解决黑色素瘤治疗药物靶向性差的问题，显著提高了聚乳酸-多肽胶束对黑色素瘤细胞的靶向效率。
优选地，所述适配体包括SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；
SEQ ID NO:2：YCKVILTHRCY。
优选地，所述聚乳酸-多肽胶束具有式I所示的结构式；
Figure BDA0002812271310000031
第二方面，本发明提供了一种纳米药物，所述纳米药物包括第一方面所述的聚乳酸-多肽胶束和共载于所述聚乳酸-多肽胶束中的化疗药物和/或基因药物。
优选地，所述化疗药物和基因药物共同包载于所述聚乳酸-多肽胶束中，其中，化疗药物包载于所述聚乳酸-多肽胶束的内核中，基因药物包载于所述聚乳酸-多肽胶束的外壳上。
优选地，所述纳米药物的粒径为150～250nm，优选为150～200nm。
优选地，所述纳米药物具有正电表面电荷，电位为10～35mV，纳米药物与细胞膜之间具有强静电作用，促进了细胞对纳米药物的摄取效率。
本发明中，纳米药物的粒径和电位合理，有利于纳米药物进入人体后，通过EPR效应靶向至肿瘤部位进而最大程度发挥抗肿瘤作用，同时避免对其他组织和器官的副作用。
优选地，所述纳米药物还包括药学上接受的载体、赋形剂或稀释剂中的任意一种或至少两种的组合。
第三方面，本发明提供了第一方面所述的聚乳酸-多肽胶束和/或第二方面所述的纳米药物在制备肿瘤治疗药物中的应用。
优选地，所述肿瘤包括黑色素瘤。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明基于两亲性物质的自组装原理，得到由两亲性聚乳酸-多肽聚合物自组装形成的聚乳酸-多肽胶束，所述聚乳酸-多肽胶束在中性环境中结构稳定，内部形成疏水性内核空腔用于包载化疗药物，外部形成亲水性多肽用于包载基因药物和促进细胞摄取，在酸性环境中亲水性多肽中的组氨酸发生质子化改变，聚乳酸-多肽胶束结构解聚，释放包载的药物，酸响应机制仅依赖于自身分子的改变，无需额外添加酸响应分子，实现了药物的缓慢释放；
(2)本发明的聚乳酸-多肽胶束还修饰有靶向性适配体，提高了聚乳酸-多肽胶束对肿瘤细胞的靶向性，药物靶向性释放于肿瘤组织处，提高了治疗效果和治疗安全性；
(3)本发明的共载化疗药物和基因药物的多肽胶束粒径和电位科学合理，具有增强的通透性和保留效果(EPR)，积累于肿瘤部位，最大程度发挥抗肿瘤作用，并避免了对其他组织和器官的副作用，多肽胶束与细胞膜之间的强静电作用促进了细胞对载药胶束摄取效率，在临床应用中具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为聚乳酸-多肽胶束载体PLA-H3R8-DR5(PHRD)的结构示意图；
图2A为聚乳酸-多肽胶束载体PLA-H3R8(PHR)的特征红外光谱图，图2B为靶向性适配体DR5修饰的聚乳酸-多肽胶束载体PLA-H3R8-DR5(PHRD)的特征红外光谱图；
图3A为PHRD的HPLC图谱，图3B为PHRD的MS图谱；
图4A为不同N/P比的PHRD-(DTIC/miRNA-34a)的zeta电位图，图4B为不同N/P比的PHRD-(DTIC/miRNA-34a)的粒径图，图4C为N/P比为10的PHRD-(DTIC/miRNA-34a)的粒径图和透射电镜图，图4D为细胞摄取PHRD-(DTIC/miRNA-34a)的效率；
图5A为不同N/P比条件下，PHRD对miRNA-34a的缩合能力，图5B为不同N/P比条件下，PHRD对miRNA-34a的释放能力，图5C为PHRD/miRNA-34a和PHRD/(DTIC/miRNA-34a)对强聚阴离子的抵抗力；
图6为PHRD的临界胶束浓度测定结果图；
图7为PHRD对DTIC的体外释放曲线。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。
实施例1靶向共递送化疗药物和基因药物载体PHRD的合成
①将聚乳酸(PLA)用TBDMS进行羟基保护后，用二环己基碳二亚胺(DCC)和HOBt活化，过滤除去二环己基脲(DCU)后，加入H-His(Trt)-OH反应过夜，得到TBDMS-聚乳酸-His(Trt)-OH；
②将Fmoc-Arg(Pbf)-Wang Resin用Pip/DMF脱保护30min，按当量比例投入氨基酸(AA)、四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)和N-甲基吗啉(NMM)，加入适量DMF，鼓氮气反应30min，树脂取样茚三酮检测透明；
③重复步骤②，直至序列偶联至倒数第二个氨基酸；
④将TBDMS-聚乳酸-His(Trt)-OH、HBTU和NMM按比例加入反应器，偶联2小时，树脂取样茚三酮检测透明，甲醇洗涤后抽干反应器内树脂，转移至切割管中，加入TFA/EDT/H2O＝95/2.5/2.5切割液，摇床控温3h进行抽滤；
⑤将切割滤液收集至离心管中，加入6倍体积的冰乙醚，离心收集固体沉淀，用乙醚清洗3次后，得到粗品；
⑥将粗品真空干燥过夜，反向HPLC纯化，得到TBDMS保护的聚乳酸-多肽，将TBDMS保护的聚乳酸-多肽溶解于DMF中，加入四丁基氟化铵，搅拌2h，浓缩，反向HPLC纯化，得到精品PHRD，产物结构见式I，示意图如图1所示。
实施例2靶向共递送化疗药物和基因药物载体PHRD的表征
(1)红外光谱鉴定
取1～2mg PHR和PHRD固体干燥样品，在玛瑙研钵中充分磨细后，加入400mg干燥的KBr，继续研磨至完全混合，颗粒直径约为2μm；取100mg混合物均匀铺洒于干净的压膜内，于压片机上在29.4Mpa压力下，压制1min，制成透明薄片；将此透明薄片装于样品架上，置于分光光度计的样品池处，从4000cm-1扫至400cm-1。
由DR5的结构可知，其存在游离羟基(3700cm-1～3500cm-1)、游离氨基(3500cm-1～3300cm-1)、缔合氨基(3450cm-1～3200cm-1)、羧酸基(1900cm-1～1650cm-1)、苯环(3000cm-1，1680cm-1～1500cm-1)和酯胺(1900cm-1～1650cm-1)等；而H3R8存在游离氨基(3500cm-1～3300cm-1)、酯胺(1900cm-1～1650cm-1)和酯键(1900cm-1～1650cm-1)等。对比图2A和图2B发现，图2B在约3000cm-1和1618cm-1处存在吸收峰，说明成功合成PHRD。
(2)HPLC和MS鉴定
利用HPLC法检测合成的PHRD纯度，如图3A中显示，色谱图中代表PHRD多肽聚合物的为单峰，谱图中无其他的杂质峰干扰，出峰时间大约在10.732min，结果显示制备并纯化得到的PHRD的纯度高，几乎不含有其他杂质，可用于下一步实验。
图3B为PHRD的MS分析鉴定结果，结果显示该PHRD多肽聚合物的分子量是4283.94，且结构特征符合PHRD多肽聚合物的特征。
实施例3共载DTIC和miRNA-34a的聚乳酸-多肽胶束的构建
本实施例基于靶向共递送化疗药物和基因药物载体PHRD，采用超声乳化法制备共载化疗药达卡巴嗪(DTIC)和基因药miRNA-34a的多肽胶束，步骤如下：
(1)将3mg DTIC溶于3mL甲醇中，配制为1mg/mL溶液；
(2)称取5mg PHRD，溶于去离子水中，配制为1mg/mL溶液，并将3mL DTIC溶液逐滴加入到PHRD溶液中，冰浴条件下超声，功率为100W，时间为30s，共超声2次；
(3)将乳化后的混合液迅速转移至磁力搅拌器上快速搅拌过夜，除去溶液中的甲醇后收集混合液，用孔径为0.45μm的微孔滤膜去除未包封的DTIC，并用超滤法去除游离的DTIC，制得包载DTIC的多肽胶束PHRD-DTIC；
(4)取适量的miRNA-34a按照不同N/P比加入到PHRD-DTIC溶液中，涡旋振荡30s，室温避光孵育30min，制得共载DTIC和miRNA-34a的多肽胶束PHRD-(DTIC/miRNA-34a)，备用。
实施例4共载DTIC和miRNA-34a的聚乳酸-多肽胶束PHRD-(DTIC/miRNA-34a)的表征
(1)PHRD-(DTIC/miRNA-34a)的粒径和电位
PHRD-(DTIC/miRNA-34a)聚乳酸-多肽胶束的粒径、电位和形态对其转染效率和稳定性有显著影响，因此，需要对共载多肽胶束的粒径和电位进行检测和控制。
取新鲜配制的适量的N/P为2.5:1、5:1、10:1、20:1、40:1的PHRD-(DTIC/miRNA-34a)多肽胶束溶液，加入去离子水稀释，用安东帕Litesizer500电位测定仪测定粒径和zeta电位；
取新鲜配置的适量的N/P为10:1的PHRD-(DTIC/miRNA-34a)多肽胶束溶液，利用TEM观察形貌。
由图4A和图4B可知，所有胶束都具有正电表面电荷，zeta电位在一个范围内，除N/P比为40的胶束外，所有胶束的粒径均小于200nm。
如图4C所示，N/P比为10时PHRD-(DTIC/miRNA-34a)具有球形和致密的纳米结构，粒径为164.1±4.5nm，多分散指数(PDI)为0.269±0.780，PHRD-(DTIC/miRNA-34a)的合理尺寸使其具有增强的通透性和保留效果(EPR)，适合通过给药系统进行给药。
由于N/P比为10时PHRD-(DTIC/miRNA-34a)的zeta电位为27.3±1.38mV，胶束与细胞膜之间具有强烈的静电作用，如图4D所示，在此N/P比下，细胞对胶束的吸收效率高。
(2)共载多肽胶束的载药量和包封率
利用HPLC测定PHRD-(DTIC/miRNA-34a)中DTIC的浓度，流动相为甲醇:水(30/70，v/v)，流速为1.0mL/min，紫外检测波长为230nm，色谱柱为C18column(Diamonsil，5μm，250×4.6mm)，柱温为30℃。载药率(drug loading content，DL)和包封率(encapsulationefficiency，EE)根据以下公式计算：
DL(％)＝胶束中药物的质量/载药胶束质量×100％
EE(％)＝胶束中药物的质量/投入药物的质量×100％
计算发现，共载多肽胶束的载药量为29.25±3.23μg/mg，包封率为78.3±5.71％。
(3)琼脂糖凝胶电泳实验
利用琼脂糖凝胶电泳实验考察PHRD对miRNA-34a的包裹能力和保护能力，步骤如下：
按照N/P为0.5～40将适量的miRNA-34a添加到含有Blank-PHRD或PHRD/DTIC的溶液中，分别获得PHRD/miRNA-34a和PHRD/(DTIC/miRNA-34a)；
将载有miRNA-34a的多肽胶束在室温下孵育30min，随后加入Tris-醋酸盐-EDTA(TAE)缓冲液中，上样至Gelred染色的1.0％(w/v)琼脂糖凝胶上，100V电泳20min，采用UV照明器进行凝胶成像。
如图5A和图5B所示，PHRD能够有效缩合miRNA-34a，在N/P比为10时，miRNA-34a的迁移率发生了完全变化。为了验证多肽聚合是否会影响PHRD与miRNA-34a的结合能力，向胶束中添加一种类似于谷胱甘肽的还原剂DTT来破坏二硫键，结果发现，在DTT存在的条件下，PHRD结合miRNA-34a的亲和力较弱。基于以上电泳结果，表明二硫键交联的肽可以在细胞质的还原环境中解离，从而有效释放药物和miRNA-34a。
进一步利用肝素置换实验评估PHRD对强聚阴离子的抵抗力，步骤如下：
配制浓度分别为5、10、20、50μg/mL的肝素水溶液，分别加入到PHRD/miRNA-34a或PHRD/(DTIC/miRNA-34a)(N/P＝10)中，共孵育1h后，取样进行凝胶电泳分析，以bPEI-25K/miRNA-34a(N/P＝10)作为对照。
如图5C所示，在不同肝素浓度条件下，bPEI-25K/miRNA-34a多链体被完全破坏，封装能力减弱；相反，即使在高达50μg/mL肝素浓度的条件下，PHRD/miRNA-34a和PHRD/(DTIC/miRNA-34a)也能强烈吸附siRNA分子，表明PHRD对竞争性强的聚阴离子具有优异的抵抗力。基于以上稳定性结果，表明PHRD胶束可用于体内递送miRNA-34a。
(4)临界胶束浓度(CMC)测定
以丙酮为溶剂配制6×10-6M芘溶液，将丙酮自然挥发掉后，在含微量芘的容量瓶中加入空白胶束溶液，定容配制浓度为5.0×10-5mg/mL～2.0mg/mL的溶液(1×10-5mg/mL、5×10-5mg/mL、1×10-4mg/mL、5×10-4mg/mL、1×10-3mg/mL、5×10-3mg/mL、0.01mg/mL、0.05mg/mL、0.1mg/mL、0.5mg/mL、1mg/mL、2mg/mL)，25℃避光孵育至少2h，采用荧光分光光度计(Hitachi F-7000，日本)分别测定各溶液的荧光光谱图，荧光扫描的激发波长为333nm，激发狭缝为5.0nm，发射狭缝为2.5nm，扫描速度为500nm/min。记录373nm(I1)和383nm(I3)处的荧光值，以空白胶束浓度的对数值为横坐标，I1/I3为纵坐标作图。
如图6所示，在胶束浓度较低的条件下，I1/I3的强度较低，揭示了胶束在水性环境中的特性；当胶束浓度增加到临界胶束浓度(CMC)时，I1/I3的强度比急剧增加，表明在形成胶束的疏水环境中存在芘；PHRD的CMC低至0.002131mg/mL，说明胶束通过静脉注射至体内能够保持稳定。
(5)DTIC体外释放
采用透析法考察PHRD-(DTIC/miRNA-34a)胶束对DTIC的体外释放情况，选取相对分子质量为500的透析袋，透析介质为PBS溶液(pH＝7.4)，透析温度为37℃。将2mL PHRD-(DTIC/miRNA-34a)溶液或游离DTIC溶液装于透析袋中，置于100mL PBS缓冲液中，100r/min、37℃条件下，分别于0.5、1、2、3、4、5、10、24、48、72时间点取1mL外液，并补加1mL释放介质，利用HPLC法测定外液中DTIC的浓度，绘制体外释放曲线。
如图7所示，胶束负载的DTIC起初有突释效果，可能是由于部分药物粘附在胶束外部的亲水链段，随后是一个缓慢释药的过程，DTIC载药胶束72小时后才释放了85.6％；而游离的DTIC在开始两小时后已经完全从透析袋内释放出来。说明DTIC包裹于胶束内具有一定的缓释作用，这为增加药物的稳定性以及延长药物的作用时间奠定了基础。
综上所述，本发明的聚乳酸-多肽胶束在中性条件下结构稳定，呈纳米颗粒形态，肿瘤治疗药物包载于疏水性内核中，利用多肽适配体靶向肿瘤细胞，到达酸性肿瘤环境中发生解聚，缓慢释放包载的药物，酸响应机制仅依赖于自身分子的改变，无需额外添加酸响应分子，安全性高、毒性低，在肿瘤的联合治疗领域具有重要意义。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 嘉兴学院
<120> 一种聚乳酸-多肽胶束及其应用
<130> 20201202
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
His His His Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg
1 5 10
<210> 2
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Tyr Cys Lys Val Ile Leu Thr His Arg Cys Tyr
1 5 10

Claims (9)

1.一种聚乳酸-多肽胶束，其特征在于，所述聚乳酸-多肽胶束由两亲性聚乳酸-多肽聚合物自组装形成，所述两亲性聚乳酸-多肽聚合物包括含有精氨酸的亲水性多肽和提供组装驱动力的疏水性聚乳酸；
所述亲水性多肽形成聚乳酸-多肽胶束的外壳，所述疏水性聚乳酸形成聚乳酸-多肽胶束的内核；
所述两亲性聚乳酸-多肽聚合物上还连接有靶向肿瘤细胞的适配体；
所述亲水性多肽由精氨酸和组氨酸组成，精氨酸位于所述亲水性多肽的羧基端，组氨酸位于所述亲水性多肽的氨基端，连接精氨酸和聚乳酸；
所述亲水性多肽包括SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；
所述适配体通过二硫键连接在所述亲水性多肽的氨基端；
所述适配体包括靶向黑色素瘤细胞的多肽适配体；
所述适配体包括SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；
所述聚乳酸-多肽胶束具有式I所示的结构式：
Figure FDA0003516088700000011
2.一种纳米药物，其特征在于，所述纳米药物包括权利要求1所述的聚乳酸-多肽胶束和共载于所述聚乳酸-多肽胶束中的化疗药物和/或基因药物。
3.根据权利要求2所述的纳米药物，其特征在于，所述化疗药物和基因药物共同包载于所述聚乳酸-多肽胶束中。
4.根据权利要求2所述的纳米药物，其特征在于，所述纳米药物的粒径为150～250nm。
5.根据权利要求2所述的纳米药物，其特征在于，所述纳米药物的电位为10～35mV。
6.根据权利要求2所述的纳米药物，其特征在于，所述纳米药物还包括药学上接受的载体和/或赋形剂。
7.根据权利要求1所述的聚乳酸-多肽胶束在制备肿瘤治疗药物中的载体的应用。
8.根据权利要求2-6中任一项所述的纳米药物在制备肿瘤治疗药物中的应用。
9.根据权利要求7或8所述的应用，其特征在于，所述肿瘤包括黑色素瘤。
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