CN108714151B - 一种两性霉素b抗真菌纳米药物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种两性霉素B抗真菌纳米药物，包括：两性霉素B和担载两性霉素B的载体；所述载体具有式(Ⅰ)所示结构。本发明中的载体和两性霉素B之间有静电作用、共轭作用和疏水作用三种作用协同发挥，因此形成的纳米药物粒子更稳定，释放速度更慢，更有利于到达感染区，而不是释放出游离两性霉素B经由肾脏排出体外，从而提高了药物的耐受性。同时，本发明的载体和药物体系相对于两性霉素B大大降低了毒性，因此，本发明的两性霉素B抗真菌纳米药物的毒副作用较小，治疗效果较优。

Description

一种两性霉素B抗真菌纳米药物及其制备方法

技术领域

本发明涉及抗真菌药物制备技术领域，尤其涉及一种两性霉素B抗真菌纳米药物及其制备方法。

背景技术

两性霉素B(Amphotericin B，AmB)为多烯类抗真菌药物。对其敏感的真菌有新型隐球菌、皮炎芽生菌、组织胞浆菌、球孢子菌属、孢子丝菌属、念珠菌属等，部分曲菌属对本品耐药，皮肤和毛发癣菌则大多耐药。两性霉素B对细菌、立克次体、病毒等无抗微生物活性。常用治疗量所达到的药物浓度对真菌仅具抑菌作用。

两性霉素B是治疗危重深部真菌感染的唯一有效药物，但其毒性大，不良反应多见。两性霉素B可造成肾功能损害，肝功能损害，血尿素氮或血肌酐明显升高，可有发热、寒战、头痛、食欲不振、恶心、呕吐等反应，静脉用药可引起血栓性静脉炎，鞘内注射可引起背部及下肢疼痛。同时，两性霉素B对肾脏有损害作用，可致蛋白尿、管型尿，白细胞下降、贫血、血压下降或升高、肝损害、复视、周围神经炎、皮疹等反应。试用期间可出现心率加快，甚至心室颤动。

为了解决上述技术问题，研究者提出了一些应对的方案。由于两性霉素B是一种在水中很难溶解的药物，难溶性超过了阿霉素，因而，获得有效的可以降低毒性而又不影响药效的方案所需的技术难度更大。目前市场上的一种方法是酸化处理增加溶解性，但是酸化处理之后，药效会降低。另一种方法是用脂质体担载，这种方法由于没有酸化，因此具有比较好的溶解性和药效，但是脂质体和两性霉素形成的粒子稳定性不够，会导致释放较快，最终测试后的毒副作用并不令人满意，治疗效果也有待于提高。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种两性霉素B抗真菌纳米药物及其制备方法，本发明制备的两性霉素B抗真菌纳米药物的毒副作用较小，治疗效果较优。

本发明提供了一种两性霉素B抗真菌纳米药物，包括：两性霉素B和担载两性霉素B的载体；

所述载体具有式(Ⅰ)所示结构：

其中，R₁独立地选自氢、糖残基、巯基、醛基、羟基、羧基、氨基、烷基、取代烷基、烯基、炔基和短肽中的一种；

R₂独立地选自-NH-或-R₅(CH₂)_rNH-，R₅为-O-、-OCONH-、-OCO-、-NHCOO-或-NHCO-，1≤r≤10；

R₃独立地选自氢或者阳离子；

R₄独立地选自氢或疏水基团；

20≤m≤500，5≤nl≤200，5≤n2≤200。

优选的，所述R₁独立地选自氢、碳原子数为1～40的烷基、巯基、糖残基、醛基、羧基、乙烯基、炔基、丁二酰亚胺、马来酰亚胺、RGD类短肽、LHRH类短肽和叶酸取代的烷基中的一种。

优选的，所述R₃为氢、金属阳离子或有机阳离子，所述金属阳离子为钠、钾、钙或镁；所述有机阳离子为胺的阳离子；

所述R₄独立地选自氢、碳原子数为4～20的烷基、苯甲基、胆固醇基、胆酸基和脱氧胆酸基中的一种。

本发明还提供了一种两性霉素B抗真菌纳米药物的制备方法，包括以下步骤：

将两性霉素B、具有式(Ⅰ)所示结构的载体与有机溶剂混合均匀，得到的混合溶液在水性介质中进行反应，得到两性霉素B抗真菌纳米药物；

其中，R₁独立地选自氢、糖残基、巯基、醛基、羟基、羧基、氨基、烷基、取代烷基、烯基、炔基和短肽中的一种；

R₂独立地选自-NH-或-R₅(CH₂)_rNH-，R₅为-O-、-OCONH-、-OCO-、-NHCOO-或-NHCO-，1≤r≤10；

R₃独立地选自氢或者阳离子；

R₄独立地选自氢或疏水基团；

20≤m≤500，5≤nl≤200，5≤n2≤200。

优选的，所述混合均匀具体为：

A)将两性霉素B与有机溶剂混合均匀，得到两性霉素B的有机溶液；

B)将具有式(Ⅰ)所示结构的载体与有机溶剂混合均匀，得到具有式(Ⅰ)所示结构的载体的有机溶液；

C)将两性霉素B的有机溶液滴入具有式(Ⅰ)所示结构的载体的有机溶液中，混匀；

步骤A)和步骤B)并无顺序限制；

步骤A)、步骤B)和步骤C)均在避光条件下进行。

优选的，所述反应的温度为15～50℃，所述反应的时间为2～72h。

优选的，所述反应后，还包括：避光透析和冻干。

优选的，所述两性霉素B和具有式(Ⅰ)所示结构的载体的质量比为1～20：80～99。

优选的，所述R₁独立地选自氢、碳原子数为1～40的烷基、巯基、糖残基、醛基、羧基、乙烯基、炔基、丁二酰亚胺、马来酰亚胺、RGD类短肽、LHRH类短肽和叶酸取代的烷基中的一种；

所述R₃为氢、金属阳离子或有机阳离子，所述金属阳离子为钠、钾、钙或镁；所述有机阳离子为胺的阳离子；

所述R₄独立地选自氢、碳原子数为4～20的烷基、苯甲基、胆固醇基、胆酸基和脱氧胆酸基中的一种。

优选的，步骤A)中的有机溶剂和步骤B)中的有机溶剂均为二甲基亚砜。

本发明提供了一种两性霉素B抗真菌纳米药物，包括：两性霉素B和担载两性霉素B的载体；

所述载体具有式(Ⅰ)所示结构：

其中，R₁独立地选自氢、糖残基、巯基、醛基、羟基、羧基、氨基、烷基、取代烷基、烯基、炔基和短肽中的一种；

R₂独立地选自-NH-或-R₅(CH₂)_rNH-，R₅为-O-、-OCONH-、-OCO-、-NHCOO-或-NHCO-，1≤r≤10；

R₃独立地选自氢或者阳离子；

R₄独立地选自氢或疏水基团；

20≤m≤500，5≤nl≤200，5≤n2≤200。

本发明中的载体和两性霉素B之间有静电作用、共轭作用和疏水作用三种作用协同发挥，因此形成的纳米药物粒子更稳定，释放速度更慢，更有利于到达感染区，而不是释放出游离两性霉素B经由肾脏排出体外，从而提高了药物的耐受性。同时，本发明的载体和药物体系相对于两性霉素B大大降低了毒性，因此，本发明的两性霉素B抗真菌纳米药物的毒副作用较小，治疗效果较优。

实验结果表明，本发明提供的两性霉素B抗真菌纳米药物在48小时会释放50％左右的药物，释放速度更慢，更有利于到达感染区，而不是释放出游离两性霉素B经由肾脏排出体外。通过溶血实验可知，本发明的两性霉素B抗真菌纳米药物致溶血性更低，更不容易导致溶血，更不会去破坏红细胞。

附图说明

图1为两性霉素B抗真菌纳米药物3的粒径谱图；

图2为式(Ⅰ-a)所示结构的载体、两性霉素B抗真菌纳米药物3的电位谱图；

图3为两性霉素B、两性霉素B抗真菌纳米药物3的释放谱图；

图4为两性霉素B、两性霉素B抗真菌纳米药物3的致溶血性随药物浓度变化谱图；

图5为两性霉素B、两性霉素B抗真菌纳米药物3的致溶血性随时间变化谱图；

图6为BALB/c小鼠分别注射两性霉素B抗真菌纳米药物3和两性霉素B后血液中肌酐和尿素氮浓度变化的对比谱图；

图7为昆明小鼠分别注射两性霉素B抗真菌纳米药物3和两性霉素B后小鼠生存和体重变化谱图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明提供了一种两性霉素B抗真菌纳米药物，包括：两性霉素B和担载两性霉素B的载体；

所述载体具有式(Ⅰ)所示结构：

其中，R₁独立地选自氢、糖残基、巯基、醛基、羟基、羧基、氨基、烷基、取代烷基、烯基、炔基和短肽中的一种；

R₂独立地选自-NH-或-R₅(CH₂)_rNH-，R₅为-O-、-OCONH-、-OCO-、-NHCOO-或-NHCO-，1≤r≤10；

R₃独立地选自氢或者阳离子；

R₄独立地选自氢或疏水基团；

20≤m≤500，5≤nl≤200，5≤n2≤200。

在本发明中，R₁优选为氢、碳原子数为1～40的烷基、巯基、糖残基、醛基、羧基、乙烯基、炔基、丁二酰亚胺、马来酰亚胺、RGD类短肽、LHRH类短肽和叶酸取代的烷基中的一种；更优选为氢、碳原子数为1～40的烷基、巯基、糖残基、醛基、羧基、乙烯基、丙炔基、丁二酰亚胺、马来酰亚胺、RGD、LHRH和叶酸取代的乙烷基中的一种。

R₃优选为氢、金属阳离子或有机阳离子，所述金属阳离子优选为钠、钾、钙或镁；所述有机阳离子优选为胺的阳离子。

所述R₄优选为氢、碳原子数为4～20的烷基、苯甲基、胆固醇基、胆酸基和脱氧胆酸基中的一种。

上述式(Ⅰ)所述的聚(乙二醇)-b-聚(L-谷氨酸-co-L-苯丙氨酸)嵌段共聚物，若以聚乙二醇单元为A单元，聚(L-谷氨酸)单元为B单元，聚(L-苯丙氨酸)单元为C单元，则所述嵌段共聚物为A(BC)或(CB)A(BC)嵌段构型的嵌段共聚物。

m为乙二醇的聚合度，20≤m≤500，优选为40≤m≤250；nl为谷氨酸聚合度，5≤nl≤200，优选为10≤n1≤100；n2为苯丙氨酸聚合度，5≤n2≤200，优选为10≤n2≤50。

在本发明的某些实施例中，所述具有式(Ⅰ)所示结构的载体中，R₁为甲基，R₂为-NH-，R₃为氢，R₄为氢，此时，所述载体具有式(Ⅰ-a)所示结构：

在本发明的某些实施例中，所述具有式(Ⅰ-a)所示结构的载体中，m＝113，n1＝20，n2＝10。

在本发明的某些实施例中，所述两性霉素B具有式(Ⅱ)所示结构：

在本发明中，所述两性霉素B和具有式(Ⅰ)所示结构的载体的质量比优选为1～20：80～99。在本发明的某些实施例中，所述两性霉素B和具有式(Ⅰ)所示结构的载体的质量比为5：95、10：90、15：85、20：30。

本发明中的载体和两性霉素B之间有静电作用、共轭作用和疏水作用三种作用协同发挥，因此形成的纳米药物粒子更稳定，释放速度更慢，更有利于到达感染区，而不是释放出游离两性霉素B经由肾脏排出体外，从而提高了药物的耐受性。同时，本发明的载体和药物体系相对于两性霉素B大大降低了毒性，因此，本发明的两性霉素B抗真菌纳米药物的毒副作用较小，治疗效果较优。

本发明还提供了一种两性霉素B抗真菌纳米药物的制备方法，包括以下步骤：

将两性霉素B、具有式(Ⅰ)所示结构的载体与有机溶剂混合均匀，得到的混合溶液在水性介质中进行反应，得到两性霉素B抗真菌纳米药物；

其中，R₁独立地选自氢、糖残基、巯基、醛基、羟基、羧基、氨基、烷基、取代烷基、烯基、炔基和短肽中的一种；

R₂独立地选自-NH-或-R₅(CH₂)_rNH-，R₅为-O-、-OCONH-、-OCO-、-NHCOO-或-NHCO-，1≤r≤10；

R₃独立地选自氢或者阳离子；

R₄独立地选自氢或疏水基团；

20≤m≤500，5≤nl≤200，5≤n2≤200。

所述混合均匀优选为：

A)将两性霉素B与有机溶剂混合均匀，得到两性霉素B的有机溶液；

B)将具有式(Ⅰ)所示结构的载体与有机溶剂混合均匀，得到具有式(Ⅰ)所示结构的载体的有机溶液；

C)将两性霉素B的有机溶液滴入具有式(Ⅰ)所示结构的载体的有机溶液中，混匀；

步骤A)和步骤B)并无顺序限制；

步骤A)、步骤B)和步骤C)均在避光条件下进行。

步骤A)优选为：将两性霉素B加入有机溶剂中，混合均匀后，得到两性霉素B的有机溶液。

所述有极溶剂优选为二甲基亚砜。

本发明对所述两性霉素B与有机溶剂的配比并无特殊的限制，能够将两性霉素B完全溶解即可。在本发明的某些实施例中，所述两性霉素B与有机溶剂的配比为0.5mg：1mL、1.0mg：1mL、1.5mg：1mL或4.0mg：1mL。

步骤B)优选为：将具有式(Ⅰ)所示结构的载体加入有机溶剂中，混合均匀后，得到具有式(Ⅰ)所示结构的载体的有机溶液。

所述有极溶剂优选为二甲基亚砜。

本发明对所述具有式(Ⅰ)所示结构的载体与有机溶剂的配比并无特殊的限制，能够将具有式(Ⅰ)所示结构的载体完全溶解即可。在本发明的某些实施例中，所述具有式(Ⅰ)所示结构的载体与有机溶剂的配比为9.5mg：1mL、9.0mg：1mL、8.5mg：1mL或6.0mg：1mL。

所述两性霉素B和具有式(Ⅰ)所示结构的载体的质量比优选为1～20：80～99。在本发明的某些实施例中，所述两性霉素B和具有式(Ⅰ)所示结构的载体的质量比为5：95、10：90、15：85、20：30。

然后，将两性霉素B的有机溶液滴入具有式(Ⅰ)所示结构的载体的有机溶液中，混匀，得到混合溶液。

所述滴入的时间优选为10～50min。在本发明的某些实施例中，所述滴入的时间为30min。

得到的混合溶液在水性介质中进行反应，从而实现药物的担载，得到两性霉素B抗真菌纳米药物。

优选的，得到的混合溶液在水性介质中进行反应具体为：

在避光的条件下，将得到的混合溶液滴入水性介质中，进行反应。

所述水性介质优选为水、生理盐水、葡萄糖注射液、缓冲溶液、组织培养液或体液。所述水优选为去离子水。本发明对所述水性介质的用量并无特殊的限制，可以根据实际情况进行选择。在本发明的某些实施例中，所述水性介质与所述两性霉素的用量比为10mL：0.5mg、10mL：1.0mg、10mL：1.5mg或10mL：4.0mg。

所述滴入优选在超声、冰浴条件下进行。所述滴入的时间优选为1～5min。在本发明的某些实施例中，所述滴入的时间为2min。本发明对所述超声的功率并无特殊的限制，采用本领域技术人员熟知的超声功率即可。在本发明的某些实施例中，所述超声的功率为300W。本发明对所述冰浴的温度并无特殊的限制，采用本领域技术人员熟知的冰浴的温度即可。在本发明的某些实施例中，所述冰浴的温度为0℃。

所述反应的温度优选为15～50℃。在本发明的某些实施例中，所述反应的温度为25℃。所述反应的时间优选为2～72h；更优选为2～24h。在本发明的某些实施例中，所述反应的时间为24h。

所述反应完成后，优选还包括：避光透析和冻干。本发明对所述避光透析的方法并无特殊的限制，采用本领域技术人员熟知的避光透析的方法即可。所述避光透析的时间优选为24～72h，更优选为48～72h。所述避光透析中，换水的次数优选为6～10次。

本发明对所述冻干的方法并无特殊的限制，采用本领域技术人员熟知的冻干的方法即可。本发明优选为液氮速冻，在冻干过程中可加入少量冻干保护剂。所述冻干保护剂优选为寡糖中的一种或几种。在本发明的某些实施例中，所述冻干保护剂为甘露醇。

上述两性霉素B抗真菌纳米药物的制备方法简单易行，非常适合大规模推广。

本发明对上述所采用的原料组份的来源并无特殊的限制，可以为一般市售。

本发明提供了一种两性霉素B抗真菌纳米药物，包括：两性霉素B和担载两性霉素B的载体；

所述载体具有式(Ⅰ)所示结构：

其中，R₁独立地选自氢、糖残基、巯基、醛基、羟基、羧基、氨基、烷基、取代烷基、烯基、炔基和短肽中的一种；

R₂独立地选自-NH-或-R₅(CH₂)_rNH-，R₅为-O-、-OCONH-、-OCO-、-NHCOO-或-NHCO-，1≤r≤10；

R₃独立地选自氢或者阳离子；

R₄独立地选自氢或疏水基团；

20≤m≤500，5≤nl≤200，5≤n2≤200。

本发明中的载体和两性霉素B之间有静电作用、共轭作用和疏水作用三种作用协同发挥，因此形成的纳米药物粒子更稳定，释放速度更慢，更有利于到达感染区，而不是释放出游离两性霉素B经由肾脏排出体外，从而提高了药物的耐受性。同时，本发明的载体和药物体系相对于两性霉素B大大降低了毒性，因此，本发明的两性霉素B抗真菌纳米药物的毒副作用较小，治疗效果较优。

实验结果表明，本发明提供的两性霉素B抗真菌纳米药物在48小时会释放50％左右的药物，释放速度更慢，更有利于到达感染区，而不是释放出游离两性霉素B经由肾脏排出体外。通过溶血实验可知，本发明的两性霉素B抗真菌纳米药物致溶血性更低，更不容易导致溶血，更不会去破坏红细胞。

为了进一步说明本发明，以下结合实施例对本发明提供的一种两性霉素B抗真菌纳米药物及其制备方法进行详细描述，但不能将其理解为对本发明保护范围的限定。

实验药物：两性霉素B购自上海源叶生物科技有限公司，其他试剂均为一般市售。

实验动物：BALB/c雌性小鼠(鼠龄为6～8周)，平均体重为16g，均由中国科学院实验动物中心(上海)提供；昆明小鼠(雌性、鼠龄约为7周)，平均体重为18g，均由吉林大学实验动物中心(长春)提供。兔子由吉林大学实验动物中心(长春)提供，兔子眼球血由实验人员现用现取。

实验仪器：十八角光散射仪(美国怀雅特技术公司)、电位仪(美国布鲁克海文仪器公司)、紫外-可见光光谱仪(珀金埃尔默企业管理(上海)有限公司)、酶标仪(美国伯乐生命医学产品(上海)有限公司)、生物医学分析仪(HITACHI-SOP-7180、株式会社日立制作所)。

实施例1

避光条件下将两性霉素B(0.5mg)、式(Ⅰ-a)所示结构的载体(9.5mg)分别加入装有1mL二甲基亚砜的干燥烧杯中。充分溶解后，将装有两性霉素B的二甲基亚砜溶液用30min滴入装有纳米载体的二甲基亚砜溶液中。混合完毕后，再将混合溶液在超声(功率300W)、冰浴条件(0℃)下用2min时间滴入10mL去离子水中，在25℃下反应24h，得到的混合溶液透析48h，期间换水6次，然后，采用液氮速冻进行冻干，用到的冻干保护剂为甘露醇，得到两性霉素B抗真菌纳米药物1。所述具有式(Ⅰ-a)所示结构的载体中，m＝113，n1＝20，n2＝10。

对所述两性霉素B抗真菌纳米药物1进行紫外光谱测试，计算得到两性霉素B载药量为4.8％，反应担载效率为96.0％。

实施例2

避光条件下将两性霉素B(1.0mg)、式(Ⅰ-a)所示结构的载体(9.0mg)分别加入装有1mL二甲基亚砜的干燥烧杯中。充分溶解后，将装有两性霉素B的二甲基亚砜溶液用30min滴入装有纳米载体的二甲基亚砜溶液中。混合完毕后，再将混合溶液在超声(功率300W)、冰浴条件(0℃)下用2min时间滴入10mL去离子水中，在25℃下反应24h，得到的混合溶液透析48h，期间换水6次，然后，采用液氮速冻进行冻干，用到的冻干保护剂为甘露醇，得到两性霉素B抗真菌纳米药物2。所述具有式(Ⅰ-a)所示结构的载体中，m＝113，n1＝20，n2＝10。

对所述两性霉素B抗真菌纳米药物2进行紫外光谱测试，计算得到两性霉素B载药量为9.4％，反应担载效率为94.0％。

实施例3

避光条件下将两性霉素B(1.5mg)、式(Ⅰ-a)所示结构的载体(8.5mg)分别加入装有1mL二甲基亚砜的干燥烧杯中。充分溶解后，将装有两性霉素B的二甲基亚砜溶液用30min滴入装有纳米载体的二甲基亚砜溶液中。混合完毕后，再将混合溶液在超声(功率300W)、冰浴条件(0℃)下用2min时间滴入10mL去离子水中，在25℃下反应24h，得到的混合溶液透析48h，期间换水6次，然后，采用液氮速冻进行冻干，用到的冻干保护剂为甘露醇，得到两性霉素B抗真菌纳米药物3。所述具有式(Ⅰ-a)所示结构的载体中，m＝113，n1＝20，n2＝10。

对所述两性霉素B抗真菌纳米药物3进行紫外光谱测试，计算得到两性霉素B载药量为14.0％，反应担载效率为93.3％。

实施例4

避光条件下将两性霉素B(4.0mg)、式(Ⅰ-a)所示结构的载体(6.0mg)分别加入装有1mL二甲基亚砜的干燥烧杯中。充分溶解后，将装有两性霉素B的二甲基亚砜溶液用30min滴入装有纳米载体的二甲基亚砜溶液中。混合完毕后，再将混合溶液在超声(功率300W)、冰浴条件(0℃)下用2min时间滴入10mL去离子水中，在25℃下反应24h，得到的混合溶液透析48h，期间换水6次，然后，采用液氮速冻进行冻干，用到的冻干保护剂为甘露醇，得到两性霉素B抗真菌纳米药物4。所述具有式(Ⅰ-a)所示结构的载体中，m＝113，n1＝20，n2＝10。

对所述两性霉素B抗真菌纳米药物4进行紫外光谱测试，计算得到两性霉素B载药量为18.7％，反应担载效率为46.7％。

比较例1

避光条件下将阿霉素(0.5mg)、式(Ⅰ-a)所示结构的载体(9.5mg)分别加入装有1mL二甲基亚砜的干燥烧杯中。充分溶解后，将装有阿霉素的二甲基亚砜溶液用30min滴入装有纳米载体的二甲基亚砜溶液中。混合完毕后，再将混合溶液在超声(功率300W)、冰浴条件(0℃)下用2min时间滴入10mL去离子水中，在25℃下反应24h，得到的混合溶液透析48h，期间换水6次，然后，采用液氮速冻进行冻干，用到的冻干保护剂为甘露醇，得到阿霉素复合物1。

对所述阿霉素复合物1进行紫外光谱测试，计算得到阿霉素载药量为0.7％，反应担载效率为14％。

比较例2

避光条件下将阿霉素(1.5mg)、式(Ⅰ-a)所示结构的载体(8.5mg)分别加入装有1mL二甲基亚砜的干燥烧杯中。充分溶解后，将装有阿霉素的二甲基亚砜溶液用30min滴入装有纳米载体的二甲基亚砜溶液中。混合完毕后，再将混合溶液在超声(功率300W)、冰浴条件(0℃)下用2min时间滴入10mL去离子水中，在25℃下反应24h，得到的混合溶液透析48h，期间换水6次，然后，采用液氮速冻进行冻干，用到的冻干保护剂为甘露醇，得到阿霉素复合物2。

对所述阿霉素复合物2进行紫外光谱测试，计算得到阿霉素载药量为1.37％，反应担载效率为9.13％。

通过上述实施例和比较例的对比可知，采用本发明的制备方法得到的两性霉素B的载药量和反应担载效率均远远高于阿霉素的载药量和反应担载效率。

实施例5

将两性霉素B抗真菌纳米药物3配成0.1mg/mL、5mL的水溶液，使用十八角光散射仪测试粒径，测试结果如图1所示。图1为两性霉素B抗真菌纳米药物3的粒径谱图。

从图1可以看出：两性霉素B抗真菌纳米药物3在磷酸缓冲液(pH＝7.4)中粒径为33.2±31.3(nm)，两性霉素B抗真菌纳米药物3在血浆中粒径为38.8±35.4(nm)。显然，两性霉素B抗真菌纳米药物3在磷酸缓冲液(pH＝7.4)中和在血浆中粒径相近。

实施例6

将式(Ⅰ-a)所示结构的载体、两性霉素B抗真菌纳米药物1、2、3分别溶解于0.1mg/mL、2mL的磷酸缓冲溶液(pH＝7.4)，电位仪测试电位，测试结果如图2所示。图2为式(Ⅰ-a)所示结构的载体、两性霉素B抗真菌纳米药物3的电位谱图。

从图2以及测试结果得出，式(Ⅰ-a)所示结构的载体电位为-11.18±3.68mV，两性霉素B抗真菌纳米药物1为-3.23±2.88mV，两性霉素B抗真菌纳米药物2为-0.58±2.48mV，两性霉素B抗真菌纳米药物3为-3.94±2.72mV。因此，可知载体担载两性霉素B之后电位值趋近0。

实施例7

将两性霉素B、两性霉素B抗真菌纳米药物3(1.00mg/L，2.00mL)分别溶解于磷酸缓冲溶液(pH＝7.4)中，将混合溶液装于7kDa的透析袋中，将透析袋放在含有1wt％吐温80的20mL磷酸缓冲溶液(pH＝7.4)，放置在100rpm转速下在震荡箱中，在不同时间点分别收集2mL释放液，并用紫外-可见光光谱仪测试。图3为两性霉素B、两性霉素B抗真菌纳米药物3的释放谱图。

通过图3以及测试得出，12h时，两性霉素B释放百分比为100％，两性霉素B抗真菌纳米药物3释放百分比分别为11.3±3.6％；24h时，两性霉素B释放百分比为100％，两性霉素B抗真菌纳米药物3释放百分比分别为22.6±4.5％；48h时，两性霉素B释放百分比为100％，两性霉素B抗真菌纳米药物3释放百分比分别为42.6±3.7％；120h时，两性霉素B释放百分比为100％，两性霉素B抗真菌纳米药物3释放百分比分别为63.0±9.2％。可以得出，两性霉素B抗真菌纳米药物3释放速度较慢。

实施例8

将两性霉素B、两性霉素B抗真菌纳米药物3按照不同药物浓度(25mg/L、12.5mg/L、6.25mg/L、3.125mg/L、1.5625mg/L)分别加入从兔子眼球血中离心分离出的兔红细胞rRBC悬浮液中，然后将样品离心并转移至96孔板。在预定时间点(1h、2h、4h和6h)使用酶标仪在576nm处读取释放的游离血红蛋白的吸光度。用磷酸缓冲溶液(pH＝7.4)处理的rRBC作阴性对照，而用1％Triton-X处理的rRBC用作阳性对照。基于以下公式计算致溶血性：

致溶血性(％)＝[(处理样品的吸光度-阴性对照的吸光度)/(阳性对照的吸光度-阴性对照的吸光度)]×100％。

计算结果如图4和图5所示。图4为两性霉素B、两性霉素B抗真菌纳米药物3的致溶血性随药物浓度变化谱图，其中，检测时间点为2h。图5为两性霉素B、两性霉素B抗真菌纳米药物3的致溶血性随时间变化谱图，其中，药物浓度为25mg/L。

从图4、图5可以看出，不同浓度的两性霉素B抗真菌纳米药物3在2h对应的致溶血性小于20％，不同浓度的两性霉素B在2h对应的致溶血性甚至可以超过80％；不同时间的两性霉素B抗真菌纳米药物3在药物浓度为25mg/L的致溶血性小于25％；不同时间的两性霉素B在药物浓度为12.5mg/L的致溶血性可超过60％。

实施例9

将健康的BALB/c小鼠(雌性，6-8周)随机分成5组，每组4只小鼠。连续3天通过尾静脉以0.26mg/kg或0.8mg/kg的剂量连续注射两性霉素B抗真菌纳米药物3或游离两性霉素B(磷酸缓冲液，pH＝7.4)。最后一次注射后两天，从小鼠眼球取出1.0mL血液样品，用生物医学分析仪(HITACHI-SOP-7180)测试数据，测试结果如图6所示。图6为BALB/c小鼠分别注射两性霉素B抗真菌纳米药物3和两性霉素B后血液中肌酐和尿素氮浓度变化的对比谱图。

图6中的图a为BALB/c小鼠分别注射两性霉素B抗真菌纳米药物3和两性霉素B后血液中肌酐浓度变化的对比谱图。图6中的图b为BALB/c小鼠分别注射两性霉素B抗真菌纳米药物3和两性霉素B后血液中尿素氮浓度变化的对比谱图。从图6可以看出，担载后两性霉素B对血液中肌酐影响减小，因此，肾毒性较低。

实施例10

将昆明小鼠随机分为6组(每组10只，平均体重18g，7周龄，雌性)，不同剂量两性霉素B(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mg/kg)和两性霉素B抗真菌纳米药物3(基于AmB为1.5、2、2.5、3、3.5、4mg/kg)。记录小鼠的体重和死亡。最大耐受剂量不应使动物体重减少超过对照组的20％，并且不会导致死亡。结果如图7所示。图7为昆明小鼠分别注射两性霉素B抗真菌纳米药物3和两性霉素B后小鼠生存和体重变化谱图。

图7为昆明小鼠分别注射两性霉素B抗真菌纳米药物3和两性霉素B后小鼠生存变化谱图以及昆明小鼠分别注射两性霉素B抗真菌纳米药物3和两性霉素B后小鼠体重变化谱图。

经计算两性霉素B最大耐受剂量为0.8mg/kg，两性霉素B抗真菌纳米药物3最大耐受剂量为3mg/kg。显然，注射两性霉素B抗真菌纳米药物3相比于注射两性霉素B，最大耐受剂量得到了明显的提高。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (7)

1.一种两性霉素B抗真菌纳米药物，包括：两性霉素B和担载两性霉素B的载体；

所述载体具有式（Ⅰ）所示结构：

（Ⅰ）；

其中，R₁为甲基，R₂为-NH-，R₃为氢，R₄为氢；

20≤m≤500，5≤nl≤200，5≤n2≤200。

2.一种两性霉素B抗真菌纳米药物的制备方法，包括以下步骤：

将两性霉素B、具有式（Ⅰ）所示结构的载体与有机溶剂混合均匀，得到的混合溶液在水性介质中进行反应，得到两性霉素B抗真菌纳米药物；

（Ⅰ）；

其中，R₁为甲基，R₂为-NH-，R₃为氢，R₄为氢；

20≤m≤500，5≤nl≤200，5≤n2≤200。

3.根据权利要求2所述的两性霉素B抗真菌纳米药物的制备方法，其特征在于，所述混合均匀具体为：

A）将两性霉素B与有机溶剂混合均匀，得到两性霉素B的有机溶液；

B）将具有式（Ⅰ）所示结构的载体与有机溶剂混合均匀，得到具有式（Ⅰ）所示结构的载体的有机溶液；

C）将两性霉素B的有机溶液滴入具有式（Ⅰ）所示结构的载体的有机溶液中，混匀；

步骤A）和步骤 B）并无顺序限制；

步骤A）、步骤B）和步骤C）均在避光条件下进行。

4.根据权利要求2所述的两性霉素B抗真菌纳米药物的制备方法，其特征在于，所述反应的温度为15~50℃，所述反应的时间为2~72h。

5.根据权利要求2所述的两性霉素B抗真菌纳米药物的制备方法，其特征在于，所述反应后，还包括：避光透析和冻干。

6.根据权利要求2所述的两性霉素B抗真菌纳米药物的制备方法，其特征在于，所述两性霉素B和具有式（Ⅰ）所示结构的载体的质量比为1~20：80~99。

7.根据权利要求3所述的两性霉素B抗真菌纳米药物的制备方法，其特征在于，步骤A）中的有机溶剂和步骤B）中的有机溶剂均为二甲基亚砜。

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