CN110201176A - 一种多级缓释载药纳米短纤维的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种多级缓释载药纳米短纤维的制备方法，包括将负载了抗癌药物阿霉素(DOX)的层状双氢氧化物(LDH)与P‑gp抑制剂α‑生育酚琥珀酸酯(α‑TOS)共同混合在聚乳酸‑羟基乙酸共聚物(PLGA)纺丝液中进行静电纺丝，并进行均质处理。本发明以有机无机双载体构建了双载药的多级缓释载药纳米短纤维，材料中的抗癌药物和P‑gp抑制剂可在肿瘤微酸环境中多级释放，用于克服癌细胞的多药耐药性，双载体纳米纤维延长了药物的释放路径，实现了抗癌药物的长效缓释，为耐药肿瘤长期有效的治疗提供了新方法。

Description

一种多级缓释载药纳米短纤维的制备方法
技术领域
本发明属于药物载体领域，特别涉及一种多级缓释载药纳米短纤维的制备方法。
背景技术
癌症是导致死亡的主要原因之一，世界卫生组织(WHO)估计在2030年将有1313万人的死亡与癌症有关。目前，癌症的治疗方案主要有外科手术、化学治疗、放射疗法以及这些方法的组合。化学治疗作为最常用的治疗手段之一，主要通过干扰DNA合成和有丝分裂，导致快速生长和分裂的癌细胞死亡。许多原发性肿瘤和转移性病变在化学治疗初期效果良好，但肿瘤通常复发并产生耐药性。耐药性主要体现在癌细胞对治疗的不敏感，这是导致抗肿瘤化疗失败的关键因素。因为这些肿瘤细胞膜表面往往有较高的P-糖蛋白(P-gp)表达水平，从而导致药物从与P-gp关联的癌细胞膜表面泵出。因此构建可以长期缓释的能抑制P-gp表达水平的药物和化疗药物共递送体系是目前克服多药耐药研究的重点。
目前大多使用联合治疗来抑制耐药性，即通过抗癌药物与P-gp抑制剂结合进行治疗。通过实验研究证明，P-gp抑制剂的加入可以有效的降低肿瘤细胞的多药耐药性，其中α-生育酚琥珀酸酯(α-TOS)作为P-gp抑制剂，不仅可以抑制P-gp的活性还能诱导肿瘤细胞凋亡。然而，直接给药存在药物突释、需要多次给药等问题，因此需要设计合适的药物递送体系进行药物输送。
近二十年来，纳米技术的出现对纳米药物体系产生了深远的影响。研究较多的药物递送体系有：聚合物胶束、树状大分子、脂质体、碳纳米管、磁性纳米颗粒(如铁的氧化物)、二氧化硅纳米颗粒、静电纺丝纳米纤维、层状双氢氧化物(LDH)等。有许多研究工作利用不同的纳米载体负载抗肿瘤药物或P-gp抑制剂和抗肿瘤药物的组合来解决耐药性问题，但是这些载体不能实现P-gp抑制剂和抗癌药物的分级释放，且存在药物突释问题，因此不能较好的规避对健康组织的损伤。
通过查阅文献发现LDH生物相容性良好、载药率高，具有阴离子交换能力，可以进行药物控释，因此可以作为优良的药物载体。使用LDH作为单一药物载体仍然存在不能实现P-gp抑制剂和抗癌药物的分级释放。需要设计双载体载药来解决这个问题。静电纺丝纳米纤维生物相容性良好，且易于合成和进行结构修饰，具有极大的比表面积和高孔隙率以及高柔韧性。根据文献报道，通过静电纺丝技术制造的用于透皮和药物递送应用的纳米纤维能够作为药物储存器，以持续少量的方式释放药物，实现药物长期缓释，降低药物突释对正常细胞的毒副作用。通过查阅文献，发现可以将无机载体与静电纺丝纳米纤维结合起来作为纳米药物载体，提供有机无机双药物释放路径，来解决P-gp抑制剂和抗癌药物不能分级释放的问题。然而，静电纺纳米纤维通常以膜的形式使用，只能以手术植入或者外敷给药，容易对患者造成二次伤害或降低药物的利用率。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种多级缓释载药纳米短纤维的制备方法，该短纤维可以实现抗癌药物和P-gp抑制剂的多级释放，并且有机无机双载体的药物释放路径可以有效减缓药物的释放速率。
本发明提供了一种多级缓释载药纳米短纤维的制备方法，包括：
(1)将阿霉素DOX与层状双氢氧化物LDH按质量比1:1～3在超纯水中充分溶解后混合均匀，调节溶液pH值，离心洗涤、真空冷冻干燥得到DOX@LDH纳米颗粒；
(2)将DOX@LDH纳米颗粒、α-生育酚琥珀酸酯α-TOS按质量比2:1～3:2加入PLGA纺丝液中，搅拌得到DOX@LDH/α-TOS/PLGA纺丝液，静电纺丝得到DOX@LDH/α-TOS/PLGA纤维膜；
(3)将上述纤维膜剪碎，浸泡在PVA水溶液中，之后进行均质处理，离心洗涤、真空冷冻干燥得到DOX@LDH/α-TOS/PLGA短纤维，即多级缓释载药纳米短纤维。
所述步骤(1)中的层状双氢氧化物LDH的制备步骤如下：
将Mg(NO3)2·6H2O和Al(NO3)3·9H2O按摩尔比1:1～3分别溶于超纯水中并混合均匀，充氮，调节溶液pH值，充分反应后离心洗涤、真空冷冻干燥即得。
所述Mg(NO3)2·6H2O水溶液的浓度为0.016～0.020M，Al(NO3)3·9H2O水溶液的浓度为0.032～0.040M。
所述调节溶液pH值采用1M NaOH溶液，最终溶液pH值＝9.5～9.8。
所述离心洗涤的工艺参数为：洗液为超纯水，离心速率为5500～6000rpm，离心时间为10～15min，清洗3次。
所述步骤(1)中的LDH水溶液的浓度为1～2mg/mL，DOX水溶液的浓度为2～4mg/mL。
所述步骤(1)中的调节溶液pH值采用1M NaOH溶液，最终溶液pH值＝9.5～9.8。
所述步骤(1)中的离心洗涤的工艺参数为：洗液为超纯水，离心速率为6000～6500rpm，离心时间为15～30min，清洗3次。
所述步骤(2)中的PLGA纺丝液所采用的溶剂为体积比3:1的四氢呋喃THF和N-N-二甲基甲酰胺DMF；PLGA与其溶剂的质量体积比为1g:4mL。
所述步骤(2)中的静电纺丝的工艺参数为：针头为18号，纺丝电压为20kV，流速为0.4～0.6mL/h，接收距离为10～15cm，环境温度为20～30℃，湿度为50～60％，接收装置为铺在滚轴上的铝箔纸，滚轴的转速为300～350rpm。
所述步骤(3)中的PVA水溶液的浓度为0.5～1wt％。
所述步骤(3)中的均质处理的工艺参数为：均质机转速为15000～16000rpm，均质时间为45～60min。
所述步骤(3)中的离心洗涤的工艺参数为：洗液为超纯水，离心速率为3000～4000rpm，离心时间为2～3min，清洗3次。
本发明选用具有高载药率的LDH作为一级药物载体，聚合物纳米纤维为二级药物载体，负载化疗药物DOX形成的DOX@LDH复合物，选用α-TOS作为P-gp抑制剂克服肿瘤细胞的多药耐药问题，构建了掺杂有DOX@LDH和α-TOS的PLGA双载药静电纺纳米纤维，均质处理后得到了DOX@LDH/α-TOS/PLGA短纤维。本发明的多级缓释载药纳米短纤维可用于抗癌药物和P-gp抑制剂的长期多级释放，从而可以较好的抑制耐药肿瘤细胞的生长，在多药耐药癌细胞的治疗领域有广阔的研究前景。
有益效果
(1)本发明中主体材料为静电纺纳米短纤维，材料加工工艺简单，成本低廉，具有产业化实施的前景。
(2)本发明通过在共混静电纺丝液中加入P-gp抑制剂α-TOS，可以克服癌细胞的多药耐药性。
(3)本发明以高载药率的LDH作为一级药物载体，聚合物纳米纤维为二级药物载体，可以实现DOX和α-TOS的长期多级释放，从而可以较好的抑制耐药肿瘤细胞的生长，在多药耐药癌细胞的治疗领域有广阔的研究前景。
(4)本发明通过均质处理得到可注射多级缓释载药纳米短纤维，提高抗癌药物的治疗效果。
附图说明
图1为本发明的多级缓释载药纳米短纤维的合成示意图；
图2为LDH的扫描电镜图片(a)及尺寸分布图(b)；
图3为LDH吸附DOX前后的X-射线衍射图；
图4为LDH、DOX@LDH的红外光谱图；
图5为DOX@LDH/α-TOS/PLGA短纤维的SEM图(a)以及DOX@LDH/α-TOS/PLGA短纤维长度分布图(b)；
图6为DOX@LDH/α-TOS/PLGA短纤维的TEM图(a)以及DOX@LDH/α-TOS/PLGA短纤维中DOX@LDH的高分辨TEM图(b)；
图7为α-TOS/PLGA短纤维在不同pH的磷酸盐缓冲液中α-TOS的累计释放曲线(a)以及DOX/PLGA、DOX@LDH/α-TOS/PLGA短纤维在不同pH的磷酸盐缓冲液中DOX的累计释放曲线(b)；
图8为LDH/PLGA、DOX/PLGA、DOX@LDH/α-TOS/PLGA的动态凝血实验评价；
图9为不同浓度的LDH/PLGA短纤维与MCF-7细胞(a)和MCF-7/ADR细胞(b)分别共培养24小时的细胞毒性评价；
图10为不同浓度的DOX以及DOX/PLGA、α-TOS/PLGA、DOX@LDH/α-TOS/PLGA短纤维与MCF-7(左图)及MCF-7/ADR(右图)细胞共培养24小时的细胞毒性评价；
图11为MCF-7细胞与DOX@LDH/α-TOS/PLGA短纤维共培养3小时后的激光共聚焦显微镜图片；
图12为MCF-7/ADR细胞与DOX@LDH/α-TOS/PLGA短纤维共培养3小时后的激光共聚焦显微镜图片。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
(1)将830.8mg Mg(NO3)2·6H2O和603.8mg Al(NO3)3·9H2O分别溶于50mL超纯水中，在25℃下剧烈搅拌20min使两种化合物充分溶解。将两种溶液混合均匀。充氮赶氧5次，然后在氮气环境中加入1M的NaOH溶液15mL调节溶液的pH至9.5。25℃下剧烈搅拌48h使其充分反应。收集反应后的溶液于离心管中，设置转速为6000rpm，离心时间为10min，得到的白色沉淀即为LDH。加入适量的超纯水使用涡旋震荡仪将沉淀分散均匀，进行超声洗涤，然后设置转速为6000rpm离心10min，重复操作3次，得到纯净的LDH沉淀。真空冷冻干燥得到LDH纳米颗粒。
(2)将20.3mgDOX和10.3mg步骤(1)制备的LDH分别充分溶解在10mL超纯水里，25℃下磁力搅拌1h，加入1M的NaOH调节溶液的pH至9.5，25℃下磁力搅拌24h。收集反应后的溶液于离心管中，设置转速为6000rpm，离心时间为20min得到DOX@LDH。加入适量的超纯水使用涡旋震荡仪将沉淀分散均匀，进行超声洗涤，然后设置转速为6000rpm离心20min，重复操作3次，得到纯净的DOX@LDH沉淀。真空冷冻干燥得到DOX@LDH纳米颗粒。
(3)将3mL四氢呋喃THF和1mL N-N-二甲基甲酰胺DMF混合均匀后加入1g PLGA，25℃磁力搅拌12小时得到PLGA纺丝液。将14.49mg步骤(2)制备的DOX@LDH纳米颗粒、9.56mgα-TOS加入PLGA纺丝液中，25℃下磁力搅拌8h，确保材料在纺丝液中混合均匀，得到DOX@LDH/α-TOS/PLGA纺丝液，以10mL的注射器吸取DOX@LDH/α-TOS/PLGA纺丝液，注射器接连18号针头，设置注射泵流速为0.6mL/h，接收装置为铺在滚轴上的铝箔纸，滚轴的转速为350rpm，接收距离为15cm，设置纺丝电压为20kV，在环境温度为25℃，湿度为55％条件下进行静电纺丝处理，得到DOX@LDH/α-TOS/PLGA纤维膜。
(4)将步骤(3)得到的DOX@LDH/α-TOS/PLGA纤维膜进行剪切，将得到的碎片在0.5wt％PVA分散剂中浸泡10min，使用均质机进行均质处理，设置均质转速16000rpm，处理50min，得到均质液。离心洗涤，使用蒸馏水作为洗液，设置离心转速为4000rpm离心2min，重复操作3次。真空冷冻干燥得到DOX@LDH/α-TOS/PLGA短纤维。
实施例2
本发明以扫描电子显微镜(SEM)、透射电子显微镜(TEM)、X-射线衍射(XRD)、红外光谱分析(FTIR)、紫外-分光光度计(UV-Vis)、凝血实验、细胞活力分析(CCK-8测试)、激光共聚焦显微镜表征本发明制备的LDH及多级缓释载药纳米短纤维中的形貌，短纤维的药物长期多级释放效果及短纤维在耐药癌细胞中的应用潜能。
扫描电子显微镜测试：
采用扫描电子显微镜表征实施例1步骤(1)得到的LDH和步骤(5)得到的DOX@LDH/α-TOS/PLGA短纤维。LDH的SEM结果如图2a-b所示，LDH直径为76±18.9nm，呈较为均匀的六边形或圆盘形。DOX@LDH/α-TOS/PLGA短纤维的SEM结果如图5a-b所示，DOX@LDH/α-TOS/PLGA短纤维表面光滑，长度为17.4±7.3μm。
X-射线衍射(XRD)测试：
采用XRD表征实施例1步骤(1)中制备的LDH纳米颗粒和步骤(2)制备的DOX@LDH纳米颗粒。XRD结果如图3所示，LDH负载DOX时，峰型尖锐对称，LDH的特征峰的位置003、006、012没有明显的变化，证明负载DOX不会影响LDH的晶型。观察到003峰左移，表明DOX进入LDH的层间。
红外光谱分析(FTIR)测试：
采用FTIR表征实施例1步骤(1)中制备的LDH纳米颗粒和步骤(2)制备的DOX@LDH纳米颗粒。FTIR结果如图4所示，观察到DOX的特征吸收峰即1618nm处有氨基的伸缩振动，在1408nm处有C-C键的伸缩振动，在1270nm和997nm处有C-O-C键的伸缩振动，同时可以观察到负载了DOX以后LDH在1382nm处的NO3 -的特征吸收峰消失，说明反应过程中LDH层间的NO3 -被取代。
透射电子显微镜(TEM)测试：
采用TEM表征实施例1步骤(4)得到的DOX@LDH/α-TOS/PLGA短纤维。TEM结果如图6所示，在图6(a)中可以观察到纤维的表面光滑，说明药物和无机载体的加入以及均质处理不会影响短纤维的形貌。在图6(b)中可以观察到明显的晶格结构，证明图6(a)短纤维内的黑色阴影为DOX@LDH晶体，DOX@LDH晶体被均匀的包裹在短纤维中。
实施例3
体外释放动力学测试
使用紫外-分光光度计(UV-Vis)测量在不同时间点不同pH的缓冲溶液中短纤维的药物释放量。取5mg DOX/PLGA、α-TOS/PLGA和DOX@LDH/α-TOS/PLGA短纤维分别加入1mL pH＝7.4、6.8、5.5的PBS缓冲液中超声分散均匀，装入截留分子量为5000的透析袋中，将装了材料的透析袋放进50mL的离心管中，加入9mL对应pH的PBS缓冲液，放入恒温摇床中进行药物缓释实验。前3天依次在1、2、4、8、16、24、48、72h取液，第4天至第20天每两天取一次液，第20天至第60天每五天取一次液。每次取液取1mL，再向离心管中加入1mL对应pH的PBS缓冲液。测量DOX@LDH/α-TOS/PLGA短纤维的溶液在480nm处的吸光度，测量α-TOS/PLGA短纤维在280nm处的吸光度，根据DOX和α-TOS的标准曲线分别算出两种纤维中α-TOS和DOX的释放速率，总结不同pH对药物释放的影响。每种样品在不同pH下做5组平行实验。
体外释放动力学结果如图7所示，图7(a)显示DOX@LDH/α-TOS/PLGA短纤维在pH＝6.8时可快速释放出α-TOS，图7(b)显示在pH＝5.5时，LDH中的DOX释放速度较快，且60天时DOX的累积释放量为44.2％，相比DOX/PLGA短纤维，DOX@LDH/α-TOS/PLGA短纤维中药物的释放速率明显减缓，证明了双载体优良的药物缓释特性。对比图7(a)和图7(b)相同pH下的药物累计释放量，可以观察到在DOX@LDH/α-TOS/PLGA短纤维中α-TOS的释放速率远高于DOX的释放速率，证明了α-TOS首先发挥作用，即实现了多级缓释。
实施例4
动态凝血实验测试：
采用动态凝血实验对纳米短纤维的抗凝血性能进行评价。取0.2g CaCl2至15mL离心管中，加入10mL pH＝7的PBS缓冲液，配置成0.2M的CaCl2溶液。12孔板中每孔各加1mgLDH/PLGA、DOX/PLGA、LDH@DOX/α-TOS/PLGA短纤维。每孔滴加健康人全血20μL，将人全血滴加在材料上，确保血液与材料充分接触。之后再滴加10μL 0.2M的CaCl2溶液。将只有健康人全血和CaCl2溶液没有材料的组分设为对照组。将孔板放入37℃恒温培养箱中，分别在5、10、20、40、60min时取出，沿孔板侧壁缓缓加5mL超纯水，加水时尽量保持液面稳定，以免对实验结果产生影响。加水5min后收集1mL上清液。使用紫外分光光度计测定该上清液在540nm处的吸光度。每组实验设定3组平行实验。
动态凝血实验结果如图8所示，观察到DOX@LDH/α-TOS/PLGA短纤维没有凝血现象，具有一定的抗凝血效果。
实施例5
材料CCK-8细胞活力测试
通过CCK-8实验测试纯载体材料LDH/PLGA短纤维的生物相容性及多级缓释载药纳米纤维的细胞毒性。取生长旺盛期的MCF-7及MCF-7/ADR细胞配置成10万/mL的细胞悬液，取100μL加入96孔板中，放入恒温培育箱培养24小时后，加入100μL的不同梯度浓度的不同短纤维，继续培养24小时后，使用pH＝7.4的PBS缓冲液洗净孔板中的血清及材料，每孔加入90μL无血清培养基和10μL CCK-8试剂，放回培养箱共孵育3小时。使用酶标仪测试450nm处的吸光度。
CCK-8检测纯载体材料生物相容性的结果如图9a-b所示，LDH/PLGA短纤维没有显示出明显的细胞毒性，表现出良好的生物相容性。CCK-8检测DOX@LDH/α-TOS/PLGA短纤维的细胞毒性的结果如图10所示，相比DOX/PLGA和α-TOS/PLGA短纤维，DOX@LDH/α-TOS/PLGA短纤维抑制癌细胞增殖的效果最好。
实施例6
MCF-7及MCF-7/ADR细胞对材料的吞噬检测
取15万生长旺盛期的MCF-7及MCF-7/ADR细胞接种在激光共聚焦显微镜专用培养皿中，在恒温培养箱培养24小时后取出培养皿，将培养过夜的培养基吸出，在每个培养皿中加入1mL使用培养基配置的DOX浓度为20μg/mL的DOX@LDH/α-TOS/PLGA短纤维溶液。设置不加材料的培养基为空白对照组。继续培养3小时后，使用PBS缓冲液洗涤3次，每孔加500μL体积分数为10％戊二醛稀释液，在4℃环境下对MCF-7及MCF-7/ADR细胞固定15min，固定后使用PBS缓冲液洗涤3次。在避光条件下对细胞进行细胞骨架和细胞核的染色。使用鬼笔环肽处理1小时后用PBS缓冲液洗涤5次。使用DAPI处理5min后用PBS缓冲液洗涤5次。在激光共聚焦显微镜下对空白组与实验组进行观察。
激光共聚焦显微镜的结果如图11和图12所示，在MCF-7及MCF-7/ADR细胞中均可以观察到红色的短纤维，证明材料可以很好的被细胞吞噬，其红色荧光是由负载的DOX产生的。

Claims (8)

1.一种多级缓释载药纳米短纤维的制备方法，包括：
(1)将阿霉素DOX与层状双氢氧化物LDH按质量比1:1～3在超纯水中充分溶解后混合均匀，调节溶液pH值，离心洗涤、真空冷冻干燥得到DOX@LDH纳米颗粒；
(2)将DOX@LDH纳米颗粒、α-生育酚琥珀酸酯α-TOS按质量比2:1～3:2加入PLGA纺丝液中，搅拌得到DOX@LDH/α-TOS/PLGA纺丝液，静电纺丝得到DOX@LDH/α-TOS/PLGA纤维膜；
(3)将上述纤维膜剪碎，浸泡在PVA水溶液中，之后进行均质处理，离心洗涤、真空冷冻干燥得到DOX@LDH/α-TOS/PLGA短纤维，即多级缓释载药纳米短纤维。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中的层状双氢氧化物LDH的制备步骤如下：
将Mg(NO3)2·6H2O和Al(NO3)3·9H2O按摩尔比1:1～3分别溶于超纯水中并混合均匀，充氮，调节溶液pH值，充分反应后离心洗涤、真空冷冻干燥即得。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述Mg(NO3)2·6H2O水溶液的浓度为0.016～0.020M，Al(NO3)3·9H2O水溶液的浓度为0.032～0.040M。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中的LDH水溶液的浓度为1～2mg/mL，DOX水溶液的浓度为2～4mg/mL。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中的PLGA纺丝液所采用的溶剂为体积比3:1的四氢呋喃THF和N-N-二甲基甲酰胺DMF；PLGA与其溶剂的质量体积比为1g:4mL。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中的静电纺丝的工艺参数为：针头为18号，纺丝电压为20kV，流速为0.4～0.6mL/h，接收距离为10～15cm，环境温度为20～30℃，湿度为50～60％，接收装置为铺在滚轴上的铝箔纸，滚轴的转速为300～350rpm。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中的PVA水溶液的浓度为0.5～1wt％。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中的均质处理的工艺参数为：均质机转速为15000～16000rpm，均质时间为45～60min。
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