CN102046011A

CN102046011A - 微管相互作用剂的脂质-油-水纳米乳递送系统

Info

Publication number: CN102046011A
Application number: CN200880129433XA
Authority: CN
Inventors: 罗伯特·绍尔; 罗伯特·罗德里格斯
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2008-04-04
Filing date: 2008-04-04
Publication date: 2011-05-04
Also published as: EP2262369A4; BRPI0821895A2; EP2262369A1; KR20110009128A; JP2011516472A; WO2009123595A1; CA2720390A1; IL208386A0; AU2008354007A1

Abstract

一种在治疗、诊断和预防包括人类的温血动物中以细胞过度增殖为特征的疾病、病症、综合征或其症状中有益的药物组合物，及其使用方法和制备方法，所述药物组合物包括：通过匀浆化加工制备的脂质纳米乳，该脂质纳米乳包括各自包括至少一种能够优先选择性地主动地内在化到病态细胞内的非双层形成脂质的脂质颗粒；有效量的与所述纳米乳组合的至少一种治疗性或诊断性微管相互作用剂；和药学可接受的载体。在一个优选的实施方案中，所述组合物也可以由蛋白质载体分子和/或促乳化剂组成，所述促乳化剂比如表面活性剂、基于植物的脂肪源、溶剂及其组合。

Description

微管相互作用剂的脂质-油-水纳米乳递送系统

发明领域

本发明涉及治疗剂和诊断试剂，更具体而言，涉及以适于引入患者中且能够促进活性选择剂浓缩入以过度增殖为特征的细胞包括肿瘤细胞中的脂质-油-水纳米乳形式的微管相互作用剂的制剂。

发明背景

药物在肿瘤及其微环境内分布的作用还没有被充分地研究。目前，为了得到益处，必须给予高剂量的甚至最强效的药物以驱动扩散和组织分布。然而，肿瘤块内药物浓度的增加并不一定导致细胞药物浓度或到达细胞内靶点的能力增加。实际上，虽然某些药物可以通过结合聚合物、脂质体包囊或固体脂质纳米颗粒制剂增加肿瘤块内的浓度，但是这些可能事实上抑制细胞的摄取和分布。另外，高剂量给药通过扩散驱动肿瘤渗透通常可引起与癌症治疗的高发病率有关的那些副作用。因此，期望设计一种药物递送技术，其改善药物穿过肿瘤组织的渗透和增加其在肿瘤细胞内的浓度，同时表现出增加的安全和功效特征。虽然研究了多种方法用于药物被动累积到肿瘤中，然而，几乎没有技术能有效地促进主动肿瘤细胞摄取。

脂质可溶性药物容易渗透细胞膜，且可以经由细胞转运。以过度增殖为特征的细胞比如癌细胞通常显示出脂类代谢异常，特征是它们极大地增加了脂质和脂肪酸的优先摄取。因此，对于癌症，已经发现脂质在膜结构、生长和转移、信号转导和转运过程中起主要作用。

对于脂质颗粒、脂质体、合成纳米颗粒及其它高分子试剂而言，由于肿瘤血管系统的特征性泄漏特征(leaky features)引起的被称为渗透性和潴留增加(EPR)效应的现象在实体瘤中很普遍，并且已经被开发用于例如聚合物-结合的抗癌药的更有选择性的靶向和肿瘤块聚集。现有技术中已经报道了包囊剂比如高分子微泡、脂质体和固体聚合或脂质纳米颗粒(各自是以多种组合物、制剂和结构制备的，并且在多种生理条件施用)的用途。然而，这些试剂仅仅允许被动聚集在肿瘤中。而且，这些试剂通常通过广泛共同聚集在网状内皮系统中而从循环中快速清除，并且使用这些试剂会带来细胞毒性和免疫应答提高。

研究表明多种受体类型和亚型、转运蛋白和脂筏现象很可能涉及脂质摄取到癌细胞中，即使在患有同一疾病但遗传学改变的患者中。虽然已经用各种治疗剂制备了基于脂质的纳米颗粒或基于HDL或LDL的药物载体，其模拟天然受体配体且增加靶向和药物摄取到癌细胞，然而，对于癌症的治疗，仍然缺乏促进主动肿瘤细胞药物摄取的最优化制剂。

D′Arrigo的美国专利4684479和5215680，将其引入本文作为参考，描述了气体-或空气-填充的脂质涂层的微泡(LCM)的形成、其制备方法及用作超声方法的显影剂和药物递送的用途。LCM的制备方法是基于简单的机械振摇非离子脂质的含水混悬液，所述非离子脂质比如特定链长和固定比例的饱和甘油酯和胆固醇酯。在所有情况下，加入的大部分脂质(99％)絮凝或沉淀，当过滤时有另外的物料损失，产率小于1％。还发现这些人造的LCM在体外具有非常长的寿命，持续超过6个月。而且，尽管它们的过滤率低，但是LCM足够小和柔顺，足以横穿肿瘤组织微循环的有孔毛细管壁。特别地注意LCM的高选择性、温度依赖性、表观表面可饱和的摄取到啮齿类动物脑肿瘤细胞以及狗的自发性肿瘤中，有可能模拟某些脂质的癌细胞的自然摄取。然而，迄今为止，还没有利用LCM技术的药物化合物的有效制剂，当向患者施用时，其呈现最小至不存在的不良副作用水平。

紫杉醇是称为紫杉烷的药物类的一个成员，已经主要是从太平洋紫杉树、短叶紫杉和相关物种的树皮中将其分离出。尽管观察到制剂赋形剂的过敏性反应，但是已经发现紫杉烷用于治疗各种癌症，比如卵巢癌、乳腺癌、非小细胞肺癌及头颈癌。施用紫杉烷的困难是该药物通常不是水溶性的。因此，将紫杉醇配制在Cremophor EL

(聚乙氧基蓖麻油)和乙醇的1∶1混合物中以产生Taxol

(Bristol-Myers Squibb，Inc.)。需要在稳定约十二个小时的合适载体中重构，同时在线过滤以除去可能结晶出来的任何药物。Taxol

已经显示出在患者中是神经毒性的、引起感觉的和有时伴有运动神经病。Cremophor EL

部分地引起神经病，因为它本身不无显著的副作用。

将紫杉醇配制在稳定的脂质乳剂中的尝试同样没有成功。据报道该药物不溶于脂质乳剂比如主要包含豆油的Intralipid

或包含大豆油和红花油的混合物的Liposyn中。在大豆油或红花油中加热紫杉醇，或者甚至当超声处理时，不会引起明显量的药物溶出，在匀浆化步骤期间将紫杉醇加入到脂质乳剂中同样得到了令人失望的结果。已经用三醋精、L-α-卵磷脂、聚山梨酯80、Pluronic F-68、油酸乙酯和甘油配制了包括至多15mg/ml的紫杉醇的乳剂。然而，这些乳剂是高毒性的且不稳定的。也将紫杉醇与Cremophor EL

和乙醇混合在LCM制剂中。然而，虽然从药物递送的观点来看，LCM的肿瘤摄取选择性是吸引人的，但是根据现有技术的制备产率和药物负载容量太低而不可行。使用Cremophor EL

和乙醇与紫杉醇或许也导致该制剂的毒性。

另外，制备方法复杂，小的条件改变可引起粒径和性质特征的显著不同。典型的方法包括高剪切匀浆化和超声、高压匀浆化、热匀浆化、冷匀浆化和溶剂乳化蒸发。无菌过滤或放射的灭菌也可能是复杂的。因此，将药物加入乙醇和水溶液中，接着高剪切匀浆化以增加在LCM中的药物负载和脂质溶解度的尝试导致形成稳定性差的不含气体的颗粒，其即便包含也只包含很少的药物。

用合适的递送媒介物(vehicle)施用治疗剂是高度期望的，所述递送媒介物同时促进肿瘤块内的聚集和细胞内在化但是限制在健康组织中的聚集。采用更有效地递送，可以降低治疗剂的全身和健康组织浓度，同时获得相同或更好的治疗效果，副作用较少或减少。具有固有程度的肿瘤细胞选择性的此类试剂递送将提供另外的优点。进一步，不限于单一肿瘤类型，但是选择性聚集在肿瘤块内和细胞内在化到多种癌细胞类型中的递送媒介物是特别期望的，其能够更安全有效地治疗癌症。还能够提高治疗剂的负载容量的递送媒介物将是现有技术的显著进步。

因此，显然需要一种稳定的、容易制备的、生物相容的、有效的微管相互作用剂(包括紫杉烷比如紫杉醇)的制剂，其促进摄取到肿瘤细胞中，但仍显示出最小的副作用。

本发明的目的和工业实用性

因此，本发明的一个目的是提供一种用于治疗或诊断以细胞过度增殖为特征的疾病、病症和综合征比如癌症的药物组合物，其显示出快速、选择性增加和优先摄取到肿瘤细胞内。

本发明的一个进一步的目的是提供一种用于治疗或诊断以细胞过度增殖为特征的疾病、病症和综合征比如癌症的药物组合物，当施用时其引起的副作用最小。

本发明的一个更进一步的目的是提供一种用于治疗或诊断以细胞过度增殖为特征的疾病、病症和综合征比如癌症的药物组合物，其容易以最小可能的成本制备，并且能够贮存最长可能的时期。

发明概述

为了获得这些目的，本发明广泛地提供一种用于治疗、诊断或预防包括人类的温血动物中以过度增殖为特征的疾病、病症或综合征或其症状的药物组合物，其中所述药物组合物包括：脂质纳米乳，其包括：包括均匀地分散在水相中的如下定义的脂质颗粒的脂质纳米乳，能够选择性地优先内在化到病态细胞内，包括癌细胞；有效量的与所述脂质纳米乳组合的至少一种治疗剂；和药学可接受的载体。

所述脂质颗粒各自包括至少一种非双层形成脂质。已经发现这样的合适的脂质颗粒显著地增加治疗剂或诊断剂靶向递送和浓缩到以细胞增殖为特征的病态细胞包括癌细胞中，用于改善治疗功效和生物利用度，同时减少或至少保持获得期望的治疗益处所必需的施用剂量和频率。而且，所述纳米乳显示出延长持续时间的特别的物理和化学稳定性，从而极大地便于所述药物组合物预包装在稳定的、即时施用形式中，以及从而消除了与如目前采用现有技术中包含类似活性剂的组合物实施时临床稀释和配制有关的问题和不方便。

所述脂质颗粒同时包含药学活性治疗性微管相互作用剂。合适的微管相互作用剂包括，但不限于：紫杉烷，比如例如紫杉醇；埃坡霉素；长春花生物碱，比如例如长春新碱；软珊瑚醇；盘皮海绵内酯；多拉司他汀；秋水仙碱；考布他丁(combrestatins)；拟茎点霉毒素A；软海绵素B；海绵抑制素1；匍枝珊瑚醇；laulimalides；和其衍生物、类似物、同源物及每种前述试剂的组合。所述微管相互作用剂的存在量足够杀死或至少中止过度增殖细胞的生长。

在本发明的进一步的方面，提供一种诊断、治疗或预防包括人类的温血动物中的以细胞过度增殖为特征的疾病、病症或综合征或其症状包括癌症的方法，其中所述方法包括向温血动物施用有效量的本文公开的药物组合物。

在本发明的一个更进一步的方面，提供一种制备本文公开的药物组合物的方法，其包括步骤：

a)混合至少一种非双层形成脂质与有效量的至少一种诊断剂或治疗剂，得到脂质部分；

b)将所述脂质部分加入到水相中，得到分散液；和

c)在由此足以分散所述至少一种非双层形成脂质分散的高剪切条件下搅拌所述分散液，形成包括脂质颗粒的脂质纳米乳。

附图说明

下述附图阐述本发明的实施方案，而不意味着限制整个说明书和权利要求书所包括的本申请的范围。

图1图解了根据本发明在20％DMSO中负载10％紫杉醇的脂质颗粒的粒径分布和ζ电势。

图2通过绘制在蔗糖密度研究中负载紫杉醇的脂质颗粒的百分比溶解度图显示紫杉醇包括到根据本发明的脂质颗粒中。

图3A和3B描述显示通过荧光激活细胞分选可定量根据本发明的脂质颗粒的细胞摄取图。

图4A-4D描绘显示相对于HT-29结肠和SF-539肺肿瘤细胞的肿瘤细胞系对根据本发明的脂质颗粒的细胞摄取图。

图5为显示与配制在Cremophor EL

中的紫杉醇相比，配制在根据本发明的脂质颗粒一个特定混合物中的紫杉醇的肿瘤细胞摄取更大量的图。

图6描述显示在对LN和Cremophor EL药物培养两小时之后，紫杉醇的细胞摄取达到稳定水平的图。

图7图解确定在根据本发明的脂质颗粒中的紫杉醇的量是否对于细胞摄取饱和的试验结果。

图8A和8B描述显示胆固醇是根据本发明的脂质颗粒的细胞摄取中关键组分的图。

图9A和9B描绘显示与在Cremophor EL

中的紫杉醇相比，在根据本发明的脂质颗粒中的紫杉醇的内在化达到更大程度的图。

图10A-10D描述显示单独的紫杉醇对比在根据本发明的脂质颗粒中的紫杉醇的细胞毒性的图。

图11图解与配制在Cremophor EL

中相比，配制在本发明的脂质颗粒中的紫杉醇的细胞毒性更大的图。

图12A和12B图解显示与配制在Cremophor EL

中相比，配制在本发明的脂质颗粒中的紫杉醇具有显著更大抗肿瘤活性的图。

图13显示用EmPAC、Abraxane

或Taxol

治疗且紫杉醇-特异性抗体染色的A549细胞的代表性图像。

发明详述

本发明通常涉及用于治疗、诊断或预防温血动物中的以细胞过度增殖为特征的疾病、病症或综合征或其症状的药物组合物。这样的动物包括哺乳动物类的那些，比如人类、马、牛、家畜包括狗和猫等，易患以细胞过度增殖为特征的疾病及其它病理学病症和综合征包括癌症。本发明的药物组合物包括包括如下述定义的脂质颗粒的纳米乳，与其操作缔合的至少一种治疗或诊断微管-相互作用剂，所述脂质颗粒对于微管相互作用剂具有增加的负载容量，和药学可接受的载体或赋形剂，从而使得所述脂质颗粒特别适合选择性地递送到并有效浓缩于这样的病态细胞和组织如肿瘤细胞和组织内。

设计所述纳米乳的脂质颗粒的结构以促进同时提高被动聚集和主动内在化到病态细胞和组织内，包括肿瘤细胞和组织。所述脂质颗粒通过主动代谢摄取进入这些细胞，同时它们被动地聚集在病态组织的血管区内。因此，本发明的脂质颗粒提供一种递送媒介物，其选择性地优先靶向用于以过度增殖为特征的细胞包括肿瘤和癌细胞的摄取和内在化。如本文使用的“内在化”指所述脂质颗粒被细胞主动摄取。这样的提高的内在化水平与颗粒对治疗剂或诊断剂的高负载容量提供了一种通过向这样的靶点递送有效量的治疗剂或诊断剂，从而诱导有益的治疗效果，包括终止生长、诱导分化或杀死细胞，来治疗或诊断这些靶点的有效媒介物。因此，特别是与现有技术的递送系统相比较，本发明的脂质颗粒不仅增加了向病态细胞和组织递送治疗剂，而且减少了获得期望的功效所需的治疗剂的量。

本发明的脂质颗粒经延长的时期是物理或化学上特别稳定的，因此，受到由于现有技术的递送系统中通常显示的不期望的沉淀、聚集或不溶性引起的治疗剂或诊断剂的损失最小。而且，这些脂质颗粒显示出其它有利的特征，包括控制释放；增加的药物稳定性；积极的药物负载容量；与疏水性药物的较好相容性；相对低的生物毒性；和低的有机溶剂含量。本发明的脂质颗粒的制备和施用也相对简单方便。

如本文使用的术语“脂质颗粒”指包括含有任何脂质的结构，典型地为纳米化的，其是形成纳米乳部分的至少基本上完整的颗粒。术语“基本上完整的”指与脂质体相反，在不存在膜的情况下，所述颗粒保持其形状。所述脂质颗粒包括至少一种非双层形成脂质。

脂质双层结构或排列典型地是由具有亲水端(极性头区)和疏水端(非极性尾区)的某些种类的脂质形成，所述脂质包括两亲性分子比如磷脂，其显示出在水溶液中自组装成两个相对的脂质分子层的能力和/或倾向。所述两个相对的脂质分子层排列成使得它们的疏水端彼此相对，形成含油芯，而它们的亲水端面向所述双层结构的任一面的水溶液。在本发明中，术语“非双层形成脂质”包括缺乏在水相环境中形成脂质双层结构或排列的这种能力和/或倾向的脂质。非双层形成脂质的实例包括只是弱极性的脂质，优选基本上非极性或中性的脂质。在本发明中，更优选的脂质是中性脂质。

本发明的脂质颗粒与在美国专利号4684479和5215680中描述的包含气体的微泡不同，在结构上也与脂质体比如例如在美国专利号6565889和6596305中描述的那些不同，将其都引入本文作为参考。特别地，所述脂质颗粒是由非双层形成脂质的混合物形成的，所述非双层形成脂质的混合物是生理学可接受的，且至少基本上不含带电脂质或极性脂质，包括例如磷脂。非双层形成脂质的合适的实例包括选自下述的那些：饱和的和不饱和的羧酸的甘油单酯；饱和的脂肪族醇的甘油单酯；甾醇芳香酸酯；甾醇；萜烯；胆汁酸；胆汁酸的碱金属盐；脂肪族酸的甾醇酯；糖酸的甾醇酯；糖酸的酯；脂肪族醇的酯；糖酯；脂肪族酸的酯；糖酸；皂苷；皂苷元；甘油；脂肪族酸的甘油二酯；脂肪族酸的甘油三酯；脂肪族醇的甘油二酯；脂肪族醇的甘油三酯；及其组合。

在本发明的一个实施方案中，所述脂质颗粒是通过首先形成一组选择的非双层形成脂质的混合物制备的，所述脂质提供具有下文描述的粒径的脂质颗粒，当应用于靶向病态组织和细胞时，所述粒径有助于高内在化水平。所述脂质混合物通常包括：

a)至少一种第一成员，选自由以下组成的组：包含约9至18个碳原子的羧酸的甘油单酯和包含约10至18个碳原子的脂肪族醇；

b)至少一种第二成员，选自由以下组成的组：甾醇芳香酸酯；和

c)至少一种第三成员，选自由以下组成的组：甾醇、萜烯、胆汁酸和胆汁酸的碱金属盐；

d)至少一种任选的第四成员，选自由以下组成的组：包含约1至18个碳原子的脂肪族酸的甾醇酯；糖酸的甾醇酯；糖酸和包含约10至18个碳原子的脂肪族醇的酯；糖和包含约10至18个碳原子的脂肪族酸的酯；糖酸，皂苷；和皂苷元；和

e)至少一种任选的第五成员，选自由以下组成的组：：甘油；含约10至18个碳原子的脂肪族酸的甘油二酯或三酯；和包含约10至18个碳原子的脂肪族醇。

虽然如上所述的脂质混合物仅仅包括成员(a)至(c)，更优选地其包括成员(d)和/或(e)，因为理论上存在这两种任选的成员增加了所述脂质颗粒的长期稳定性和粒径一致性。

在本发明的一个优选的实施方案中，配制形成本发明的脂质颗粒的脂质混合物的五种成员(包括两种任选的成员)以(1-5)∶(0.25-3)∶(0.25-3)∶(0-3)∶(0-3)的(a)∶(b)∶(c)∶(d)∶(e)的重量比混合。

虽然已经描述了所述脂质混合物的第一成员包括含有约10至18个碳原子的饱和羧酸的甘油单酯，预期包含约9至18个碳原子的单-或多不饱和羧酸的甘油单酯，比如但不限于9-碳油酸或反油酸，也对于所述脂质混合物的构成有用。

应当理解，所述脂质混合物的成员的比例可根据一些因素变化，所述因素包括，但不限于靶向递送的细胞和/或组织的类型、负载的治疗剂或诊断剂、治疗剂或诊断剂的预期剂量、使用的药学可接受的载体、施用方式、存在的其它赋形剂或添加剂等。而且，能够使所述脂质颗粒被靶向病态组织和细胞选择性地内在化的因素不仅包括所述脂质混合物的组成和得到的脂质颗粒的结构，而且包括如下文描述的颗粒的尺寸和分子量。

本发明的脂质颗粒保持期望的粒径分布，优选地其中所述颗粒的大部分具有约0.02至0.2μ(微米)，优选0.02μ至0.1μ的平均粒径，变化的小量颗粒落在上述范围之上或之下，某些脂质颗粒的仅仅为至多约200nm。在本发明的脂质颗粒中可得到的粒径范围进一步引起经延长的时间增加的物理和化学稳定性，和不期望的凝聚和药物沉淀的实质性减少。而且，该范围特别适于治疗癌症；较大的颗粒可能适于其它用途(例如，靶向其它类型的细胞或组织)。本文提供的范围将部分由应用的脂质混合物和加入的治疗剂或诊断剂的类型和量确定。

本发明中应用的治疗剂或诊断剂可以是不带电荷或带电荷、非极性的或极性的、天然的或合成的等。如本文使用的术语“治疗剂”包括影响微管生成、结构、缔合、功能和破坏的任何物质，包括，但不限于药物、激素、维生素、营养物质等，因此，其用于预防和治疗以细胞过度增殖为特征的疾病、病症、综合征或其症状，包括癌症。因此，用于本发明的治疗剂包括影响微管生成、结构、缔合、功能和破坏的所有类型的药物、亲脂性多肽、细胞毒素、寡核苷酸、细胞毒素抗肿瘤剂、抗代谢药、激素和放射性分子。术语“寡核苷酸”包括反义寡核苷酸和有义寡核苷酸，(例如，通常称为载体的核酸)。寡核苷酸可以是“天然的”或在亚基或亚基之间的键方面“修饰的”。

然而，在本发明的一个特定方面，所述治疗剂为微管相互作用剂，选自由以下组成的组：：紫杉烷，比如例如紫杉醇、多西他赛、三尖杉宁碱、浆果赤霉素-III、10-脱乙酰基浆果赤霉素-III、脱乙酰基紫杉醇和脱乙酰基-7-表紫杉醇；长春花生物碱，比如例如长春新碱、长春碱、长春瑞滨、长春地辛及其类似物；埃坡霉素；软珊瑚醇；盘皮海绵内酯；多拉司他汀；秋水仙碱；考布他丁；拟茎点霉毒素A；软海绵素B；海绵抑制素1；匍枝珊瑚醇；laulimalides；衍生物、类似物、同源物及每种前述试剂的组合；和已知显示出这样的微管-相互作用活性的类似药物或物质。

紫杉烷比如紫杉醇也可以作为抗炎剂以较小时间释放剂量使用。该用途在外科手术放置到患者内的生物医疗装置比如支架方面特别重要。虽然期望在支架周围和内部的细胞有一些聚集，因为该聚集形成光滑的覆盖层，从而将该装置引入到动脉本身，但是这样的细胞聚集也可以阻塞内部通道和引起动脉再狭窄。因此，Boston Scientific Corporation制备了一种用专有的聚合物涂层的紫杉醇-洗脱冠状动脉支架系统，所述聚合物结合支架表面上的紫杉醇。所述紫杉醇-聚合物复合物能够精确控制紫杉醇的剂量和时间-释放特征，能够洗脱足量的药物以抑制支架周围的细胞聚集和显著地预防支架周围的再狭窄和血管的再形成。预期本发明的药物组合物，特别是当治疗剂是紫杉烷或其它微管相互作用剂时，将类似地用于调节外科手术植入的生物医疗装置周围的细胞聚集。

本发明的药物组合物显示出长期的物理和化学稳定性，使这样的组合物能够方便地预包装成稳定的、即时施用的剂型，从而消除了通常与现有技术中类似的组合物相关的施用前临床稀释和配制的必要。本发明的药物组合物显示出经延长的时期(例如，在约30℃下至少14天和在4℃下至少12个月)的期望的药物和乳化稳定性。本发明的药物组合物包含的脂质颗粒的量为约0.1μg/ml至1000μg/ml，优选约10μg/ml至800μg/ml，最优选约200μg/ml至600μg/ml。基于所述药物组合物的总量计，所述治疗剂或诊断剂的典型的浓度可以是至少0.001％w/v，优选0.001％至90％w/v，更优选约0.1％至25％w/v。所述药物组合物中存在的治疗剂或诊断剂的量可以为约0.001μg/ml至1000μg/ml，优选约0.1μg/ml至800μg/ml，更优选约60μg/ml至400μg/ml。

本发明的药物组合物还可以包括促乳化剂，其选自基于植物的脂肪源、溶剂、表面活性剂或其组合。已经发现单独或组合的所述促乳化剂理论上通过减少或最小化脂质颗粒的不期望的沉淀或聚集，增加了所述脂质颗粒的稳定性和保持其小粒径性质，从而正面影响和促进所述脂质颗粒主动摄取到癌细胞中。所述促乳化剂也将改善本发明的药物组合物的物理和化学稳定性及药物负载容量。

在本发明的一个优选的实施方案中，所述基于植物的脂肪源包括通常为植物油形式的植物衍生的脂肪酸，比如例如大豆油、亚麻籽油(flaxseed oil)、大麻籽油、亚麻油(linseed oil)、芥子油、菜籽油、低芥酸菜子油(canola oil)、红花油、芝麻油、葵花油、葡萄籽油、扁桃仁油、杏仁油、蓖麻油、玉米油、棉籽油、椰子油、榛子油、印度楝树油、橄榄油、棕榈油、棕榈坚果油、花生油、南瓜子油、米糠油、核桃油及其混合物。更优选的植物油是大豆油。

植物油的常用存在量足够使所述纳米乳具有较高的表面张力，其依次增加靶细胞的质膜或其上受体的疏水性相互作用的概率。所述基于植物的脂肪源的存在量可以为约0.001％v/v至5.0％v/v，更优选地为约0.005％v/v 4.0％v/v，最优选地为约0.01％v/v至2.5％v/v。

在本发明的另一个优选的实施方案中，所述表面活性剂为选自非离子表面活性剂的那些。非离子表面活性剂的实例包括脱水山梨糖醇酯及其混合物，比如脂肪酰化的脱水山梨糖醇酯及其聚氧乙烯衍生物及其混合物，包括但不限于泊洛沙姆化合物(188、182、407和908)、泰洛沙泊、聚山梨酯20、60和80、羟乙酸钠、十二烷基硫酸钠等，及其组合。更优选的非离子表面活性剂为洗涤剂聚山梨酯，比如例如吐温

-80。

所述表面活性剂的存在量通常为足够通过稳定所述纳米乳的疏水性组分和亲水性组分之间的界面和保持疏水性组分不结合而增加该纳米乳的动力学稳定性，因此，一旦形成，该纳米乳在贮存中不会有显著地变化。所述表面活性剂的存在量可以为约0.01％w/v至4.0％w/v，更优选约0.1％w/v至3.0％w/v，和最优选约0.2％w/v至2.5％w/v。

在本发明的另一个优选的实施方案中，所述溶剂包括任何药学可接受的水可混溶性稀释剂或溶剂，比如例如极性质子和极性非质子溶剂。这样的溶剂优选地选自1，3-丁二醇；二甲亚砜；醇，比如甲醇、丁醇、苯甲醇、异丙醇和乙醇；等。一种更优选的溶剂为苯甲醇。

所述溶剂的存在量通常为足够控制所述纳米乳中非离子表面活性剂聚集的程度。所述溶剂的存在量可以为约0.001％v/v至99.9％v/v，更优选地为0.005％v/v至80％v/v，和最优选地为约0.005％v/v至70％v/v。

本发明的组合物不限制或改变治疗剂或诊断剂的潜在药理学活性或化学性质，而是仅仅提高所述试剂递送至和内在化到包括癌细胞或组织的病态细胞或组织内，以赋予治疗或诊断益处。与紫杉烷作为治疗癌症的治疗剂的用途有关的教导的实例公开在例如美国专利号6346543；6384071；6387946；6395771；6403634；和6500858中，将其引入本文作为参考。

通常，本发明的药物组合物是通过联合所述脂质颗粒与治疗剂或诊断剂和将其充分地混合制备的。在与治疗剂或诊断剂混合之前，所述脂质混合物可以与表面活性剂和基于植物的脂肪源的组合混合，所述治疗剂或诊断剂本身可以与用于溶解的水可混溶性溶剂混合。然后，将该脂质颗粒-治疗剂/诊断剂组合与水，优选纯净水混合。然后，使得到的混合物经受典型地在标准常规高剪切匀浆化搅拌器或匀浆器中产生的高剪切力，以制备包括分散在水相内的脂质颗粒的纳米乳。足够的高剪切力可以用合适的高剪切匀浆化搅拌器或匀浆器比如由Microfluidics of Newton，MA.销售的Microfluidizer

Fluid Materials Processors产生。为了得到可用于向包括人类的温血动物施用的更纯化的形式，可以对得到的纳米乳进行进一步处理。

在某些情况下，期望从混合过程除去不适当的大颗粒，以便使粒径分布保持在期望的范围内。合适的过滤系统，比如来自Millipore Corporation of Waltham，Massachusetts的那些，可用于该目的。因此，合适的过滤系统的选择可能是将所述脂质颗粒的粒径分布控制在期望的范围的因素，其在本领域技术人员的常规技术范围内。可选地，可以通过透析处理所述纳米乳以除去杂质，得到的渗析液保留用于药物用途。透析是一种除去任何非-颗粒化脂质混合物成分、药物和/或溶剂和获得任何期望的缓冲液更换或浓缩的优选的方法。可以使用额定分子量截留5000至500000的渗析膜，分子量为10000至300000是优选的。当比如通过透析纯化除去非颗粒化的药物时，可以表征如所描述得到的脂质颗粒以确定所述脂质颗粒可能内在化到靶细胞，比如例如C₆神经胶质瘤细胞中的程度。

本发明的组合物还可以包括药学可接受的载体或赋形剂。药学可接受的载体的实例是本领域熟知的，其包括在药物组合物中通常使用的那些，比如但不限于抗氧化剂、缓冲剂、螯合剂、香味剂、着色剂、防腐剂、提高生物利用度的摄取促进剂、抗微生物剂及其组合。这样的添加剂的量取决于期望的性质，其可以由在本领域技术人员容易地确定。

本发明药物组合物通常可以包含盐、缓冲剂、防腐剂和相容性载体，任选地与其它治疗成分组合。当在药物中使用时，所述盐应当是药学可接受的，但是非药学可接受的盐可方便地用于制备其药学可接受的盐，且没有从本发明的范围中排除。这样的药理学和药学可接受的盐包括，但不限于由下述酸制备的那些：盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、马来酸、乙酸、palicylic、对-甲苯磺酸、酒石酸、柠檬酸、甲烷磺酸、甲酸、丙二酸、琥珀酸、萘-2-磺酸和苯磺酸。药学可接受的盐也可以制备成碱金属或碱土金属盐，比如羧酸基的钠盐、钾盐或钙盐。

本发明还提供用治疗剂或诊断剂治疗或诊断患者的方法，其通过向细胞递送有效量的至少一种治疗剂或诊断剂用于实施预防、诊断或治疗以细胞过度增殖为特征的疾病、病症或综合征或其症状。改进的癌症治疗是特别预期的，包括通过控制肿瘤细胞增殖、血管生成、转移性生长、细胞凋亡治疗原发肿瘤，和治疗外科手术切除之后或同时的微小转移的发展；及放射性或其它化疗性治疗原发肿瘤。本发明的药物组合物用于这样的癌症类型，如原发性或转移性黑素瘤、淋巴瘤、肉瘤、肺癌、肝癌、霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤、白血病、子宫癌、子宫颈癌、膀胱癌、肾癌、结肠癌和腺癌比如乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌和胰腺癌。

对于治疗和诊断应用，当与药学可接受的载体混合时，所述药物组合物可以直接地施用至患者。该方法可以通过施用单独的治疗剂或诊断剂或与有效量的另一种治疗剂或诊断剂的组合来实施，其可以是或可以不是第二种微管相互作用剂。当不是微管相互作用剂时，该第二种试剂可以是，但不限于细胞生长抑制剂、叶酸抑制剂、烷化剂、拓扑异构酶抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、鬼臼霉素、抗肿瘤抗生素、化疗剂、细胞凋亡诱导剂及其组合。这样的治疗剂还可以包括代谢抑制试剂。许多这样的治疗剂是本领域已知的。当需要放大或保证患者对治疗方法的反应时，所述组合治疗方法提供同时、顺序或单独用于治疗这样的病症。

本发明的方法可以使用医学上可接受的任何施用方式实施，并且产生了有效的活性化合物水平，而不会引起临床不可接受的副作用。尽管特别地适合肠胃外施用的剂型是优选的，本发明的组合物也可以配制用于吸入、口服、局部、透皮、鼻腔、眼部、肺部、直肠、经粘膜、静脉内、肌内、皮下、腹膜内、胸内、胸膜内、子宫内、瘤内或输注方法或施用，以气溶胶、喷雾剂、粉剂、凝胶剂、洗剂、乳膏剂、栓剂、软膏剂等形式。如果这样的制剂是期望，可以包括本领域熟知的其它添加剂，以赋予所述制剂期望的稠度及其它性质。

本领域技术人员将认识到施用治疗剂或诊断剂的特定的方式取决于选择的特定的试剂；所述施用是用于治疗、诊断还是预防疾病、病症、综合征或其症状；待治疗或诊断的医学病症的严重性；和治疗效果所需的剂量。例如，用于治疗白血病而施用抗癌剂的优选的方式包括静脉内施用，而用于治疗皮肤癌的优选的方法可包括局部施用或真皮内施用。

如本文使用的“有效量”指获得期望的治疗或诊断效果的该治疗剂或诊断剂的剂量或多剂量。通常，治疗剂或诊断剂的有效量可以随如下因素而变化：使用的特定试剂的活性；所述试剂的代谢稳定性和作用时长；受试者的种类、年龄、体重、一般健康状态、饮食状态、性别和饮食；施用方式和时间；排泄速率；药物组合(如果有)；和待治疗的特定病症的表现程度和/或严重性。精确剂量可以由本领域普通技术人员确定，而不需要过度实验，为了获得期望的结果，每天施用一次或多次，并且为了获得期望的治疗效果或如果发生任何并发症，可以由独立的执业医师调节剂量。重要地，当用于治疗癌症时，使用的治疗剂的剂量应当足够抑制或杀死肿瘤细胞，同时保持正常细胞基本上不受伤害。

包括在本发明的药物组合物内的治疗剂或诊断剂可以以不超过可以被给定脂质颗粒溶解、悬浮或操作缔合的最大量的任何期望量配制。所述诊断剂或治疗剂的量可以为0.001μg/ml至1000μg/ml，优选约0.1μg/ml至800μg/ml，更优选约300μg/ml。

通常，所述脂质颗粒以足够向患者施用有效量的方式递送。所述剂量可以为约0.1mg/kg至175mg/kg，优选约1mg/kg至80mg/kg，和更优选5mg/kg至60mg/kg。所述剂量可以以单剂量或独立的分剂量施用，所述分剂量比如每天一次至四或多次。在某些剂量下受试者的反应不足的情况下，可以使用甚至更高的剂量(或不同的、更定位的递送途径的有效更高剂量)至患者耐受的程度。为了获得治疗剂或诊断剂的合适的全身或靶向水平，预期每天多剂量。

在本发明的另一个实施方案中，可以使用微管相互作用剂作为体外诊断剂。如前所述，根据所述的特定肿瘤细胞或细胞类型，在抑制不同的肿瘤类方面，不同的微管相互作用剂的功效可以不同。因此，例如，在其中诊断或选择合适的化疗策略可能困难的情况下，体外的肿瘤细胞培养物与已知靶向特定肿瘤细胞类型的微管相互作用剂的试验提供了鉴定肿瘤类型和有效治疗的另一种方法。

在本发明的另一个方面，提供一种制备本发明的药物组合物的方法。将所述脂质混合物加入到一定量的治疗剂或诊断剂中，使得当用水相加工时，该组合物形成包括脂质颗粒分散液的脂质纳米乳，其中脂质颗粒的分散相以纳米级粒径的大分子或小分子簇形式存在。在制备本发明的组合物中，将所述脂质混合物和治疗剂或诊断剂与包括水，优选过滤水的水相混合。加工得到的混合物，形成具有平均粒径范围典型地为，但不总是至多200nm范围的脂质颗粒，所述粒径是特别适于治疗癌症的粒径，较大的颗粒适于其它用途。得到的范围部分地受使用的脂质混合物、加入到该脂质混合物中的治疗剂或诊断剂的类型和量及常用于制备脂质颗粒的技术的影响。

本发明的药物组合物可以使用常规分散液制备技术或本领域已知的方法制备。这样的技术包括，但不限于高剪切匀浆化、超声搅拌或超声处理、高压匀浆化、溶剂乳化/蒸发等。在本发明的一个实施方案中，所述脂质颗粒可以是经由常规高压匀浆化技术，使用合适的高压匀浆器制备的。合适规格的匀浆器是市售可获得的。高压匀浆器通常设计用于在典型地为约100至2000bar的高压下，推动流体穿过跨距约几微米的狭窄缝隙。加压流体经非常短的距离加速至超过1000km/h的非常快的速度。包含所述脂质混合物的加压流体遭遇非常高的剪切应力和空化力(cavitation forces)，将所述脂质混合物有效地破碎和粉碎成亚微米范围的颗粒。如前所述，大部分的脂质颗粒具有的平均粒径范围为约0.02μ至0.2μ，优选0.02μ至0.1μ，变化的小量颗粒落在上述范围之上或之下，某些脂质颗粒的仅仅为至多约200nm。

在制备脂质颗粒的另一个特定的方法中，所述脂质混合物可以与基于植物的脂肪源比如植物油和表面活性剂比如非离子表面活性剂混合，得到脂质相。所述治疗剂或诊断剂可以与溶剂比如水可混溶性溶剂混合，得到治疗剂或诊断剂相。此后，在水相的存在下，优选地通过超声处理，混合所述脂质和治疗剂或诊断剂相，并掺合在一起。之后，在高剪切力下，匀浆化得到的混合物，以制备本发明的相应纳米乳。然后，可以通过0.2μ膜过滤该纳米乳，灭菌和/或除去杂质比如未用的脂质物质、过量的治疗剂或诊断剂等，得到适于作为药物组合物向需要治疗或诊断的包括人类的温血动物递送的纯化形式。

提供下述实施例用于帮助理解本发明的药物组合物。

实施例1

EmPAC的配制

选择紫杉醇作为第一种药物候选物，其将被测试经由负载在脂质纳米颗粒(LN)上的配制并将被发展为市售可用的产品。所述紫杉醇/LN制剂是直接在水和4％乙醇中，接着是用110Y Microfluidics Microfluidizer

高压匀浆器(Model M-110Y，Microfluidics，Inc.，Newton，MA)以18000psi高压匀浆化四个周期制备的。尽管之前的研究表明紫杉醇可以以至多-25％w/w脂质浓度结合到LN中，但是据发现该制剂仅仅稳定几小时，尽管与药物结合相比，这样的问题似乎与稳定性更相关。在发现在1mM焦磷酸钠(pH 9.5)中制备的LN保持稳定至少两个月之后，选择1mM焦磷酸钠(pH 9.5)作为药物结合研究的第一种试验介质。

据发现如果以15000psi匀浆化3次，将紫杉醇结合到具有在1mM焦磷酸钠中4％乙醇含量的LN中，则仅仅具有5％药物负载的制剂是稳定的，并且甚至该最终制剂不能稳定显著的时期。在结合之后的第二天，在5％负载的样品中观察到微小的浊度，在第三天，其变成全部沉淀。而在33％和16％药物负载的样品中，观察到立即混浊。将这些发现概括在表1中。这样的稳定性降低的可能原因可能是紫杉醇在水中的溶解性差、乙醇含量低(4％)、最终溶液的pH高(pH 11.5)和/或不相容的脂质浓度。

表1.负载到在4％乙醇中制备的LN中的紫杉醇

非常可能的是改变有机物含量，在此例中所述有机物是乙醇，可以改善结合药物的颗粒的稳定性。因此，首先制备不同的乙醇含量(例如，50％v/v、25％v/v、12.5％v/v)的LN。观察到即使不含药物的颗粒在乙醇含量小于或等于25％v/v下也不稳定。而且，仅仅12.5％v/v乙醇的LN保持稳定至少一天。因此，将10％的紫杉醇负载到含有12.5％v/v乙醇含量的LN上。在三小时之后，观察到凝胶形成，强烈表明高水平的乙醇不能稳定LN中的紫杉醇制剂。乙醇也通常用作破乳剂。这可能是即使高百分率的乙醇也不能有助于得到稳定的负载药物的制剂的原因。除了别的溶剂之外，二甲亚砜(DMSO)是一种选择的溶剂，因为已知紫杉醇在DMSO中具有非常好的溶解性。因此，在第二个机器Microfluidizer

高压匀浆器(Model M110EH，Microfluidics，Inc.，Newton，MA)M-110EH中，以15000psi和三个周期，制备在10％DMSO中的负载紫杉醇的样品。

使用两个对照，一个不含紫杉醇，另一个不含脂质组分。根据第二个对照，显然脂质组分在结合药物的LN中的稳定性方面确实起作用，因为在没有脂质组分的存在下，该样品会沉淀出。然而，观察到含有10％紫杉醇的样品在第二天沉淀，而含有5％紫杉醇的样品保持澄清。根据这些样品的高效液相色谱法(HPLC)测定，观察到在这些样品中的紫杉醇降解。

因为紫杉醇在DMSO中高度可溶，试验在不同浓度的DMSO中用紫杉醇制备的LN的稳定性。可以看出浓度20％的DMSO产生了含有10％w/w紫杉醇的200μg/ml LN的最大稳定性。将代表性的粒径分布和ζ电势值显示在图1中。将该修饰的制剂的稳定性数据显示在表2中。

表2.在修饰的DMSO制剂中负载紫杉醇的LN的稳定性

假设前述的紫杉醇在24小时之内降解几乎100％可能是由于制剂中的高pH(11.0)。加入1mM焦磷酸钠降低pH至9.5。因此，研究经由1mM焦磷酸钠调节pH对脂质组分和紫杉醇的稳定性作用。

据发现pH等于或超过6.0时，所述制剂保持澄清，没有观察到沉淀。然而，在pH超过6.0时，存在相当大量的紫杉醇降解。因此，最佳溶液是利用用稀磷酸调节pH到6.0的1mM焦磷酸钠，以保持在制剂中脂质组分和紫杉醇的化学和物理稳定性。将所有结果都概括在表3中。

表3.pH对脂质纳米颗粒稳定性的影响^￥

因此，因为发现DMSO和pH的控制可以导致制剂的长期稳定性，所以接下来的研究方面是过滤是否影响脂质组分和负载紫杉醇的LN样品的药物效价，因为在制备期间为了灭菌产品可能使用过滤。

在初始筛选不同类型的膜比如尼龙、PVDF和PES之后，得出结论聚醚砜(PES)亲水性膜是过滤所述制剂最合适的膜。当过滤在20％DMSO中制备的负载10％紫杉醇的LN穿过0.22μmPES膜滤器时，至少98％的紫杉醇穿过该膜。当通过ELSD分析来自这些相同制剂的脂质组分时，93％的全部组分穿过所述膜。因此，证实过滤将提高所述制剂的稳定性和品质。

为了确定在20％DMSO的存在下，紫杉醇是否结合到LN中，或者DMSO是否通过将紫杉醇分配到水相中防止紫杉醇结合到LN中，使用蔗糖密度梯度进行从LN中分离¹⁴C-标记的紫杉醇。放射性计数的分布的测量提供关于其中包含紫杉醇的级分的数据。因此，在10％w/w紫杉醇(包括某些¹⁴C-标记的紫杉醇)的存在下，制备200μg/ml的LN，并将该制剂在蔗糖密度梯度上分级分离。收集级分，分析放射性计数，以测定其中包含紫杉醇的级分。在所述梯度的底部发现沉淀的级分，其主要由不溶性紫杉醇组成。在所述梯度中发现一个带，确定其为LN，分析沉淀物和LN级分中的放射性含量。在包括LN的脂质的存在下，在底部沉淀物中发现非常少的放射性标记物。在不存在脂质的情况下，发现更大量的沉淀物，在沉淀物级分中发现比例小得多的放射性标记物。

然后，如图2所示，在不存在脂质的情况下，约80％的紫杉醇沉淀出，而在脂质的存在下，仅仅1.8％的紫杉醇沉淀出。这支持了在LN中，大多数紫杉醇结合到的脂质中的观点。

在临床情况中，经3-24小时期间静脉内输注约2.5L通常被认为对于大多数患者是安全和可耐受的。目前在临床应用中紫杉醇的剂量范围为经3-24小时期间135至175mg/m²。假定平均尺寸的男性具有～1.8m²的表面积，获得这样的剂量需要浓度为～97μg/ml的紫杉醇。为了在这些时间和体积参数内递送这样的治疗剂量的紫杉醇，紫杉醇必须有足够高的浓度。因此，期望配制获得这样的剂量的负载紫杉醇的LN样品作为基准。然而，因为本发明能够选择性地靶向肿瘤细胞，结合紫杉醇的LN所需的治疗剂量实际地可以低很多。因此，比例大得多的施用药物将终止于肿瘤细胞。

如随后的下表4中明显可见，有可能制备含有10％紫杉醇负载的至多400μg/ml的LN，其稳定至少5小时而没有聚集的迹象。该制剂具有的紫杉醇浓度为40μg/ml，其经过静脉内施用所需的时间是稳定的。

在过滤穿过0.22μm PES膜之后，负载在LN上的在1mM焦磷酸钠(pH-6.0)的20％DMSO中的10％紫杉醇的样品保持稳定至少三天。在将焦磷酸钠的浓度改变成0.5mM之后，样品保持稳定7天。最初，分析过滤的和未过滤的形式的所有样品的紫杉醇含量和粒径分布。因此，这些数据表明可以制备在LN中的浓度如目前临床使用的那些的紫杉醇制剂。

因此，制备第二种紫杉醇-LN制剂，其由60μg/ml的紫杉醇；300μg/ml的脂质混合物；0.5％的丁醇；0.5％的大豆油；和0.25％的吐温

-80组成。对该第二种制剂进行的稳定性研究显示，使用400μg/ml的脂质和固定浓度的紫杉醇的制剂稳定至少24小时。将结果概括在表4中。

表4.脂质浓度对纳米颗粒稳定性的影响

特别地，据发现如表5所示，第二种紫杉醇-LN制剂在室温下稳定至少七天，并且在2-8℃下稳定至少三十天。

表5.第二种制剂的稳定性

然而，因为发现丁醇对小鼠是有毒的，当注射时引起昏睡(数据没有显示)，所以用苯甲醇代替丁醇。得到的第三种制剂由60μg/ml的紫杉醇、400μg/ml的脂质混合物、0.06％的苯甲醇、0.5％的大豆油和0.25％吐温-80组成。发现该第三种制剂在室温下稳定至少三周，在2-8℃下稳定超过八十天，如表6中所概括的。

表6.第三种制剂的稳定性

实施例2

EMULSIPHAN和EmPAC的细胞摄取

为了确定人肿瘤细胞是否摄取LN和它们是否显示出不同的摄取LN的能力，进行本文描述的研究。发现不仅大多数试验的肿瘤细胞系容易摄取发荧光的LN，而且来自不同肿瘤细胞谱系的肿瘤细胞系显示出不同的摄取LN的能力。

如下制备这些试验所使用的LN制剂：通过超声处理10分钟将合适的脂质溶解在95％乙醇中至10mg/mL。接着，将在乙醇中的100μL的0.5mg/mL胆固醇基BODIPY-FL(Molecular Probes，Eugene，OR)加入到1mL的10mg/ml溶解的脂质中。最后，将脂质和胆固醇基BODIPY-FL混合物加入到50mL的1mM焦磷酸钠水溶液中，通过110Y Microfluidics Microfluidizer

高压匀浆器(型号M-110Y，Microfluidics，Inc.，Newton，MA)处理。

为了首先通过荧光激活细胞分选(FACS)确定荧光标记的纳米颗粒的细胞摄取程度与细胞荧光强度成正比，测定每个细胞的平均荧光强度与LN的浓度成正比，如图3A所示，以及每个细胞的平均荧光强度与在LN的存在下培养时间成正比，如从图3B中明显可见。实际上，目测证实荧光强度与固定在玻璃盖片上相同处理细胞的发荧光的LN摄取的程度成比例(数据没有显示)。用荧光亲脂性染料DiO(Molecular Probes，Eugene，OR)标记LN，其可以使用荧光素的过滤装置检测。通过微流化制备含有200μg/ml脂质和2.5μg/ml DiO的LN。将标记的LN加入到C6细胞中，并且培养在37℃下。此后，除去培养基，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞，胰蛋白酶消化，并再次洗涤，之后固定在4％甲醛中。加入0、12.5、25、50和100μg/ml的LN，并且培养60分钟。将50μg/ml的LN加入细胞中，并培养0、5、10、15、30和60分钟，之后除去培养基，处理用于FACS分析。如从图3A和3B看到的结果明显可见，其分别显示出每个细胞的荧光强度与浓度的增加和培养时间的增加成正比，显然，可以通过FACS评价LN摄取。

为了确定来自不同细胞谱系的细胞是否显出不同的摄取LN的能力，以及评价来自不同肿瘤类型的细胞摄取LN的相对能力，在多组肿瘤细胞系中试验LN摄取。选择的细胞系选自由国家癌症学会(National Cancer Institute，NCI)的开发治疗剂计划体外筛选(Developmental Therapeutics Program In Vitro Screening)使用的那些。所述NCI细胞系组由来源于许多不同人肿瘤谱系的细胞系组成，具有来自每个代表性人肿瘤谱系的一些不同细胞系。使用的细胞系包括HS-578T、MDA-MB-231和MX-1乳腺癌；H23、H460和H522肺癌；SF-539肝；和HT29、SW-620和COLO205结肠肿瘤细胞系。

通过微流化，用200μg/ml脂质和0.5％w/w胆固醇基-BODIPY-FL制备LN。将标记的LN加入细胞中，并培养在37℃下。此后，除去培养基，用PBS洗涤细胞，胰蛋白酶消化，并再次洗涤，之后固定在4％甲醛中。通过FACS分析样品，并测定每个细胞的平均荧光强度。比较来源于结肠、乳腺、中枢神经系统(CNS)和肺的细胞与已经分别显示出摄取低和高量的发荧光的LN的来自HT-29结肠癌细胞系和SF-539肺癌细胞系的细胞。通过减去未处理的相同细胞系的荧光强度获得每个LN-处理的细胞样品的发荧光的LN摄取。

如图4A至4D所示，来自NCI组的细胞系的LN摄取的比较显示不同谱系的细胞类型之间的LN摄取不同。尽管来自相同肿瘤谱系的细胞之间可看到一些差异性，但是每个肿瘤谱系的相对摄取相当一致。例如，乳腺肿瘤和肺肿瘤细胞系通常显示出比结肠肿瘤细胞系更高的LN摄取。在来自肺肿瘤和CNS的细胞系中发现最大的LN摄取。

将所有的结果概括在表7中。

表7.肿瘤细胞系对脂质纳米颗粒的摄取

^§对于每个发荧光的LN-处理的样品，通过比较并减去来自相同相应的未处理的细胞系的荧光，获得每个细胞的平均荧光强度。

^￡ND-未测定。因为高水平沉淀而不能测定粒径。

接着，在一系列分析培养的肿瘤细胞摄取放射性标记的紫杉醇的试验中，比较配制在LN(EmPAC)中的紫杉醇的摄取和配制在常规媒介物cremophor/乙醇1∶1(Cremophor EL

)中的紫杉醇(称为Taxol

)的摄取。

在第一个试验中，将¹⁴C-标记的紫杉醇加入到LN(从而形成EmPAC)和Taxol

中。在该试验中使用的EmPAC制剂是包含DMSO的第一种制剂(参见实施例1)。将由相同浓度的紫杉醇组成的这些制剂加入到在12-孔重复中的SF539神经胶质瘤和A549肺癌细胞中1小时。除去培养基，并且在除去药物和在含有相同体积的包含甲苯的闪烁合剂的PBS中洗涤之后，将细胞单层溶解，以测定与每单层样品结合的紫杉醇。每个样品的放射性标记计数表示为最初加入到每个样品中的总放射性标记的分数。来自该试验的结果表明与Taxol

相比，SF539显著更多地内在化配制在LN中的紫杉醇(即，EmPAC)，如图5所证实的。

基本上如之前描述的重复该试验，不同在于用第二种EmPAC制剂治疗细胞，并且在药物培养之后的各个时间收集细胞。将对于每个制剂基本上相同量放射性标记的药物加入到每个细胞样品中。显示与细胞单层结合的放射性标记药物的原始计数。另外，为了评价细胞摄取的动力学，分析作为药物培养时间函数的紫杉醇摄取。用SF539神经胶质瘤细胞的上述研究证实在到达稳定水平之前，摄取随着两小时的时期增加。对于EmPAC和Taxol

也观察到这一点，表明差异不是由于Cremophor EL

制剂中紫杉醇的相对不溶性引起的，如图6所示。然而，与Taxol相比，在EmPAC中与这些细胞结合的紫杉醇的量显著地更多。

为了确定EmPAC中的紫杉醇或脂质混合物是否可以饱和细胞摄取，进行其中改变全部未标记的紫杉醇而脂质和放射性标记的紫杉醇的量保持不变的试验。如图7所示，紫杉醇的量似乎对于细胞摄取而言是饱和的，尽管这一点根据该特定的试验不是完全清楚的。因为标记的紫杉醇是恒定的，而总紫杉醇是变化的，其可能仅仅代表较小或较大分数的总紫杉醇。增加紫杉醇浓度也可增加颗粒总数。因此，即使摄取相同量的负载药物的颗粒，也可能摄取较少量的标记的紫杉醇。

接着，进行一系列试验以确定LN的每个脂质组分对细胞摄取的贡献。用缺少一种组分的体系制备示踪取代的¹⁴C-标记的胆固醇标记的LN样品。使用300μg/ml脂质和20％DMSO制备LN样品。成比例地增加所有其它组分以补偿缺少的组分。将该样品加入到SF539人神经胶质瘤细胞中两小时。还是用单组分与用于制备LN颗粒的胆固醇1∶1的混合物进行相同的试验。图8A和8B都证实了胆固醇在LN中发现的所有脂质组分中起最重要的促进细胞摄取的作用。

尽管假设放射性标记的紫杉醇与细胞单层的结合是紫杉醇内在化的结果，但是形式可能性是紫杉醇位于细胞外部，而不是被内在化。为了确定紫杉醇是否被内在化，用配制在EmPAC或Cremophor EL

中的紫杉醇治疗A549人肺肿瘤细胞2小时。接着，用冰冷的甲醇固定细胞，先用抗紫杉烷抗体(Hawaii Biotech Honolulu，HI)染色，接着用结合到发荧光的Alexa Fluor 488分子(Molecular Probes，Eugene，OR)的第二抗体染色。图9A中显然可见，紫杉醇被内在化，并且定位于微管。因为已知在体外紫杉醇结合微管，这表明配制在EmPAC以及Cremophor EL

中的紫杉醇被内在化。然而，也通过示踪每个细胞的边缘定量每个样品的许多细胞区域的细胞内荧光强度，和定量示踪边界内的荧光强度。如图9B所示，发现EmPAC治疗的细胞具有的荧光强度是用Taxol

治疗的细胞的大致两倍，从而证实了之前的发现。

实施例3

EmPAC的细胞毒性

该组试验的目的是确定EmPAC的相对肿瘤生长抑制和细胞毒性。比较EmPAC与溶于DMSO中的紫杉醇(制造商推荐的)或Taxol

为了确定结合到LN的紫杉醇是否保持杀死细胞的能力，在许多不同的细胞系中，比较溶于DMSO储备溶液中的单独的紫杉醇与等摩尔量的EmPAC的细胞毒素作用。使用MTS细胞增殖测定评价相对细胞毒性。MTS是一种四唑化合物，其被活细胞生物还原为可溶性甲

产物。可以使用该甲产物在490nm的吸光度确定活细胞的相对数量。因此，可以使用MTS评价单独的紫杉醇对比EmPAC的相对的细胞毒效价。试验的细胞系包括子宫肉瘤细胞系MES-SA及其耐药性亚系MES-S A-DX5，以观察将紫杉醇结合到LN中是否影响耐药性细胞中的紫杉醇的细胞毒性。因此，以次融合密度铺板MES-SA、MES-SA-DX5、A549和MX-1细胞系。在铺板细胞后第二天，将稀释在组织培养基中的等摩尔浓度的单独的紫杉醇和EmPAC加入到细胞中，使其与细胞培养72小时。替换培养基，并根据制造商(Promega Corp，Madison，WI)的说明进行MTS测定。基于标准化计算来自每个相应细胞系的未治疗的细胞的百分比存活。在图11A至11D中的每个数据点代表6个样品的平均值±SEM。

如图10A所示，在较低的紫杉醇浓度下，在MES-SA和A549细胞中，EmPAC显示出比在DMSO中的紫杉醇略低的细胞毒性，但是似乎在较高的浓度下，比单独的紫杉醇杀死更大分数的细胞，也如图10C所示。这可能是由于单独的紫杉醇在水性培养基中是极不溶的；其疏水性的性质导致紫杉醇在较高浓度下聚集，阻止其进入细胞中。将紫杉醇结合到LN中可以使得紫杉醇在水性培养基中保持稳定，防止聚集和使较高浓度的紫杉醇进入细胞。在MX-1乳腺癌细胞中，EmPAC也显示出比单独的紫杉醇显著更大的细胞毒性，如图10D中明显可见，并且对于MES-S A-DX5细胞系，其显示出比单独的紫杉醇中等更大的细胞毒性，如图10B所示。尽管这些观察结果的潜在机制是未知的，一个假设是在耐药性细胞系MES-SADX-5的情况下，EmPAC不会同单独的紫杉醇一样有效地从细胞中泵出，因为其埋藏在脂质中，至少最初被当做LN的组分。脂质颗粒通过特定的机制摄取到细胞内，其可能不受耐药性的潜在细胞机制的影响。

调整前述的试验，以比较EmPAC与Cremophor EL

在该试验中使用的EmPAC制剂是通过如下方法制备的：在吐温

-80和大豆油的存在下，通过超声处理溶解专有的脂质混合物，接着将该混合物加入到已经在丁醇中通过超声处理溶解的紫杉醇中。通过在110EH Microfluidics Microfluidizer

高压匀浆器(Model M-I lOY，Microfluidics，Inc.，Newton，MA)上微流化加工该混合物。在暴露于SF539神经胶质瘤细胞一小时之后，比较这些紫杉醇制剂，之后除去药物，对药物的这一短期暴露比对药物的连续暴露更接近模拟对抗肿瘤药物的体内肿瘤细胞暴露，因为紫杉醇具有的生物可利用的体内半衰期小于一小时(Wiernik等人，1987；Rowinsky等人，1990)。

在除去药物之后，接着使细胞增殖另外72小时，之后用MTT测定存活率和增殖。所述MTT测定使用存在于活细胞中的线粒体脱氢酶测量细胞生存力，因为预期活细胞具有比临死细胞或死细胞更高的脱氢酶活性，和由此更大的MTT活性水平。计算每个细胞样品的存活率，作为相对于未暴露于药物的相应对照细胞系的分数。绘制百分比存活与药物浓度的函数图，将每个曲线拟合成四参数逻辑曲线，计算EC₅₀值。用学生t-检验评价对于每种药物浓度，EmPAC对比Cremophor EL

之间的统计学显著性。如图11所示，虽然单独的EmPAC对于细胞杀死和细胞存活没有显著的作用(数据没有显示)，但是与比Taxol相比，EmPAC对神经胶质瘤细胞的细胞毒性更显著。

实施例5

在小鼠肿瘤模型中EmPAC的肿瘤生长抑制

当用EmPAC或同等剂量的Taxol

治疗皮下植入H23人肺肿瘤的裸鼠时，观察到与同等剂量的Taxol

中的紫杉醇相比，EmPAC的肿瘤生长抑制更显著。

给裸鼠皮下植入H23肺肿瘤细胞，在施用药物之前，让其生长25天。各自在第25、27、29、32、34、36、39、42天，给患肿瘤动物IP注射2mL的60μg/ml药物。在这些注射天数的每天测量肿瘤体积。在肿瘤植入之后第45天，进行最后一次肿瘤体积的测量。将注射的药物制剂的组成显示在表8中。

表8.H23 TGI的动物实验组

如图12A所示，在第一次注射药物之后的20天期间，用EmPAC治疗的动物的肿瘤体积在整个时期都减小，而用Taxol

治疗的动物的肿瘤在前十一天显示出肿瘤体积消退，之后在试验的其它时期重新开始稳定的生长过程。在整个研究期间，来自用LN对照治疗的动物或未治疗的动物的肿瘤都显示出稳定的生长。因此，EmPAC能够减小肿瘤尺寸比Taxol更长的时间。将图12A的数据绘图显示药物治疗期间平均肿瘤体积。

转向图12B，通过比较药物治疗的第一天和最后一天之间的肿瘤体积差异确定百分比肿瘤消退。显示用Taxol

治疗的小鼠和EmPAC治疗的小鼠之间肿瘤消退的统计学显著差异(p＜0.0005)。每组表示3±SEM的平均值。在研究结束之前，来自EmPAC治疗的动物的肿瘤消退约71％(71.4±2.4％)，而来自Taxol

治疗的动物的肿瘤消退约19％(18.7±0.9％)。因此，数据表明EmPAC具有的抗癌活性比Taxol

更显著。

为了比较具有不同浓度的紫杉醇的EmPAC对肿瘤生长抑制的量，给植入H460人肺肿瘤细胞的裸鼠注射用比在实施例1的第三种制剂中两倍多紫杉醇配制的EmPAC。也施用一至四倍的上述TGI试验中给出的剂量的Taxol

结果表明EmPAC大致如四倍高的Taxol

一样有效。

在该试验中，使用60和137μg/ml紫杉醇的EmPAC制剂和同等量的紫杉醇。另外，向携带H460肿瘤的小鼠施用大致四倍的原始第三种EmPAC制剂的给予剂量的Taxol小鼠肿瘤生长的尺寸比上述试验的更大。给动物剂量给药，每周三次，间隔两天，共施用3周，在注射药物前测量肿瘤，以便将其肿瘤达到临界尺寸限值以上的动物自动处以安乐死。计算随时间的相对肿瘤体积，将其作为时间函数绘制图。进行t检验以测定用不同药物治疗的动物之间的肿瘤生长抑制是否存在显著差异。另外，由达到临界尺寸限值的肿瘤产生存活曲线，其中端点定义为治疗相关的原因或处以安乐死引起的动物死亡。

令人遗憾地，动物组不是随机的，因此对照组动物开始具有最小的肿瘤，而用较高剂量药物治疗的那些具有比治疗之前更大的肿瘤。然而，结果表明EmPAC的大致如四倍浓度的Taxol

一样有效。

实施例6

EmPAC的药代动力学和生物分布

为了确定IP对比IV的EmPAC药代动力学差异和EmPAC的生物分布，给植入A549肺肿瘤的裸鼠IP或IV注射EmPAC或在Taxol

中的紫杉醇，各自都包含放射性标记的紫杉醇。

如下制备包含¹⁴C-标记的紫杉醇的EmPAC制剂：

A)缓冲液的制备

1)向1L的水中加入466.1mg的焦磷酸钠，以制备1mM的焦磷酸钠溶液。

2)通过加入稀磷酸调节pH至4.0。

3)经由0.22μm PES过滤器过滤。

4)向10mL的该缓冲液中加入10μL的10％吐温-80。

B)脂质储备溶液

1)测量10mg的脂质混合物粉末，并将其溶于10mL的DMSO中，以制备1mg/mL脂质/DMSO溶液。

2)超声处理直到获得澄清溶液。

C)热的紫杉醇：

1)取50μL的热紫杉醇。

2)在80℃水浴中完全蒸发乙酸乙酯。

D)配制：将800μL的脂质/DMSO溶液加入到热的紫杉醇溶液中。充分混合，并涡旋。取该溶液，然后加入到3.2mL的水性缓冲液中。

在注射后0(注射后立即)、0.5、1、6或12小时将动物处以安乐死。通过心脏穿刺取血，获取选择器官(例如，全脑、肾、肺、胃、脾、胰腺、肿瘤、肿瘤对侧的肌肉、尿、粪便、全血和肿瘤下的肿瘤肌肉)的组织。处理所有的组织和血液，计数放射性标记的药物。称重和匀浆化所有的组织。因为所述组织太小以致于不能通过使用的天平准确地称重(天平读取一个小数位)，称重包括使用的缓冲液的组织匀浆。称重等分试样的匀浆，之后闪烁计数以测定总匀浆的级分。测定全部器官组织中¹⁴-C-标记的紫杉醇总数。结果表明，在IP对比IV注射的药物之间的药代动力学没有显著差异。这些结果也表明在EmPAC中的紫杉醇对比Taxol中的紫杉醇之间存在类似的药代动力学。其中在注射之后0.25、0.75、3、6或12小时获取组织的类似试验表明EmPAC和Taxol

具有基本上相同的药代动力学特征，组织紫杉醇水平峰值在注射后约三小时。此外，当将EmPAC制剂改变为在实施例1中描述的第三种制剂时，结果再次表明EmPAC制剂#3具有与Taxol

相同的药代动力学特征。

实施例7

的紫杉醇的细胞摄取

Taxol

(在CremophorEL

∶乙醇1∶1中的紫杉醇)已经在临床应用了许多年，用于治疗多种不同的癌症适应症，包括非小细胞肺癌和乳腺癌。Abraxane

一种用HSA配制的紫杉醇制剂，已经被FDA批准用于癌症治疗。该研究的目的是确定在使用A549人肺癌和MDA MB 435乳腺癌细胞系暴露于每种紫杉醇制剂一小时的短期暴露试验中，在影响体外紫杉醇的细胞摄取方面，EmPAC是否与Taxol和Abraxane

不同。然后，固定细胞，并且先用抗紫杉醇的抗体染色，接着用荧光标记的第二抗体染色。通过表荧光显微镜显影如细胞内荧光染色可检测的细胞内紫杉醇。用冷CCD摄像机俘获荧光标记的细胞的数字图像。使用数字成像软件定量标记细胞的荧光强度，并且比较每个试验组中平均细胞内荧光强度。

材料和方法

细胞系

将购自美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)的A549人非小细胞肺肿瘤细胞培养在含有10％胎牛血清(FCS)的Roswell Park Memorial Institute(RPMI)1640培养基中，以1∶3至1∶8的比例继代培养。

将购自ATCC的MDA MB 435人乳腺癌细胞培养在含有10％胎牛血清(FCS)的Roswell Park Memorial Institute(RPMI)1640培养基中，以1∶3至1∶8的比例继代培养。

试验制品

Taxol(批号729537)得自Ben Venue Laboratories，Inc.，Bedford，OH。

EmPAC(批号T343)是通过如下方法制备的：通过混合在0.3mL苯甲醇中超声处理溶解的90.42mg紫杉醇；超声处理的混合物，其包含5.6g大豆油、6.61g吐温

80.和123.23mg脂质混合物粉末；和300mL HPLC等级的水，并在1250bar下高压匀浆化来乳化。然后，将10g的右旋糖加入到200mL的该溶液中，超声处理至溶解，并且经由0.22μM过滤器无菌过滤。得到的产物包含2.0％大豆油、2.2％吐温80、400μg/ml脂质混合物粉末、0.1％苯甲醇和300μg/ml紫杉醇(批号28042/kl)。

用于可注射悬浮液的Abraxane

(批号200495，有效期2007年4月；Abraxis BioScience，Inc.)购自GlobalRx，Inc(Efland，NC)，作为包含100mg的紫杉醇和900mg的HSA的粉剂提供。然后，通过加入20mL的无菌PBS以制备包含5mg/ml紫杉醇45mg/ml HSA的悬浮液，重构Abraxane粉剂。根据包装说明，在24小时之内，使用重构的Abraxane

进行试验，以避免丧失稳定性。

试剂

1)Milli Q水

2)苯甲醇，Sigma，批号02748PC

3)大豆油，Sigma，批号074k0169

4)吐温80，Sigma Ultra，批号073K00641

5)紫杉醇(R&D等级)，Indena，批号28042/kl

6)葡萄糖(无水粉末)，Fisher，批号024291

7)emulsiphan脂质混合物#003/05

抗体

1)小鼠抗紫杉醇IgG.目录号TA 12；Hawaii Biotechnology，Inc.，Aiea，Hawaii.

2)AlexaFluor 488-结合的小鸡抗小鼠IgG.Molecular Probes，Inc.Eugene，OR.

另外的抗体染色材料

1)Nunc Lab Tek Cell腔式载玻片系统。Nalge Nunc International，Inc.，Rochester，NY.

2)Tris缓冲的生理盐水(TBS).Boston Bioproducts.Worcester，MA.

研究设计和步骤

设计试验使得研究者不知道每个试验制品的身份。将该试验制品放到新的管中，并且由不直接参与试验的人重新标记；在计算结果之后，显露试验制品的身份。

至细胞生长到＞50％融合，除去培养基，简单地通过先加入5mL的PBS，接着抽吸洗涤该细胞单层。将2mL的胰蛋白酶乙二胺四乙酸(EDTA)加入到每个烧瓶中，并且将该烧瓶置于组织培养恒温箱中5分钟。加入10mL的完全培养基以停止酶促反应，通过用血清学吸量管反复再悬浮使细胞解聚。将10μL的细胞加入到10μL的0.4％台盼蓝溶液中，混合，并且将～10-20μL的该细胞溶液置于血细胞计数器的室中。通过在4角正方形的血细胞计数器的室中以100X总放大倍数计数不含台盼蓝的细胞数量来测定活细胞数量。

通过下式确定需要的细胞体积：

细胞体积＝(A×10⁴细胞/mL)(以mL计需要的细胞V_总)÷(2df)(B细胞/mL)

其中：df为稀释系数；A为在血细胞计数器上计数的细胞数量；和B为试验所需要的细胞的浓度/mL。

将A549肺肿瘤和MDA MB 435乳腺癌细胞以4×10⁴细胞/cm²传代到8-孔腔式载玻片中。使细胞培养过夜24小时，之后加入试验制品。

将各自包含2.5M紫杉醇的试验制品和不含试验制品的对照完全培养基加入到两份重复腔式载玻片孔中，并在培养哺乳动物细胞所使用的标准条件(5％CO2.95％O2；37℃)下培养一小时。在培养期结束时，通过先加入1mL PBS的温PBS接着抽吸所述温的PBS，洗涤细胞样品一次。将3mL冰冷的甲醇加入到每个组织培养孔中，并且将细胞固定在-20℃的甲醇中15分钟。将载玻片置于包含0.02％叠氮化钠的PBS中直到染色。

用在TBS，pH 8.0中的10％正常鸡血清(NCS)封闭细胞样品一小时。在除去封闭溶液之后，在室温下，用包含2％NCS和以1∶100稀释的小鼠抗紫杉醇的TBS培养细胞一小时。在第一抗体培养结束时，在洗瓶中简单地用TBS冲洗细胞样品，并且将全部的腔式载玻片浸入包含TBS的Coplin染色缸中。通过在搅拌板上用搅拌棒搅拌TBS 10分钟完成腔式载玻片的洗涤。在三次更换的TBS中洗涤腔式载玻片。在室温下，用包含2％NCS和以1∶100稀释的结合Alexa Fluor 488的小鸡抗小鼠IgG染色细胞30分钟。在第二抗体培养结束时，在洗瓶中简单地用TBS冲洗细胞，并且如上所述洗涤。用包含14.3μM的二盐酸4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)的Fluoromount G封固剂(Southern Biotechnology，Inc.)封固染色的细胞，并且用盖玻片盖住。

为了显影Alexa Fluor二次染色的抗紫杉醇，采用表荧光显微镜，使用激发波长480nm和发射波长520nm查看载玻片和细胞。使用激发波长358nm和发射波长461nm的过滤器目测DAPI染色体染色。使用Zeiss Axiocam HR数字照相机和Axiovision图象获取和分析软件获得图像。对于每个细胞区域，采用Zeiss Axiocam HR数字照相机同时获得紫杉醇染色和DAPI染色的图像。通过使用Axiovision软件测定紫杉醇染色的每个细胞区域的细胞内荧光强度。从每个样品的两份重复孔随机抽取各自包含4至19个细胞的8至11个不相重叠的细胞区域的图像。总计，对于每个细胞样品，分析总共123-147个细胞。细胞周长是通过对每个细胞用鼠标数字描图细胞边缘人工定义的。

计算和统计分析

将来自荧光强度和细胞面积的数据拷贝到Excel电子数据表，在Excel中计算独立细胞的每个面积上的平均荧光强度。

为了计算平均细胞荧光强度，使用下式：

[(I₁/A₁)+(I₂/A₂)+(I₃/A₃)+...(I_n/A_n)]/n＝每个细胞面积的平均荧光强度

其中：I为如人工描绘的细胞周长所定义的每个细胞面积的强度；A为每个定义的细胞面积的面积；和n为采样的细胞数量。

比较用不同试验制品治疗的细胞之间的平均细胞内紫杉醇水平，该水平如通过对于每个治疗样品的每个面积的平均荧光强度确定。

使用学生t检验比较在EmPAC-、Taxol

-和Abraxane

-治疗的细胞之间平均荧光强度的统计学显著差异。

结果

测定各自用EmPAC、Taxol

或Abraxane

治疗的108-147A549细胞的平均荧光强度。将对于每个试验制品治疗的A549细胞样品的每个细胞的平均荧光强度显示在表9中。用非试验制品治疗的细胞没有显示出特异性染色(数据没有显示)。因此，没有测定未治疗细胞的荧光强度。也没有测定MDA-MB-435细胞的荧光强度，因为当用紫杉醇治疗时，其变成圆形，使得细胞质和细胞外周难于显影。

表9.在对各种紫杉醇制剂暴露1小时的A549细胞中的细胞内发荧光的紫杉醇

$对于每个组，由在10-12个区域中超过109-147个细胞测量的。

表10.比较在A549肿瘤细胞中紫杉醇制剂的每个细胞面积细胞内发荧光的紫杉醇强度的学生t检验的结果

如图13所示，用EmPAC、Taxol

或Abraxane(R)治疗的细胞都显示出具有微管的典型核周纤维状图案的荧光染色。这表明所述抗紫杉醇染色是特异性的，因为紫杉醇积极结合微管，并且主要定位于细胞中的微管。

学生t检验指示用EmPAC或Taxol

治疗的细胞具有的平均细胞内紫杉醇水平显著地高于Abraxane

的，如由每个细胞面积的平均荧光强度所指示的(表9和10；EmPAC和Abraxane之间比较的P＜0.0001，Taxol

和Abraxane之间比较的P＜0.0001)。进一步发现EmPAC具有比Taxol

中等较高的细胞内紫杉醇水平(表9，分别为116.7±2.0和112±1.8)，但是该差异统计学上较不显著(P＝0.08)。

讨论/结论

来自该研究的结果表明EmPAC和Taxol

制剂具有比Abraxane

显著更多的紫杉醇的细胞摄取。这些结果似乎与通过这些紫杉醇制剂进行的上述细胞生长抑制研究的结果一致，其表明当简单地暴露于细胞一小时时，相对于Abraxane

EmPAC和Taxol具有更大的细胞生长抑制活性。因为这三种制剂具有相同的活性成分，对于这三种制剂之间差异的一种可能的解释可能是它们的媒介物的原因。在这种情况下，有可能相对于EmPAC和Taxol的媒介物，Abraxane

的媒介物抑制紫杉醇的细胞摄取。

来自该研究的结果与来自实施例2的结果一致，在实施例2中我们比较了配制在EmPAC中的与配制在Taxol

中的放射性标记的紫杉醇的细胞摄取。然而，实施例2的结果表明相对于Taxol

-治疗的细胞的紫杉醇摄取，EmPAC-治疗的A549细胞的紫杉醇摄取显著地更多。尽管在该研究中观察到相对于Taxol

-治疗的细胞，EmPAC-治疗的细胞的紫杉醇摄取更多，但是该差异统计学上较不显著。结果之间的这一差异可能是由于在两个研究中的EmPAC制剂不同引起的。

参考文献

Ibrahim NK，Desai N，Legha S，Soon-Shiong P，Theriault RL，Rivera E，Esmaeli B，Ring SE，Bedikian A，Hortobagyi GN，和Ellerhorst JA.2002.Phase I and pharmacokinetics study of ABI-007，a Cremophor-free，protein-stabilized，nanoparticle formulation of paclitaxel(一种无Cremophor、蛋白稳定化的紫杉醇纳米颗粒制剂ABI-007的I期和药代动力学研究).Clin.Cancer Res.8：1038 1044.

Singla AK，Garg A，和Aggarwal D.2002.Paclitaxel and its formulations(紫杉醇及其制剂).Int.J.Pharm.235：179-192.

应当理解，本发明涉及一种用于递送包括抗癌剂的治疗剂和诊断剂用于治疗癌细胞和组织的组合物形式的递送系统。因此，所有的抗癌剂以及可以用这样的治疗剂治疗的显示出脂类代谢异常和脂质摄取升高的所有的病态组织和细胞包括癌细胞都在本发明的范围之内。

前述讨论仅仅公开和描述了本发明的示例性的实施方案。根据这样的讨论和所附的权利要求，本领域技术人员容易认识到在不背离如在下权利要求中定义的本发明的精神和范围时，可以进行各种改变、修饰和变化。而且，虽然本文已经描述了示例性的实施方案，本领域的其他实施者可以认识到本发明的其它设计或用途。因此，虽然已经结合其示例性的实施方案描述了本发明，应当理解在设计和使用方面的许多修饰对本领域普通技术人员是显而易见的，本申请预期涵盖任何其改进或变化。因此，显然预期到本发明仅仅受到权利要求及其同等物的限制。

Claims

1.一种用于治疗或预防包括人类的温血动物中以细胞过度增殖为特征的疾病、病症或综合征或其症状的药物组合物，所述药物组合物包括：

脂质纳米乳，其包括各自包括至少一种能够优先选择性地内在化到病态细胞内的非双层形成脂质的脂质颗粒；

有效量的与所述脂质纳米乳组合的至少一种治疗剂；

和药学可接受的载体，

其中所述药物组合物是通过匀浆化加工制备的。

2.权利要求1所述的药物组合物，其中所述治疗剂为微管相互作用剂。

3.如权利要求2所述的药物组合物，其中所述微管相互作用剂选自由以下组成的组：紫杉烷、长春花生物碱、埃坡霉素、软珊瑚醇、多拉司他汀、考布他丁、匍枝珊瑚醇、laulimalide、盘皮海绵内酯、秋水仙碱、拟茎点霉毒素A、软海绵素B、海绵抑制素1和其衍生物、类似物、同源物及组合。

4.如权利要求3所述的药物组合物，其中所述紫杉烷选自由以下组成的组：紫杉醇、三尖杉宁碱、多西他赛、浆果赤霉素-III、10-脱乙酰基浆果赤霉素-III、脱乙酰基紫杉醇、脱乙酰基-7-表紫杉醇和其衍生物、同源物、类似物及组合。

5.如权利要求3所述的药物组合物，其中所述长春花生物碱选自由以下组成的组：长春新碱、长春碱、长春瑞滨、长春地辛和其衍生物、同源物、类似物及组合。

6.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述治疗剂的量为基于所述药物组合物总量的至少0.001％重量。

7.如权利要求6所述的药物组合物，其中所述治疗剂的量为基于所述药物组合物总量的约0.1％至90％重量。

8.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述非双层形成脂质只是弱极性的。

9.如权利要求8所述的药物组合物，其中所述非双层形成脂质基本上是非极性的或中性的。

10.如权利要求8所述的药物组合物，其中所述非双层形成脂质是中性的。

11.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述脂质颗粒包括非双层形成脂质的混合物。

12.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述脂质颗粒稳定地分散在水相中至少七天。

13.如权利要求12所述的药物组合物，其中所述脂质颗粒稳定地分散在水相中至少十四天。

14.如权利要求13所述的药物组合物，其中所述脂质颗粒稳定地分散在水相中至少一个月。

15.如权利要求14所述的药物组合物，其中所述脂质颗粒稳定地分散在水相中至少六个月。

16.如权利要求15所述的药物组合物，其中所述脂质颗粒稳定地分散在水相中至少一年。

17.如权利要求1所述的药物组合物，其还包括促乳化剂。

18.如权利要求17所述的药物组合物，其中所述促乳化剂选自由以下组成的组：表面活性剂、基于植物的脂肪源、溶剂及其组合。

19.如权利要求18所述的药物组合物，其中所述表面活性剂为非离子表面活性剂。

20.如权利要求19所述的药物组合物，其中所述非离子表面活性剂为洗涤剂聚山梨酯。

21.如权利要求20所述的药物组合物，其中所述洗涤剂聚山梨酯为吐温

-80。

22.如权利要求18所述的药物组合物，其中所述非离子表面活性剂为脱水山梨醇酯。

23.如权利要求22所述的药物组合物，其中所述脱水山梨醇酯选自由以下组成的组：脂肪-酰化的脱水山梨醇酯和其聚氧乙烯衍生物、及其混合物。

24.如权利要求18所述的药物组合物，其中所述表面活性剂以足以防止所述纳米乳在储存期间变质的量存在。

25.如权利要求24所述的药物组合物，其中所述表面活性剂以约0.01％w/v至4.0％w/v的量存在。

26.如权利要求25所述的药物组合物，其中所述表面活性剂以约0.1％w/v至3.0％w/v的量存在。

27.如权利要求18所述的药物组合物，其中所述溶剂为水-可混溶性溶剂。

28.如权利要求27所述的药物组合物，其中所述水-可混溶性溶剂选自由以下组成的组：极性溶剂及其组合。

29.如权利要求28所述的药物组合物，其中所述溶剂选自由以下组成的组：极性非质子溶剂、极性质子溶剂及其组合。

30.如权利要求29所述的药物组合物，其中所述极性非质子溶剂为二甲亚砜。

31.如权利要求29所述的药物组合物，其中所述极性质子溶剂为醇。

32.如权利要求31所述的药物组合物，其中所述醇选自由以下组成的组：丁醇、丙醇、乙醇、甲醇、苯甲醇及其组合。

33.如权利要求18所述的药物组合物，其中所述溶剂以足以控制所述表面活性剂聚集程度的量存在。

34.如权利要求33所述的药物组合物，其中所述溶剂以约0.001％w/v至99.9％w/v的量存在。

35.如权利要求34所述的药物组合物，其中所述溶剂以约0.005％w/v至80％w/v的量存在。

36.如权利要求18所述的药物组合物，其中所述基于植物的脂肪源为植物油。

37.如权利要求36所述的药物组合物，其中所述植物油选自由以下组成的组：大豆油、亚麻籽油、大麻籽油、亚麻油、芥子油、菜籽油、低芥酸菜子油、红花油、芝麻油、葵花油、葡萄籽油、扁桃仁油、杏仁油、蓖麻油、玉米油、棉籽油、椰子油、榛子油、印度楝树油、橄榄油、棕榈油、棕榈坚果油、花生油、南瓜子油、米糠油、核桃油及其组合。

38.如权利要求37所述的药物组合物，其中所述植物油为大豆油。

39.如权利要求18所述的药物组合物，其中所述基于植物的脂肪源以足以使所述纳米乳具有较高的表面张力的量存在，从而增加与靶细胞质膜的疏水性相互作用的概率。

40.如权利要求39所述的药物组合物，其中所述基于植物的脂肪源以约0.001％w/v至5.0％w/v的量存在。

41.如权利要求40所述的药物组合物，其中所述基于植物的脂肪源以约0.005％w/v至4.0％w/v的量存在。

42.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述至少一种非双层形成脂质选自由以下组成的组：羧酸的甘油单酯、脂肪族醇、甾醇芳香酸酯、甾醇、萜烯、胆汁酸、胆汁酸的碱金属盐、脂肪族酸的甾醇酯、糖酸的甾醇酯、糖酸的酯、脂肪族醇的酯、糖的酯、脂肪族酸的酯、糖酸、皂苷、皂苷元、甘油、脂肪族酸的甘油二酯、脂肪族酸的甘油三酯、脂肪族醇的甘油二酯和脂肪族醇的甘油三酯及其组合。

43.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述至少一种非双层形成脂质是脂质混合物的形式，包括：

c)至少一种第三成员，选自由以下组成的组：甾醇、萜烯、胆汁酸和胆汁酸的碱金属盐。

44.如权利要求43所述的药物组合物，其中所述羧酸的甘油单酯是饱和的。

45.如权利要求43所述的药物组合物，其中所述羧酸的甘油单酯是不饱和的。

46.如权利要求43所述的药物组合物，其中所述脂质混合物的(a)∶(b)∶(c)的重量比为基于所述脂质颗粒总重量的(1-5)∶(0.25-3)∶(0.25-3)。

47.如权利要求43所述的药物组合物，其中所述脂质混合物还包括：

d)至少一种第四成员，选自由以下组成的组：包含约1至18个碳原子的脂肪族酸的甾醇酯；糖酸的甾醇酯；糖酸和包含约10至18个碳原子的脂肪族醇的酯；糖和包含约10至18个碳原子的脂肪族酸的酯；糖酸，皂苷；和皂苷元；和

e)至少一种第五成员，选自由以下组成的组：甘油；含约10至18个碳原子的脂肪族酸的甘油二酯和三酯；和包含约10至18个碳原子的脂肪族醇。

48.如权利要求47所述的药物组合物，其中所述脂质混合物的(a)∶(b)∶(c)∶(d)∶(e)的重量比为基于所述脂质颗粒总重量的(1-5)∶(0.25-3)∶(0.25-3)∶(0.25-3)∶(0.25-3)。

49.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述脂质颗粒以约0.1μg/ml至1000μg/ml的量存在。

50.如权利要求49所述的药物组合物，其中所述脂质颗粒以约10μg/ml至800μg/ml的量存在。

51.如权利要求50所述的药物组合物，其中所述脂质颗粒以约200μg/ml至600μg/ml的量存在。

52.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述脂质颗粒的平均粒径为至多0.2μ(微米)。

53.如权利要求52所述的药物组合物，其中所述脂质颗粒的平均粒径为约0.02μ至0.2μ。

54.一种用于诊断包括人类的温血动物中的疾病、病症、综合征或其症状的药物组合物，所述药物组合物包括：

脂质纳米乳，其包括各自包括至少一种能够优先选择性地内在化到病态细胞内的非双层形成脂质的脂质颗粒，所述病态细胞包括癌细胞；

有效量的与所述脂质纳米乳组合的至少一种诊断剂；

和药学可接受的载体，

其中所述药物组合物是通过匀浆化加工制备的。

55.一种治疗或预防包括人类的温血动物中的疾病、病症和其症状的方法，其包括向所述动物施用有效量的权利要求1的药物组合物。

56.如权利要求55所述的方法，其中所述药物组合物嵌入手术插入动物体内的生物医疗装置的表面。

57.如权利要求56所述的方法，其中所述生物医疗装置为支架。

58.一种制备权利要求1的药物组合物的方法，其包括如下步骤：

a)混合至少一种非双层形成脂质与有效量的至少一种治疗剂，得到脂质部分；

b)将所述脂质部分加入到水相中，得到分散液；和

c)在由此足以分散所述至少一种非双层形成脂质的高剪切条件下搅拌所述分散液，形成包括脂质颗粒的脂质纳米乳。

59.如权利要求58所述的方法，还包括向所述药物组合物添加促乳化剂的步骤。

60.如权利要求59所述的方法，其中所述促乳化剂选自由以下组成的组：表面活性剂、溶剂、基于植物的脂肪源及其组合。

61.如权利要求60所述的方法，还包括在与所述治疗剂混合的步骤之前混合所述表面活性剂与所述至少一种非双层形成脂质的步骤。

62.如权利要求60所述的方法，还包括在与所述治疗剂混合的步骤之前混合所述基于植物的脂肪源与所述至少一种非双层形成脂质的步骤。

63.如权利要求60所述的方法，还包括在与所述至少一种非双层形成脂质混合的步骤之前混合所述溶剂与所述治疗剂的步骤。

64.如权利要求58所述的方法，其中所述搅拌步骤包括通过流体匀浆化方法加工所述脂质混合物。

65.如权利要求64所述的方法，其中所述流体匀浆化方法选自由以下组成的组：高剪切匀浆化、超声匀浆化、高压匀浆化及其组合。

66.如权利要求58所述的方法，还包括灭菌所述纳米乳。

67.如权利要求58所述的方法，还包括通过无菌过滤加工所述纳米乳。

68.如权利要求67所述的方法，其中所述加工步骤包括使所述纳米乳通过0.2μ膜。

69.一种诊断包括人类的温血动物中以细胞过度增殖为特征的疾病、病症、综合征或其症状的方法，所述方法包括向所述温血动物施用有效量的权利要求54所述的药物组合物。