CN112618516A - 一种用于调节肿瘤部位一氧化氮浓度的粒子制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于调节肿瘤部位一氧化氮浓度的粒子制备方法及应用，包括以下步骤：步骤1：将富精氨酸肽类树状大分子和碳纳米管溶于溶剂中形成混合溶液A，将混合溶液A加入水中形成混合溶液B；自组装形成纳米粒子NTRD；富精氨酸的肽类树状大分子和碳纳米管的质量比为5:1；步骤2：将步骤1得到的混合溶液B滴于透明质酸水溶液中，搅拌、震荡，去除多余透明质酸，即得所需纳米粒子；所述富精氨酸肽类树状大分子以肽类树状大分子为骨架，以精氨酸为端基功能化基团构成；本发明采用富精氨酸的肽类树状大分子供给精氨酸作为酶底物，能够大大提高肿瘤部位一氧化氮浓度，进而增加肿瘤部位血管舒张，促进粒子在肿瘤部位渗透。

Description

一种用于调节肿瘤部位一氧化氮浓度的粒子制备方法及应用
技术领域
本发明涉及药剂学技术领域，具体涉及一种用于调节肿瘤部位一氧化氮浓度的粒子制备方法及应用。
背景技术
一氧化氮是一种明星多功能信号分子，是高度活性的自由基。在体内L-精氨酸作为一氧化氮的供体，可被一氧化氮合酶(NOS)氧化。在某些情况下可被生理上的活性氧(ROS)如超氧阴离子或过氧化氢氧化。一氧化氮不但能够引起细胞凋亡，在抗击肿瘤过程中起到重要作用。同时一氧化氮与血管舒张程度的调节也息息相关。目前常见的NO工体是N-diazeniumdiolate系列和Snitrosothiols系列的盐。这些作为NO供体的盐，在血液循环中可能导致NO的暴释，不能在肿瘤部位可控释放。
发明内容
本发明针对现有技术存在的问题提供一种基于肽类树状大分子自组装形成的可生成NO的用于调节肿瘤部位一氧化氮浓度的粒子的制备方法及应用。
本发明采用的技术方案是：一种用于调节肿瘤部位一氧化氮浓度的粒子制备方法，包括以下步骤：
步骤1：将富精氨酸肽类树状大分子和碳纳米管溶于溶剂中形成混合溶液A，将混合溶液A加入水中形成混合溶液B；自组装形成纳米粒子NTRD；富精氨酸的肽类树状大分子和碳纳米管的质量比为5:1；
步骤2：将步骤1得到的混合溶液B滴于透明质酸水溶液中，搅拌、震荡，去除多余透明质酸，即得所需纳米粒子；
所述富精氨酸肽类树状大分子以肽类树状大分子为骨架，以精氨酸为端基功能化基团构成。
进一步的，所述富精氨酸肽类树状大分子是以精氨酸为支化单元的一代、二代或三代肽类树状大分子；
其中肽类树状大分子的结构如下：
Figure BDA0002883636520000021
进一步的，还包括以下步骤：将富精氨酸肽类树状大分子连接蒽环类药物，然后自组装于碳纳米管上；蒽环类药物为盐酸阿霉素；蒽环类药物通过腙键偶联在肽类树状大分子根部；精氨酸为L-精氨酸。
进一步的，所述步骤2中透明质酸水溶液的浓度为2mg/mL，混合溶液B和透明质酸水溶液的体积比为1:2。
进一步的，所述步骤1中溶剂为二甲基亚砜，自组装完成后透析除去有机溶剂。
进一步的，所述步骤2中去除透明质酸采用孔径为200nm的膜过滤。
进一步的，所述碳纳米管替换为石墨烯、金棒、硫化钼、ZnO纤维中的一种。
进一步的，所述步骤2中的透明质酸替换为海藻酸、牛血清蛋白、白蛋白中的一种。
一种调节肿瘤部位一氧化氮浓度的粒子在治疗肿瘤药物中的应用。
进一步的，所述治疗肿瘤药物为化疗药物。
本发明的有益效果是：
(1)本发明在自组装体中引入碳纳米管，具有优良的光热效果；光热效果能引起细胞因子(尤其是IFN-γ)的表达，提供一种刺激肿瘤部位诱导型一氧化氮合酶(iNOS)高表达的策略；
(2)本发明采用富精氨酸肽类树状大分子供给精氨酸作为酶底物，光热触发细胞因子IFN-γ高表达进而有效激活肿瘤部位一氧化氮合酶(iNOS)后，能够大大提高肿瘤部位一氧化氮浓度，进而增加肿瘤部位血管舒张，促进粒子在肿瘤部位渗透。
附图说明
图1为本发明步骤1得到的NTRD纳米粒子的示意图。
图2为本发明步骤2得到的AMBs纳米粒子的示意图。
图3为本发明实施例中得到的AMBs纳米粒子形貌的表征。
图4为本发明实施例中得到的AMBs纳米粒子的电位示意图。
图5为本发明实施例中得到的不同浓度的AMBs纳米粒子随时间变化的光热示意图。
图6为本发明实施例中得到的AMBs纳米粒子随时间变化表面氨基暴露量曲线图。
图7为本发明实施例中得到的AMBs纳米粒子随时间变化DOX的释放量曲线。
图8为本发明实施例中得到的AMBs纳米粒子的一氧化氮释放量示意图。
图9为本发明实施例中得到的AMBs纳米粒子化疗药物的核质分布示意图。
图10为本发明实施例中得到的AMBs纳米粒子的荧光密度示意图。
图11为本发明实施例中得到的AMBs纳米粒子ROS产生的SEM图。
图12为本发明实施例中得到的细胞凋亡示意图。
图13为本发明实施例中免疫细胞因子的释放示意图。
图14为本发明实施例中肿瘤部位iNOS的表达示意。
图15为本发明实施例中肿瘤部位NO浓度示意图。
图16为本发明实施例中肿瘤部位血流灌注量示意图。
图17为本发明实施例中AMBs纳米粒子在肿瘤部位的渗透示意图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步说明。
一种用于调节肿瘤部位一氧化氮浓度的粒子制备方法，包括以下步骤：
步骤1：将富精氨酸肽类树状大分子和碳纳米管溶于溶剂中形成混合溶液A，将混合溶液A加入水中形成混合溶液B；自组装形成纳米粒子NTRD，结构如图1所示；富精氨酸的肽类树状大分子和碳纳米管的质量比为5:1；所述富精氨酸肽类树状大分子是以精氨酸为支化单元的一代、二代或三代肽类树状大分子；
富精氨酸肽类树状大分子以肽类树状大分子为骨架，以精氨酸为端基功能化基团构成。
肽类树状大分子的结构如下：
Figure BDA0002883636520000041
将富精氨酸肽类树状大分子连接蒽环类药物，然后自组装于碳纳米管上；蒽环类药物为盐酸阿霉素；蒽环类药物通过腙键偶联在肽类树状大分子根部。
碳纳米管替换为石墨烯、金棒、硫化钼、ZnO纤维中的一种。
步骤2：将步骤1得到的混合溶液B滴于透明质酸水溶液中，搅拌、震荡，去除多余透明质酸，即得所需纳米粒子；透明质酸水溶液的浓度为2mg/mL，混合溶液B和透明质酸水溶液的体积比为1:2。溶剂为二甲基亚砜，自组装完成后透析除去有机溶剂。去除透明质酸采用孔径为200nm的膜过滤。透明质酸替换为海藻酸、牛血清蛋白、白蛋白中的一种。用透明质酸包裹步骤1得到的纳米粒子表面，形成负电荷表面电荷的粒子。
实施例
按照下面步骤制备用于调节肿瘤部位一氧化氮浓度的粒子：
步骤1：富精氨酸的肽类树状大分子的合成，可以通过发散法或收敛法制备
以发散法为例进行说明：
H-Lys-OMe·2HCl和Boc-Lys(Boc)-OH在缩合剂条件下缩合并纯化后，在强酸(三氟乙酸)条件下脱叔丁氧羰基(Boc)保护，乙醚洗涤沉淀后得二代的精氨酸树状分子。精确称取二代精氨酸树状分子与Boc-Lys(Boc)-OH与缩合剂(HOBT，EDC·HCl)，氮气氛围中二氯甲烷为溶剂条件下缩合，冰水浴下加入N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)。反应完成后分别在酸性、碱性条件下洗涤、干燥、柱层析纯化。得到三代树状分子(外侧有保护基)。
上述三代树状分子修饰水合肼后，脱保护后的三代树状分子在盐酸阿霉素在氮气保护下DMSO溶剂中，加入催化量冰醋酸，通过可逆腙键接合抗肿瘤药物，反应完成后减压蒸发溶剂，将溶液置于截流量为1500Da的透析袋中透析，所得水溶液冷冻干燥，得连接蒽环类药物的富精氨酸树状分子。具体方法可参照(201610282064.4)中肽类树状大分子制备方法，上述方法为现有方法，在此不再赘述。
步骤2：将10mg步骤1制备得到的富精氨酸肽类树状大分子和2mg碳纳米管溶于200μL二甲基亚砜中。在超声条件下将上述溶液滴入1800μL去离子水中自组装，透析(MWCO100KDa)除去有机溶剂，得到NTRD的悬液，4℃存储备用。
步骤3：将2mL步骤2得到的溶液滴入4mL浓度为2mg/mL的透明质酸水溶液中，搅拌、震荡。透明质酸分子将由正负电荷吸附包裹在NTRD粒子表面。用孔径200nm的膜过滤去离子水冲洗，去除多余的透明质酸后，在水中重悬。得AMBs溶液。
(1)对步骤3得到的AMBs纳米粒子进行表征
分别配制100μg/mL碳纳米管、NTRDs、AMBs溶液，将其滴在通网上，室温干燥，然后通过投射电镜进行观察，如图3所示。SWNT为碳纳米管形貌图，NTRD为步骤2得到的纳米粒子的形貌图，AMBs为步骤3得到的纳米粒子的形貌图。从图中可以看出AMBs为棒状纳米粒子。
(2)对步骤3得到的AMBs纳米粒子的电荷进行表征
分别配置100μg/mL碳纳米管(SWNT)、NTRDs、AMBs溶液，利用动态光散射法(DLS仪)测定表面电位，结果如图4所示。从图中可以看出，SWNT的表面电位为负电(-13.2mV)，当表面包覆富精氨酸的肽类树状大分子后，电位翻转为正点(+20.3mV)。而在AMBs中，透明质酸通过正负电荷吸附在粒子表面后，粒子电位为负电(-38.7mV)。AMBs粒子的负电表面保证了其生物相容性，能够在血液中长循环。
(3)AMBs纳米粒子的光热性能
分别配制浓度为30μg/mL、50μg/mL、80μg/mL的AMBs水溶液，对比例为PBS溶液。将上述溶液分别在波长为808nm的近红外激光照射12分钟后，用红外热像仪记录温度，从图5可以看出随着AMBs浓度的提高其温度越高，说明AMBs具有优异的光热效果。
(4)AMBs在透明质酸酶作用下水解表面透明质酸的氨基暴露实验
将质量浓度为100μg/mL的AMBs溶液和透明质酸酶溶液HAase(质量浓度为20μg/mL)在37℃条件下孵育2小时后降解AMBs表面的透明质酸。上述浓度为混合溶液中各组分的终浓度。对比例为AMBs溶液和NTRDs溶液，其中AMBs溶液中AMBs的质量浓度为100μg/mL；NTRDs溶液中NTRDs的质量浓度为100μg/mL。
将上述三种溶液分别于100μL荧光胺的DMF溶液混合，在室温条件下孵育10分钟。混合物用荧光光度计检测380nm激发，480nm发射的荧光强度。其结果如图6所示，从图中可以看出AMBs+HAase中暴露的胺随时间的变化迅速升高然后趋于稳定。可以看出粒子表面的透明质酸被成功水解。
(5)疏水药物释放行为
配制质量浓度为200μg/mL的AMBs溶液，将溶液分成几份分别置于pH为7.4、pH为5.0的缓冲溶液中。每个对照组设置加与不加透明质酸酶(HAase质量浓度为20μg/mL)。取1mL于节流分子量为1000Da的透析袋中。透析袋置于15mL上述缓冲液中，37℃下摇床孵育，振动速率150rpm。每1小时取出1mL外部缓冲液并补充1mL响应的新鲜缓冲液。对于光照组，两小时光照一次，光照功率1W/cm2，光照时间5分钟。用荧光分光光度计在480nm激发波长和560nm发射波长下测定了透析液中DOX的浓度，结果如图5所示，在酸性条件下，腙键断裂，化疗药物释放。
(6)一氧化氮的释放行为
实验组为AMBs(HAase)(用20μg/mL的HAase预处理2小时)和AMBs组；对照组为NTRD组、，L-Arg(L-精氨酸)组。
上述各组分别采用1U诱导型一氧化氮合酶(iNOS)，50mM醋酸镁，6M氧合血红蛋白，150μM的NADPH，18μM的H4B，180μM的DTT进行处理；处理过程为：在37℃下孵育0.5小时(三个对照组浓度以最终胍基浓度5mM确定)。
一氧化氮的量由氧合血红蛋白转化成高铁血红蛋白来测定(测401nm处的紫外吸收)，其结果如图8所示，体外iNOS可以成功氧化精氨酸，生成NO。
(7)化疗药物的核质分布
实验组为AMBs给予808nm近红外激光照射(AMBs+L组)和AMBs组，对照组为DOX和DOX.HCl。
将4T1细胞以5×104的密度接种在六孔板中，培养24小时后，将质量浓度为20μg/mL的AMBs溶液和AMBs+L溶液，和当量浓度的各对照组的1640培养基溶液与细胞孵育2小时后，吸出培养液，用PBS洗涤三次，收集细胞。
通过分离细胞核与细胞浆的试剂盒，在低渗透压条件下，使细胞充分膨胀，然后破坏细胞膜，释放出细胞浆，然后通过离心得到细胞核沉淀。分别检测细胞浆和细胞核中的阿霉素含量。
检测方法如下：每个孔的样品加入50μL 5M的HCl溶液，50℃孵育1.5小时，充分断裂腙键释放DOX。冷却后加入50μL 1M的NaOH溶液，涡旋混合。加入1mL氯仿/异丙醇(体积比4/1)，涡旋萃取出阿霉素。分离有机相后蒸干溶剂，加入1mL二甲基亚砜复溶，用荧光分光光度计定量阿霉素的量，结果如图9所示。从图中可以看出化疗药物能够成功实现入胞、入核。
(8)ROS检测
将4T1细胞以1×104的密度接种在玻底皿中，培养24小时后，将2μg/mL AMBs和当量浓度的各对照组的1640培养基溶液与细胞孵育2小时，给予808nm近红外光照后，用ROS染料DCFH-DA染色后，用PBS洗三次，通过激光共聚焦观察ROS产生情况，结果如图10所示。
定量检测：将4T1细胞以1×104的密度接种在96孔板中，培养24小时后，将2μg/mLAMBs和当量浓度的各对照组的1640培养基溶液与细胞孵育2小时，给予808nm近红外光照后，用ROS染料DCFH-DA染色后，用PBS洗三次，通过酶标仪检测488nm激发，525nm发射下的荧光强度，结果如图11所示，光照作用下，能够提高肿瘤部位ROS浓度。
(9)细胞凋亡检测
将鼠三阴乳腺癌细胞株4T1以1×104的密度接种在6孔板中，将2μg/mL AMBs和当量浓度的各对照组的1640培养基溶液与细胞孵育24小时，PBS洗涤两遍后，用7-AAD和Annexin V-APC室温下染色15分钟，通过流式细胞仪检测，结果如图12所示，肿瘤细胞大量凋亡，凋亡的肿瘤细胞产生的大量肿瘤相关抗原，为后续细胞因子释放、一氧化氮合酶激活提供了必要条件。
(10)免疫细胞因子释放
将4T1细胞以5×104的数量接种在BALB/c毛鼠的腋下。当肿瘤长到100mm3时，通过尾静脉注射AMBs及各个对照组，给药浓度为10mg/kg，各个对照组都换算成当量的DOX和SWNT给药量。激光光照组在注射的3小时光照(808nm,10分钟)。24小时后杀死老鼠，取小鼠血清(眼部取全血与抗凝管后，1500rpm,10min离心取上清血浆)，通过Elisa方法分别检测TH1细胞因子(IFN-γ、IL-1β、TNF-α)，TH2细胞因子(IL-10、IL-4)。
简述Elisa测细胞因子的方法：酶标板孔中分别加不同组的血浆标本、标准品(100ul/孔)，用封板胶纸封住反应孔，37℃孵箱孵育90分钟后，PBS洗板5次,空白孔加生物素化抗体稀释液，其余孔加入生物素化抗体工作液(100ul/孔),用新的封板胶纸封住板子，37℃孵育60分钟后，洗板5次。空白孔加酶结合物稀释液，其余孔种加酶结合物工作液(100ul/孔)。用新的封板胶纸封住反应孔，37℃避光孵育30分钟。洗板5次后，加入显色底物(TMB)(100ul/孔)，避光37℃孵育15分钟。加入反应终止液(100ul/孔),混匀后立即测量OD450值，结果如图13所示，小鼠血清中细胞因子浓度提高。
(11)肿瘤部位iNOS高表达
同上地，将4T1细胞以5×104的数量接种在BALB/c毛鼠的腋下。当肿瘤长到100mm3时，通过尾静脉注射AMBs及各个对照组，给药浓度为10mg/kg，各个对照组都换算成当量的DOX和SWNT给药量。激光光照组在注射的6小时光照(808nm,10分钟)。48小时后，处死小鼠，无菌条件下解剖肿瘤。将肿瘤用无菌解剖剪剪成小块，浸泡于无血清的1640培养基。加入IV型胶原酶(浓度0.5％)消化肿瘤组织，37℃培养2小时。过200目细胞筛过滤，收集滤液，PBS洗涤三遍后，分别用荧光标记的F4/80和iNOS抗体染色，流式细胞仪检测，结果如图14所示，肿瘤部位iNOS表达水平提高。
(12)肿瘤部位NO的产生
同上地，将4T1细胞以5×104的数量接种在BALB/c毛鼠的腋下。当肿瘤长到100mm3时，通过尾静脉注射AMBs及各个对照组，给药浓度为10mg/kg，各个对照组都换算成当量的DOX和SWNT给药量。激光光照组在注射的6小时光照(808nm,1W/cm2,10分钟)。48小时后，继续给药(同上：通过尾静脉注射AMBs及各个对照组，给药浓度为10mg/kg，各个对照组都换算成当量的DOX和SWNT给药量。激光光照组在注射的3小时光照(808nm,10分钟))。48小时后，处死小鼠，无菌条件下解剖肿瘤，称重。将肿瘤用无菌解剖剪剪成小块，浸泡于无血清的1640培养基，培养24小时后，用Griess试剂盒测培养液中的NO2 -的浓度，结果如图15所示，肿瘤部位NO浓度升高。
简述Griess法测NO2 -的浓度的方法：96孔板中，每孔依次加入各组培养液和标样60μL，NADPH(2mM)5μL，黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD，10μL)，硝酸还原酶5μL，混匀后37℃孵育30分钟。加入LDH buffer 10μL，LDH 10μL以清除NADPH，混匀后37℃孵育30分钟。加入GrissReagent I和Griss Reagent II，混匀后室温20-30分钟后，测定A540 nm。标样由NaNO2配置。
(13)多普勒检测肿瘤部位的血流灌注量
同上地，将4T1细胞以5×104的数量接种在BALB/c毛鼠的腋下。当肿瘤长到100mm3时，通过尾静脉注射AMBs及各个对照组，给药浓度为10mg/kg，各个对照组都换算成当量的DOX和SWNT给药量。激光光照组在注射的6小时光照(808nm,1W/cm2,10分钟)。48小时后，继续给药(同上：通过尾静脉注射AMBs及各个对照组，给药浓度为10mg/kg，各个对照组都换算成当量的DOX和SWNT给药量。激光光照组在注射的3小时光照(808nm,10分钟))。48小时后，通过多普勒血流仪检测肿瘤部位血流灌注量，结果如图16所示，肿瘤部位血管扩张，血流灌注量提升。
(14)光声成像观测AMBs在肿瘤中的渗透
同上地，将4T1细胞以5×104的数量接种在BALB/c毛鼠的腋下。当肿瘤长到100mm3时，通过尾静脉注射AMBs及各个对照组，给药浓度为10mg/kg，各个对照组都换算成当量的DOX和SWNT给药量。激光光照组在注射的6小时光照(808nm,10分钟)。48小时后，继续给药(同上：通过尾静脉注射AMBs及各个对照组，给药浓度为10mg/kg，各个对照组都换算成当量的DOX和SWNT给药量。激光光照组在注射的3小时光照(808nm,1W/cm2,10分钟))。通过水合氯醛(0.1mg/mL)腹腔注射麻醉小鼠。用光声成像仪，观察SWNT的信号分布，结果如图17所示，纳米粒子在肿瘤部位的渗透效果得到显著提升。
本发明在自组装体中引入碳纳米管，具有优良的光热效果；光热效果能引起细胞因子(尤其是IFN-γ)的表达，提供一种刺激肿瘤部位诱导型一氧化氮合酶(iNOS)高表达的策略；采用富精氨酸的肽类树状大分子供给精氨酸作为酶底物，能够大大提高肿瘤部位一氧化氮浓度，进而增加肿瘤部位血管舒张，促进粒子在肿瘤部位渗透。

Claims (10)

1.一种用于调节肿瘤部位一氧化氮浓度的粒子制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：将富精氨酸肽类树状大分子和碳纳米管溶于溶剂中形成混合溶液A，将混合溶液A加入水中形成混合溶液B；自组装形成纳米粒子NTRD；富精氨酸的肽类树状大分子和碳纳米管的质量比为5:1；
步骤2：将步骤1得到的混合溶液B滴于透明质酸水溶液中，搅拌、震荡，去除多余透明质酸，即得所需纳米粒子；
所述富精氨酸肽类树状大分子以肽类树状大分子为骨架，以精氨酸为端基功能化基团构成。
2.根据权利要求1所述的一种用于调节肿瘤部位一氧化氮浓度的粒子制备方法，其特征在于，所述富精氨酸肽类树状大分子是以精氨酸为支化单元的一代、二代或三代肽类树状大分子；
肽类树状大分子的结构如下：
Figure FDA0002883636510000011
3.根据权利要求1所述的一种用于调节肿瘤部位一氧化氮浓度的粒子制备方法，其特征在于，还包括以下步骤：
将富精氨酸肽类树状大分子连接蒽环类药物，然后自组装于碳纳米管上；蒽环类药物为盐酸阿霉素；蒽环类药物通过腙键偶联在肽类树状大分子根部；精氨酸为L-精氨酸。
4.根据权利要求1所述的一种用于调节肿瘤部位一氧化氮浓度的粒子制备方法，其特征在于，所述步骤2中透明质酸水溶液的浓度为2mg/mL，混合溶液B和透明质酸水溶液的体积比为1:2。
5.根据权利要求1所述的一种用于调节肿瘤部位一氧化氮浓度的粒子制备方法，其特征在于，所述步骤1中溶剂为二甲基亚砜，自组装完成后透析除去有机溶剂。
6.根据权利要求1所述的一种用于调节肿瘤部位一氧化氮浓度的粒子制备方法，其特征在于，所述步骤2中去除透明质酸采用孔径为200nm的膜过滤。
7.根据权利要求1所述的一种用于调节肿瘤部位一氧化氮浓度的粒子制备方法，其特征在于，所述碳纳米管替换为石墨烯、金棒、硫化钼、ZnO纤维中的一种。
8.根据权利要求1所述的一种用于调节肿瘤部位一氧化氮浓度的粒子制备方法，其特征在于，所述步骤2中的透明质酸替换为海藻酸、牛血清蛋白、白蛋白中的一种。
9.采用如权利要求1～8所示制备的用于调节肿瘤部位一氧化氮浓度的粒子在治疗肿瘤药物中的应用。
10.根据权利要求9所述的一种应用，其特征在于，所述治疗肿瘤药物为化疗药物。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113549611A (zh) * 2021-06-10 2021-10-26 深圳大学 一种级联纳米酶及其制备方法与应用

Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1553965A2 (en) * 2002-07-31 2005-07-20 The Regents of The University of California Method of treating tumors
US20150147276A1 (en) * 2012-06-07 2015-05-28 President And Fellows Of Harvard College Nanotherapeutics for drug targeting
KR20160039376A (ko) * 2014-10-01 2016-04-11 강원대학교산학협력단 금 나노입자가 도입된 펩타이드 나노자기조립체의 제조 방법 및 이에 의해 제조된 금 나노입자가 도입된 펩타이드 나노자기조립체
CN105833294A (zh) * 2016-04-29 2016-08-10 四川大学 一种生物响应型诊疗一体化的肽类树状大分子组装体及其制备方法和应用
CN106421806A (zh) * 2016-11-14 2017-02-22 四川大学 一种逐级响应纳米自组装树枝状前药及制备方法和应用
CN107049955A (zh) * 2016-11-21 2017-08-18 中国药科大学 一种载甲氨蝶呤的多级靶向透明质酸纳米粒及其制备方法
CN107137718A (zh) * 2017-04-07 2017-09-08 上海长海医院 一种肽修饰的多壁碳纳米管载体及其制备方法和应用
CN107625968A (zh) * 2017-09-20 2018-01-26 四川大学 一种肿瘤特异性组织‑细胞双渗透纳米粒、制备方法及其应用
CN107802840A (zh) * 2017-11-27 2018-03-16 四川大学 一种基于肽类树形分子修饰荧光碳点的肿瘤微环境响应纳米粒及其制备方法
CN109700761A (zh) * 2018-12-19 2019-05-03 武汉工程大学 一种肿瘤靶向自运载体系及其制备方法、应用
CN110665008A (zh) * 2019-11-19 2020-01-10 南京智能高端装备产业研究院有限公司 强效溶瘤的棒状纳米组装体及其制备方法和应用

Patent Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1553965A2 (en) * 2002-07-31 2005-07-20 The Regents of The University of California Method of treating tumors
US20150147276A1 (en) * 2012-06-07 2015-05-28 President And Fellows Of Harvard College Nanotherapeutics for drug targeting
KR20160039376A (ko) * 2014-10-01 2016-04-11 강원대학교산학협력단 금 나노입자가 도입된 펩타이드 나노자기조립체의 제조 방법 및 이에 의해 제조된 금 나노입자가 도입된 펩타이드 나노자기조립체
CN105833294A (zh) * 2016-04-29 2016-08-10 四川大学 一种生物响应型诊疗一体化的肽类树状大分子组装体及其制备方法和应用
CN106421806A (zh) * 2016-11-14 2017-02-22 四川大学 一种逐级响应纳米自组装树枝状前药及制备方法和应用
CN107049955A (zh) * 2016-11-21 2017-08-18 中国药科大学 一种载甲氨蝶呤的多级靶向透明质酸纳米粒及其制备方法
CN107137718A (zh) * 2017-04-07 2017-09-08 上海长海医院 一种肽修饰的多壁碳纳米管载体及其制备方法和应用
CN107625968A (zh) * 2017-09-20 2018-01-26 四川大学 一种肿瘤特异性组织‑细胞双渗透纳米粒、制备方法及其应用
CN107802840A (zh) * 2017-11-27 2018-03-16 四川大学 一种基于肽类树形分子修饰荧光碳点的肿瘤微环境响应纳米粒及其制备方法
CN109700761A (zh) * 2018-12-19 2019-05-03 武汉工程大学 一种肿瘤靶向自运载体系及其制备方法、应用
CN110665008A (zh) * 2019-11-19 2020-01-10 南京智能高端装备产业研究院有限公司 强效溶瘤的棒状纳米组装体及其制备方法和应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HU, JINGJING: "Targeted Dendrimers for Cancer Diagnosis and Therapy", 《BIOMEDICAL NANOMATERIALS》 *
HUAYU WU: "《A Bacteria-Inspired Morphology Genetic》", 《ACS NANO》 *
张利，等: "可活化细胞穿膜肽在肿瘤治疗领域的应用", 《药学学报》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113549611A (zh) * 2021-06-10 2021-10-26 深圳大学 一种级联纳米酶及其制备方法与应用
CN113549611B (zh) * 2021-06-10 2023-05-05 深圳大学 一种级联纳米酶及其制备方法与应用

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