CN106310296B - 基于透明质酸-肽类树状大分子-钆偶联物的磁共振影像探针及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种基于透明质酸‑肽类树状大分子‑钆偶联物的磁共振影像探针，其结构为多个扇形肽类树状大分子和钆的偶联物连接在透明质酸糖链上。选择透明质酸(Hyaluronic acid，HA)作为大分子骨架链段，结合HA和肽类树状大分子的优点，构建一个基于透明质酸‑肽类树状大分子‑Gd偶联的MRI造影剂(Dendronized‑HA‑Gd)，该结构骨架本身具有可生物降解能力，无需引入其它敏感键来构筑可降解片段。

Description

基于透明质酸-肽类树状大分子-钆偶联物的磁共振影像探针 及其制备方法
技术领域
本发明属于医学成像技术领域，涉及一种高分子磁共振成像探针，具体涉及一种基于透明质酸-肽类树状大分子-钆偶联物的磁共振影像探针及其制备方法。
背景技术
在磁共振成像的临床诊断中，通常需要消耗数分钟或者数十分钟来完成整个操作，而目前商用的钆类造影剂在体内的循环时间只有十几分钟，在成像过程中，可能会出现信号未收集完成时造影剂已被代谢排出体外的尴尬局面，限制了其在某些较复杂成像上的应用。因此，目前很多研究工作集中在将小分子钆类造影剂连接到大分子载体上，如树状大分子、脂质体和大分子蛋白等，来延长钆配体的旋转相关时间，从而提高其弛豫效率的目的。
高分子钆类MRI(磁共振成像)造影剂通常拥有较高的弛豫效能，其较长的体内循环时间为材料到达肿瘤部位提供了基础，而EPR效应(增强渗透和滞留效应)可以促使材料在肿瘤部位获得较高的聚集。这些特点使得大分子MRI造影剂具有很大的应用潜力。然而，在具体应用中，一个主要的制约因素是大分子材料的缓慢降解，导致其在体内残留量高，增加了由材料本身或钆类造影剂带来的毒性风险。例如，基于聚丙烯亚胺(PPI)和聚酰胺(PAMAM)树状大分子的MRI造影剂已被研究用于肿瘤的诊断，但是由于PPI或PAMAM自身不可降解，在注入体内数天后仍有残留。与PPI和PAMAM相比，肽类树状大分子具有可生物降解性能，为其在生物医学领域中的应用奠定了基础。但是肽类树状大分子应用于MRI造影时，其水相弛豫效率表现出了分子量依赖的关系：即尺寸和分子量越大，弛豫效率越高，体内循环时间越长。然而，高代数的肽类树状大分子合成难度大，且单独使用时由于尺寸过小易被排出体外。
发明内容
基于以上技术问题，本发明提供了一种基于透明质酸-肽类树状大分子-钆偶联物的磁共振影像探针。选择透明质酸(Hyaluronic acid，HA)作为大分子骨架链段，结合HA和肽类树状大分子的优点，构建一个基于透明质酸-肽类树状大分子-Gd偶联物的MRI造影剂(Dendronized-HA-Gd)，该结构骨架本身具有可生物降解能力，无需引入其它敏感键来构筑可降解片段。
为了实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：
基于透明质酸-肽类树状大分子-钆偶联物的磁共振影像探针，其结构为多个扇形肽类树状大分子和钆的偶联物连接在透明质酸糖链上。
选择透明质酸(Hyaluronic acid，HA)作为大分子骨架链段。HA是由D-葡萄糖醛酸及N-乙酰葡糖胺交替组成的带负电荷的聚阴离子天然多糖，在生物体内广泛存在，具有优异的生物相容性，水溶性，无免疫原性和可降解能力。且透明质酸的骨架链上存在多种活性基团，种类和数目一定，更有利于作为载体材料的修饰。同时，HA可以和肿瘤细胞表面过量表达的CD44受体结合，对多种肿瘤细胞具有靶向的功能。
具体结构如下：
其中:A是以乙二胺为核的赖氨酸扇形肽类树状大分子，R与肽类树状大分子的末端氨基连接，
n＝1～16。
本发明所述的肽类树状大分子是三代肽类树状大分子。三代的树状大分子外围的可修饰位点多，且在和透明质酸的反应中，三代大分子又比更高代数的反应位阻小，综合考虑选择扇形的三代肽类树状大分子为最优。
本发明所述透明质酸-肽类树状大分子-钆偶联物的制备方法，先分别合成端位为叠氮基的肽类树状大分子-钆偶联物和炔基化透明质酸，再通过铜催化的点击反应合成终产物Dendronized-HA-Gd。
在树状大分子的的端位引入叠氮基，Gd(III)和配体的络合在“Click”反应前进行。“Click”反应后，得到的Dendronized-HA-Gd具有优异的水溶性(＞100mg/mL)，这对于它作为MRI造影剂是很有利的。
优选地，所述肽类树状大分子-钆偶联物的合成如下：
第一步，以Boc基团保护的树状大分子为原料，在氮气保护的冰浴条件下，树状大分子溶于无水CH2Cl2中，向其中加入TFA，反应结束后，除去TFA，将反应产物溶于DMF中，在氮气保护的冰浴条件下，向体系中同时加入DIPEA、HOAt、HATU和DOTA，反应得到中间产物；
第二步，在氮气保护的冰浴条件下，将所述中间产物溶于无水CH2Cl2中，向其中加入TFA，将反应产物溶解在去离子水中，向其中加入GdCl3·6H2O，反应结束后，得到肽类树状大分子-钆偶联物。
进一步优选地，将反应结束后的混合体系用截留分子量为1000的透析袋透析。透析目的是去除分子量小于1000的多余的Gd(Ⅲ)离子。
优选地，所述炔基化透明质酸的合成：将透明质酸钠溶解在去离子水中，向其中加入DMTMM来活化透明质酸钠骨架链段上的羧基，向混合体系中加入丙炔胺，反应结束后，得到炔基化的透明质酸。
HA的骨架链段具有精确的结构，其侧链基团为羧基和羟基，且基团数恒定，这将有利于对其进行修饰。而对于HA的修饰，大多数是利用其链段上的羧基进行缩合反应。本发明选择水相缩合反应，对HA进行炔基化修饰。通常情况下，在缩合反应中要先对羧基进行活化，因此需要用到活化试剂或缩合剂。DMTMM是一种高效的水相缩合剂，可以用来结合小分子和大分子，尤其是在聚多糖的修饰上。与传统的活化试剂相比，DMTMM参与的缩合反应产率高，价格便宜，且副产物通过透析就可处理干净。
进一步优选地，将反应结束后的混合体系用截留分子量为1000的透析袋透析。透析目的是去除分子量小于1000的过量的反应物和副产物。
优选地，所述Dendronized-HA-Gd的合成：在氮气保护的冰浴条件下，将肽类树状大分子-钆偶联物、炔基化透明质酸和抗坏血酸钠溶于去离子水中，向其中加入CuSO4·5H2O，反应结束后，得到终产物。
进一步优选地，将反应结束后的混合体系在EDTA溶液中用截留分子量为6000-8000的透析袋透析。透析目的是除去过量的肽类树状大分子-钆偶联物。
本发明的有益效果在于：
1、本发明结合HA和肽类树状大分子的优点，构建了一个基于透明质酸-肽类树状大分子-钆偶联物的MRI造影剂，有效的提高了钆配体的纵向弛豫效率，解决了小分子造影剂弛豫效率低的问题。其原理如下：影响T1造影剂纵向弛豫效率r1的相关因素有：1)与Gd(III)配位的内配层水分子数q；2)内外配层水分子的交换速率1/τm；3)配合物的旋转相关时间。从配合物稳定性及实际操作难易程度出发，由Solomon-Bloembergen-Mogan方程得出，通过降低配合物的翻转速率延长其旋转相关时间，或者将多个小分子T1造影剂接枝到一个载体上构筑纳米型或大分子型的多价态新型造影剂，是获得具有高弛豫效能T1造影剂的有效手段。基于以上原理，本发明将多个小分子T1造影剂接枝到一个载体上来构筑大分子型的多价态新型造影剂，可以降低配合物的翻转速率从而延长其旋转相关时间，达到提高弛豫效率的目的。
2、本发明采用扇形肽类树状大分子的优点是位阻小，端位可单独修饰，便于与直链的HA结合，且得到的偶联物结构规整。
3、由于透明质酸不含硫，骨架链上存在多种活性基团，且种类和数目一定，更有利于作为载体材料的修饰，并且透明质酸具有优异的生物相容性和水溶性，无免疫原型和可生物降解能力。因此，本发明选用透明质酸与树状大分子杂化，起到了优化结构，增加偶联物的亲水性的作用。
4、Dendronized-HA-Gd偶联物利用EPR效应(实体瘤的高通透性和滞留效应)聚集在肿瘤组织，实现了在肿瘤组织部位较高的对比增强效果，解决了小分子造影剂无特异性的问题。
5、Dendronized-HA-Gd结构骨架本身具有良好的生物降解能力，无需引入其它敏感键来构筑可降解片段。偶联物降解后可以通过肾清除排出体外，不会较长时间的残留在体内，具有良好的生物安全性。对血液成分的正常机制、正常细胞的生长、正常小鼠的行为和机体都不会产生不良影响。
附图说明
图1为炔基化透明质酸的1HNMR表征图。
图2为偶联体Ⅲ和HA的GPC测试结果图。
图3为经透明质酸酶孵育(▲)和PBS孵育(●)的体外降解测试结果图。
图4为3T磁场下Dendronized-HA-Gd偶联物和Gd-DTPA在不同Gd(III)浓度下的显影效果图。
图5为3T磁场下Dendronized-HA-Gd偶联物和Gd-DTPA在不同Gd(III)浓度下的T1弛豫效率/Gd(III)浓度曲线图。
图6为注射了Dendronized-HA-Gd偶联物和Gd-DTPA的小鼠在不同时间点肿瘤部位的MRI成像效果图。
图7为注射了Dendronized-HA-Gd偶联物和Gd-DTPA的小鼠在不同时间点肿瘤部位的相对信噪比增强ΔSNR。
图8为Dendronized-HA-Gd偶联物30min和20h的体内分布情况。
图9为Dendronized-HA-Gd和Gd-DTPA孵育过的全血的血栓弹力图。
图10为Dendronized-HA-Gd和Gd-DTPA孵育过的全血的血栓弹力图参数。
图11为Dendronized-HA-Gd偶联物和Gd-DTPA对红细胞形貌和聚集的影响(SEM放大倍数分别为500倍和2000倍)。
图12为Gd-DTPA和Dendronized-HA-Gd偶联物的细胞毒性评价。
图13为正常小鼠注射Gd-DTPA和Dendronized-HA-Gd偶联物后的体重变化。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明的实质性内容作进一步详细的描述。
实施例1
基于透明质酸-肽类树状大分子-钆偶联物的磁共振影像探针，结构为多个扇形肽类树状大分子和钆的偶联物连接在透明质酸糖链上。具体结构如下：
其中A是以乙二胺为核的赖氨酸扇形肽类树状大分子，R与肽类树状大分子的末端氨基连接，
偶联体Ⅰ：n＝1，A是1代赖氨酸扇形树状大分子。
偶联体Ⅱ：n＝4，A是2代赖氨酸扇形树状大分子。
偶联体Ⅲ：n＝6，A是3代赖氨酸扇形树状大分子。
偶联体Ⅳ：n＝8，A是3代赖氨酸扇形树状大分子。
偶联体Ⅴ：n＝16，A是4代赖氨酸扇形树状大分子。
实施例2
基于透明质酸-肽类树状大分子-钆偶联物的磁共振影像探针的制备方法，先分别合成端位为叠氮基的肽类树状大分子-钆偶联物和炔基化透明质酸，再通过铜催化的点击反应合成终产物Dendronized-HA-Gd。
实施例3
本实施例在实施例2的基础上：
所述肽类树状大分子-钆偶联物的合成如下：
第一步，以Boc基团保护的树状大分子为原料，在氮气保护的冰浴条件下，树状大分子溶于无水CH2Cl2中，向其中加入TFA，反应结束后，除去TFA，将反应产物溶于DMF中，在氮气保护的冰浴条件下，向体系中同时加入DIPEA、HOAt、HATU和DOTA，反应得到中间产物；
第二步，在氮气保护的冰浴条件下，将所述中间产物溶于无水CH2Cl2中，向其中加入TFA，反应结束后，除去TFA，将反应产物溶解在去离子水中，向其中加入GdCl3·6H2O，反应结束后，得到肽类树状大分子-钆偶联物。
实施例4
本实施例在实施例3的基础上：
将反应结束后的混合体系用截留分子量为1000的透析袋透析去除多余的Gd(Ⅲ)离子，经冷冻干燥即得肽类树状大分子-钆偶联物。
实施例5
本实施例在实施例2的基础上：
所述炔基化透明质酸的合成：将透明质酸钠溶解在去离子水中，向其中加入DMTMM来活化透明质酸钠骨架链段上的羧基，向混合体系中加入丙炔胺，反应结束后，得到炔基化的透明质酸。
实施例6
本实施例在实施例5的基础上：
将反应结束后的混合体系用截留分子量为1000的透析袋透析去除过量的反应物和副产物，冷冻干燥后得到炔基化的透明质酸钠。
实施例7
本实施例在实施例2的基础上：
Dendronized-HA-Gd的合成：在氮气保护的冰浴条件下，将肽类树状大分子-钆偶联物、炔基化透明质酸和抗坏血酸钠溶于去离子水中，向其中加入CuSO4·5H2O，反应结束后，得到终产物。
实施例8
本实施例在实施例7的基础上：
将反应结束后的混合体系在EDTA溶液中用截留分子量为6000-8000的透析袋透析，冷冻干燥后得到终产物Dendronized-HA-Gd。
实施例9
炔基化透明质酸的合成，具体步骤如下：
透明质酸钠(0.4g,0.99mmol)溶解在150mL去离子水中，用0.1M的HCl将体系的pH调至4.3左右，向其中加入DMTMM(0.82g,2.97mmol)用来活透明质酸钠骨架链段上的羧基。30min后，向混合体系中加入丙炔胺(0.16g,2.97mmol)，冰浴下反应5h。反应结束后，用截留分子量为1000的透析袋将混合体系透析2天，去除过量的反应物和副产物，冷冻干燥后得到白色固体HA-alkyne。1HNMR(400MHz,D2O):δ(ppm)＝2.81(s,1H,NHCH2CCH)，3.0-4.0(m,2H,NHCH2CCH；m,10H,backbone of sugar units)，见图1。
图1显示的是HA-alkyne的核磁谱图，2.81ppm处是丙炔胺上的炔基氢的位移，由积分值得出，大概每四个HA重复单元连接一个丙炔胺。
实施例10
Dendronized-HA-Gd(3代)的合成路线如下：
具体步骤如下：
A、Dendron 4的合成
氮气保护冰浴条件下，Dendron 3(0.88g，0.46mmol)溶于6.2mL无水CH2Cl2中，向其中加入6.2mLTFA。避光反应半小时后，移至室温继续反应2h，减压蒸除溶剂，有白色固体析出。向其中加入无水乙醚，离心分离弃去上清液，用无水乙醚处理三次，收集沉淀。脱过保护的产品经真空干燥1h后溶于40mLDMF中，氮气保护冰浴下，向体系中同时加入DIPEA，HOAt(0.74g，5.54mmol)，HATU(2.1g，5.54mmol)和DOTA(3.2g，5.54mmol)。混合体系在冰浴下避光反应30min后，移至室温继续搅拌72h。反应结束后，减压蒸除溶剂，将得到的黄色油状物溶于300mL乙酸乙酯中，依次用饱和NaHCO3溶液、1M的HCl溶液和饱和NaCl溶液洗涤，收集有机层，用无水MgSO4干燥15min。过滤除去干燥剂，滤液经减压旋蒸浓缩到刚好有固体析出时，放置于冰箱中。待有大量固体析出后，一边过滤，一边用乙醚洗涤，收集固体，真空干燥后得到棕色固体Dendron4，产率为86.2％。MALDI-TOF MS:m/z＝4432.69([M+H]+)。
B、Dendron 5的合成
氮气保护冰浴条件下，Dendron 4(1.5g，0.33mmol)溶于6.2mL无水CH2Cl2中，向其中加入6.2mLTFA。避光反应半小时后，移至室温继续反应2h，减压蒸除溶剂，有白色固体析出。向其中加入无水乙醚，离心分离弃去上清液，用无水乙醚处理三次，收集沉淀。真空干燥1h后，将得到的固体溶解在100mL去离子水中，向其中加入GdCl3·6H2O(2.19g，5.94mmol)，用0.1M的NaOH水溶液将体系的pH调至5.5，室温避光下剧烈搅拌24h。反应结束后，将混合体系用截留分子量为1000的透析袋透析2天去除多余的Gd(III)离子，经过冷冻干燥得到白色固体Dendron 5。
C、Dendronized-HA-Gd的合成
氮气保护的冰浴下，肽类树状大分子－钆偶联物(0.34mmol)、HA-alkyne(0.17mmol)和抗坏血酸钠溶于100mL去离子水中，向其中加入CuSO4·5H2O(5mL)，冰浴下搅拌30min后，移至40℃避光反应20小时。反应结束后，在1mM的EDTA溶液中，用截留分子量为6000-8000的透析袋透析2天，冷冻干燥后得到终产物Dendronized-HA-Gd。
在图2的GPC测试结果中，Dendronized-HA-Gd的出峰时间比HA的早，说明其分子量大于HA的分子量，平均分子量为23300kDa(PDI＝2.58)。证明HA和Dendron-Gd之间的“Click”反应是成功的。用DLS对Dendronized-HA-Gd的zeta电位进行测试，结果测得zeta电位为-35mV，主要归因于HA链段上的羟基和羧基。Dendronized-HA-Gd具有的高分子结构和负电荷性能，使得其在体内具有长循环功能，避免和血清蛋白的相互作用，从而有效的靶向到肿瘤部位。
Dendronized-Gd的合成中，末端氨基接枝完全是最理想的状态，但受空间位阻效应的影响，Dendron 3末端的氨基和DOTA配体很难反应完全，实际会出现部分接枝的情况，本实施例结果得到的偶联个数是6个。
实施例11
偶联体Ⅰ和偶联体Ⅱ的合成方法参照实施例10，大分子原料为2代树状大分子。
偶联体Ⅴ的合成方法参照实施例10，大分子原料为4代树状大分子。
实施例12
树状大分子的合成路线如下：
A、化合物1的合成
N2保护下，对叠氮苯甲酸(0.5g，3.06mmol)溶于50mL无水DMF，向其中加入DIPEA(2.37g，18.36mmol)，冰浴下搅拌30min后，N-Boc-乙二胺(0.59g，3.68mmol)，HOBt(0.50g，3.68mmol)和HBTU(1.39g，3.68mmol)同时加入到上述混合体系中。室温避光反应24h后,减压蒸除溶剂。将残余物溶于300mL乙酸乙酯中，依次用饱和NaHCO3溶液，1M的HCl溶液和饱和NaCl溶液洗涤，收集有机层，用无水MgSO4干燥15min。过滤除去干燥剂，滤液经减压旋蒸到一定体积后(刚好有固体析出)，放置于冰箱中。待有大量固体析出后，过滤收集固体，真空干燥后得化合物1(白色固体)0.8g，产率86.5％。1H NMR(400MHz,CDCl3)，δ＝1.45(s,9H,CH3-Boc)，3.38-3.63(m,4H,NHCH2CH2NH)，7.06-7.11和7.83-7.88(m,4H,COC6H4N3)；ESI-TOFMS:m/z＝306.15([M+H]+)，C14H19N5O3H]。
B、Dendron 1的合成
N2保护冰浴下，化合物1(0.5g，1.64mmol)溶于1.22mL无水CH2Cl2中，加入1.22mLTFA，室温避光搅拌2h后，减压蒸除溶剂，得无色油状物。向其中加入无水乙醚，有沉淀生成。离心收集沉淀，用无水乙醚洗三次，真空干燥1h，得到白色固体。氮气保护冰浴下，脱过保护的产品溶于50mL无水DMF，向其中加入DIPEA(1.27g，9.84mmol)，Boc-L-Lys(Boc)-OH(0.68g，1.97mmol),HBTU(0.75g，1.97mmol)和HOBt(0.26g，1.97mmol)。冰浴下避光搅拌30min后，移至室温继续反应24h，减压蒸除溶剂，得黄色油状物。将残余物溶于300mL乙酸乙酯中，依次用饱和NaHCO3溶液，1M的HCl溶液和饱和NaCl溶液洗涤，收集有机层，用无水MgSO4干燥15min。过滤除去干燥剂，滤液经减压旋蒸浓缩到刚好有固体析出时，放置于冰箱中。待有大量固体析出后，过滤收集固体，用乙醚洗涤，真空干燥后得到0.72g白色固体Dendron1，产率82.4％。1H NMR(400MHz,CDCl3)，δ＝1.41-1.50(s,18H,CH3-Boc)，1.57-1.87(m,6H,CH(R)NHCH2CH2CH2CH2NH)，3.48-3.74(m,4H,NHCH2CH2NH)，3.01-3.05(m,2H,CH(R)NHCH2CH2CH2CH2NH)，4.02(s,1H,CH(R)NHCH2CH2CH2CH2NH)，7.05-7.14和7.85-7.94(m,4H,COC6H4N3)；ESI-TOF MS:m/z＝556.30([M+Na]+，C25H39N7O6Na)。
C、2代树状大分子的合成
合成方法参照Dendron 1的合成过程，ESI-TOF MS:m/z＝1012.40([M+Na]+，C47H79N11O12Na)
D、3代树状大分子的合成
合成方法参照Dendron 1的合成过程，产率87.3％，ESI-TOF MS:m/z＝1925.21([M+Na]+，C91H159N19O24Na)
E、4代树状大分子的合成
合成方法参照Dendron 1的合成过程，ESI-TOF MS:m/z＝3728.36([M+H]+，C179H320N35O48)。
实施例13
本发明对Dendronized-HA-Gd(3代)进行实验检测：
一、偶联物的体外降解
用透明质酸酶去孵育Dendronized-HA-Gd偶联物，研究基于HA的偶联体系是否还能被透明质酸酶有效降解。
将Dendronized-HA-Gd以5mg/mL的浓度溶解在PBS中(pH 7.4)，透明质酸酶在体系中的浓度为150U/mL，在37℃摇床上开始孵育。分别在12h，24h和48h时取出一定体积的降解溶液，于100℃煮沸10min，使得酶的活性失活。将降解液冷却至室温，离心收集上清液，待做GPC测试。相同处理条件下，没有用透明质酸酶孵育的体系作为对照组。降解程度用分子量残留来表示：weight remained(％)＝酶孵育后的分子量/原始分子量×100％。
图3显示了测试结果，纵坐标表示的是材料的残留分子量占原始分子量的百分数，横坐标是测试的时间点。很明显，经透明质酸酶孵育的Dendronized-HA-Gd偶联物的降解速度比PBS对照组要快，48h时，残留分子量百分率只有24％，并且仍有减少的趋势，而PBS对照组的仍残留有将近60％的分子量，且趋势平缓。这说明透明质酸酶仍能够主导基于HA的偶联体系进行生物降解，并没有因为对HA进行了修饰而改变了原有的生物行为。经计算，对于Dendronized-HA-Gd来说，24％的残留分子量接近Dendron-DOTA-Gd的分子量，并且肽类树状大分子本身具有可降解性质，因此不管残留的片段是混合物还是Dendron-DOTA-Gd，都可以通过进一步降解成更小的分子而促进其排出体外。
二、水相弛豫效能
用3.0T临床磁共振扫描仪考察了Dendronized-HA-Gd偶联物的纵向弛豫效能。
ICP-MS测试Dendronized-HA-Gd中的Gd(III)为3.8％，用0.1M的PBS溶液将Dendronized-HA-Gd大分子纳米粒配成Gd(III)浓度为0.15到0.5mM的水溶液。在室温下，用临床3T磁共振扫描仪(Siemens Sonata)，测试上述不同Gd(III)浓度样品的T1弛豫效能。采用多层面SE(MSE)脉冲序列扫描得到T1-weighted图像，所使用的具体参数如下：TE＝7ms，TR＝20，30，50，70，90，125，150，175，200，300，400，500，700，850和1000ms，matrix size＝128×256。纵向弛豫效率(r1)通过1/T1对Gd(III)浓度作曲线的斜率获得。同等测试条件下，Gd-DTPA作为对照。
室温下，不同Gd(III)浓度下，Dendronized-HA-Gd及Gd-DTPA的PBS水溶液样品的T1成像效果如图4所示：Dendronized-HA-Gd偶联物的T1信号随着Gd(III)浓度的增加(0.15mM到0.5mM)，有明显的变亮趋势，且亮度明显高于相同Gd(III)浓度下的商用试剂Gd-DTPA的信号。图5是MRI造影剂在不同Gd(III)浓度下的弛豫效率，从相关曲线的斜率得出，Dendronized-HA-Gd的纵向弛豫效率r1为7.7mM-1s-1，而相同测试条件下，Gd-DTPA的仅为2.5mM-1s-1。Dendronized-HA-Gd具有的较高的纵向弛豫效率r1主要归因于它的大分子结构，将小分子钆配体连接到大分子载体上后，延长了钆配体的旋转相关时间，从而提高了其纵向弛豫效率。另一方面，偶联物具有优异的水溶性，且HA骨架链段上的修饰位点均匀分布，可以避免类似于PEG对钆配体进行缠绕而阻碍其配位水分子与周围水分子的质子交换的现象的发生，使得Dendronized-HA-Gd具有的较高的水相弛豫效率。
三、小鼠肿瘤成像
本发明选用小鼠乳腺癌模型(4T1)作为Dendronized-HA-Gd偶联物体内MRI显影效果的研究对象，实验小鼠为6-8周龄的雌性BALB/c小鼠(20±2g)。将4T1细胞以5×105的个数分散于50μL的PBS中，接种在BALB/c小鼠的右后腿上方。当肿瘤的直径达到4mm左右时，将荷瘤小鼠随机分成2组，每组5只，每只都做好合适的标记，分别用于考察Gd-DTPA和Dendronized-HA-Gd在肿瘤部位的显影效果。在临床3T磁共振扫描仪(Siemens Sonata)上，用小鼠专用线圈作为信号的发射和接收系统来采集磁共振成像的信号。所有图像均采用TSE序列获得，具体参数如下：TE＝20ms，TR＝500ms，FOV＝40ms，Slice Thickness＝1.0mm，Flip angle＝90。实验小鼠用1％的戊巴比妥钠溶液经腹腔注射麻醉后，进行平扫，得到未做增强的MRI图像。接着通过尾静脉注射的方式，对小鼠给予剂量为0.08mmol Gd(III)/kg体重的Dendronized-HA-Gd或Gd-DTPA，分别在注射后0.5h，1.5h，3.5h和20h的时间点进行磁共振扫描，并且测量平扫和不同时间点小鼠肿瘤部位的信号值。我们采用相对信噪比增强(ΔSNR)作为信号值的参数：ΔSNR＝(St/Sm)/(St0/Sm0)，St/Sm是指注射MRI造影剂后的某个时间点肿瘤部位和对侧肌肉部位的信号比值，St0/Sm0是指平扫时肿瘤部位和对侧肌肉部位的信号比值。St和Sm是我们在感兴趣区域内(0.15cm2)所测得的信号值。最后以ΔSNR为纵坐标，时间为横坐标作图，来分析小鼠肿瘤部位的信号值的变化。
如图6所示，注射了Dendronized-HA-Gd的小鼠，在做了增强成像后，其肿瘤部位与周围组织的对比度明显增强，轮廓清晰可见。而Gd-DTPA组小鼠在注射药物前后，其肿瘤部位的信号值并没有发生太明显的变化，膀胱部位明显的变亮，说明Gd-DTPA进入体内后不久，对其的排泄就开始发生。1.5h时，Dendronized-HA-Gd组小鼠肿瘤部位呈现了最亮的信号，3.5h有所降低，但是直到20h，其信号亮度仍然高于相同测试条件下Gd-DTPA组小鼠的信号。通过对肿瘤部位的信号强度进行收集统计，我们得出了相对信噪比增强与时间的关系，如图7所示。从信号值我们看出，Gd-DTPA小鼠组的ΔSNR始终在1.0左右波动，说明在注射造影剂前后肿瘤部位和正常组织部位的对比度没有明显变化。而注射了Dendronized-HA-Gd偶联物的小鼠肿瘤部位的ΔSNR值明显高于平扫时的信噪比，且在1.5h时达到最高值，这与图6的结果一致。随后，可能是由于Dendronized-HA-Gd偶联物的降解，肿瘤部位的信噪比在3.5h和20h时有所降低。Dendronized-HA-Gd之所以具有较好的肿瘤诊断效果，与其具有较高的纵向弛豫效能、较长的体内循环时间，可以靶向到肿瘤部位密不可分。体外体内磁共振成像分析，Dendronized-HA-Gd偶联物具有比商用试剂Gd-DTPA更优异的性能，在作为MRI造影剂方面具有很大的潜力。
四、偶联物的体内分布
Gd(III)在小鼠主要器官中的聚集量是评价Dendronized-HA-Gd被肿瘤组织摄取的程度和代谢途径的一个重要指标。
用ICP-MS测量小鼠不同组织器官中的Gd(III)来获得材料在体内的分布情况。我们将荷瘤(4T1)小鼠随机分成2组，每组10只，每只都做好合适的标记。通过尾静脉注射分别给予剂量为0.08mmol Gd(III)/kg体重的Dendronized-HA-Gd或Gd-DTPA，在注射后0.5h的时间点，分别从两组小鼠中随机抽取5只，通过颈椎脱臼法将小鼠处死，收集心、肝、脾、肺、肾和肿瘤，用生理盐水涮洗，滤纸吸干各器官表面的水并称重。用H2O2(1mL)和HNO3(3mL)对各器官进行消解，于120℃下加热2天。将样品离心，吸取上清液，用去离子水稀释到一定的体积后，采用ICP-MS检测样品中Gd(III)的浓度。剩下的小鼠在20h时，做相同的处理。MRI造影剂在各器官中分布的计算公式为：Gd(III)相对含量(％ID/g)＝(各样品中Gd(III)的质量/对应小鼠初始注射Gd(III)的质量)×100％/对应器官的质量。
本发明考察了荷乳腺癌肿瘤模型的小鼠在注射Dendronized-HA-Gd偶联物或Gd-DTPA后30min和20h时，其心、肝、脾、肺、肾及肿瘤部位Gd(III)的含量。图8中，30min和20h时，Dendronized-HA-Gd组小鼠肿瘤部位的Gd(III)聚集量明显高于Gd-DTPA(*p<0.05,comparedto Gd-DTPA)，且有统计学差异。定量数值更精确的证明，Dendronized-HA-Gd与Gd-DTPA相比，具有更优异的肿瘤靶向效果，这得益于其大分子杂化结构。值得注意的是，在两个时间点，与其它组织器官相比，Dendronized-HA-Gd组小鼠肾脏部位的Gd(III)含量是最高的。我们知道，肾脏是主要的排泄器官，这个结果说明Dendronized-HA-Gd可以通过肾清除被排出体外。经统计，20h时，Dendronized-HA-Gd组小鼠体内Gd(III)的总为3.4％，比30min时的7.3％降低了2倍多，进一步证明了Dendronized-HA-Gd偶联物可以有效的排出体外，归因于它的可生物降解能力，从而降低了大分子偶联物在体内长时间的滞留带来的毒性风险。
五、生物安全性评价
1、血液相容性实验
外源物质通过静脉注射进入循环系统后，会和血液成分接触，考察Dendronized-HA-Gd大分子偶联物对血液相关机制的影响是其生物安全性评价的重要指标。血液相容性评价的参数主要包括：凝血功能检测、红细胞形貌和聚集、以及红细胞溶血等。
实验所用血液来自健康人体新鲜血液，以血液和抗凝剂9:1的比例，储存在柠檬酸钠抗凝管中。血液相容性实验评价依照相关法律法规和文献报告开展。1.1血栓弹力图测试
血栓弹力图TEG测试是临床上检测凝血功能的重要项目，可以真实准确地反映材料对全血凝血机制的影响，能够完整表达血液凝固的动态变化：纤维蛋白的形成速度，溶解状态和凝块的坚固性，弹力度等。是对凝血状态进行动态、完整、连续、真实再现的一种检测手段。血栓弹力图的主要指标有：R，凝血因子反应时间，即从测试开始到检测到纤维蛋白开始形成的时间，反映参加凝血启动过程的凝血因子的综合作用，代表凝血因子的总体活性；K，表示从纤维蛋白开始形成到血凝块达到一定的硬度所需的时间；α角，与K类似，二者均是血凝块聚合速度参数，反映血凝块形成的速率，代表纤维蛋白原的功能与水平；MA，最大振幅，反映已形成的血凝块的最大强度或硬度，主要代表血小板的聚集功能。
抽取健康人体新鲜血液储存于柠檬酸钠抗凝管中，取出900μL加入到含有高岭土的特制管中待用。向全血中分别加入100μL含Dendronized-HA-Gd偶联物和Gd-DTPA的PBS溶液，充分混匀，使得材料的最终浓度为5mg/mL和10mg/mL。充分混匀后，将20μL的CaCl2(0.2M)和340μL的血液样品分别加入到测样杯中，37℃下用血栓弹力图仪进行测试。相同条件下，PBS缓冲液作为对照组进行测试。
经不同浓度Dendronized-HA-Gd偶联物和Gd-DTPA孵育过的全血的血栓弹力图显示在图9中，具体数据总结在图10中。从结果来看，两种MRI造影剂的相关测试指标都在正常范围内，和PBS对照组相比，没有明显的差异。说明Dendronized-HA-Gd偶联物对血液的凝血机制，包括凝血因子反应时间、血凝块的形成速率和强度等，都没有造成负面影响，即使在10mg/mL的高浓度下也不会造成血液高凝或血栓的形成。
1.2红细胞形貌和聚集
采取健康人体新鲜血液储存于抗柠檬酸钠管子中，向其中加入PBS，1000g离心5min，弃去上层清液，再加PBS洗，离心，吸出上层清液，重复三次，搜集红细胞。取20μL红细胞，分别与含Dendronized-HA-Gd或Gd-DTPA的PBS溶液混合，使得材料的最终浓度为1mg/mL，5mg/mL和10mg/mL。混合体系用涡旋仪震荡，充分混匀。孵育15min后，离心，弃去上清液，加入0.5mL4％的多聚甲醛固定过夜。将固定的红细胞重悬，吸取10-20μL悬浮液均匀涂在24孔板底部，然后向每个孔内依次加入75％，85％，95％，100％的乙醇水溶液浸泡10min，进行脱水。最后在25℃恒温条件下自然干燥过夜。将样品进行喷金，待测扫描电镜。在上述相同条件下，同体积的PBS缓冲液作为对照组进行制样和测试。
用SEM来分析Dendronized-HA-Gd和Gd-DTPA对红细胞的形貌和聚集的影响。由于红细胞是血液中含量最高的细胞，在血液相容性评价中，常被用作研究对象来考察生物材料对血液的影响。一旦生物材料通过静脉注射进入体内，外源物质可能对血管内的红细胞产生副作用，导致红细胞形貌异常及结构的破坏。红细胞膜可以提供一个实际可行的预测模型来研究外源物质和哺乳动物细胞膜的相互作用。红细胞的形貌、聚集和溶血是研究材料血液相容性的重要参数。如图11所示，低倍下，经不同浓度Dendronized-HA-Gd偶联物和Gd-DTPA孵育过的红细胞具有良好的分散性；高倍下，红细胞膜表面光滑完整，呈现正常的双凹结构，和PBS对照组相比，没有明显的结构变化。因此，Dendronized-HA-Gd对红细胞的形貌和聚集状态没有明显的负面影响，血液安全性良好。
1.3红细胞溶血
抽取健康人体新鲜血液储存于抗柠檬酸钠采血管中，1000g离心5min，PBS洗3次，吸出上层清液，取红细胞和PBS配成16％的红细胞悬液。向1mL含Dendronized-HA-Gd或Gd-DTPA的PBS溶液中，加入50μL的红细胞悬液，充分混匀，使得材料的终浓度为1mg/mL，5mg/mL和10mg/mL。相同条件下，1mL去离子水或者PBS缓冲液和50μL红细胞悬液进行混合，分别作为阳性对照组和阴性对照组。上述样品在室温稳定状态下孵育12h，涡旋混匀，1000g离心5min，取上层清液200μL转移至96孔板中，酶标仪测定样品在540nm的OD值。溶血百分率通过下面的公式来计算：溶血率(％)＝(A-B)/(C-B)×100，A：纳米粒样品溶液测试的吸光度，B：PBS缓冲液样品测试的吸光度，C：水溶液样品测试的吸光度。每个浓度需做3个平行组进行测试。
在溶血实验中，5％的溶血率是安全阈值的上限。经不同浓度Dendronized-HA-Gd偶联物孵育12h后的红细胞没有出现明显的溶血现象，其浓度在1mg/mL，5mg/mL和10mg/mL时引起的溶血率分别为-0.15％，0.5％和0.46％，远远低于5％的上限值。其中负值表示材料孵育的红细胞的血红蛋白释放量低于PBS对照组的血红蛋白释放量，通过公式计算就出现了负值。说明Dendronized-HA-Gd偶联物不会引起红细胞膜的破坏和血红蛋白的异常释放。
2、体外细胞毒性
材料对正常细胞系的毒副作用是生物安全性评价的重要指标。
使用CCK-8法来评价Dendronized-HA-Gd偶联物的细胞毒性。在37℃，5％CO2的条件下，小鼠胚胎成纤维细胞(NIH/3T3)、小鼠成肌细胞(C2C12)、人胚肾细胞(293T)和人肝细胞(L02)用DMEM培养基(含10％的胎牛血清，100U/mL青霉素和100U/mL的链霉素)进行培养。待细胞在培养皿底部长成致密单层后，用1mL含0.02％EDTA和0.25％胰蛋白酶的消化液对贴壁细胞进行消化处理，在96孔板中以5×103个细胞/孔的浓度分别接种上述四种细胞。用100μL DMEM培养基在37℃，5％CO2的培养箱中培养24h后，弃去96孔培养板中的培养基，加入100μL含不同Gd(III)浓度的Dendronized-HA-Gd或Gd-DTPA的培养基，使得孔板中Dendronized-HA-Gd大分子偶联物或Gd-DTPA的Gd(III)最终浓度分别为10，50，100，200和300nmol/mL，每个浓度平行做5个孔。对照组不加材料，用同体积的培养基培养细胞。继续培养24h后，弃去孔板中的培养基，用磷酸盐缓冲液(10mmol/L、pH为7.4)清洗2遍，然后加入100加L含10％的CCK8试剂的培养基(不含FBS)，再孵育2h。同时，另选5个不含细胞的空白孔，加入100μL含10％CCK8试剂的培养基(不含FBS)作为空白组，用酶标仪测450nm处的吸光度，根据吸光度计算细胞存活率。将对照组的细胞存活率定为100％，实验组细胞存活率＝(实验组吸光度-空白组吸光度)/(对照组吸光度-空白组吸光度)×100％。
如图12所示，在以Gd(III)为标准的测试浓度范围内(10nmol/mL到300nmol/mL)，经Dendronized-HA-Gd偶联物孵育的四种细胞的存活率都在100％左右，说明本发明合成的偶联物对细胞没有明显的杀灭作用，具有良好的细胞安全性。
3、正常小鼠体内毒性
本发明将健康的雌性BALB/c小鼠(6-8周龄、体重为20±2g)随机分成3组，每组5只，每只都做好合适的标记。其中两组小鼠分别通过尾静脉注射Dendronized-HA-Gd偶联物或Gd-DTPA，注射剂量同为0.08mmol Gd(III)/kg体重，剩下的一组小鼠注射生理盐水，作为对照。三组小鼠的注射体积均为200μL，注射频率为每四天一次，一共三次。第9天最后一次注射后，停止给药，继续观察6天。整个实验周期内，对小鼠的行为进行监测，每两天称取小鼠体重一次。在第15天时，采用颈椎脱臼法将小鼠处死，收集每只小鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏，经PBS涮洗后，用4％的甲醛溶液对各器官进行固定，用于组织学分析。
在本实验中，Gd(III)单次给药剂量和体内成像实验的剂量一致。在三次给药期间，注射了Dendronized-HA-Gd大分子偶联物的小鼠没有出现明显的脱水，躁动，肌肉萎缩，厌食及其它和动物体内毒性相关的症状。图13显示了健康小鼠在15天内的体重变化趋势，和生理盐水对照组相比，注射了大分子偶联物的小鼠体重正常，没有出现异常的波动。这个结果说明Dendronized-HA-Gd偶联物不会影响健康小鼠的体内营养或代谢机制。
通过组织学分析来考察Dendronized-HA-Gd偶联物或者其降解产物是否会引起组织损伤、炎症或病变等问题。组织切片结果显示，和生理盐水对照组相比，Gd-DTPA组和Dendronized-HA-Gd组的小鼠的5个主要器官(心脏、肝脏、脾脏、肺、肾)没有明显的结构异常和炎症反应，都呈现出了正常的生理结构：心肌细胞结构正常，间质没有发现出血及炎细胞浸润，心脏内外膜及心瓣膜没有发现炎细胞浸润和纤维组织增生；肝脏样品中，肝细胞结构正常，没有出现炎细胞浸润；在脾脏组中红髓、白髓及边缘区结构清晰，没有出现坏死和出血，被膜结构没有出现增厚和炎细胞浸润；肺组织中，肺泡结构清晰，上皮形态正常，未见渗出及炎细胞浸润，肺间质及胸膜没有发现增厚和炎细胞浸润；肾脏样品中，肾小球结构完整，清晰可见，其他部位未见炎症浸润。
实验小鼠的组织切片分析呈现的正常生理结构归因于Dendronized-HA-Gd大分子偶联物具有的良好的生物相容性。Dendronized-HA-Gd结合了HA和肽类树状大分子的优点，具有可生物降解性，促进了其能有效的被排出体外。同时，大分子偶联物具有的表面负电荷和良好的水溶性，保证了其在生理环境中的稳定性，避免了其与机体成分的不良作用。经血液学、细胞学、行为学及组织学等系统的分析表明，Dendronized-HA-Gd生物安全性良好，其降解产物可经肾脏排出体外。
下表为本发明实验所用的主要药品。
N,N-二甲基甲酰胺(DMF)用无水MgSO4干燥24h，减压蒸馏，收集中间馏分。二氯甲烷中加入氢化钙过夜，过滤，向滤液中加入氢化钙，常压蒸馏，收集中间馏分，密封保存于干燥器中，现蒸现用，存储不超2周。其他试剂未作特别说明的，视为分析纯，直接使用。
细胞实验中所用的所有耗材均为Life Technologies品牌。小鼠成肌细胞(C2C12)、小鼠胚胎成纤维细胞(NIH/3T3)、人胚肾细胞(293T)、人肝细胞(L02)、小鼠乳腺癌细胞(4T1)均购于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。实验小鼠(BALB/c小鼠)购于四川大学大学动物中心，饲养在SPF级别的动物房内，动物实验严格按照四川大学动物实验伦理和法律规定执行。
下表为本发明实验所用的主要仪器

Claims (7)

1.基于透明质酸-肽类树状大分子-钆偶联物的磁共振影像探针，其特征在于，具体结构如下：
其中A是以乙二胺为核的赖氨酸扇形肽类树状大分子，R与肽类树状大分子的末端氨基连接，
n＝1-16；
所述的肽类树状大分子是三代肽类树状大分子。
2.根据权利要求1所述的基于透明质酸-肽类树状大分子-钆偶联物的磁共振影像探针的制备方法，其特征在于，先分别合成端位为叠氮基的肽类树状大分子-钆偶联物和炔基化透明质酸，再通过铜催化的点击反应合成终产物Dendronized-HA-Gd。
3.根据权利要求2所述的基于透明质酸-肽类树状大分子-钆偶联物的磁共振影像探针的制备方法，其特征在于，所述肽类树状大分子-钆偶联物的合成如下：
第一步，以Boc基团保护的肽类树状大分子为原料，在氮气保护的冰浴条件下，肽类树状大分子溶于无水CH2Cl2中，向其中加入TFA，反应结束后，除去TFA，将反应产物溶于DMF中，在氮气保护的冰浴条件下，向体系中同时加入DIPEA、HOAt、HATU和DOTA，反应得到中间产物；
第二步，在氮气保护的冰浴条件下，将中间产物溶于无水CH2Cl2中，向其中加入TFA，反应结束后，除去TFA，将反应产物溶解在去离子水中，向其中加入GdCl3·6H2O，反应结束后，得到肽类树状大分子-钆偶联物。
4.根据权利要求2所述的基于透明质酸-肽类树状大分子-钆偶联物的磁共振影像探针的制备方法，其特征在于，所述炔基化透明质酸的合成：将透明质酸钠溶解在去离子水中，向其中加入DMTMM来活化透明质酸钠骨架链段上的羧基，向混合体系中加入丙炔胺，反应结束后，得到炔基化的透明质酸。
5.根据权利要求2所述的基于透明质酸-肽类树状大分子-钆偶联物的磁共振影像探针的制备方法，其特征在于，Dendronized-HA-Gd的合成：在氮气保护的冰浴条件下，将肽类树状大分子-钆偶联物、炔基化透明质酸和抗坏血酸钠溶于去离子水中，向其中加入CuSO4·5H2O，反应结束后，得到终产物。
6.根据权利要求3或者4所述的基于透明质酸-肽类树状大分子-钆偶联物的磁共振影像探针的制备方法，其特征在于，将反应结束后的混合体系用截留分子量为1000的透析袋透析。
7.根据权利要求5所述的基于透明质酸-肽类树状大分子-钆偶联物的磁共振影像探针的制备方法，其特征在于，将反应结束后的混合体系在EDTA溶液中用截留分子量为6000-8000的透析袋透析，得到终产物。
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