CN115554420B - 一种顺磁性磁共振造影剂及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种顺磁性磁共振造影剂及其制备方法和应用，涉及材料科学与生物化工交叉技术领域。本发明的造影剂是以胱胺酸钠盐为桥联剂，通过酰胺反应将透明质酸(HA)、1,4,7,10‑四氮杂环十二烷‑1,4,7,10‑四羧酸(DOTA)、阿糖胞苷连接，透明质酸与肿瘤表面的CD44受体结合进入细胞进行成像，实现特异性肿瘤靶向，并且能够进一步在体内分解，具有良好的生物相容性，其弛豫效率显著高于临床商用MRI造影剂多它灵，经过肿瘤微环境中较高浓度的谷胱甘肽(GSH)的作用后释放出药物，实现肿瘤的抑制，具有高诊断准确性的同时具有一定的治疗效果，是一种有临床应用潜力的T1MRI造影剂。

Description

一种顺磁性磁共振造影剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及材料科学与生物化工交叉技术领域，具体涉及一种顺磁性磁共振造影剂及其制备方法和应用。
背景技术
磁共振成像(MRI)造影剂的使用可以提高MR的成像灵敏度，但从2013年以来，越来越多的证据表明高剂量的使用造影剂会使其中的Gd(Ⅲ)不可逆转的滞留在中枢神经系统(CNS)；由于钆基造影剂与肾源性系统性纤维化(NSF)强烈的联系，美国食品药品监督管理局(FDA)在2010年禁止肾小球滤过率(GFR)<30mL/min/1.73m2的病人使用部分钆基造影剂，并建议对GFR进行检测，对于肾功能损伤的病人要避免对所有钆基造影剂的使用。而目前临床应用的MRI造影剂大多数是极小且亲水的基于钆的螯合物，组织选择性分布程度不高且没有靶向成像的功能，因此在不牺牲安全性能的前提下，在制备出更高弛豫度的靶向造影剂对于提高特异性富集，降低用量，减少体内滞留具有重要意义。
刺激响应型大分子造影剂是目前研究的主要方向之一，尺寸的增加会延长血液滞留时间，但也增加了细胞摄取，长时间累积金属离子的风险。目前解决这一问题的途径有两种，一是设计合适尺寸的大分子，既满足足够的血液滞留时间，又能够通过肾脏排出体外，减少体内的滞留；二是设计或选择生物可降解的大分子，在达到足够长的成像时间后能在体内迅速降解成小分子排出体外。但复杂的设计会增加合成步骤与合成成本，使得大规模合成在扩大到工业环境时非常具有挑战性。此外，复杂的纳米材料设计会使纳米载体的生物相容性降低，会增加获得FDA或欧洲药品管理局(EMA)批准用于临床的难度。因此，简单的的大分子造影剂载体设计对于临床转化具有重要意义。
综上所述，为了减少体内金属离子滞留，迫切需要设计并制备一种以简单大分子为载体的靶向疾病部位的高弛豫造影剂。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于透明质酸修饰的靶向肿瘤的顺磁性磁共振造影剂及其制备方法和应用。本发明根据透明质酸靶向肿瘤的特性，将其应用于肿瘤部位的磁共振成像，利用肿瘤微环境的特点，即谷胱甘肽浓度高于正常组织，用含有二硫键的链接剂链接大分子载体(HA)与小分子药物(阿糖胞苷和M-DOTA)，一方面降低了小分子在血液中的清除速率，另一方面实现了目标位置的可控释放，而大分子进入细胞内后可以被透明质酸酶进一步降解，提高生物安全性。
为了实现上述目的，本发明的技术方案具体如下：
本发明提供一种顺磁性磁共振造影剂，其是以胱胺酸钠盐为桥联剂，将透明质酸连接上抗肿瘤药物阿糖胞苷和小分子成像药物M-DOTA获得的，结构表达式如下：
其中，n为19～26，M为Gd3+、Dy3+或Mn2+。
本发明还提供一种顺磁性磁共振造影剂的制备方法，包括以下步骤：
S1、将透明质酸与胱胺酸钠盐进行酰胺反应获得产物HA-SS；
S2、将产物HA-SS与阿糖胞苷进行酰胺反应获得产物HA-SS-a；
S3、将产物HA-SS-a与1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四羧酸(DOTA)进行酰胺反应获得产物HA-SS-a-DOTA；
S4、向产物HA-SS-a-DOTA中加入M金属离子溶液进行络合反应，获得最终产物HA-SS-a-M-DOTA。
在上述技术方案中，优选的是，步骤S1的一种具体实施方式为：
向10mL透明质酸溶液中加入缩合剂磁力搅拌30min，将10mL胱胺酸钠盐溶液倒入活化的透明质酸溶液中，磁力搅拌24h，反应完成后用去离子水透析，冻干得到产物HA-SS；所述透明质酸与胱胺酸钠盐的质量比为100mg：(235～260)mg。
在上述技术方案中，优选的是，步骤S2的一种具体实施方式为：
向12mL产物HA-SS的溶液中加入缩合剂磁力搅拌30min，将12mL阿糖胞苷溶液倒入产物HA-SS溶液中，磁力搅拌24h，反应完成后，去离子水透析，冻干得到产物HA-SS-a；所述产物HA-SS与阿糖胞苷的质量比为120mg：(135～150)mg。
在上述技术方案中，优选的是，步骤S3的一种具体实施方式为：
向60mL的DOTA溶液中加入缩合剂磁力搅拌30min，将20mL产物HA-SS-a溶液倒入活化的DOTA溶液中，磁力搅拌24h，反应完成后，去离子水透析，冻干得到产物HA-SS-a-DOTA；所述产物HA-SS-a与DOTA的质量比为100mg：(200～240)mg。
在上述技术方案中，优选的是，步骤S4的一种具体实施方式为：
向产物HA-SS-a-DOTA溶液中滴加M金属离子溶液，反应液与二甲酚橙指示剂反应呈紫红色时，滴加结束，去离子水透析，冻干得到终产物HA-SS-a-M-DOTA。
在上述技术方案中，进一步优选的是，步骤S1、步骤S2和步骤S3中所述缩合剂是1-乙基3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，其质量比是230mg：(140～170)mg。
在上述技术方案中，再进一步优选的是，反应物与缩合剂进行活化反应要保持pH值在4.5～6.5之间。
在上述技术方案中，进一步优选的是，步骤S4中络合反应要保持pH在5～5.5内。
本发明还提供一种顺磁性磁共振造影剂在靶向肿瘤成像中的应用。
本发明的有益效果是：
本发明提供了一种特异性靶向肿瘤的顺磁性磁共振造影剂，该造影剂是以胱胺酸钠盐为桥联剂，通过酰胺反应将透明质酸(HA)、1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四羧酸(DOTA)、阿糖胞苷连接，透明质酸与肿瘤表面的CD44受体结合进入细胞进行成像，实现特异性肿瘤靶向，并且能够进一步在体内分解，具有良好的生物相容性，其弛豫效率显著高于临床商用MRI造影剂多它灵，经过肿瘤微环境中较高浓度的谷胱甘肽(GSH)的作用后释放出药物，实现肿瘤的抑制，具有高诊断准确性的同时具有一定的治疗效果，是一种有临床应用潜力的T1 MRI造影剂。
本发明提供的制备方法，将含有二硫键的胱胺酸钠盐连接小分子药物(阿糖胞苷和M-DOTA)与大分子载体(HA)，根据透明质酸靶向肿瘤的特性，增强了肿瘤部位的磁共振成像效果，利用肿瘤微环境的特点，实现了药物在目标位置的可控释放，而透明质酸可被透明质酸酶进一步降解，提高了生物安全性。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明。
图1为本发明中造影剂的制备方法的流程示意图。
图2为本发明中HA、HA-SS、HA-SS-a、HA-SS-a-DOTA的红外谱图。
图3为本发明中HA的核磁共振碳谱图。
图4为本发明中HA-SS的核磁共振碳谱图。
图5为本发明中HA-SS-a的核磁共振碳谱图。
图6为本发明中HA-SS-a-DOTA的核磁共振碳谱图。
图7为本发明中制备的造影剂在0.5T磁场下的弛豫效率图。
图8为本发明中制备的造影剂的体外响应释放曲线。
图9为本发明中造影剂与B16细胞培养24h后的细胞毒性实验结果图。
图10为本发明中造影剂在4.7T动物MRI扫描仪上获得的注射前(0h)，以及注射后30min、1h MR图像以及位置效果增强图。
图11为4T1荷瘤小鼠的组织切片图。
具体实施方式
本发明的发明思想是：本发明根据目前临床造影剂的应用缺陷，提出了一种基于透明质酸修饰的靶向肿瘤的顺磁性磁共振造影剂及其制备方法和应用，根据透明质酸靶向肿瘤的特性，将其应该用于肿瘤部位的磁共振成像，利用肿瘤微环境的特点，即谷胱甘肽浓度高于正常组织，用含有二硫键的链接剂链接大分子载体(HA)与小分子药物(阿糖胞苷和M-DOTA)，一方面降低了小分子在血液中的清除速率，另一方面实现了目标位置的可控释放，而大分子进入细胞内后可以被透明质酸酶进一步降解，提高生物安全性。
本发明提供的一种顺磁性磁共振造影剂，其是以胱胺酸钠盐为桥联剂，将透明质酸连接上抗肿瘤药物阿糖胞苷和小分子成像药物M-DOTA获得的，结构表达式如下：
其中，n为19～26，M为Gd3+、Dy3+或Mn2+。
结合图1具体说明本发明提供的顺磁性磁共振造影剂的制备方法，包括以下步骤：
S1、将透明质酸与胱胺酸钠盐进行酰胺反应获得产物HA-SS；
S2、将产物HA-SS与阿糖胞苷进行酰胺反应获得产物HA-SS-a；
S3、将产物HA-SS-a与1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四羧酸(DOTA)进行酰胺反应获得产物HA-SS-a-DOTA；
S4、向产物HA-SS-a-DOTA中加入M金属离子溶液进行络合反应，获得最终产物HA-SS-a-M-DOTA。
本发明所述的制备方法的一种具体实施方式为：包括以下步骤：
S1，向10mL透明质酸溶液中加入缩合剂磁力搅拌30min，将10mL胱胺酸钠盐溶液快速倒入活化的透明质酸溶液中，磁力搅拌24h，反应完成后用去离子水透析，冻干得到产物HA-SS。
S2，向产物HA-SS的12mL溶液中加入缩合剂磁力搅拌30min，将12mL阿糖胞苷溶液倒入产物HA-SS溶液中，磁力搅拌24h，反应完成后，去离子水透析，冻干得到产物HA-SS-a。
S3，向溶解的60mL DOTA溶液中加入缩合剂磁力搅拌30min，将产物HA-SS-a的20mL溶液倒入活化的DOTA溶液中，磁力搅拌24h，反应完成后，去离子水透析，冻干得到产物HA-SS-a-DOTA。
S4，向产物HA-SS-a-DOTA溶液缓慢滴加M金属离子溶液进行络合反应，反应液与二甲酚橙指示剂反应呈紫红色时，滴加结束。去离子水透析，冻干的终产物HA-SS-a-M-DOTA。
进一步地，上述制备方法中，步骤S1、步骤S2和步骤S3中所用的缩合剂是1-乙基3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，EDC和NHS的质量比是230mg：(140～170)mg，且活化反应中保持pH在4.5～6.5之间。
进一步地，上述制备方法中，步骤S1中的透明质酸与胱胺酸钠盐的质量比为100mg：(235～260)mg。
进一步地，上述制备方法中，步骤S2中的产物HA-SS与阿糖胞苷的质量比为120mg：(135～150)mg。
进一步地，上述制备方法中，步骤S3中的产物HA-SS-a与DOTA的质量比为100mg：(200～240)mg。
进一步地，上述制备方法中，步骤S4中络合反应的要保持pH在5～5.5内。
综上，本发明基于透明质酸修饰的靶向肿瘤的顺磁性磁共振造影剂，以HA为大分子载体，用双硫键链接小分子药物(阿糖胞苷和M-DOTA)，实现肿瘤部位的成像与治疗，是一种生物相容性良好的T1 MRI造影剂。
实施例1
HA修饰的靶向肿瘤的顺磁性MRI造影剂的制备
1.产物HA-SS的合成
称量HA0.1g(HA的分子量为7800Da)溶解于10mL去离子水中，称取胱胺酸钠盐0.25g溶于10mL去离子水中，随后向溶解的HA溶液中加入0.23g EDC与0.16g NHS磁力搅拌30min以活化HA上的羧基，将胱胺酸钠盐溶液快速倒入活化的HA溶液中，磁力搅拌24h，生成HA-SS后用去离子水透析(MWCO 3500)3d，40℃旋蒸浓缩后冻干。
2.产物HA-SS-a的合成
称量HA-SS 0.12g溶解于12mL去离子水中，称取阿糖胞苷0.14g溶于12mL去离子水中，随后向溶解的HA-SS溶液中加入0.41g EDC与0.26g NHS磁力搅拌30min以活化羧基，将阿糖胞苷溶液倒入活化的HA-SS溶液中，磁力搅拌24h，得HA-SS-a，去离子水透析(MWCO3500)3d，40℃旋蒸浓缩后冻干。
3.产物HA-SS-a-DOTA的合成
称量HA-SS-a 0.1g溶解于20mL去离子水中，称取DOTA0.21g溶于60mL去离子水中，随后向溶解的DOTA溶液中加入1.06g EDC与0.7585g NHS磁力搅拌30min以活化羧基，将HA-SS-a溶液倒入活化的DOTA溶液中，磁力搅拌24h生成HA-SS-a-DOTA，去离子水透析(MWCO3500)3d，40℃旋蒸浓缩后冻干。
4.络合
称取HA-SS-a-DOTA0.2g溶解于20mL去离子水中加入磁子不断搅拌，缓慢滴加GdCl3溶液，用1mol/L的NaOH调节pH为5.5，反应液与二甲酚橙指示剂反应呈紫红色时，滴加结束。去离子水透析(MWCO 3500)5d，40℃旋蒸浓缩后冻干，获得最终产物HA-SS-a-Gd-DOTA。
实施例2
HA修饰的靶向肿瘤的顺磁性MRI造影剂的制备
1.产物HA-SS的合成
称量HA0.2g(HA的分子量为7800Da)溶解于25mL去离子水中，称取胱胺酸钠盐0.48g溶于25mL去离子水中，随后向溶解的HA溶液中加入0.3gEDC与0.24g NHS磁力搅拌30min以活化HA上的羧基，将胱胺酸钠盐溶液快速倒入活化的HA溶液中，磁力搅拌24h，生成HA-SS后用去离子水透析(MWCO3500)3d，40℃旋蒸浓缩后冻干。
2.产物HA-SS-a的合成
称量HA-SS 0.25g溶解于25mL去离子水中，称取阿糖胞苷0.30g溶于30mL去离子水中，随后向溶解的HA-SS溶液中加入0.75g EDC与0.5g NHS磁力搅拌30min以活化羧基，将阿糖胞苷溶液倒入活化的HA-SS溶液中，磁力搅拌24h，得HA-SS-a，去离子水透析(MWCO 3500)3d，40℃旋蒸浓缩后冻干。
3.产物HA-SS-a-DOTA的合成
称量HA-SS-a 0.2g溶解于20mL去离子水中，称取DOTA0.45g溶于150mL去离子水中，随后向溶解的DOTA溶液中加入2g EDC与1.5g NHS磁力搅拌30min以活化羧基，将HA-SS-a溶液倒入活化的DOTA溶液中，磁力搅拌24h生成HA-SS-a-DOTA，去离子水透析(MWCO 3500)3d，40℃旋蒸浓缩后冻干。
4.络合
称取HA-SS-a-DOTA0.2g溶解于20mL去离子水中加入磁子不断搅拌，缓慢滴加GdCl3溶液，用1mol/L的NaOH调节pH为5.5，反应液与二甲酚橙指示剂反应呈紫红色时，滴加结束。去离子水透析(MWCO 3500)5d，40℃旋蒸浓缩后冻干，获得最终产物HA-SS-a-Gd-DOTA。
实施例3
HA修饰的靶向肿瘤的顺磁性MRI造影剂的制备
步骤4中的GdCl3溶液替换为DyCl3溶液，其余步骤同实施例1。
实施例4
HA修饰的靶向肿瘤的顺磁性MRI造影剂的制备
步骤4中的GdCl3溶液替换为MnCl2溶液，其余步骤同实施例1。
实验方法
以下是对实施例1制备的HA-SS-a-Gd-DOTA的结构及性能表征
1.红外光谱测试
通过Vertex70型红外光谱仪(德国Bruker公司)对透明质酸以及产物HA-SS、HA-SS-a、HA-SS-a-DOTA进行4000-400cm-1波长范围内的红外光谱测试，结果如图2所示，HA与胱胺酸钠盐反应生成HA-SS后，1616cm-1处的羧基的C＝O反对称伸缩峰消失，生成了酰胺键，对应1644cm-1处的C＝O峰，1406cm-1处的羧基的C＝O对称伸缩峰减弱；连接阿糖胞苷形成的HA-SS-a在1443cm-1处形成了代表C＝C不饱和伸缩振动新峰，同时1322cm-1处代表羧基C-O键伸缩振动峰消失，说明阿糖胞苷的成功连接；最后连接DOTA，在1245cm-1处出现的新峰代表C-N伸缩振动峰，1327cm-1与1280cm-1处的新峰是CH2的扭曲振动与面外摇摆峰，证明DOTA的成功连接。
3.核磁共振波谱测试
在Bruker Avance 600型核磁共振谱仪上进行核磁共振碳谱测试，以TMS为内标溶剂是D2O，测试温度为25℃，获得的谱图如图3-6所示。图3中的HA经酰胺化反应后生成了HA-SS，图4中的174ppm与175ppm处代表羧基与酰胺键中的碳发生了变化，同时在55ppm、42ppm、36ppm、34ppm处生成的新峰分别代表了HA-SS的10、13、11、12号碳；图5中178ppm处的新峰代表HA-SS-a的14号碳，在144ppm以及142ppm处的峰代表了阿糖胞苷中六元环上的双键碳；图6中170-178ppm内的新峰代表DOTA上的羧基碳，51ppm与48ppm处的新峰表示DOTA上的亚甲基碳，综上所述证明了实施例中HA-SS、HA-SS-a、HA-SS-a-DOTA的成功合成。
4.磁共振弛豫
将HA-SS-a-Gd-DOTA溶于去离子水中，配制成Gd浓度为0.05-0.8mmol·L-1的溶液，在MesoMR23-060H-I纽迈磁共振分析仪上，采用反转恢复法测试其在0.5T下的弛豫时间(T1)。以钆离子浓度通过对实验数据进行线性回归拟合得到图7，HA-SS-a-Gd-DOTA的纵向弛豫率(r1)为21.9mmol-1·L·s-1。
5.药物体外释放
分别制备不同pH值的磷酸盐缓冲液作为阿糖胞苷的释放介质，同时配置成不同浓度的二硫苏糖醇(DTT)，研究HA-SS-a-Gd-DOTA在不同环境下的阿糖胞苷释放效率。称取HA-SS-a-Gd-DOTA，并用水配置成相同浓度的溶液后移至透析袋(MWCO 3500)中，透析袋外液分别为pH＝5.7、pH＝5.7&10mmol/L DTT、pH＝7.4&10mmol/L DTT、pH＝7.4的70mL磷酸盐缓冲溶液，进行药物释放，恒温(37℃)震荡。
在不同时刻下(0.5h、1h、2h、3h、4h、8h、12h、24h)取出释放介质3mL，并加入新鲜释放介质3mL，检测270nm处的吸光度，通过标准曲线确定浓度，计算累计释放量并绘制释放曲线得到图8。累计释放量：
Ve：PBS置换体积；V0：释放介质的总体积；ci：第i次换取样时释放液的浓度；mdrug：纳米粒子载药总质量；n：置换PBS的次数；cn：第(i+1)次换取样时释放液的浓度。
6.细胞毒性实验
将B16细胞接种在96孔板中，在培养箱(5％ CO2，37℃)中培养24h后，向每孔加入HA-SS-a-Gd-DOTA或欧乃影，培养基调节Gd(Ⅲ)浓度为1-1000μmol/L(n＝5)。将细胞与药物一起培养24h后，用CCK8试剂盒进行药物的细胞毒性测量。可以观察到即使是在Gd(Ⅲ)浓度为1000μmol/L的高浓度下，细胞依旧保持高于80％的存活率，证明其良好的生物安全性(参见图9)。
7.体内MR成像
用健康雌性BALB/c裸鼠(4周龄，20±2g)建立皮下4T1肿瘤模型(小鼠模型只数n＝2)。培养4T1细胞，将约1×106的4T1细胞注射到小鼠的侧背皮下，当4T1肿瘤体积长至60-80mm3时进行成像，HA-SS-a-Gd-DOTA以0.1mmol Gd(Ⅲ)/kg的浓度尾静脉注射进小鼠体内，使用4.7T动物MRI扫描仪进行扫描在注射前(0h)、30min、1h后获取MR图像，结果如图10所示，可以看出在用药1h内获得了58.％增强效果，本发明中的HA-SS-a-Gd-DOTA具有良好的成像性能，可以获得清晰的肿瘤部位的磁共振图像。
8.组织切片
组织切片图如图11所示，可以观察到在注射本发明中的造影剂后，小鼠的各个器官并未出现明显异常，给药后没有显著的坏死细胞，且未出现纤维化、脂肪变性、增生等问题，生长状态良好，与对照组并无差异，由此可知本发明中的造影剂在体内的急性毒性较低，且重复给药并没有带来明显损伤。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (10)

1.一种顺磁性磁共振造影剂，其特征在于，其是以胱胺酸钠盐为桥联剂，将透明质酸连接上抗肿瘤药物阿糖胞苷和小分子成像药物M-DOTA获得的，结构表达式如下：
其中，n为19～26，M为Gd3+、Dy3+或Mn2+。
2.一种权利要求1所述的顺磁性磁共振造影剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、将透明质酸与胱胺酸钠盐进行酰胺反应获得产物HA-SS；
S2、将产物HA-SS与阿糖胞苷进行酰胺反应获得产物HA-SS-a；
S3、将产物HA-SS-a与1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四羧酸进行酰胺反应获得产物HA-SS-a-DOTA；
S4、向产物HA-SS-a-DOTA中加入M金属离子溶液进行络合反应，获得最终产物HA-SS-a-M-DOTA。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S1的一种具体实施方式为：
向10mL透明质酸溶液中加入缩合剂磁力搅拌30min，将10mL胱胺酸钠盐溶液倒入活化的透明质酸溶液中，磁力搅拌24h，反应完成后用去离子水透析，冻干得到产物HA-SS；
所述透明质酸与胱胺酸钠盐的质量比为100mg：(235～260)mg。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S2的一种具体实施方式为：
向12mL产物HA-SS的溶液中加入缩合剂磁力搅拌30min，将12mL阿糖胞苷溶液倒入产物HA-SS溶液中，磁力搅拌24h，反应完成后，去离子水透析，冻干得到产物HA-SS-a；
所述产物HA-SS与阿糖胞苷的质量比为120mg：(135～150)mg。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S3的一种具体实施方式为：
向60mL的DOTA溶液中加入缩合剂磁力搅拌30min，将20mL产物HA-SS-a溶液倒入活化的DOTA溶液中，磁力搅拌24h，反应完成后，去离子水透析，冻干得到产物HA-SS-a-DOTA；
所述产物HA-SS-a与DOTA的质量比为100mg：(200～240)mg。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S4的一种具体实施方式为：
向产物HA-SS-a-DOTA溶液中滴加M金属离子溶液进行络合反应，反应液与二甲酚橙指示剂反应呈紫红色时，滴加结束，去离子水透析，冻干得到终产物HA-SS-a-M-DOTA。
7.根据权利要求3-5任意一项所述的制备方法，其特征在于，所述缩合剂是1-乙基3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，其质量比是230mg：(140～170)mg。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，反应物与缩合剂进行活化反应要保持pH值在4.5～6.5之间。
9.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤S4中络合反应要保持pH在5～5.5内。
10.一种权利要求1所述的顺磁性磁共振造影剂在制备靶向肿瘤成像药物中的应用。
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